Summary
L'indagine preliminare conferma che l'emorragia subaracnoidea (SAH) provoca la morte dei periciti cerebrali. La valutazione della contrattilità dei periciti post-SAH richiede la differenziazione tra periciti cerebrali vitali e non vitali. Pertanto, è stata sviluppata una procedura per etichettare i periciti cerebrali vitali e non vitali contemporaneamente nelle sezioni cerebrali, facilitando l'osservazione utilizzando un microscopio confocale ad alta risoluzione.
Abstract
I periciti sono cellule murali cruciali situate all'interno della microcircolazione cerebrale, fondamentali per modulare attivamente il flusso sanguigno cerebrale attraverso aggiustamenti della contrattilità. Convenzionalmente, la loro contrattilità viene misurata osservando i cambiamenti morfologici e i cambiamenti del diametro capillare nelle vicinanze in circostanze specifiche. Tuttavia, la fissazione post-tissutale, la valutazione della vitalità e la conseguente contrattilità dei periciti cerebrali vengono compromessi. Allo stesso modo, l'etichettatura genetica dei periciti cerebrali non è in grado di distinguere tra periciti vitali e non vitali, in particolare in condizioni neurologiche come l'emorragia subaracnoidea (SAH), dove la nostra indagine preliminare convalida la morte dei periciti cerebrali. È stato messo a punto un protocollo affidabile per superare questi vincoli, consentendo l'etichettatura fluorescente simultanea di periciti cerebrali funzionali e non funzionali nelle sezioni cerebrali. Questo metodo di marcatura consente la visualizzazione al microscopio confocale ad alta risoluzione, marcando contemporaneamente la microvascolarizzazione della fetta di cervello. Questo protocollo innovativo offre un mezzo per valutare la contrattilità dei periciti cerebrali, il suo impatto sul diametro capillare e sulla struttura dei periciti. Lo studio della contrattilità dei periciti cerebrali all'interno del contesto SAH fornisce una comprensione approfondita dei suoi effetti sulla microcircolazione cerebrale.
Introduction
I periciti cerebrali, che si distinguono per le loro sottili protuberanze e corpi cellulari sporgenti, circondano il microcircolo 1,2. Mentre l'aumento del flusso sanguigno cerebrale è prevalentemente guidato dalla dilatazione capillare, le arterie più piccole mostrano tassi di dilatazione più lenti3. La contrattilità dei periciti esercita un'influenza sul diametro dei capillari e sulla morfologia dei periciti, influenzando la dinamica vascolare4. La contrazione dei periciti cerebrali porta alla costrizione capillare e, in scenari patologici, una contrazione eccessiva può ostacolare il flusso eritrocitario5. Vari fattori, tra cui la noradrenalina rilasciata dal locus coeruleus, possono indurre la contrazione dei periciti cerebrali all'interno dei capillari6. Con un ruolo regolatore nel flusso sanguigno cerebrale, i periciti mostrano la sintesi di 20-HETE, fungendo da sensore di ossigeno durante l'iperossia7. La contrazione dei periciti cerebrali innescata dallo stress ossidativo-nitrativo influisce negativamente sui capillari5. Nonostante le indagini sia in vivo che ex vivo sulla contrazione dei periciti cerebrali8, persistono conoscenze limitate per quanto riguarda l'imaging dei periciti cerebrali vitali e non vitali all'interno di fette di cervello.
Fondamentalmente, l'imaging post-fissazione tissutale dei periciti cerebrali compromette la loro vitalità e la successiva valutazione della contrattilità. Inoltre, in scenari come i disturbi neurologici (ad esempio, l'emorragia subaracnoidea - SAH), la marcatura transgenica dei periciti cerebrali non riesce a distinguere tra periciti vitali e non vitali, come confermato dal nostro studio preliminare sulla morte dei periciti cerebrali indotta da SAH9.
