Summary
Ön araştırma, subaraknoid kanamanın (SAK) beyin perisit ölümüne neden olduğunu doğrulamaktadır. SAK sonrası perisit kontraktilitesinin değerlendirilmesi, canlı ve canlı olmayan beyin perisitleri arasında ayrım yapılmasını gerektirir. Bu nedenle, canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini beyin bölümlerinde aynı anda etiketlemek için bir prosedür geliştirilmiştir ve yüksek çözünürlüklü bir konfokal mikroskop kullanarak gözlemi kolaylaştırmıştır.
Abstract
Perisitler, serebral mikrosirkülasyon içinde yer alan ve kasılma ayarlamaları yoluyla serebral kan akışını aktif olarak modüle etmede çok önemli olan çok önemli duvar hücreleridir. Geleneksel olarak, kasılmaları, belirli koşullar altında morfolojik kaymalar ve yakındaki kılcal çap değişiklikleri gözlemlenerek ölçülür. Bununla birlikte, doku fiksasyonu sonrası, canlılığın değerlendirilmesi ve görüntülenen beyin perisitlerinin perisit kontraktilitesi tehlikeye girer. Benzer şekilde, genetik olarak etiketlenen beyin perisitleri, özellikle ön araştırmamızın beyin perisit ölümünü doğruladığı subaraknoid kanama (SAK) gibi nörolojik durumlarda, canlı ve canlı olmayan perisitler arasında ayrım yapmada yetersiz kalmaktadır. Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için güvenilir bir protokol geliştirilmiştir ve beyin bölümlerinde hem fonksiyonel hem de fonksiyonel olmayan beyin perisitlerinin aynı anda floresan etiketlenmesini sağlar. Bu etiketleme yöntemi, aynı anda beyin dilimi mikrovaskülatürünü işaretleyen yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskop görselleştirmesine izin verir. Bu yenilikçi protokol, beyin perisit kontraktilitesini, kılcal damar çapı üzerindeki etkisini ve perisit yapısını değerlendirmek için bir araç sunar. Beyin perisit kontraktilitesinin SAK bağlamında araştırılması, serebral mikrosirkülasyon üzerindeki etkilerinin anlayışlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Introduction
İnce çıkıntıları ve çıkıntılı hücre gövdeleri ile ayırt edilen beyin perisitleri, mikrosirkülasyonuçevreler 1,2. Serebral kan akışı artışı ağırlıklı olarak kılcal damar genişlemesi tarafından yönlendirilirken, daha küçük arterler daha yavaş genişleme oranları sergiler3. Perisit kontraktilitesi, kapiller çap ve perisit morfolojisi üzerinde etki göstererek vasküler dinamiklerietkiler 4. Beyin perisitlerinin kasılması kılcal daralmaya yol açar ve patolojik senaryolarda aşırı kasılma eritrosit akışını engelleyebilir5. Locus coeruleus'tan salınan norepinefrin de dahil olmak üzere çeşitli faktörler, kılcal damarlarda beyin perisit kasılmasına neden olabilir6. Serebral kan akışında düzenleyici bir role sahip olan perisitler, hiperoksi7 sırasında bir oksijen sensörü görevi gören 20-HETE sentezi sergiler. Beyin perisitlerinin oksidatif-nitratif stresle tetiklenen kasılması kılcal damarları zararlı bir şekilde etkiler5. Beyin perisit kasılması ile ilgili hem in vivo hem de ex vivo araştırmalara rağmen8, beyin dilimleri içinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerinin görüntülenmesi ile ilgili sınırlı bilgi devam etmektedir.
En önemlisi, beyin perisitlerinin doku fiksasyonu sonrası görüntülemesi, canlılıklarını ve müteakip kasılma değerlendirmesini tehlikeye atar. Ayrıca, nörolojik bozukluklar gibi senaryolarda (ör., subaraknoid kanama - SAK), beyin perisitlerinin transgenik etiketlemesi, ön SAK kaynaklı beyin perisit ölümü çalışmamız9 tarafından onaylandığı gibi, canlı ve canlı olmayan perisitler arasında ayrım yapamaz.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, canlı perisitleri etiketlemek için TO-PRO-3'ü kullandık, ölenler ise propidyum iyodür (PI) ile boyandı. Görüntüleme sırasında kesit aktivitesini korurken, beyin dilimlerinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme teknolojileri kullandık. Bu makale, beyin perisitlerinin SAK sonrası serebral mikrosirkülasyon üzerindeki etkisini araştırmak için değerli bir araç olarak hizmet ederek, beyin dilimlerinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini görüntülemek için tekrarlanabilir bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deney protokolü, Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Etiği ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (kmmu20220945). Bu çalışma için her iki cinsiyetten 300-350 g Sprague-Dawley (SD) cinsi sıçanlar kullanıldı.
