Summary
Die Voruntersuchung bestätigt, dass eine Subarachnoidalblutung (SAB) zum Absterben der Hirnperizyten führt. Die Beurteilung der Perizytenkontraktilität nach SAB erfordert eine Unterscheidung zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Hirnperizyten. Daher wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem lebensfähige und nicht lebensfähige Hirnperizyten gleichzeitig in Hirnschnitten markiert werden können, was die Beobachtung mit einem hochauflösenden konfokalen Mikroskop erleichtert.
Abstract
Perizyten sind wichtige Wandzellen, die sich in der zerebralen Mikrozirkulation befinden und für die aktive Modulation des zerebralen Blutflusses durch Kontraktilitätsanpassungen von entscheidender Bedeutung sind. Konventionell wird ihre Kontraktilität durch die Beobachtung morphologischer Verschiebungen und Änderungen des Kapillardurchmessers in der Nähe unter bestimmten Umständen gemessen. Die Fixierung nach dem Gewebe, die Bewertung der Vitalität und die anschließende Kontraktilität der abgebildeten Hirnperizyten werden jedoch beeinträchtigt. In ähnlicher Weise ist die genetische Markierung von Hirnperizyten nicht in der Lage, zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Perizyten zu unterscheiden, insbesondere bei neurologischen Erkrankungen wie Subarachnoidalblutungen (SAB), bei denen unsere vorläufige Untersuchung den Absterben von Hirnperizyten bestätigt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein zuverlässiges Protokoll entwickelt, das die gleichzeitige Fluoreszenzmarkierung von funktionellen und nicht-funktionellen Hirnperizyten in Hirnschnitten ermöglicht. Diese Markierungsmethode ermöglicht eine hochauflösende konfokale mikroskopische Visualisierung bei gleichzeitiger Markierung der Mikrogefäße des Hirnschnitts. Dieses innovative Protokoll bietet die Möglichkeit, die Kontraktilität der Gehirnperizyten, ihre Auswirkungen auf den Kapillardurchmesser und die Perizytenstruktur zu beurteilen. Die Untersuchung der Kontraktilität von Hirnperizyten im SAB-Kontext liefert ein aufschlussreiches Verständnis ihrer Auswirkungen auf die zerebrale Mikrozirkulation.
Introduction
Hirnperizyten, die sich durch ihre schlanken Ausstülpungen und hervorstehenden Zellkörper auszeichnen, umkreisen die Mikrozirkulation 1,2. Während die zerebrale Durchblutungsaugmentation überwiegend durch kapillare Dilatation angetrieben wird, weisen kleinere Arterien langsamere Dilatationsraten auf3. Die Kontraktilität der Perizyten übt einen Einfluss auf den Kapillardurchmesser und die Perizytenmorphologie aus und wirkt sich auf die Gefäßdynamik aus4. Die Kontraktion der Hirnperizyten führt zu einer Verengung der Kapillaren, und in pathologischen Szenarien kann eine übermäßige Kontraktion den Erythrozytenfluss behindern5. Verschiedene Faktoren, einschließlich Noradrenalin, das aus dem Locus coeruleus freigesetzt wird, können eine Kontraktion der Gehirnperizyten in den Kapillaren induzieren6. Perizyten spielen eine regulatorische Rolle im zerebralen Blutfluss und zeigen eine 20-HETE-Synthese, die als Sauerstoffsensor während der Hyperoxie7 dient. Die durch oxidativ-nitrativen Stress ausgelöste Kontraktion der Hirnperizyten wirkt sich nachteilig auf die Kapillaren aus5. Trotz In-vivo- und Ex-vivo-Untersuchungen zur Hirnperizytenkontraktion8 ist das Wissen über die Bildgebung von lebensfähigen und nicht-lebensfähigen Hirnperizyten in Hirnschnitten nach wie vor begrenzt.