Per superare queste sfide, abbiamo impiegato TO-PRO-3 per marcare i periciti vivi, mentre quelli deceduti sono stati colorati con ioduro di propidio (PI). Abbiamo utilizzato tecnologie di imaging confocale ad alta risoluzione per visualizzare i periciti cerebrali vitali e non vitali nelle fette di cervello, preservando l'attività della fetta durante l'imaging. Questo articolo ha lo scopo di presentare un metodo riproducibile per l'imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello, fungendo da prezioso strumento per sondare l'impatto dei periciti cerebrali sulla microcircolazione cerebrale dopo SAH.
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Protocol
Il protocollo sperimentale è stato approvato dall'Animal Ethics and Use Committee della Kunming Medical University (kmmu20220945). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley (SD) di entrambi i sessi, 300-350 g.
1. Induzione del modello SAH
- Anestetizzare i ratti usando il 2% di isoflurano e il 100% di ossigeno. Mantenere l'anestesia somministrando un'anestesia inalatoria continua con isoflurano (1%-3%). Fissare la testa del ratto con un apparecchio stereotassico (vedi Tabella dei materiali).
- Creare il modello SAH attenendosi alla procedura riportata di seguito.
- Inserire un ago per microiniezione nella cisterna soprasellare. Quindi, iniettare sangue autologo dall'arteria caudale del ratto (senza anticoagulante) nella cisterna soprasellare utilizzando una pompa a siringa (vedere Tabella dei materiali).
- Impiantare un ago per microiniezione nel ventricolo cerebrale laterale destro utilizzando le coordinate menzionate: bregma, −0,8 mm; laterale, 1,4 mm; profondità, 4 mm9. Per i gruppi SAH, iniettare 0,2 mL di sangue dell'arteria caudale di ratto. Per i gruppi fittizi, somministrare lo stesso volume di soluzione fisiologica isotonica (Figura 1A).
2. Preparazione e stabilizzazione della fetta di cervello
- Anestetizzare in profondità i ratti usando l'inalazione di isoflurano al 2%. Dopo la decapitazione, estrarre l'intero cervello e immergerlo in liquido cerebrospinale artificiale ghiacciato (ACSF).
NOTA: Utilizzare soluzioni ACSF appena preparate con la seguente composizione: 134 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1,1 mM NaH 2 PO4, 1,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2e 10,11 mM D-Glucosio (vedere la tabella dei materiali). Mantenere un pH compreso tra 7,3 e 7,4. - Utilizzare un vibratomo (vedere la tabella dei materiali) per preparare fette di cervello acuto con uno spessore di 200 μm dai ratti SD in ACSF ghiacciato aerato con il 5% di CO 2 e il 95% di O 2 (Figura 2).
- Posizionare le fette di cervello acuto spesse 200 μm in una camera di conservazione su una rete di nylon immersa in ACSF. Equilibrare la soluzione ACSF con il 95% di O 2 e il 5% di CO2 mantenendo un intervallo di temperatura di 35-37 °C. Lasciare che le fette di cervello si stabilizzino per 2 ore, dando loro il tempo di adattarsi (Figura 3).
3. Marcatura dei periciti in fette di cervello acuto con TO-PRO-3
NOTA: I periciti provenienti da fette di cervello acuto sono stati marcati in fluorescenza utilizzando il tracciante TO-PRO-310.
- Aggiungere il colorante fluorescente TO-PRO-3 all'ACSF, ottenendo una concentrazione finale di 1 μM. Incubare le fette di cervello acuto a temperatura ambiente in un ambiente buio con l'ACSF contenente TO-PRO-3 per 20 minuti.
NOTA: Ricordarsi di indossare guanti in lattice durante la manipolazione di TO-PRO-3 per protezione. - Trasferire il filtro a rete di nylon, che trasporta le fette di cervello, dalla camera di carico a una camera di risciacquo a piastre a 6 pozzetti (vedi Tabella dei materiali). Lasciare che le fette di cervello rimangano nella camera di risciacquo per 10 minuti (Figura 4D).
NOTA: Questa fase di risciacquo termina il processo di colorazione, riduce l'etichettatura di fondo e previene le macchie non specifiche. - Risciacquare i preparati per un totale di 15 minuti utilizzando una soluzione di ACSF bilanciata con una miscela di 5% CO 2 e 95% O2 . Questa fase di risciacquo arresta l'assorbimento del colorante e riduce al minimo l'etichettatura di fondo (Figura 4C).
