Summary
A investigação preliminar confirma que a hemorragia subaracnóidea (HSA) causa a morte do pericito cerebral. A avaliação da contratilidade dos pericitos pós-HAS requer diferenciação entre pericitos cerebrais viáveis e não viáveis. Assim, um procedimento foi desenvolvido para marcar pericitos cerebrais viáveis e não viáveis simultaneamente em cortes cerebrais, facilitando a observação usando um microscópio confocal de alta resolução.
Abstract
Os pericitos são células murais cruciais situadas dentro da microcirculação cerebral, fundamentais na modulação ativa do fluxo sanguíneo cerebral através de ajustes de contratilidade. Convencionalmente, sua contratilidade é aferida observando-se deslocamentos morfológicos e alterações no diâmetro capilar próximo em circunstâncias específicas. No entanto, a fixação pós-tecidual, avaliando a vitalidade e a consequente contratilidade dos pericitos cerebrais imageados, fica comprometida. Da mesma forma, a marcação genética de pericitos cerebrais é insuficiente na distinção entre pericitos viáveis e não viáveis, particularmente em condições neurológicas como hemorragia subaracnóidea (HSA), onde nossa investigação preliminar valida a morte de pericitos cerebrais. Um protocolo confiável foi desenvolvido para superar essas restrições, permitindo a marcação fluorescente simultânea de pericitos cerebrais funcionais e não funcionais em seções cerebrais. Este método de marcação permite a visualização em microscópio confocal de alta resolução, marcando concomitantemente a microvasculatura do corte cerebral. Este protocolo inovador oferece um meio de avaliar a contratilidade do pericito cerebral, seu impacto no diâmetro capilar e na estrutura do pericito. A investigação da contratilidade dos pericitos cerebrais no contexto da HAS permite uma compreensão perspicaz de seus efeitos na microcirculação cerebral.
Introduction
Os pericitos cerebrais, que se distinguem por suas protuberâncias delgadas e corpos celulares salientes, circundam a microcirculação 1,2. Enquanto o aumento do fluxo sanguíneo cerebral é predominantemente impulsionado pela dilatação capilar, as artérias menores exibem taxas de dilatação mais lentas3. A contratilidade dos perócitos exerce influência sobre o diâmetro capilar e a morfologia dos pericitos, afetando a dinâmica vascular4. A contração dos pericitos cerebrais leva à constrição capilar e, em cenários patológicos, a contração excessiva pode impedir o fluxo eritrocitário5. Vários fatores, incluindo a noradrenalina liberada do locus coeruleus, podem induzir a contração do pericícito cerebral dentro dos capilares6. Com papel regulador no fluxo sanguíneo cerebral, os pericitos exibem síntese de 20-TETE, servindo como sensor de oxigênio durante a hiperóxia7. A contração dos pericitos cerebrais desencadeada pelo estresse oxidativo-nitrativo afeta negativamente os capilares5. Apesar das investigações in vivo e ex vivo sobre a contração do pericito cerebral8, persiste um conhecimento limitado sobre a obtenção de imagens de pericitos cerebrais viáveis e não viáveis em fatias cerebrais.
Crucialmente, a imagem pós-fixação tecidual dos pericitos cerebrais compromete sua vitalidade e subsequente avaliação da contratilidade. Além disso, em cenários como distúrbios neurológicos (por exemplo, hemorragia subaracnóidea - HSA), a marcação transgênica de pericitos cerebrais falha em diferenciar entre pericitos viáveis e não viáveis, como confirmado por nosso estudo preliminar de morte cerebral induzida porHAS9.
Para superar esses desafios, empregamos o TO-PRO-3 para marcar pericitos vivos, enquanto os falecidos foram corados com iodeto de propídio (PI). Usamos tecnologias de imagem confocal de alta resolução para visualizar pericitos cerebrais viáveis e não viáveis em cortes cerebrais, preservando a atividade de cortes durante exames de imagem. Este artigo tem como objetivo apresentar um método reprodutível para obtenção de imagens de pericitos cerebrais viáveis e não viáveis em cortes cerebrais, servindo como uma ferramenta valiosa para investigar o impacto dos pericitos cerebrais na microcirculação cerebral pós-HAS.
