Summary
Den foreløbige undersøgelse bekræfter, at subaraknoid blødning (SAH) forårsager hjernepericytdød. Evaluering af pericytkontraktilitet efter SAH kræver differentiering mellem levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter. Derfor er der udviklet en procedure til at mærke levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter samtidigt i hjernesektioner, hvilket letter observation ved hjælp af et konfokalmikroskop med høj opløsning.
Abstract
Pericytter er afgørende vægmalerier beliggende i cerebral mikrocirkulation, afgørende for aktivt modulerende cerebral blodgennemstrømning via kontraktilitetsjusteringer. Konventionelt måles deres kontraktilitet ved at observere morfologiske skift og nærliggende kapillærdiameterændringer under specifikke omstændigheder. Alligevel bliver postvævsfiksering, evaluering af vitalitet og efterfølgende pericytkontraktilitet af afbildede hjernepericytter kompromitteret. På samme måde er genetisk mærkning af hjernepericytter kort i at skelne mellem levedygtige og ikke-levedygtige pericytter, især i neurologiske tilstande som subaraknoid blødning (SAH), hvor vores foreløbige undersøgelse validerer hjernens pericytdød. En pålidelig protokol er blevet udtænkt for at overvinde disse begrænsninger, hvilket muliggør samtidig fluorescerende mærkning af både funktionelle og ikke-funktionelle hjernepericytter i hjernesektioner. Denne mærkningsmetode tillader højopløsnings konfokal mikroskopvisualisering, samtidig med at hjerneskivens mikrovaskulatur markeres. Denne innovative protokol giver et middel til at vurdere hjernens pericytkontraktilitet, dens indvirkning på kapillærdiameter og pericytstruktur. Undersøgelse af hjernens pericytkontraktilitet inden for SAH-konteksten giver indsigtsfuld forståelse af dens virkninger på cerebral mikrocirkulation.
Introduction
Hjernepericytter, kendetegnet ved deres slanke fremspring og fremspringende cellelegemer, omkranser mikrocirkulationen 1,2. Mens cerebral blodgennemstrømningsforøgelse overvejende drives af kapillær udvidelse, udviser mindre arterier langsommere dilatationshastigheder3. Pericytkontraktilitet udøver indflydelse på kapillærdiameter og pericytmorfologi, hvilket påvirker vaskulær dynamik4. Sammentrækning af hjernepericytter fører til kapillær indsnævring, og i patologiske scenarier kan overdreven sammentrækning hæmme erytrocytstrømmen5. Forskellige faktorer, herunder noradrenalin frigivet fra locus coeruleus, kan fremkalde hjernepericytkontraktion inden for kapillærer6. Med en regulerende rolle i cerebral blodgennemstrømning udviser pericytter 20-HETE-syntese, der tjener som en iltføler under hyperoxia7. Oxidativ-nitrativ stress-udløst sammentrækning af hjernens pericytter påvirker kapillærerne negativt5. På trods af både in vivo- og ex vivo-undersøgelser af hjernens pericytkontraktion 8 er der fortsat begrænset viden om billeddannelse af levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter i hjerneskiver.
Det er afgørende, at billeddannelse efter vævsfiksering af hjernens pericytter kompromitterer deres vitalitet og efterfølgende kontraktilitetsvurdering. Desuden kan transgen mærkning af hjernepericytter i scenarier som neurologiske lidelser (f.eks. Subaraknoid blødning - SAH) ikke skelne mellem levedygtige og ikke-levedygtige pericyter, som bekræftet af vores foreløbige SAH-inducerede hjernepericytdødsundersøgelse9.