4. Colorazione dei periciti non vitali della microcircolazione cerebrale in fette di cervello acuto
- Incubare fette di cervello precaricate con TO-PRO-3 a 37 °C con isolectina B4 coniugata ad Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/mL, vedere la tabella dei materiali) per 30 minuti in un ambiente buio. Dopo l'incubazione, sciacquare le fette di cervello per 15 minuti in ACSF (Figura 4E).
- Incubare le fette di cervello in ACSF gassate con il 5% di CO 2 e il 95% di O2 come di consueto. Aggiungere ioduro di propidio (PI) a una concentrazione di 37 μM a entrambe le soluzioni a 37 °C. Questo etichetterà i periciti cerebrali non vitali. Incubare i preparati in questa soluzione di ACSF per 60 minuti al buio (Figura 4F).
- Successivamente, risciacquare i preparati per 15 minuti con soluzioni ACSF per arrestare l'assorbimento del colorante e ridurre al minimo l'etichettatura di fondo.
5. Imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette cerebrali acute
- Trasferire delicatamente le fette di cervello in piastre confocali con fondo di vetro (vedere Tabella dei materiali) utilizzando pipette Pasteur in plastica. Riempire le piastre con una soluzione di ACSF precedentemente bilanciata con il 5% di CO 2 e il 95% di O2 . Usa una rete di ferro per fissare le fette di cervello di ratto in posizione.
- Trasferire le piastre confocali con fondo di vetro sul tavolino di un microscopio confocale. Posizionare la fetta di cervello acuto sul fondo del piatto e perfonderla9 con una soluzione di ACSF bilanciata con una miscela di 95% O 2 e 5% CO2 durante l'imaging al microscopio confocale (Figura 5A e Figura 5Ab').
- Visualizza le cellule di parete della microvascolarizzazione corticale cerebrale utilizzando un obiettivo 40x. Acquisisci pile di immagini utilizzando un software compatibile (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare filtri appropriati per IB4 (eccitazione/emissione 460 nm/520 nm), PI (eccitazione/emissione 545 nm/595 nm) e TO-PRO-3 (eccitazione/emissione 606 nm/666 nm) (Figura 5D).
NOTA: Acquisire immagini con i seguenti dettagli: obiettivo DIC N1 da 40×, 3 × 12 bit: 512 × 512 pixel (0,22 × 0,22 mm), calibrazione: 0,42 μm/px. - Identificare la microvascolarizzazione cerebrale e i periciti in base alla loro rete e morfologia. Individua una regione specifica contenente una rete di microvascolarizzazione cerebrale su ogni fetta di cervello e acquisisci immagini.
- Annotare attentamente la posizione dell'imaging per garantire l'uniformità nelle acquisizioni successive (Figura 5B,C). Per ulteriori elaborazioni e analisi, utilizzare un software di analisi delle immagini (ImageJ) e un software di fotoritocco (vedere la tabella dei materiali).
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Representative Results
In condizioni fisiologiche normali, i periciti cerebrali generalmente non subiscono la morte cellulare. La figura 6 illustra questo fenomeno, con il giallo che indica la presenza di periciti cerebrali vitali; I periciti cerebrali non mostrano alcuna colorazione con PI, indicando la loro vitalità. Per indagare ulteriormente se i periciti rimangono attaccati alla microvascolarizzazione dopo la morte cellulare, sono stati impiegati metodi in un modello di ratto SAH e sono state condotte successive imaging.
Sono stati sviluppati metodi per l'imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello dopo SAH. Come illustrato nella Figura 7, i periciti cerebrali vitali (frecce blu) si trovano all'interno della microvascolarizzazione, mentre i periciti cerebrali non vitali sono rappresentati da frecce bianche. Questa visualizzazione simultanea consente l'identificazione di periciti cerebrali vitali e non vitali all'interno di fette di cervello. Inoltre, è stato osservato che i periciti cerebrali non vitali marcati con PI sono rimasti attaccati all'intera microvascolarizzazione.