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Protocol
O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética e Uso de Animais da Kunming Medical University (kmmu20220945). Ratos Sprague-Dawley (SD) de ambos os sexos, 300-350 g, foram utilizados para o presente estudo.
1. Indução do modelo de HAS
- Anestesiar os ratos com isoflurano a 2% e oxigênio a 100%. Manter a anestesia fornecendo anestesia inalatória contínua com isoflurano (1%-3%). Fixe a cabeça do rato utilizando um aparelho estereotáxico (ver Tabela de Materiais).
- Crie o modelo SAH seguindo as etapas abaixo.
- Insira uma agulha de microinjeção na cisterna suprasselar. Em seguida, injete sangue autólogo da artéria caudal do rato (sem anticoagulante) na cisterna suprasselar usando uma bomba de seringa (ver Tabela de Materiais).
- Implantar uma agulha de microinjeção no ventrículo cerebral lateral direito usando as coordenadas mencionadas: bregma, −0,8 mm; lateral, 1,4 mm; profundidade, 4 mm9. Para os grupos de HAS, injetar 0,2 mL de sangue da artéria caudal do rato. Para grupos sham, administrar o mesmo volume de solução salina isotônica (Figura 1A).
2. Preparação e estabilização de fatias cerebrais
- Anestesiar profundamente os ratos usando inalação de isoflurano a 2%. Após a decapitação, extraia todo o cérebro e mergulhe-os no líquido cefalorraquidiano artificial gelado (ACSF).
NOTA: Use soluções ACSF recém-preparadas com a seguinte composição: 134 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1,1 mM NaH 2 PO 4, 1,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl 2e 10,11 mM D-Glucose (ver Tabela de Materiais). Manter um pH entre 7,3 e 7,4. - Use um vibratomo (ver Tabela de Materiais) para preparar cortes cerebrais agudos com uma espessura de 200 μm dos ratos SD em ACSF gelada que é aerada com 5% CO 2 e 95% O 2 (Figura 2).
- Coloque os cortes cerebrais agudos de 200 μm de espessura em uma câmara de armazenamento sobre uma tela de nylon submersa em ACSF. Equilibrar a solução de ACSF com 95% de O 2 e 5% de CO2, mantendo uma faixa de temperatura de 35-37 °C. Permitir que os cortes cerebrais se estabilizem por 2 h, dando-lhes tempo para se ajustar (Figura 3).
3. Marcação de pericitos em cortes cerebrais agudos com TO-PRO-3
NOTA: Os pericitos dos cortes cerebrais agudos foram marcados fluorescentemente usando o traçador TO-PRO-310.
- Adicione o corante fluorescente TO-PRO-3 à ACSF, obtendo uma concentração final de 1 μM. Incubar as fatias cerebrais agudas à temperatura ambiente em um ambiente escuro com a ACSF contendo TO-PRO-3 por 20 min.
NOTA: Lembre-se de usar luvas de látex ao manusear TO-PRO-3 para proteção. - Transfira o filtro de malha de nylon, carregando as fatias cerebrais, da câmara de carga para uma câmara de enxágue de placa de 6 poços (consulte Tabela de Materiais). Permitir que os cortes cerebrais permaneçam na câmara de enxágue por 10 min (Figura 4D).
NOTA: Esta etapa de enxágue encerra o processo de coloração, diminui a marcação de fundo e evita manchas inespecíficas. - Enxaguar as preparações por um total de 15 min usando solução de ACSF equilibrada com uma mistura de 5% CO 2 e 95% O2. Essa etapa de enxágue interrompe a absorção do corante e minimiza a marcação de fundo (Figura 4C).
