Summary
예비 조사 결과 지주막하 출혈(SAH)이 뇌 주위 세포 사멸을 유발한다는 사실이 확인되었습니다. SAH 후 세포주위 수축성을 평가하려면 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주피를 구별해야 합니다. 따라서 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 동시에 라벨링하는 절차가 개발되어 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 관찰을 용이하게 합니다.
Abstract
주위 세포는 대뇌 미세 순환 내에 위치한 중요한 벽화 세포로, 수축성 조절을 통해 대뇌 혈류를 능동적으로 조절하는 데 중추적인 역할을 합니다. 일반적으로 수축성은 특정 상황에서 형태학적 변화와 인근 모세관 직경 변화를 관찰하여 측정됩니다. 그러나 조직 후 고정, 활력 평가 및 이미징된 뇌 주위 세포의 주위 세포 수축성이 손상됩니다. 마찬가지로, 뇌 주위 세포를 유전적으로 표지하는 것은 생존 가능한 주위 세포와 생존 불가능한 주위 세포를 구별하는 데 부족하며, 특히 지주막하 출혈(SAH)과 같은 신경학적 상태에서는 예비 조사에서 뇌 주위 세포의 사멸을 입증합니다. 이러한 제약을 극복하기 위해 신뢰할 수 있는 프로토콜이 고안되어 뇌 절편에서 기능적 및 비기능적 뇌 주위 세포의 동시 형광 태깅을 가능하게 합니다. 이 표지 방법을 사용하면 고해상도 컨포칼 현미경을 시각화하여 뇌 절편 미세혈관을 동시에 표시할 수 있습니다. 이 혁신적인 프로토콜은 뇌 주위 세포 수축성, 모세혈관 직경에 미치는 영향 및 주위 세포 구조를 평가할 수 있는 수단을 제공합니다. SAH 맥락에서 뇌 주위 세포 수축성을 조사하면 대뇌 미세 순환에 미치는 영향을 통찰력 있게 이해할 수 있습니다.
Introduction
가느다란 돌기와 돌출된 세포체로 구별되는 뇌 주피세포는 미세순환 1,2를 둘러싸고 있습니다. 대뇌 혈류 확대는 주로 모세혈관 확장에 의해 이루어지지만, 동맥이 작을수록 확장 속도가 느려진다3. 주위 수축력은 모세혈관 직경과 주위 세포 형태에 영향을 미쳐 혈관 역학에 영향을 미친다4. 뇌 주위세포의 수축은 모세혈관 수축을 유발하며, 병리학적 시나리오에서 과도한 수축은 적혈구 흐름을 방해할 수 있다5. 유전자좌(locus coeruleus)에서 분비되는 노르에피네프린(norepinephrine)을 포함한 다양한 요인이 모세혈관 내에서 뇌주위 세포 수축을 유도할 수 있다6. 대뇌 혈류를 조절하는 역할을 하는 pericyte는 20-HETE 합성을 나타내며 과산소증7 동안 산소 센서 역할을 한다. 산화-질화 스트레스로 유발된 뇌 주위 세포의 수축은 모세혈관에 해로운 영향을 미친다5. 뇌 주위 세포 수축에 대한 생체 내 및 생체 외 연구에도불구하고8, 뇌 절편 내에서 생존 가능한 뇌 주위 세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포의 이미징에 관한 제한된 지식은 여전히 남아 있다.
결정적으로, 뇌 주위의 조직 고정 후 영상은 활력과 후속 수축성 평가를 손상시킵니다. 또한, 신경학적 장애(예: 지주막하 출혈 - SAH)와 같은 시나리오에서 뇌 주피세포의 형질전환 표지는 예비 SAH 유도 뇌주위 세포 사멸 연구에서 확인된 바와 같이 생존 가능한 주위세포와 생존 불가능한 주위를 구별하지 못합니다9.
이러한 문제를 극복하기 위해 TO-PRO-3를 사용하여 살아있는 pericyte를 라벨링하고 죽은 pericyte는 propidium iodide (PI)로 염색했습니다. 고해상도 컨포칼 이미징 기술을 사용하여 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주위 세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 시각화하는 동시에 이미징 중 절편 활성을 보존했습니다. 이 논문은 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주위 세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 이미징하기 위한 재현 가능한 방법을 제시하는 것을 목표로 하며, SAH 후 뇌 미세 순환에 대한 뇌 주위 세포의 영향을 조사하는 귀중한 도구 역할을 합니다.