Entscheidend ist, dass die Bildgebung der Hirnperizyten nach der Gewebefixierung deren Vitalität und die anschließende Beurteilung der Kontraktilität beeinträchtigt. Darüber hinaus kann in Szenarien wie neurologischen Störungen (z. B. Subarachnoidalblutung - SAB) bei der transgenen Markierung von Hirnperizyten nicht zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Perizyten unterschieden werden, wie unsere vorläufige SAB-induzierte Hirnperizytentodstudie9 bestätigt.
Um diese Herausforderungen zu meistern, setzten wir TO-PRO-3 zur Markierung lebender Perizyten ein, während verstorbene mit Propidiumiodid (PI) gefärbt wurden. Wir verwendeten hochauflösende konfokale Bildgebungstechnologien, um lebensfähige und nicht lebensfähige Hirnperizyten in Hirnschnitten zu visualisieren und gleichzeitig die Schichtaktivität während der Bildgebung zu erhalten. Dieser Artikel zielt darauf ab, eine reproduzierbare Methode zur Darstellung lebensfähiger und nicht lebensfähiger Hirnperizyten in Hirnschnitten vorzustellen, die als wertvolles Werkzeug dient, um den Einfluss von Hirnperizyten auf die zerebrale Mikrozirkulation nach SAB zu untersuchen.
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Protocol
Das Versuchsprotokoll wurde von der Kommission für Tierethik und -verwendung der Medizinischen Universität Kunming genehmigt (kmmu20220945). Für die vorliegende Studie wurden Sprague-Dawley (SD)-Ratten beiderlei Geschlechts, 300-350 g, verwendet.
1. Induktion des SAB-Modells
- Betäuben Sie die Ratten mit 2 % Isofluran und 100 % Sauerstoff. Aufrechterhaltung der Anästhesie durch kontinuierliche Inhalationsanästhesie mit Isofluran (1%-3%). Befestigen Sie den Kopf der Ratte mit einem stereotaktischen Gerät (siehe Materialtabelle).
- Erstellen Sie das SAH-Modell, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Führen Sie eine Mikroinjektionsnadel in den suprasellaren Spülkasten ein. Anschließend wird Eigenblut aus der Rattenschwanzarterie (ohne Antikoagulans) mit einer Spritzenpumpe in die suprasellare Zisterne injiziert (siehe Materialtabelle).
- Implantieren Sie eine Mikroinjektionsnadel in den rechten lateralen Hirnventrikel mit den genannten Koordinaten: bregma, −0,8 mm; seitlich, 1,4 mm; Tiefe, 4 mm9. Für SAB-Gruppen injizieren Sie 0,2 ml Blut aus der Rattenschwanzarterie. Bei Scheingruppen wird die gleiche Menge isotonischer Kochsalzlösung verabreicht (Abbildung 1A).
2. Präparation und Stabilisierung von Hirnschnitten
- Die Ratten werden mit einer Inhalation von 2 % Isofluran tief betäubt. Nach der Enthauptung wird das gesamte Gehirn entnommen und in eiskaltes künstliches Liquor cerebrospinalis (ACSF) getaucht.
HINWEIS: Verwenden Sie frisch zubereitete ACSF-Lösungen mit der folgenden Zusammensetzung: 134 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1,1 mM NaH 2 PO 4, 1,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl 2und 10,11 mM D-Glucose (siehe Materialtabelle). Halten Sie einen pH-Wert zwischen 7,3 und 7,4 aufrecht. - Verwenden Sie ein Vibratom (siehe Materialtabelle), um akute Hirnschnitte mit einer Dicke von 200 μm von den SD-Ratten in eiskaltem ACSF herzustellen, das mit 5 % CO 2 und 95 % O2 belüftet ist (Abbildung 2).
- Legen Sie die 200 μm dicken akuten Hirnschnitte in eine Vorratskammer auf ein Nylonnetz, das in ACSF getaucht ist. Die ACSF-Lösung wird mit 95 % O2 und 5 %CO2 in einem Temperaturbereich von 35-37 °C ausgeglichen. Lassen Sie die Gehirnschnitte 2 Stunden lang stabilisieren, damit sie sich anpassen können (Abbildung 3).