For at overvinde disse udfordringer anvendte vi TO-PRO-3 til at mærke levende pericytter, mens afdøde blev farvet med propidiumiodid (PI). Vi brugte konfokale billeddannelsesteknologier med høj opløsning til at visualisere levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter i hjerneskiver, samtidig med at skiveaktiviteten bevares under billeddannelsen. Denne artikel har til formål at præsentere en reproducerbar metode til billeddannelse af levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter i hjerneskiver, der tjener som et værdifuldt værktøj til at undersøge virkningen af hjernepericytter på cerebral mikrocirkulation efter SAH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den eksperimentelle protokol blev godkendt af Animal Ethics and Use Committee of Kunming Medical University (kmmu20220945). Sprague-Dawley (SD) rotter af begge køn, 300-350 g, blev anvendt til denne undersøgelse.
1. Inducering af SAH-modellen
- Bedøv rotterne med 2% isofluran og 100% ilt. Oprethold anæstesi ved at levere kontinuerlig inhalationsanæstesi med isofluran (1% -3%). Fastgør rottens hoved ved hjælp af et stereotaksisk apparat (se materialetabel).
- Opret SAH-modellen ved at følge nedenstående trin.
- Indsæt en mikroinjektionsnål i suprasellar cisternen. Derefter injiceres autologt blod fra rottens halearterie (uden antikoagulant) i suprasellar cisterne ved hjælp af en sprøjtepumpe (se materialetabel).
- Implanter en mikroinjektionsnål i højre laterale cerebrale ventrikel ved hjælp af de nævnte koordinater: bregma, -0,8 mm; lateral, 1,4 mm; dybde, 4 mm9. For SAH-grupper injiceres 0,2 ml rottehalearterieblod. For skingrupper administreres det samme volumen isotonisk saltvand (figur 1A).
2. Forberedelse og stabilisering af hjerneskive
- Bedøvelse af rotterne dybt ved hjælp af 2% isofluranindånding. Efter halshugning ekstraheres hele hjernen og nedsænkes i iskold kunstig cerebrospinalvæske (ACSF).
BEMÆRK: Brug frisklavede ACSF-opløsninger med følgende sammensætning: 134 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1,1 mM NaH 2 PO 4, 1,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2 og 10,11 mM D-glucose (se materialetabel). Oprethold en pH-værdi mellem 7,3 og 7,4. - Brug et vibratomt (se materialetabel) til at forberede akutte hjerneskiver med en tykkelse på 200 μm fra SD-rotterne i iskold ACSF, der luftes med 5% CO 2 og 95%O2 (figur 2).
- Placer de 200 μm tykke akutte hjerneskiver i et opbevaringskammer på et nylonnet nedsænket i ACSF. ACSF-opløsningen afbalanceres med 95 %O2 og 5 % CO2, idet der opretholdes et temperaturområde på 35-37 °C. Lad hjerneskiverne stabilisere sig i 2 timer, hvilket giver dem tid til at justere (figur 3).
3. Mærkning af pericytter i akutte hjerneskiver med TO-PRO-3
BEMÆRK: Pericytter fra akutte hjerneskiver blev fluorescerende mærket ved hjælp af sporstoffet TO-PRO-310.
- Der tilsættes fluorescerende farvestof TO-PRO-3 til ACSF, hvorved der opnås en slutkoncentration på 1 μM. De akutte hjerneskiver inkuberes ved stuetemperatur i mørke omgivelser med den TO-PRO-3-holdige ACSF i 20 minutter.
BEMÆRK: Husk at bære latexhandsker, når du håndterer TO-PRO-3 for beskyttelse. - Overfør nylonnetsilen, der bærer hjerneskiverne, fra påfyldningskammeret til et 6-brønds pladeskylningskammer (se materialetabel). Lad hjerneskiverne blive i skyllekammeret i 10 minutter (figur 4D).
BEMÆRK: Dette skylletrin afslutter farvningsprocessen, reducerer baggrundsmærkning og forhindrer uspecifik farvning. - Skyl præparaterne i alt 15 minutter med ACSF-opløsning, der er ekvilibreret med en blanding af 5% CO2 og 95%O2. Dette skylletrin stopper farvestofoptagelsen og minimerer baggrundsmærkning (figur 4C).