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Protocol
실험 프로토콜은 쿤밍 의과대학 동물 윤리 및 사용 위원회(kmmu20220945)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 남녀 모두의 Sprague-Dawley (SD) 쥐 (300-350 g)가 사용되었습니다.
1. SAH 모델 유도
- 2% 이소플루란과 100% 산소를 사용하여 쥐를 마취합니다. 연속 흡입 마취에 이소플루란(1%-3%)을 공급하여 마취를 유지합니다. 입체 장치를 사용하여 쥐의 머리를 고정합니다( 재료 표 참조).
- 아래 단계에 따라 SAH 모델을 만듭니다.
- 미세 주사 바늘을 suprasellar 수조에 삽입합니다. 그런 다음 주사기 펌프를 사용하여 쥐의 꼬리 동맥(항응고제 없음)에서 자가 혈액을 suprasellar 수조에 주입합니다( 재료 표 참조).
- 언급된 좌표를 사용하여 오른쪽 외측 뇌실에 미세 주입 바늘을 이식합니다: 브레그마, -0.8mm; 측면, 1.4mm; 깊이, 4mm9. SAH 그룹의 경우 쥐 꼬리 동맥혈 0.2mL를 주사합니다. 가짜 그룹의 경우 동일한 양의 등장성 식염수를 투여합니다(그림 1A).
2. 뇌 절편 준비 및 안정화
- 2% 이소플루란 흡입을 사용하여 쥐를 깊이 마취시킵니다. 참수 후 뇌 전체를 적출하여 얼음처럼 차가운 인공 뇌척수액(ACSF)에 담그십시오.
참고: 134mM NaCl, 2.8mM KCl, 29mM NaHCO3, 1.1mM NaH2PO4, 1.5mMMgSO4, 2.5mM CaCl2 및 10.11mM D-Glucose(재료 표 참조). pH를 7.3에서 7.4 사이로 유지하십시오. - 비브라톰(재료 표 참조)을 사용하여 5% CO2 및 95%O2로 폭기된 얼음처럼 차가운 ACSF에서 SD 쥐로부터 200μm 두께의 급성 뇌 절편을 준비합니다(그림 2).
- 200μm 두께의 급성 뇌 절편을 ACSF에 잠긴 나일론 메쉬의 보관실에 넣습니다. 35-37 °C의 온도 범위를 유지하면서 ACSF 용액을 95 % O 2 및 5 % CO2 와 평형을 이룹니다. 뇌 절편이 2시간 동안 안정화되도록 하여 적응할 시간을 줍니다(그림 3).
3. TO-PRO-3를 이용한 급성 뇌절편의 주위 세포 표지
참고: 급성 뇌 절편의 주위 세포는 추적자 TO-PRO-310을 사용하여 형광 표지되었습니다.
- 형광 염료 TO-PRO-3을 ACSF에 첨가하여 최종 농도 1μM를 달성합니다. TO-PRO-3 함유 ACSF를 사용하여 어두운 환경의 실온에서 20분 동안 급성 뇌 절편을 배양합니다.
알림: 보호를 위해 TO-PRO-3을 취급하는 동안 라텍스 장갑을 착용하는 것을 잊지 마십시오. - 브레인 슬라이스를 운반하는 나일론 메쉬 스트레이너를 로딩 챔버에서 6웰 플레이트 헹굼 챔버로 옮깁니다( 재료 표 참조). 뇌 절편을 헹굼실에 10분 동안 그대로 둡니다(그림 4D).
알림: 이 헹굼 단계는 염색 과정을 종료하고 배경 라벨링을 줄이며 비특이적 염색을 방지합니다. - 15 % CO 2 및 5 % O2의 혼합물로 평형을 이루는 ACSF 용액을 사용하여 총 95 분 동안 제제를 헹굽니다. 이 헹굼 단계는 염료 흡수를 중단하고 배경 라벨링을 최소화합니다(그림 4C).
4. 급성 뇌 절편에서 대뇌 미세 순환의 비생명 주위 세포 염색
- 어두운 환경에서 30분 동안 Alexa Fluor 488(FITC-ISOB4, 5μg/mL, 재료 표 참조)에 접합된 이솔렉틴 B4를 사용하여 37°C에서 TO-PRO-3이 사전 로드된 뇌 절편을 배양합니다. 배양 후 뇌 절편을 ACSF에서 15분 동안 헹굽니다(그림 4E).