3. Markierung von Perizyten in akuten Hirnschnitten mit TO-PRO-3
HINWEIS: Perizyten aus akuten Hirnschnitten wurden mit dem Tracer TO-PRO-310 fluoreszenzmarkiert.
- Der Fluoreszenzfarbstoff TO-PRO-3 wird mit dem ACSF versetzt, so dass eine Endkonzentration von 1 μM erreicht wird. Inkubieren Sie die akuten Hirnschnitte bei Raumtemperatur in dunkler Umgebung mit dem TO-PRO-3-haltigen ACSF für 20 min.
HINWEIS: Denken Sie daran, Latexhandschuhe zu tragen, wenn Sie TO-PRO-3 zum Schutz handhaben. - Das Nylongewebesieb mit den Hirnschnitten aus der Ladekammer in eine 6-Well-Plattenspülkammer überführen (siehe Materialtabelle). Lassen Sie die Hirnschnitte 10 Minuten in der Spülkammer verbleiben (Abbildung 4D).
HINWEIS: Dieser Spülschritt beendet den Färbeprozess, verringert die Hintergrundbeschriftung und verhindert unspezifische Flecken. - Spülen Sie die Präparate insgesamt 15 Minuten lang mit einer ACSF-Lösung, die mit einer Mischung aus 5 %CO2 und 95 %O2 äquilibriert ist. Dieser Spülschritt stoppt die Farbstoffaufnahme und minimiert die Hintergrundmarkierung (Abbildung 4C).
4. Färbung nicht-vitaler Perizyten der zerebralen Mikrozirkulation in akuten Hirnschnitten
- Inkubieren Sie Gehirnschnitte, die mit TO-PRO-3 vorgeladen sind, bei 37 °C mit Isolektin B4, konjugiert mit Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/ml, siehe Materialtabelle) für 30 Minuten in einer dunklen Umgebung. Nach der Inkubation werden die Hirnschnitte 15 Minuten lang in ACSF gespült (Abbildung 4E).
- Inkubieren Sie die Hirnschnitte wie üblich in ACSF, das mit 5 % CO2 und 95 %O2 vergast ist. Propidiumiodid (PI) in einer Konzentration von 37 μM wird zu beiden Lösungen bei 37 °C gegeben. Dadurch werden nicht-vitale Hirnperizyten markiert. Die Präparate werden in dieser ACSF-Lösung 60 Minuten lang im Dunkeln inkubiert (Abbildung 4F).
- Als nächstes spülen Sie die Präparate 15 Minuten lang mit ACSF-Lösungen, um die Farbstoffaufnahme zu stoppen und die Hintergrundmarkierung zu minimieren.
5. Bildgebung vitaler und nicht-vitaler Hirnperizyten in akuten Hirnschnitten
- Die Gehirnschnitte werden vorsichtig mit Pasteurpipetten aus Kunststoff in konfokale Schalen mit Glasboden (siehe Materialtabelle) übertragen. Füllen Sie die Schalen mit ACSF-Lösung, die zuvor mit 5 % CO2 und 95 %O2 äquilibriert wurde. Verwende ein Eisengitter, um Rattenhirnschnitte an Ort und Stelle zu befestigen.
- Übertragen Sie die konfokalen Glasbodenschalen auf den Tisch eines konfokalen Mikroskops. Positionieren Sie den akuten Hirnschnitt am Boden der Schale und perfundiertieren Sie ihn9 mit einer ACSF-Lösung, die mit einer Mischung aus 95 % O2 und 5 %CO2 während der konfokalen mikroskopischen Bildgebung äquilibriert ist (Abbildung 5A und Abbildung 5Ab').
- Visualisieren Sie die Wandzellen der zerebralen kortikalen Mikrogefäße mit einem 40-fachen Objektiv. Erfassen Sie Bildstapel mit kompatibler Software (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie geeignete Filter für IB4 (Anregung/Emission 460 nm/520 nm), PI (Anregung/Emission 545 nm/595 nm) und TO-PRO-3 (Anregung/Emission 606 nm/666 nm) (Abbildung 5D).