Figura 1: Modello SAH . (A) La testa del ratto è stata saldamente fissata all'apparato stereotassico per garantirne la stabilità. Il modello SAH è stato indotto inserendo con cautela un ago stereotassico nella cisterna soprasellare. (B,C) Nel modello SAH, il sangue entra nello spazio subaracnoideo all'interno del cranio, colpendo il cervello. Gli emisferi cerebrali si riempiono di sangue circa 24 ore dopo la SAH. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione acuta di una fetta di cervello intero . (A) La camera inferiore è stata rivestita con colla di agarosio per il fissaggio. (B) La colla è stata meticolosamente applicata alla camera inferiore per aderire saldamente al cervello. (C) Il serbatoio circostante è stato riempito con ACSF ghiacciato per mantenere la temperatura. (D) Lo spessore della sezione desiderata è stato accuratamente definito. (E,F). Le fette di cervello sono state meticolosamente trasferite su una piastra a 6 pozzetti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Pipette di trasferimento e caricamento del colorante in una piastra a 6 pozzetti. (A) Le fette di cervello acuto sono state trasferite utilizzando pipette di plastica Pasteur (3 ml). La lunghezza della pipetta utilizzata in (a) era di 18,2 cm. Per (b) e (c), la punta sottile della pipetta di plastica Pasteur è stata accuratamente tagliata per evitare potenziali danni alle fette di cervello durante il trasferimento. Le piastre a 6 pozzetti sono state spostate in modo efficiente da (B) a (C) per la colorazione a fluorescenza in un bagno d'acqua a 37 °C. (B) Un pozzetto della piastra a 6 pozzetti ospitava un piccolo filtro a rete di nylon, con tubi sottili posizionati per l'erogazione del gas. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Incubazione di fette di cervello acute. È stata seguita meticolosamente una procedura sistematica per marcare i periciti con TO-PRO-3 nelle fette cerebrali acute. (A) Inizialmente, un pozzetto di una piastra a sei pozzetti (12 × 8 cm) è stato riempito con 10 mL di ACSF, garantendo una corretta aerazione facendo gorgogliare la soluzione utilizzando tubi sottili collegati a una miscela di 95% O 2 e 5% CO2 . (B) Successivamente, le fette di cervello sono state meticolosamente trasferite sulla piastra a sei pozzetti. (C) 10 μL della soluzione madre TO-PRO-3 sono stati introdotti nella camera di caricamento del colorante, agitando delicatamente per facilitare la dissoluzione del colorante (D). (E,F) Per caratterizzare ulteriormente le fette di cervello, è stata condotta la colorazione con IB4 (1 μM in ACSF) e PI (1 μM in ACSF). Questi passaggi sequenziali hanno permesso di marcare con successo i periciti con TO-PRO-3 in fette cerebrali acute, facilitando così la successiva analisi ed esame dei periciti cerebrali marcati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello. (A) La soluzione è bilanciata con una miscela di O 2 al 95% e CO2 al 5% erogata attraverso il tubo. (B-E) Configurazione per l'imaging ad alta risoluzione di cellule marcate con TO-PRO-3, endoteliali marcate con IB4 e cellule marcate con PI in fette di cervello acute. (E) Microscopia confocale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immagine dei periciti cerebrali vitali in fette di cervello. (A) La microvascolarizzazione cerebrale è stata etichettata con IB4 (verde). (B) Le cellule non vitali sono state marcate con PI. (C) I periciti vitali sono stati etichettati con TO-PRO-3 (giallo). (D) Viene visualizzata l'immagine unita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Immagine rappresentativa dei periciti cerebrali vitali e non vitali in una fetta di cervello dopo SAH. (A) La microvascolarizzazione cerebrale è stata etichettata con IB4 (verde). (B) Le cellule non vitali sono state marcate con PI (rosso). (C) I periciti vitali sono stati etichettati con TO-PRO-3 (giallo). (D) Viene visualizzata l'immagine unita. Le frecce blu indicano esempi di periciti cerebrali vitali, mentre le frecce bianche indicano esempi di periciti cerebrali non vitali. In particolare, i nuclei dei periciti non sporgono al di sopra della superficie microvascolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Correlazione positiva tra il numero di periciti non vitali e il tempo dopo la SAH. L'imaging confocale ad alta risoluzione è stato impiegato per catturare i periciti cerebrali in vari punti temporali dopo la SAH. La morte cellulare evidente dei periciti cerebrali è iniziata a 6 ore dopo la SAH, come indicato dalle frecce bianche in (A). Successivamente, c'è stato un aumento sostanziale della morte dei periciti dalle 6 ore in poi. Il conteggio dei periciti non vitali ha mostrato una correlazione positiva con il tempo trascorso dopo la SAH, come illustrato in (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sono state sviluppate tecniche di imaging confocale ad alta risoluzione per la visualizzazione dei periciti cerebrali vitali, dei periciti cerebrali non vitali e della microvascolarizzazione in fette di cervello. Nelle fette acute di cervello di ratto, il processo comporta la marcatura iniziale dei periciti con TO-PRO-311, seguita da cellule endoteliali microvascolari con IB412; successivamente, l'identificazione dei periciti deceduti viene condotta utilizzando PI. Questo protocollo è semplice, riproducibile e altamente applicabile per la ricerca funzionale.