1. SAH modelini indükleme
- Sıçanları% 2 izofluran ve% 100 oksijen kullanarak uyuşturun. İzofluran (%1-%3) ile sürekli inhalasyon anestezisi sağlayarak anesteziyi koruyun. Stereotaksik bir aparat kullanarak farenin kafasını sabitleyin (bkz.
- Aşağıdaki adımları izleyerek SAH modelini oluşturun.
- Suprasellar rezervuarın içine bir mikroenjeksiyon iğnesi yerleştirin. Daha sonra, sıçanın kuyruk arterinden (antikoagülan olmadan) bir şırınga pompası kullanarak suprasellar sarnıca otolog kan enjekte edin (bkz.
- Belirtilen koordinatları kullanarak sağ lateral serebral ventriküle bir mikroenjeksiyon iğnesi implante edin: bregma, −0.8 mm; yanal, 1,4 mm; derinlik, 4 mm9. SAK grupları için 0.2 mL sıçan kuyruğu arter kanı enjekte edin. Sahte gruplar için aynı hacimde izotonik salin uygulayın (Şekil 1A).
2. Beyin dilimi hazırlama ve stabilizasyon
- % 2 izofluran inhalasyonu kullanarak sıçanları derinlemesine uyuşturun. Dekapitasyondan sonra, tüm beyinleri çıkarın ve buz gibi yapay beyin omurilik sıvısına (ACSF) daldırın.
NOT: Aşağıdaki bileşime sahip taze hazırlanmış ACSF çözeltileri kullanın: 134 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1.1 mM NaH 2 PO 4, 1.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2 ve 10.11 mM D-Glikoz (Malzeme Tablosuna bakınız). pH'ı 7.3 ile 7.4 arasında tutun. - %5CO2 ve %95O2 ile havalandırılan buz gibi ACSF'de SD sıçanlardan 200 μm kalınlığında akut beyin dilimleri hazırlamak için bir vibratom kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 2).
- 200 μm kalınlığındaki akut beyin dilimlerini ACSF'ye batırılmış naylon bir ağ üzerindeki bir saklama odasına yerleştirin. ACSF çözeltisini 35-37 °C sıcaklık aralığını koruyarak %95 O2 ve %5CO2 ile dengeleyin. Beyin dilimlerinin 2 saat boyunca stabilize olmasına izin verin ve uyum sağlamaları için zaman tanıyın (Şekil 3).
3. Akut beyin dilimlerindeki perisitlerin TO-PRO-3 ile etiketlenmesi
NOT: Akut beyin dilimlerinden elde edilen perisitler, izleyici TO-PRO-310 kullanılarak floresan olarak etiketlendi.
- Floresan boya TO-PRO-3'ü ACSF'ye ekleyin ve 1 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde edin. Akut beyin dilimlerini oda sıcaklığında TO-PRO-3 içeren ACSF ile karanlık bir ortamda 20 dakika inkübe edin.
NOT: Koruma için TO-PRO-3'ü tutarken lateks eldiven giymeyi unutmayın. - Beyin dilimlerini taşıyan naylon süzgeci yükleme odasından 6 oyuklu bir plaka durulama odasına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Beyin dilimlerinin durulama odasında 10 dakika kalmasına izin verin (Şekil 4D).
NOT: Bu durulama adımı, boyama işlemini sonlandırır, arka plan etiketlemesini azaltır ve spesifik olmayan lekelenmeyi önler. - Preparatları% 5 CO 2 ve% 95 O2 karışımı ile dengelenmiş ACSF solüsyonu kullanarak toplam 15 dakika durulayın. Bu durulama adımı, boya alımını durdurur ve arka plan etiketlemesini en aza indirir (Şekil 4C).
4. Akut beyin dilimlerinde serebral mikrosirkülasyonun hayati olmayan perisitlerinin boyanması
- TO-PRO-3 ile önceden yüklenmiş beyin dilimlerini 37 ° C'de Alexa Fluor 488'e (FITC-ISOB4; 5 μg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) konjuge edilmiş izolektin B4 ile karanlık bir ortamda 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, beyin dilimlerini ACSF'de 15 dakika durulayın (Şekil 4E).