4. Coloração de pericitos não vitais da microcirculação cerebral em cortes cerebrais agudos
- Incubar fatias cerebrais pré-carregadas com TO-PRO-3 a 37 °C com isolectina B4 conjugada a Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/mL, ver Tabela de Materiais) por 30 min em um ambiente escuro. Após a incubação, enxaguar os cortes cerebrais por 15 min em ACSF (Figura 4E).
- Incubar as fatias cerebrais em ACSF gaseadas com 5% CO 2 e 95% O2 como de costume. Adicionar iodeto de propídio (PI) a uma concentração de 37 μM a ambas as soluções a 37 °C. Isso rotulará os pericitos cerebrais não vitais. Incubar as preparações nesta solução de ACSF por 60 min no escuro (Figura 4F).
- Em seguida, lave as preparações por 15 minutos com soluções ACSF para interromper a absorção de corante e minimizar a rotulagem de fundo.
5. Imagem de pericitos cerebrais vitais e não vitais em cortes cerebrais agudos
- Transfira suavemente fatias cerebrais para pratos confocais com fundo de vidro (ver Tabela de Materiais) usando pipetas plásticas Pasteur. Recheie os pratos com solução de ACSF previamente equilibrada com 5% de CO 2 e 95% de O2. Use uma malha de ferro para fixar fatias de cérebro de rato no lugar.
- Transfira as placas confocais de fundo de vidro para o estágio de um microscópio confocal. Posicionar o corte cerebral agudo no fundo da placa e perfundi-lo9 com solução de ACSF equilibrada com uma mistura de O2 a 95% e CO2 a 5% durante a microscopia confocal (Figura 5A e Figura 5Ab').
- Visualize as células da parede da microvasculatura cortical cerebral usando uma objetiva de 40x. Capture pilhas de imagens usando software compatível (consulte Tabela de Materiais). Utilizar filtros apropriados para IB4 (excitação/emissão 460 nm/520 nm), PI (excitação/emissão 545 nm/595 nm) e TO-PRO-3 (excitação/emissão 606 nm/666 nm) (Figura 5D).
NOTA: Capture imagens com os seguintes detalhes: lente objetiva DIC N1 de 40×, 3 × 12 bits: 512 × 512 pixels (0,22 × 0,22 mm), calibração: 0,42 μm/px. - Identificar microvasculatura e pericitos cerebrais com base em sua rede e morfologia. Localize uma região específica contendo uma rede de microvasculatura cerebral em cada fatia cerebral e capture imagens.
- Observe cuidadosamente a localização das imagens para garantir a consistência nas capturas subsequentes (Figura 5B,C). Para processamento e análise posteriores, use software de análise de imagem (ImageJ) e software de edição de fotos (consulte Tabela de Materiais).
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Representative Results
Em condições fisiológicas normais, os pericitos cerebrais geralmente não sofrem morte celular. A Figura 6 ilustra esse fenômeno, com amarelo indicando a presença de pericitos cerebrais vitais; os pericitos cerebrais não apresentam coloração com IP, indicando sua viabilidade. Para investigar melhor se os pericitos permanecem aderidos à microvasculatura após a morte celular, métodos foram empregados em um modelo de HAS em ratos, e imagens subsequentes foram conduzidas.
Métodos de imagem de pericitos cerebrais vitais e não vitais em cortes cerebrais após HAS foram desenvolvidos. Como mostrado na Figura 7, os pericitos cerebrais vitais (setas azuis) estão localizados dentro da microvasculatura, enquanto os pericitos cerebrais não vitais são representados por setas brancas. Essa visualização simultânea permite a identificação de pericitos cerebrais vitais e não vitais dentro de fatias cerebrais. Além disso, observou-se que os pericitos cerebrais não vitais marcados com IP permaneceram aderidos a toda a microvasculatura.