4. Farvning af ikke-vitale pericytter af cerebral mikrocirkulation i akutte hjerneskiver
- Inkuber hjerneskiver forudindlæst med TO-PRO-3 ved 37 °C med isolectin B4 konjugeret med Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/ml, se materialetabel) i 30 minutter i mørke omgivelser. Efter inkubation skylles hjerneskiverne i 15 minutter i ACSF (figur 4E).
- Inkuber hjerneskiverne i ACSF gasset med 5% CO 2 og 95% O2 som normalt. Der tilsættes propidiumiodid (PI) i en koncentration på 37 μM til begge opløsninger ved 37 °C. Dette vil mærke ikke-vitale hjernepericytter. Inkuber præparaterne i denne ACSF-opløsning i 60 minutter i mørke (figur 4F).
- Skyl derefter præparaterne i 15 minutter med ACSF-opløsninger for at standse farvestofoptagelsen og minimere baggrundsmærkning.
5. Billeddannelse af vitale og ikke-vitale hjernepericytter i akutte hjerneskiver
- Overfør forsigtigt hjerneskiver til konfokale skåle med glasbund (se materialetabel) ved hjælp af Pasteur-pipetter af plast. Fyld opvasken med ACSF-opløsning, der tidligere er ekvilibreret med 5% CO2 og 95%O2. Brug et jernnet til at sikre rottehjerneskiver på plads.
- Overfør glasbunden konfokale skåle til scenen af et konfokalmikroskop. Placer den akutte hjerneskive i bunden af skålen og perfus9 den med ACSF-opløsning ekvilibreret med en blanding af 95%O2 og 5% CO2 under konfokal mikroskopibilleddannelse (figur 5A og figur 5Ab').
- Visualiser vægcellerne i den cerebrale kortikale mikrovaskulatur ved hjælp af et 40x mål. Tag billedstakke ved hjælp af kompatibel software (se Materialetabel). Brug passende filtre til IB4 (excitation/emission 460 nm/520 nm), PI (excitation/emission 545 nm/595 nm) og TO-PRO-3 (excitation/emission 606 nm/666 nm) (figur 5D).
BEMÆRK: Tag billeder med følgende detaljer: 40× DIC N1-objektivobjektiv, 3 × 12 bit: 512 × 512 pixels (0,22 × 0,22 mm), kalibrering: 0,42 μm / px. - Identificer cerebral mikrovaskulatur og pericytter baseret på deres netværk og morfologi. Find en bestemt region, der indeholder et cerebralt mikrovaskulaturnetværk på hver hjerneskive og tag billeder.
- Bemærk omhyggeligt billeddannelsesstedet for at sikre konsistens i efterfølgende optagelser (figur 5B,C). For yderligere behandling og analyse skal du bruge billedanalysesoftware (ImageJ) og fotoredigeringssoftware (se materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under normale fysiologiske forhold gennemgår hjernens pericytter generelt ikke celledød. Figur 6 illustrerer dette fænomen, hvor gul angiver tilstedeværelsen af vitale hjernepericytter; hjernepericytter viser ingen farvning med PI, hvilket indikerer deres levedygtighed. For yderligere at undersøge, om pericytter forbliver knyttet til mikrovaskulaturen efter celledød, blev metoder anvendt i en SAH-rottemodel, og efterfølgende billeddannelse blev udført.
Metoder til billeddannelse af både vitale og ikke-vitale hjernepericytter i hjerneskiver efter SAH er blevet udviklet. Som afbildet i figur 7 er vitale hjernepericytter (blå pile) placeret inden for mikrovaskulaturen, mens ikke-vitale hjernepericytter er repræsenteret af hvide pile. Denne samtidige visualisering gør det muligt at identificere både vitale og ikke-vitale hjernepericytter i hjerneskiver. Desuden blev det observeret, at PI-mærkede ikke-vitale hjernepericytter forblev fastgjort til hele mikrovaskulaturen.