- 평소와 같이 5 % CO 2 및 95 % O2 로 가스 처리 된 ACSF에서 뇌 절편을 배양합니다. 37μM 농도의 프로피듐 요오드화물(PI)을 37°C의 두 용액에 모두 첨가합니다. 이것은 중요하지 않은 뇌 주위 세포에 라벨을 붙일 것입니다. 이 ACSF 용액에서 어두운 곳에서 60분 동안 제제를 배양합니다(그림 4F).
- 그런 다음 ACSF 용액으로 15분 동안 준비물을 헹구어 염료 흡수를 중단하고 배경 라벨링을 최소화합니다.
5. 급성 뇌 절편에서 중요한 뇌 주위 세포와 비생명 뇌 주위의 이미징
- 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 뇌 절편을 유리 바닥 공초점 접시(재료 표 참조)로 부드럽게 옮깁니다. 이전에 5 % CO 2 및 95 % O2 로 평형을 이룬 ACSF 용액으로 접시를 채웁니다. 철망을 사용하여 쥐의 뇌 조각을 제자리에 고정합니다.
- 유리 바닥 컨포칼 접시를 컨포칼 현미경의 스테이지로 옮깁니다. 급성 뇌 절편을 접시 바닥에 놓고 컨포칼 현미경 이미징 중에 95% O2 및 5%CO2의 혼합물로 평형화된 ACSF 용액으로9를 관류합니다(그림 5A 및 그림 5Ab').
- 40x 대물렌즈를 사용하여 대뇌 피질 미세혈관의 벽 세포를 시각화합니다. 호환되는 소프트웨어를 사용하여 이미지 스택을 캡처합니다( 재료 표 참조). IB4(여기/방출 460nm/520nm), PI(여기/방출 545nm/595nm) 및 TO-PRO-3(여기/방출 606nm/666nm)에 적합한 필터를 사용합니다(그림 5D).
참고: 40× DIC N1 대물 렌즈, 3 × 12비트: 512 × 512픽셀(0.22 × 0.22mm), 보정: 0.42μm/px. - 대뇌 미세혈관과 주위세포를 네트워크와 형태에 따라 식별합니다. 각 뇌 절편에서 대뇌 미세혈관 네트워크를 포함하는 특정 영역을 찾아 이미지를 캡처합니다.
- 후속 캡처에서 일관성을 보장하기 위해 이미징 위치를 주의 깊게 기록해 둡니다(그림 5B,C). 추가 처리 및 분석을 위해 이미지 분석 소프트웨어(ImageJ) 및 사진 편집 소프트웨어를 사용하십시오(재료 표 참조).
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Representative Results
정상적인 생리학적 조건에서 뇌 주위세포는 일반적으로 세포 사멸을 겪지 않습니다. 그림 6 은 이 현상을 보여주며, 노란색은 중요한 뇌 주위 세포의 존재를 나타냅니다. 뇌 주위 세포는 PI로 염색되지 않아 생존 가능성을 나타냅니다. 세포 사멸 후 pericyte가 미세혈관에 부착된 상태로 남아 있는지 여부를 추가로 조사하기 위해 SAH 쥐 모델에 방법을 사용하고 후속 이미징을 수행했습니다.
SAH 후 뇌 절편에서 중요한 뇌 주위 세포와 비중요한 뇌 주위 세포를 모두 이미징하는 방법이 개발되었습니다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 중요한 뇌 주위 세포(파란색 화살표)는 미세혈관 내에 위치하는 반면, 비필수 뇌 주위 세포는 흰색 화살표로 표시됩니다. 이 동시 시각화를 통해 뇌 절편 내에서 중요한 뇌 주위 세포와 비중요한 뇌 주위 세포를 모두 식별할 수 있습니다. 또한, PI 표지된 비생명 뇌 주위세포가 전체 미세혈관에 부착된 상태로 남아 있는 것이 관찰되었습니다.