HINWEIS: Nehmen Sie Bilder mit den folgenden Details auf: 40× DIC N1 Objektiv, 3 × 12 Bit: 512 × 512 Pixel (0,22 × 0,22 mm), Kalibrierung: 0,42 μm/px. - Identifizierung von zerebralen Mikrogefäßen und Perizyten anhand ihres Netzwerks und ihrer Morphologie. Lokalisieren Sie eine bestimmte Region, die ein zerebrales Mikrogefäßsystem auf jedem Hirnschnitt enthält, und nehmen Sie Bilder auf.
- Notieren Sie sich sorgfältig den Aufnahmeort, um die Konsistenz bei nachfolgenden Aufnahmen sicherzustellen (Abbildung 5B,C). Verwenden Sie für die weitere Verarbeitung und Analyse eine Bildanalysesoftware (ImageJ) und eine Bildbearbeitungssoftware (siehe Materialtabelle).
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Representative Results
Unter normalen physiologischen Bedingungen erleiden Hirnperizyten in der Regel keinen Zelltod. Abbildung 6 veranschaulicht dieses Phänomen, wobei Gelb das Vorhandensein lebenswichtiger Hirnperizyten anzeigt. Die Perizyten des Gehirns zeigen keine Färbung mit PI, was auf ihre Lebensfähigkeit hinweist. Um weiter zu untersuchen, ob Perizyten nach dem Zelltod an das Mikrogefäßsystem gebunden bleiben, wurden Methoden in einem SAH-Rattenmodell eingesetzt und anschließend eine Bildgebung durchgeführt.
Es wurden Methoden entwickelt, mit denen sowohl vitale als auch nicht-vitale Hirnperizyten in Hirnschnitten nach SAB dargestellt werden können. Wie in Abbildung 7 dargestellt, befinden sich lebenswichtige Hirnperizyten (blaue Pfeile) innerhalb des Mikrogefäßsystems, während nicht-vitale Hirnperizyten durch weiße Pfeile dargestellt werden. Diese gleichzeitige Visualisierung ermöglicht die Identifizierung von vitalen und nicht-vitalen Hirnperizyten innerhalb von Hirnschnitten. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass PI-markierte nicht-vitale Hirnperizyten an das gesamte Mikrogefäßsystem gebunden blieben.
Abbildung 1: SAB-Modell . (A) Der Kopf der Ratte war fest mit dem stereotaktischen Apparat verbunden, um die Stabilität zu gewährleisten. Das SAB-Modell wurde durch vorsichtiges Einführen einer stereotaktischen Nadel in die suprasellare Zisterne induziert. (B,C) Im SAB-Modell tritt Blut in den Subarachnoidalraum des Schädels ein und wirkt sich auf das Gehirn aus. Die Gehirnhälften füllen sich ca. 24 Stunden nach der SAB mit Blut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Akute Präparation des gesamten Hirnschnitts . (A) Die untere Kammer wurde zur Fixierung mit Agarose-Kleber beschichtet. (B) Der Klebstoff wurde sorgfältig auf die untere Kammer aufgetragen, um fest am Gehirn zu haften. (C) Der umgebende Tank wurde mit eiskaltem ACSF gefüllt, um die Temperatur zu halten. (D) Die gewünschte Querschnittsdicke wurde sorgfältig definiert. (E,F). Die Hirnschnitte wurden akribisch auf eine 6-Well-Platte übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Transferpipetten und Farbstoffbeladung in einer 6-Well-Platte. (A) Akute Hirnschnitte wurden mit Pasteurpipetten aus Kunststoff (3 ml) übertragen. Die Länge der in (a) verwendeten Pipette betrug 18,2 cm. Für (b) und (c) wurde die feine Spitze der Pasteurpipette aus Kunststoff vorsichtig gekürzt, um eine mögliche Beschädigung der Hirnschnitte während des Transfers zu vermeiden. Die 6-Well-Platten wurden für die Fluoreszenzfärbung in einem 37 °C warmen Wasserbad effizient von (B) auf (C) umgestellt. (B) Eine Vertiefung der 6-Well-Platte enthielt ein kleines Nylongewebesieb mit feinen Schläuchen, die für die Gaszufuhr positioniert waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Inkubation