Figura 1: Modelo de HAS . (A) A cabeça do rato foi firmemente presa ao aparelho estereotáxico para garantir a estabilidade. O modelo de HAS foi induzido pela inserção cuidadosa de uma agulha estereotáxica na cisterna suprasselar. (B,C) No modelo de HAS, o sangue entra no espaço subaracnóideo dentro do crânio, afetando o cérebro. Os hemisférios cerebrais se enchem de sangue aproximadamente 24 h após a HAS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação aguda de fatias cerebrais inteiras . (A) A câmara inferior foi revestida com cola de agarose para fixação. (B) A cola foi meticulosamente aplicada na câmara inferior para aderir firmemente ao cérebro. (C) O tanque ao redor foi preenchido com ACSF gelada para manter a temperatura. (D) A espessura de corte desejada foi cuidadosamente definida. (E,F). Os cortes cerebrais foram meticulosamente transferidos para uma placa de 6 poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Pipetas de transferência e carregamento de corante em placa de 6 poços. (A) Os cortes cerebrais agudos foram transferidos com pipetas plásticas de Pasteur (3 mL). O comprimento da pipeta utilizada em (a) foi de 18,2 cm. Para (b) e (c), a ponta fina da pipeta plástica de Pasteur foi cuidadosamente aparada para evitar qualquer dano potencial às fatias cerebrais durante a transferência. As placas de 6 poços foram eficientemente transferidas de (B) para (C) para coloração de fluorescência em banho-maria de 37 °C. (B) Um poço da placa de 6 poços acomodava um pequeno filtro de malha de nylon, com tubulação fina posicionada para fornecimento de gás. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Incubação de cortes cerebrais agudos. Um procedimento sistemático foi meticulosamente seguido para marcar os pericitos com TO-PRO-3 nos cortes cerebrais agudos. (A) Inicialmente, um poço de uma placa de seis poços (12 × 8 cm) foi preenchido com 10 mL de ACSF, garantindo a aeração adequada borbulhando a solução com tubos finos conectados a uma mistura de 95% deO2 e 5% de CO2. (B) Posteriormente, os cortes cerebrais foram meticulosamente transferidos para a placa de seis poços. (C) 10 μL da solução-estoque TO-PRO-3 foram introduzidos na câmara de carga do corante, agitando suavemente para facilitar a dissolução do corante (D). (E,F) Para melhor caracterização dos cortes cerebrais, foram realizadas colorações com IB4 (1 μM em ACSF) e PI (1 μM em ACSF). Essas etapas sequenciais permitiram a marcação bem-sucedida de pericitos com TO-PRO-3 em cortes cerebrais agudos, facilitando assim a análise e o exame subsequentes dos pericitos cerebrais marcados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagem dos pericitos cerebrais vitais e não vitais em cortes cerebrais. (A) A solução é equilibrada com uma mistura de 95% de O 2 e 5% de CO2 fornecida através da tubulação. (B-E) Configuração para imagens de alta resolução de células marcadas com TO-PRO-3, endotélio marcado com IB4 e PI em cortes cerebrais agudos. (E) Microscopia confocal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagem dos pericitos cerebrais vitais em cortes cerebrais. (A) A microvasculatura cerebral foi marcada com IB4 (verde). (B) Células não vitais foram marcadas com IP. (C) Os pericitos vitais foram marcados com TO-PRO-3 (amarelo). (D) A imagem mesclada é exibida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Imagem representativa dos pericitos cerebrais vitais e não vitais em um corte cerebral após HAS. (A) A microvasculatura cerebral foi marcada com IB4 (verde). (B) Células não vitais foram marcadas com IP (vermelho). (C) Os pericitos vitais foram marcados com TO-PRO-3 (amarelo). (D) A imagem mesclada é exibida. As setas azuis indicam exemplos de pericitos cerebrais vitais, enquanto as setas brancas indicam exemplos de pericitos cerebrais não vitais. Notavelmente, os núcleos dos pericitos não se projetam acima da superfície microvascular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Correlação positiva entre o número de pericitos não vitais e o tempo após HAS. Imagem confocal de alta resolução foi empregada para capturar pericitos cerebrais em vários momentos pós-HAS. A morte celular periciável dos pericitos cerebrais iniciou-se 6 h após a HAS, como indicado pelas setas brancas em (A). Posteriormente, houve um aumento substancial na morte do pericito a partir da marca de 6 h. A contagem de pericitos não vitais apresentou correlação positiva com o tempo decorrido após a HAS, conforme demonstrado em (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
São desenvolvidas técnicas de imagem confocal de alta resolução para visualização de pericitos cerebrais vitais, pericitos cerebrais não vitais e microvasculatura em fatias cerebrais. Em cortes agudos de cérebro de ratos, o processo envolve a marcação inicial dos pericitos com TO-PRO-311, seguida por células endoteliais microvasculares com IB412; posteriormente, a identificação dos pericitos falecidos é realizada por meio do IP. Este protocolo é simples, reprodutível e altamente aplicável para pesquisa funcional.