그림 1: SAH 모델 . (A) 쥐의 머리는 안정성을 보장하기 위해 입체 장치에 단단히 고정되었습니다. SAH 모델은 suprasellar 수조에 입체 바늘을 조심스럽게 삽입하여 유도되었습니다. (나,씨) SAH 모델에서 혈액은 두개골 내의 지주막하 공간으로 들어가 뇌에 영향을 미칩니다. 대뇌 반구는 SAH 후 약 24시간 후에 혈액으로 채워집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 급성 전뇌 절편 준비 . (A) 바닥 챔버는 고정을 위해 아가로스 접착제로 코팅되었습니다. (B) 접착제를 뇌에 단단히 부착하기 위해 바닥 챔버에 꼼꼼하게 도포되었습니다. (C) 주변 탱크는 온도를 유지하기 위해 얼음처럼 차가운 ACSF로 채워졌습니다. (D) 원하는 단면 두께를 신중하게 정의했습니다. (E,F)입니다. 뇌 절편은 6웰 플레이트로 꼼꼼하게 옮겨졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 6웰 플레이트에서 피펫과 염료 로딩을 옮깁니다 . (A) 급성 뇌 절편은 플라스틱 파스퇴르 피펫(3mL)을 사용하여 옮겼습니다. (a)에 사용된 피펫의 길이는 18.2cm였습니다. (b)와 (c)의 경우, 플라스틱 파스퇴르 피펫의 미세한 끝부분을 조심스럽게 다듬어 이송 중 뇌 절편에 대한 잠재적인 손상을 방지했습니다. 6웰 플레이트는 37°C 수조에서 형광 염색을 위해 (B)에서 (C)로 효율적으로 전환되었습니다. (B) 6웰 플레이트의 웰 중 하나는 가스 전달을 위해 배치된 미세 튜브와 함께 작은 나일론 메쉬 스트레이너를 수용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 급성 뇌 절편의 배양. 급성 뇌 절편에서 TO-PRO-3로 pericyte를 표지하기 위해 체계적인 절차를 꼼꼼하게 따랐습니다. (A) 초기에, 6-웰 플레이트(12 × 8 cm)의 1웰을 10 mL의 ACSF로 채워, 95% O2 및 5%CO2의 혼합물에 연결된 미세 튜브를 사용하여 용액을 버블링하여 적절한 폭기를 보장하였다. (B) 그 후, 뇌 절편을 6웰 플레이트로 꼼꼼하게 옮겼다. (C) 10μL의 TO-PRO-3 원액을 염료 로딩 챔버에 도입하고, 염료 용해를 용이하게 하기 위해 부드럽게 교반하였다(D). (이,에프) 뇌 절편을 추가로 특성화하기 위해 IB4(ACSF에서 1μM) 및 PI(ACSF에서 1μM)로 염색을 수행했습니다. 이러한 순차적 단계를 통해 급성 뇌 절편에서 TO-PRO-3로 주위 세포를 성공적으로 표지할 수 있었고, 따라서 표지된 뇌 주피세포의 후속 분석 및 검사를 용이하게 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 뇌 절편에서 중요한 뇌 주위 세포와 비중요한 뇌 주위 세포의 이미징. (A) 용액은 튜브를 통해 전달되는 95 % O 2 및 5 % CO2 의 혼합물로 평형을 이룹니다. (B-E) 급성 뇌 절편에서 TO-PRO-3 표지, IB4 표지 내피 세포 및 PI 표지 세포의 고해상도 이미징을 위한 설정. (E) 공초점 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 뇌 절편의 중요한 뇌 주위 세포 이미지 . (A) 대뇌 미세혈관은 IB4(녹색)로 표지되었습니다. (B) 비생명 세포는 PI로 표지되었습니다. (C) 생명 주위세포는 TO-PRO-3(노란색)으로 표지되었습니다. (D) 병합된 이미지가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: SAH 후 뇌 절편에서 중요한 뇌 주위 세포와 중요하지 않은 뇌 주위의 대표 이미지 . (A) 대뇌 미세혈관은 IB4(녹색)로 표지되었습니다. (B) 비생명 세포는 PI(빨간색)로 표지되었습니다. (C) 생명 주위세포는 TO-PRO-3(노란색)으로 표지되었습니다. (D) 병합된 이미지가 표시됩니다. 파란색 화살표는 중요한 뇌 주위 세포의 예를 나타내고 흰색 화살표는 중요하지 않은 뇌 주위 세포의 예를 나타냅니다. 특히, pericyte의 핵은 미세혈관 표면 위로 돌출되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 비생명 주위 세포의 수와 SAH 후 시간 사이의 양의 상관관계. 고해상도 컨포칼 이미징을 사용하여 SAH 이후 다양한 시점에서 뇌 주위 세포를 캡처했습니다. 뇌 주피세포의 눈에 띄는 세포 사멸은 (A)의 흰색 화살표로 표시된 바와 같이 SAH 후 6시간에 시작되었습니다. 그 후, 6시간 표시부터 pericyte 사멸이 크게 증가했습니다. 비생명 주위 세포의 수는 (B)에 묘사된 바와 같이 SAH 이후 경과된 시간과 양의 상관관계를 나타냈습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
중요한 뇌 주위 세포, 비필수 뇌 주위 세포 및 뇌 절편의 미세혈관을 시각화하기 위한 고해상도 공초점 이미징 기술이 개발되었습니다. 급성 쥐 뇌 절편에서, 이 과정은 TO-PRO-311을 사용한 주위 세포의 초기 표지를 수반한 후 IB412를 사용한 미세혈관 내피 세포를 수반합니다. 그 후, PI를 사용하여 죽은 pericyte의 식별이 수행됩니다. 이 프로토콜은 간단하고 재현 가능하며 기능 연구에 매우 적합합니다.