von akuten Hirnschnitten. Ein systematisches Verfahren wurde akribisch befolgt, um Perizyten mit TO-PRO-3 in den akuten Hirnschnitten zu markieren. (A) Zunächst wurde eine Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen (12 × 8 cm) mit 10 ml ACSF gefüllt, wobei eine ordnungsgemäße Belüftung sichergestellt wurde, indem die Lösung unter Verwendung eines feinen Schlauchs, der mit einem Gemisch aus 95 %O2 und 5 %CO2 verbunden war, aufgeblasen wurde. (B) Anschließend wurden die Hirnschnitte akribisch auf die Sechs-Well-Platte übertragen. (C) 10 μl der TO-PRO-3-Stammlösung wurden unter leichtem Rühren in die Farbstoffladekammer gegeben, um die Farbstoffauflösung zu erleichtern (D). (E,F) Zur weiteren Charakterisierung der Hirnschnitte wurde eine Färbung mit IB4 (1 μM in ACSF) und PI (1 μM in ACSF) durchgeführt. Diese sequentiellen Schritte ermöglichten die erfolgreiche Markierung von Perizyten mit TO-PRO-3 in akuten Hirnschnitten und erleichterten so die anschließende Analyse und Untersuchung der markierten Hirnperizyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Bildgebung von vitalen und nicht-vitalen Hirnperizyten in Hirnschnitten. (A) Die Lösung wird mit einem Gemisch aus 95 %O2 und 5 %CO2 äquilibriert, das durch den Schlauch abgegeben wird. (B-E) Aufbau für die hochauflösende Bildgebung von TO-PRO-3-markierten, IB4-markierten endothelialen und PI-markierten Zellen in akuten Hirnschnitten. (E) Konfokale Mikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Bild vitaler Hirnperizyten in Hirnschnitten . (A) Die zerebrale Mikrovaskulatur wurde mit IB4 (grün) markiert. (B) Nicht-vitale Zellen wurden mit PI markiert. (C) Vitale Perizyten wurden mit TO-PRO-3 (gelb) markiert. (D) Das zusammengefügte Bild wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Repräsentatives Bild von vitalen und nicht-vitalen Hirnperizyten in einem Hirnschnitt nach SAB . (A) Die zerebrale Mikrovaskulatur wurde mit IB4 (grün) markiert. (B) Nicht-vitale Zellen wurden mit PI (rot) markiert. (C) Vitale Perizyten wurden mit TO-PRO-3 (gelb) markiert. (D) Das zusammengefügte Bild wird angezeigt. Blaue Pfeile zeigen Beispiele für lebenswichtige Hirnperizyten, während weiße Pfeile Beispiele für nicht-vitale Hirnperizyten anzeigen. Bemerkenswert ist, dass die Zellkerne der Perizyten nicht über die mikrovaskuläre Oberfläche hinausragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Positive Korrelation zwischen der Anzahl der nicht-vitalen Perizyten und der Zeit nach SAB. Hochauflösende konfokale Bildgebung wurde eingesetzt, um Hirnperizyten zu verschiedenen Zeitpunkten nach der SAB zu erfassen. Der auffällige Zelltod der Hirnperizyten begann 6 Stunden nach der SAB, wie durch weiße Pfeile in (A) angezeigt. In der Folge kam es ab der 6-Stunden-Marke zu einem deutlichen Anstieg des Perizytentodes. Die Anzahl der nicht-vitalen Perizyten zeigte eine positive Korrelation mit der Zeit, die nach der SAB verstrichen ist, wie in (B) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Es wurden hochauflösende konfokale Bildgebungsverfahren zur Visualisierung von vitalen Hirnperizyten, nicht-vitalen Hirnperizyten und der Mikrogefäße in Hirnschnitten entwickelt. In akuten Hirnschnitten von Ratten werden zunächst Perizyten mit TO-PRO-311 markiert, gefolgt von mikrovaskulären Endothelzellen mit IB412; Anschließend erfolgt die Identifizierung der verstorbenen Perizyten mittels PI. Dieses Protokoll ist einfach, reproduzierbar und in hohem Maße anwendbar für die funktionelle Forschung.