- Beyin dilimlerini her zamanki gibi %5 CO2 ve% 95 O2 ile gazlanmış ACSF'de inkübe edin. 37 °C'de her iki çözeltiye de 37 μM konsantrasyonda propidyum iyodür (PI) ekleyin. Bu, hayati olmayan beyin perisitlerini etiketleyecektir. Preparatları bu ACSF çözeltisinde karanlıkta 60 dakika inkübe edin (Şekil 4F).
- Ardından, boya alımını durdurmak ve arka plan etiketlemesini en aza indirmek için preparatları ACSF solüsyonlarıyla 15 dakika durulayın.
5. Akut beyin dilimlerinde vital ve vital olmayan beyin perisitlerinin görüntülenmesi
- Plastik Pasteur pipetleri kullanarak beyin dilimlerini cam tabanlı konfokal kaplara (Malzeme Tablosuna bakın) nazikçe aktarın. Bulaşıkları daha önce% 5 CO2 ve% 95 O2 ile dengelenmiş ACSF çözeltisi ile doldurun. Sıçan beyin dilimlerini yerine sabitlemek için demir bir ağ kullanın.
- Cam tabanlı konfokal tabakları konfokal mikroskop aşamasına aktarın. Akut beyin dilimini çanağın dibine yerleştirin ve konfokal mikroskopi görüntüleme sırasında %95 O2 ve %5CO2 karışımı ile dengelenmiş ACSF solüsyonu ileperfüze edin 9 (Şekil 5A ve Şekil 5Ab').
- Serebral kortikal mikrovaskülatürün duvar hücrelerini 40x objektif kullanarak görselleştirin. Uyumlu yazılımı kullanarak görüntü yığınlarını yakalayın (bkz. IB4 (uyarma/emisyon 460 nm/520 nm), PI (uyarma/emisyon 545 nm/595 nm) ve TO-PRO-3 (uyarma/emisyon 606 nm/666 nm) için uygun filtreler kullanın (Şekil 5D).
NOT: Aşağıdaki ayrıntılara sahip görüntüler yakalayın: 40× DIC N1 objektif lens, 3 × 12 bit: 512 × 512 piksel (0,22 × 0,22 mm), kalibrasyon: 0,42 μm/piksel. - Serebral mikrovasküler sistemi ve perisitleri ağlarına ve morfolojilerine göre tanımlayın. Her beyin diliminde serebral mikrovasküler ağ içeren belirli bir bölgeyi bulun ve görüntü yakalayın.
- Sonraki çekimlerde tutarlılığı sağlamak için görüntüleme konumunu dikkatlice not edin (Şekil 5B,C). Daha fazla işleme ve analiz için görüntü analiz yazılımı (ImageJ) ve fotoğraf düzenleme yazılımı kullanın (bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normal fizyolojik koşullar altında, beyin perisitleri genellikle hücre ölümüne uğramazlar. Şekil 6 , hayati beyin perisitlerinin varlığını gösteren sarı ile bu fenomeni göstermektedir; beyin perisitleri, PI ile boyanma göstermez, bu da canlılıklarını gösterir. Hücre ölümünü takiben perisitlerin mikrovaskülatüre bağlı kalıp kalmadığını daha fazla araştırmak için, bir SAK sıçan modelinde yöntemler kullanıldı ve daha sonra görüntüleme yapıldı.
SAK sonrası beyin dilimlerinde hem vital hem de vital olmayan beyin perisitlerinin görüntülenmesi için yöntemler geliştirilmiştir. Şekil 7'de gösterildiği gibi, hayati beyin perisitleri (mavi oklar) mikrovaskülatür içinde bulunurken, hayati olmayan beyin perisitleri beyaz oklarla temsil edilir. Bu eşzamanlı görselleştirme, beyin dilimleri içinde hem hayati hem de hayati olmayan beyin perisitlerinin tanımlanmasına izin verir. Ayrıca, PI işaretli non-vital beyin perisitlerinin tüm mikrovasküler sisteme yapışık kaldığı gözlendi.