Figur 1: SAH-model . (A) Rottens hoved var solidt fastgjort til stereotaksapparatet for at sikre stabilitet. SAH-modellen blev induceret ved omhyggeligt at indsætte en stereotaksisk nål i suprasellar cisternen. (B,C) I SAH-modellen kommer blod ind i det subaraknoidrum i kraniet, der påvirker hjernen. De cerebrale halvkugler fyldes med blod ca. 24 timer efter SAH. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Akut forberedelse af hele hjerneskiven . (A) Det nederste kammer blev belagt med agaroselim til fiksering. (B) Limen blev omhyggeligt påført det nederste kammer for at klæbe fast til hjernen. (C) Den omgivende tank blev fyldt med iskold ACSF for at opretholde temperaturen. (D) Den ønskede sektionstykkelse blev omhyggeligt defineret. (E, F). Hjerneskiverne blev omhyggeligt overført til en 6-brønds plade. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Overfør pipetter og farvelægning i en plade med 6 huller. (A) Akutte hjerneskiver blev overført ved hjælp af plastiske Pasteur-pipetter (3 ml). Længden af pipetten i litra a) var 18,2 cm. For (b) og (c) blev den fine spids af Pasteur-pipetten af plast omhyggeligt trimmet for at forhindre enhver potentiel skade på hjerneskiverne under overførslen. 6-brøndspladerne blev effektivt overført fra (B) til (C) til fluorescensfarvning i et 37 °C vandbad. (B) En brønd på 6-brøndspladen rummede en lille nylonnetsil med fine slanger placeret til gastilførsel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Inkubation af akutte hjerneskiver. En systematisk procedure blev omhyggeligt fulgt for at mærke pericytter med TO-PRO-3 i de akutte hjerneskiver. (A) Indledningsvis blev en brønd i en plade med seks brønde (12 × 8 cm) fyldt med 10 ml ACSF, hvilket sikrede korrekt beluftning ved at boble opløsningen ved hjælp af fine slanger forbundet med en blanding af 95%O2 og 5% CO2. (B) Derefter blev hjerneskiverne omhyggeligt overført til seksbrøndpladen. (C) 10 μL af TO-PRO-3-stamopløsningen blev indført i farvelægningskammeret, forsigtigt omrørt for at lette farvestofopløsning (D). (E,F) For yderligere at karakterisere hjerneskiverne blev farvning med IB4 (1 μM i ACSF) og PI (1 μM i ACSF) udført. Disse sekventielle trin muliggjorde en vellykket mærkning af pericytter med TO-PRO-3 i akutte hjerneskiver, hvilket letter efterfølgende analyse og undersøgelse af de mærkede hjernepericytter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Billeddannelse af vitale og ikke-vitale hjernepericytter i hjerneskiver. (A) Opløsningen er ekvilibreret med en blanding af 95%O2 og 5% CO2 leveret gennem slangen. (B-E) Opsætning til billeddannelse i høj opløsning af TO-PRO-3-mærkede, IB4-mærkede endotel- og PI-mærkede celler i akutte hjerneskiver. E) Konfokal mikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Billede af vitale hjernepericytter i hjerneskiver. (A) Cerebral mikrovaskulatur blev mærket med IB4 (grøn). (B) Ikke-vitale celler blev mærket med PI. (C) Vitale pericytter blev mærket med TO-PRO-3 (gul). (D) Det flettede billede vises. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Repræsentativt billede af vitale og ikke-vitale hjernepericytter i en hjerneskive efter SAH. (A) Cerebral mikrovaskulatur blev mærket med IB4 (grøn). (B) Ikke-vitale celler blev mærket med PI (rød). (C) Vitale pericytter blev mærket med TO-PRO-3 (gul). (D) Det flettede billede vises. Blå pile angiver eksempler på vitale hjernepericytter, mens hvide pile angiver eksempler på ikke-vitale hjernepericytter. Især stikker kernerne af pericytter ikke ud over den mikrovaskulære overflade. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Positiv korrelation mellem antallet af ikke-vitale pericytter og tiden efter SAH. Højopløselig konfokal billeddannelse blev anvendt til at fange hjernepericytter på forskellige tidspunkter efter SAH. Mærkbar celledød af hjernens pericytter begyndte 6 timer efter SAH, som angivet med hvide pile i (A). Derefter var der en betydelig stigning i pericytdød fra 6 timers mærket og fremefter. Antallet af ikke-vitale pericytter viste en positiv korrelation med den tid, der gik efter SAH, som afbildet i (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udviklet er højopløselige konfokale billeddannelsesteknikker til visualisering af vitale hjernepericytter, ikke-vitale hjernepericytter og mikrovaskulaturen i hjerneskiver. I akutte rottehjerneskiver indebærer processen indledende mærkning af pericytter med TO-PRO-311 efterfulgt af mikrovaskulære endotelceller med IB412; efterfølgende udføres identifikation af afdøde pericytter ved hjælp af PI. Denne protokol er ligetil, reproducerbar og yderst anvendelig til funktionel forskning.