Para rastrear especificamente os pericitos cerebrais dentro do sistema nervoso, o fluoróforo vermelho-distante TO-PRO-3 é empregado. Enquanto o TO-PRO-3 cora predominantemente os núcleos do tecido fixo13, ele incorpora seletivamente em pericitos vivos ex vivo quando aplicado em solução salina fisiológica14. Estudos prévios afirmaram a identificação inequívoca de pericitos cerebrais murinos utilizando o TO-PRO-315. Esse fluoróforo efetivamente marca pericitos cerebrais vitais11. Em contraste, o IP, um fluorocromo carregado comumente utilizado para avaliação da viabilidade celular em temporeal12, serve como marcador de deterioração celular quando aplicado antes da fixação (coloração PI pré-fixação)16. No entanto, como as características morfológicas dos pericitos, particularmente de seus núcleos, não se estendem além da superfície microvascular, a distinção entre núcleos endoteliais e pericitários pela coloração de IP pode ser um desafio, como indica a seta branca na Figura 8A. Estudos envolvendo microscopia eletrônica para reconstrução tridimensional da região CA1 do hipocampo de ratos têm sugerido que aproximadamente um terço do endotélio é recoberto pelos somas e processos dospericitos17.
Na Figura 6, observam-se pericitos cerebrais marcados com TO-PRO-3 no interior da microvasculatura. Imagens confocais da microvasculatura cerebral marcada com IB4 e IP revelam que apenas algumas células sofrem morte celular durante o processo de secção, como evidenciado pela ausência de células mortas PI-positivas na Figura 6. Consequentemente, o modelo de HAS é utilizado para investigar a presença de pericitos não vitais. A Figura 7 ilustra que, dentro dos cortes cerebrais, a morte celular é mais proeminente nos pericitos do que nas células endoteliais. Além disso, na Figura 8A, observa-se aumento significativo da morte pericitária a partir de 6 h após a HAS. A Figura 8B demonstra uma correlação positiva entre o número de pericitos não vitais e o tempo decorrido após a HAS. No entanto, um estudo abrangente de imagem de pericitos cerebrais vitais e não vitais não foi documentado com o melhor conhecimento atual.
Atualmente, permanece incerto se pericitos de outras espécies ou sistemas (por exemplo, coração, intestino delgado) também manifestam estados vitais e não vitais em fatias agudas após HAS. Em conclusão, o protocolo fornecido oferece uma abordagem replicável para obtenção de imagens de pericitos cerebrais vitais e não vitais em cortes cerebrais pós-HAS. Devido à sua simplicidade e confiabilidade, esta técnica pode ser empregada para desvendar a diversidade funcional e estrutural dos pericitos em cortes cerebrais e facilitar investigações celulares detalhadas em vários modelos de doenças relacionadas à fisiopatologia dos pericitos.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81960226,81760223); Fundação de Ciências Naturais da Província de Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
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