Şekil 1: SAH modeli . (A) Stabiliteyi sağlamak için sıçanın kafası stereotaksik cihaza sıkıca sabitlendi. SAH modeli, suprasellar sarnıç içine dikkatlice stereotaksik bir iğne yerleştirilerek indüklendi. (B,C) SAK modelinde kan, kafatası içindeki subaraknoid boşluğa girerek beyni etkiler. Serebral hemisferler SAK'tan yaklaşık 24 saat sonra kanla dolar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akut tüm beyin dilimi hazırlığı . (A) Alt hazne, sabitleme için agaroz yapıştırıcı ile kaplandı. (B) Yapıştırıcı, beyne sıkıca yapışması için alt bölmeye titizlikle uygulandı. (C) Sıcaklığı korumak için çevredeki tank buz gibi ACSF ile dolduruldu. (D) İstenen kesit kalınlığı dikkatlice tanımlanmıştır. (E,F). Beyin dilimleri titizlikle 6 oyuklu bir plakaya aktarıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Pipetleri ve boya yüklemesini 6 oyuklu bir plakaya aktarın. (A) Akut beyin dilimleri plastik Pasteur pipetleri (3 mL) kullanılarak transfer edildi. (a)'da kullanılan pipetin uzunluğu 18,2 cm idi. (b) ve (c) için, plastik Pasteur pipetinin ince ucu, transfer sırasında beyin dilimlerine herhangi bir zarar gelmesini önlemek için dikkatlice kesildi. 6 oyuklu plakalar, 37 °C'lik bir su banyosunda floresan boyama için (B)'den (C)'ye verimli bir şekilde geçirildi. (B) 6 oyuklu plakanın bir kuyusu, gaz dağıtımı için konumlandırılmış ince borulara sahip küçük bir naylon ağ süzgecini barındırdı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Akut beyin dilimlerinin inkübasyonu. Akut beyin dilimlerinde perisitleri TO-PRO-3 ile etiketlemek için sistematik bir prosedür titizlikle takip edildi. (A) Başlangıçta, altı oyuklu bir plakanın (12 × 8 cm) bir kuyucuğu 10 mL ACSF ile dolduruldu ve çözeltinin %95O2 ve %5CO2 karışımına bağlı ince borular kullanılarak köpürtülmesiyle uygun havalandırma sağlandı. (B) Daha sonra, beyin dilimleri titizlikle altı oyuklu plakaya aktarıldı. (C) 10 μL TO-PRO-3 stok çözeltisi, boya çözünmesini kolaylaştırmak için hafifçe çalkalayarak boya yükleme odasına verildi (D). (E,F) Beyin dilimlerini daha fazla karakterize etmek için IB4 (ACSF'de 1 μM) ve PI (ACSF'de 1 μM) ile boyama yapıldı. Bu ardışık adımlar, akut beyin dilimlerinde perisitlerin TO-PRO-3 ile başarılı bir şekilde etiketlenmesini sağladı, böylece etiketli beyin perisitlerinin sonraki analizini ve incelemesini kolaylaştırdı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Beyin dilimlerinde hayati ve hayati olmayan beyin perisitlerinin görüntülenmesi. (A) Çözelti, borudan iletilen %95 O2 ve %5CO2 karışımı ile dengelenir. (B-E) Akut beyin dilimlerinde TO-PRO-3 etiketli, IB4 etiketli endotel ve PI etiketli hücrelerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için kurulum. (E) Konfokal mikroskopi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Beyin dilimlerinde hayati beyin perisitlerinin görüntüsü . (A) Serebral mikrovasküler sistem IB4 (yeşil) ile etiketlendi. (B) Hayati olmayan hücreler PI ile etiketlendi. (C) Vital perisitler TO-PRO-3 (sarı) ile etiketlendi. (D) Birleştirilen görüntü görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: SAK sonrası bir beyin diliminde hayati ve hayati olmayan beyin perisitlerinin temsili görüntüsü . (A) Serebral mikrovasküler sistem IB4 (yeşil) ile etiketlendi. (B) Hayati olmayan hücreler PI (kırmızı) ile etiketlendi. (C) Vital perisitler TO-PRO-3 (sarı) ile etiketlendi. (D) Birleştirilen görüntü görüntülenir. Mavi oklar hayati beyin perisitlerinin örneklerini gösterirken, beyaz oklar hayati olmayan beyin perisitlerinin örneklerini gösterir. Özellikle, perisitlerin çekirdekleri mikrovasküler yüzeyin üzerine çıkmaz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Hayati olmayan perisit sayısı ile SAK sonrası süre arasındaki pozitif korelasyon. SAK sonrası çeşitli zaman noktalarında beyin perisitlerini yakalamak için yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme kullanıldı. Beyin perisitlerinin gözle görülür hücre ölümü, (A)'daki beyaz oklarla gösterildiği gibi, SAK'tan 6 saat sonra başladı. Daha sonra, 6 saatten itibaren perisit ölümünde önemli bir artış oldu. Vital olmayan perisitlerin sayısı, (B)'de gösterildiği gibi, SAK sonrası geçen süre ile pozitif bir korelasyon gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hayati beyin perisitlerini, hayati olmayan beyin perisitlerini ve beyin dilimlerindeki mikrovaskülatürü görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Akut sıçan beyin dilimlerinde, işlem perisitlerin TO-PRO-311 ile ilk etiketlenmesini ve ardından IB412 ile mikrovasküler endotel hücrelerini gerektirir; daha sonra, ölen perisitlerin tanımlanması PI kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol basit, tekrarlanabilir ve işlevsel araştırmalar için son derece uygulanabilir.