Um Hirnperizyten innerhalb des Nervensystems gezielt aufzuspüren, wird der tiefrote Fluorophor TO-PRO-3 eingesetzt. Während TO-PRO-3 hauptsächlich die Kerne von fixiertem Gewebe13 färbt, wird es selektiv ex vivo in lebende Perizyten eingebaut, wenn es in physiologischer Kochsalzlösung angewendet wird14. Frühere Studien haben die eindeutige Identifizierung von murinen Hirnperizyten mit TO-PRO-3bestätigt 15. Dieser Fluorophor markiert effektiv lebenswichtige Hirnperizyten11. Im Gegensatz dazu dient PI, ein häufig verwendetes geladenes Fluorochrom für die Echtzeit-Beurteilung der Zellviabilität12, als Marker für sich verschlechternde Zellen, wenn es vor der Fixierung (PI-Färbung vor der Fixierung)16 aufgetragen wird. Da sich die morphologischen Merkmale der Perizyten, insbesondere ihrer Zellkerne, jedoch nicht über die mikrovaskuläre Oberfläche erstrecken, kann die Unterscheidung zwischen Endothel- und Perizytenkernen mittels PI-Färbung schwierig sein, wie durch den weißen Pfeil in Abbildung 8A angedeutet. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zur dreidimensionalen Rekonstruktion der CA1-Region des Ratten-Hippocampus deuten darauf hin, dass etwa ein Drittel des Endothels von den Somas und Fortsätzen der Perizyten bedeckt ist17.
In Abbildung 6 sind mit TO-PRO-3 markierte Hirnperizyten innerhalb des Mikrogefäßsystems zu sehen. Konfokale Bilder der zerebralen Mikrogefäße, die mit IB4 und PI markiert sind, zeigen, dass nur wenige Zellen während des Schnittprozesses den Zelltod erleiden, was durch das Fehlen von PI-positiven toten Zellen in Abbildung 6 belegt wird. Folglich wird das SAB-Modell verwendet, um das Vorhandensein von nicht-vitalen Perizyten zu untersuchen. Abbildung 7 zeigt, dass der Zelltod in Hirnschnitten in Perizyten stärker ausgeprägt ist als in Endothelzellen. Darüber hinaus wird in Abbildung 8A ein signifikanter Anstieg des Perizytentods ab 6 Stunden nach SAB beobachtet. Abbildung 8B zeigt eine positive Korrelation zwischen der Anzahl der nicht-vitalen Perizyten und der nach SAB verstrichenen Zeit. Dennoch ist eine umfassende Studie, die sowohl vitale als auch nicht-vitale Hirnperizyten abbildet, nach heutigem Kenntnisstand nicht dokumentiert.
Derzeit ist noch unklar, ob Perizyten aus anderen Spezies oder Systemen (z.B. Herz, Dünndarm) auch vitale und nicht-vitale Zustände in akuten Schnitten nach SAB manifestieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das bereitgestellte Protokoll einen replizierbaren Ansatz für die Bildgebung sowohl vitaler als auch nicht-vitaler Hirnperizyten in Hirnschnitten nach SAB bietet. Aufgrund ihrer Einfachheit und Zuverlässigkeit kann diese Technik eingesetzt werden, um die funktionelle und strukturelle Vielfalt von Perizyten in Hirnschnitten aufzudecken und detaillierte zelluläre Untersuchungen in verschiedenen Krankheitsmodellen im Zusammenhang mit der Pathophysiologie von Perizyten zu ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223) unterstützt; die Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
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