Per tracciare in modo specifico i periciti cerebrali all'interno del sistema nervoso, viene impiegato il fluoroforo rosso lontano TO-PRO-3. Mentre TO-PRO-3 colora prevalentemente i nuclei del tessuto fisso13, si incorpora selettivamente nei periciti viventi ex vivo quando applicato in soluzione fisiologica14. Studi precedenti hanno affermato l'identificazione inequivocabile dei periciti cerebrali murini utilizzando TO-PRO-315. Questo fluoroforo marca efficacemente i periciti cerebrali vitali11. Al contrario, PI, un fluorocromo caricato comunemente utilizzato per la valutazione della vitalità cellulare in tempo reale12, funge da marcatore per il deterioramento delle cellule quando viene applicato prima della fissazione (colorazione PI pre-fissazione)16. Tuttavia, poiché le caratteristiche morfologiche dei periciti, in particolare i loro nuclei, non si estendono al di sopra della superficie microvascolare, distinguere tra nuclei endoteliali e periciti utilizzando la colorazione PI può essere difficile, come indicato dalla freccia bianca nella Figura 8A. Studi che coinvolgono la microscopia elettronica per la ricostruzione tridimensionale della regione CA1 dell'ippocampo di ratto hanno suggerito che circa un terzo dell'endotelio è coperto dai somi e dai processi dei periciti17.
Nella Figura 6, i periciti cerebrali marcati con TO-PRO-3 sono osservati all'interno della microvascolarizzazione. Le immagini confocali della microvascolarizzazione cerebrale marcata con IB4 e PI rivelano che solo poche cellule subiscono la morte cellulare durante il processo di sezionamento, come evidenziato dall'assenza di cellule morte PI-positive nella Figura 6. Di conseguenza, il modello SAH viene utilizzato per studiare la presenza di periciti non vitali. La Figura 7 illustra che, all'interno delle fette di cervello, la morte cellulare è più prominente nei periciti rispetto alle cellule endoteliali. Inoltre, nella Figura 8A, si osserva un aumento significativo della morte dei periciti a partire da 6 ore dopo la SAH. La Figura 8B mostra una correlazione positiva tra il numero di periciti non vitali e il tempo trascorso dopo la SAH. Tuttavia, uno studio completo che immagazzina i periciti cerebrali vitali e non vitali non è stato documentato al meglio delle conoscenze attuali.
Attualmente, rimane incerto se i periciti di altre specie o sistemi (ad esempio, cuore, intestino tenue) manifestino anche stati vitali e non vitali nelle fette acute dopo SAH. In conclusione, il protocollo fornito offre un approccio replicabile per l'imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello post-SAH. Grazie alla sua semplicità e affidabilità, questa tecnica può essere impiegata per svelare la diversità funzionale e strutturale dei periciti in fette di cervello e facilitare indagini cellulari dettagliate in vari modelli di malattia correlati alla fisiopatologia dei periciti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223); la Fondazione di Scienze Naturali della Provincia dello Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
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