Sinir sistemi içindeki beyin perisitlerini spesifik olarak izlemek için, uzak kırmızı florofor TO-PRO-3 kullanılır. TO-PRO-3 ağırlıklı olarak sabit doku13'ün çekirdeklerini boyarken, fizyolojik salin14 içinde uygulandığında seçici olarak ex vivo canlı perisitlere dahil olur. Önceki çalışmalar, TO-PRO-315 kullanılarak murin beyin perisitlerinin kesin olarak tanımlandığını doğrulamıştır. Bu florofor, hayati beyin perisitlerini etkili bir şekilde etiketler11. Buna karşılık, gerçek zamanlı hücre canlılığı değerlendirmesi12 için yaygın olarak kullanılan yüklü bir florokrom olan PI, fiksasyondan önce uygulandığında (ön fiksasyon PI boyama) bozulan hücreler için bir belirteç görevi görür16. Bununla birlikte, perisitlerin morfolojik özellikleri, özellikle çekirdekleri, mikrovasküler yüzeyin üzerine uzanmadığından, Şekil 8A'daki beyaz okla gösterildiği gibi, PI boyama kullanarak endotelyal ve perisit çekirdekleri arasında ayrım yapmak zor olabilir. Sıçan hipokampusunun CA1 bölgesinin üç boyutlu rekonstrüksiyonu için elektron mikroskobu içeren çalışmalar, endotelin yaklaşık üçte birinin perisitlerin somaları ve süreçleri tarafından kapsandığını göstermiştir17.
Şekil 6'da, mikrovasküler sistem içinde TO-PRO-3 ile işaretlenmiş beyin perisitleri gözlenmektedir. IB4 ve PI ile etiketlenmiş serebral mikrovaskülatürün konfokal görüntüleri, Şekil 6'da PI pozitif ölü hücrelerin yokluğu ile kanıtlandığı gibi, kesit işlemi sırasında sadece birkaç hücrenin hücre ölümüne uğradığını ortaya koymaktadır. Sonuç olarak, hayati olmayan perisitlerin varlığını araştırmak için SAK modeli kullanılmıştır. Şekil 7, beyin dilimleri içinde, endotel hücrelerine kıyasla perisitlerde hücre ölümünün daha belirgin olduğunu göstermektedir. Ek olarak, Şekil 8A'da, SAK'tan 6 saat sonra başlayarak perisit ölümünde önemli bir artış gözlenmiştir. Şekil 8B, hayati olmayan perisitlerin sayısı ile SAK sonrası geçen süre arasında pozitif bir korelasyon göstermektedir. Bununla birlikte, hem hayati hem de hayati olmayan beyin perisitlerini görüntüleyen kapsamlı bir çalışma, mevcut bilgilerin en iyisi olarak belgelenmemiştir.
Şu anda, diğer türlerden veya sistemlerden (örneğin, kalp, ince bağırsak) perisitlerin SAK sonrası akut dilimlerde hayati ve hayati olmayan durumlar gösterip göstermediği belirsizliğini korumaktadır. Sonuç olarak, sağlanan protokol, SAK sonrası beyin dilimlerinde hem hayati hem de hayati olmayan beyin perisitlerini görüntülemek için tekrarlanabilir bir yaklaşım sunmaktadır. Basitliği ve güvenilirliği nedeniyle, bu teknik, beyin dilimlerindeki perisitlerin fonksiyonel ve yapısal çeşitliliğini ortaya çıkarmak ve perisit patofizyolojisi ile ilgili çeşitli hastalık modellerinde ayrıntılı hücresel araştırmaları kolaylaştırmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (81960226,81760223) alınan hibelerle desteklenmiştir; Yunnan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K.
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T.
- Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
- Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
- Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
- Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