For specifikt at spore hjernepericytter i nervesystemet anvendes den langt røde fluorofor TO-PRO-3. Mens TO-PRO-3 overvejende pletter kernerne i fast væv13, inkorporerer det selektivt i levende pericytter ex vivo, når det anvendes i fysiologisk saltvand14. Tidligere undersøgelser har bekræftet den entydige identifikation af murine hjernepericytter ved hjælp af TO-PRO-315. Denne fluorofor mærker effektivt vitale hjernepericytter11. I modsætning hertil fungerer PI, en almindeligt anvendt ladet fluorochrom til vurdering af cellelevedygtighedi realtid 12, som en markør for forringede celler, når de påføres før fiksering (præfiksering PI-farvning)16. Da pericytternes morfologiske egenskaber, især deres kerner, imidlertid ikke strækker sig over den mikrovaskulære overflade, kan det være udfordrende at skelne mellem endotel- og pericytkerner ved hjælp af PI-farvning, som angivet med den hvide pil i figur 8A. Undersøgelser, der involverer elektronmikroskopi til tredimensionel rekonstruktion af CA1-regionen i rottehippocampus, har antydet, at ca. en tredjedel af endotelet er dækket af somas og processer af pericytter17.
I figur 6 observeres hjernepericytter mærket med TO-PRO-3 inden for mikrovaskulaturen. Konfokale billeder af cerebral mikrovaskulatur mærket med IB4 og PI afslører, at kun få celler gennemgår celledød under sektionsprocessen, som det fremgår af fraværet af PI-positive døde celler i figur 6. Derfor bruges SAH-modellen til at undersøge tilstedeværelsen af ikke-vitale pericytter. Figur 7 illustrerer, at celledød inden for hjerneskiver er mere fremtrædende i pericytter sammenlignet med endotelceller. Derudover observeres i figur 8A en signifikant stigning i pericytdød startende 6 timer efter SAH. Figur 8B viser en positiv sammenhæng mellem antallet af ikke-vitale pericytter og den tid, der er gået efter SAH. Ikke desto mindre er en omfattende undersøgelse, der billeddanner både vitale og ikke-vitale hjernepericytter, ikke blevet dokumenteret efter den bedste viden.
I øjeblikket er det fortsat usikkert, om pericytter fra andre arter eller systemer (f.eks. Hjerte, tyndtarm) også manifesterer vitale og ikke-vitale tilstande i akutte skiver efter SAH. Afslutningsvis tilbyder den medfølgende protokol en replikerbar tilgang til billeddannelse af både vitale og ikke-vitale hjernepericytter i hjerneskiver efter SAH. På grund af sin enkelhed og pålidelighed kan denne teknik anvendes til at afsløre den funktionelle og strukturelle mangfoldighed af pericytter i hjerneskiver og lette detaljerede cellulære undersøgelser i forskellige sygdomsmodeller relateret til pericytpatofysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223); Naturvidenskabsfonden i Yunnan-provinsen (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K.
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T.
- Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
- Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
- Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
- Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