신경계 내의 뇌 주피세포를 특이적으로 추적하기 위해 원적색 형광단 TO-PRO-3가 사용됩니다. TO-PRO-3는 주로 고정 조직13의 핵을 염색하지만, 생리식염수14에 적용하면 생체 외 살아있는 주위 세포에 선택적으로 통합됩니다. 이전 연구에서는 TO-PRO-315를 사용하여 쥐 뇌 주피세포의 명백한 식별을 확인했습니다. 이 형광단은 중요한 뇌 주위 세포(vital brain pericyte)를 효과적으로 표지한다11. 대조적으로, 실시간 세포 생존율 평가(12)를 위해 일반적으로 사용되는 하전 형광 색소체인 PI는 고정 전에 적용할 때(고정 전 PI 염색)16 세포의 악화에 대한 마커 역할을 합니다. 그러나 주위 세포의 형태학적 특성, 특히 핵은 미세혈관 표면 위로 확장되지 않기 때문에 그림 8A의 흰색 화살표에서 알 수 있듯이 PI 염색을 사용하여 내피 세포와 주위 세포를 구별하는 것은 어려울 수 있습니다. 쥐 해마의 CA1 영역을 3차원으로 재구성하기 위해 전자 현미경을 사용한 연구는 내피의 약 1/3이 체세포와 주위 세포의 돌기로 덮여 있음을 시사했다17.
그림 6에서는 TO-PRO-3로 표지된 뇌 주피세포가 미세혈관 내에서 관찰됩니다. IB4 및 PI로 표지된 대뇌 미세혈관의 컨포칼 이미지는 그림 6에서 PI 양성 죽은 세포가 없는 것으로 입증된 바와 같이 절편 과정에서 소수의 세포만 세포 사멸을 겪는다는 것을 보여줍니다. 결과적으로, SAH 모델은 비생명 주위세포의 존재를 조사하는 데 활용됩니다. 그림 7은 뇌 절편 내에서 세포 사멸이 내피 세포에 비해 주위 세포에서 더 두드러진다는 것을 보여줍니다. 또한, 그림 8A에서, SAH 후 6시간 후부터 주위 세포 사멸의 상당한 증가가 관찰됩니다. 그림 8B는 비생명 주위 세포의 수와 SAH 후 경과 시간 사이의 양의 상관 관계를 보여줍니다. 그럼에도 불구하고, 중요한 뇌 주위 세포와 비중요한 뇌 주위 세포를 모두 이미징하는 포괄적인 연구는 현재 지식의 최대한으로 문서화되지 않았습니다.
현재, 다른 종 또는 시스템(예: 심장, 소장)의 pericyte도 SAH 후 급성 절편에서 생명 및 비생명 상태를 나타내는지 여부는 불확실합니다. 결론적으로, 제공된 프로토콜은 SAH 후 뇌 절편에서 중요한 뇌 주위 세포와 비중요한 뇌 주위 세포를 모두 이미징하기 위한 복제 가능한 접근 방식을 제공합니다. 단순성과 신뢰성으로 인해 이 기술은 뇌 절편에서 주위 세포의 기능적 및 구조적 다양성을 밝히고 주위 세포 병태생리학과 관련된 다양한 질병 모델에서 상세한 세포 조사를 용이하게 하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81960226,81760223)의 보조금으로 지원되었습니다. 윈난성 자연과학재단 (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
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