Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Nutzung der Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transformation (AMT) zur Integration von Genen von Interesse in das Kerngenom der grünen Mikroalge Chlorella vulgaris, was zur Produktion stabiler Transformanten führt.
Abstract
Die Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation (AMT) dient als weit verbreitetes Werkzeug zur Manipulation von Pflanzengenomen. A. tumefaciens weist jedoch die Fähigkeit auf, Gene auf eine Vielzahl von Arten zu übertragen. Zahlreichen Mikroalgenarten fehlen etablierte Methoden, um interessante Gene zuverlässig in ihr Kerngenom zu integrieren. Um die potenziellen Vorteile der Mikroalgenbiotechnologie zu nutzen, sind einfache und effiziente Werkzeuge zur Genommanipulation von entscheidender Bedeutung. In dieser Arbeit wird ein optimiertes AMT-Protokoll für die industrielle Mikroalgenart Chlorella vulgaris vorgestellt, das das grün fluoreszierende Reporterprotein (mGFP5) und den Antibiotikaresistenzmarker für Hygromycin B verwendet. Mutanten werden durch Plattierung auf Tris-Acetat-Phosphat (TAP)-Medien ausgewählt, die Hygromycin B und Cefotaxim enthalten. Die Expression von mGFP5 wird nach über zehn Generationen der Subkultivierung mittels Fluoreszenz quantifiziert, was auf eine stabile Transformation der T-DNA-Kassette hinweist. Dieses Protokoll ermöglicht die zuverlässige Generierung mehrerer transgener C. vulgaris-Kolonien in weniger als zwei Wochen unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Pflanzenexpressionsvektors pCAMBIA1302.
Introduction
Agrobacterium tumefaciens, ein gramnegatives bodenbürtiges Bakterium, besitzt eine einzigartige Fähigkeit zum Gentransfer zwischen den Königreichen, was ihm den Titel "natürlicher Gentechniker"1 eingebracht hat. Dieses Bakterium kann DNA (T-DNA) von einem tumorinduzierenden Plasmid (Ti-Plasmid) über ein Typ-IV-Sekretionssystem in Wirtszellen übertragen, was zur Integration und Expression der T-DNA in das Wirtsgenom führt 1,2,3,4. In der Natur führt dieser Prozess bei Pflanzen zur Tumorbildung, die allgemein als Kronengallenkrankheit bekannt ist. Agrobacterium kann T-DNA jedoch auch in verschiedene andere Organismen übertragen, darunter Hefen, Pilze, Algen, Seeigelembryonen und sogar menschliche Zellen unter Laborbedingungen 5,6,7,8.
Unter Ausnutzung dieses natürlichen Systems ermöglicht die Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation (AMT) die zufällige Integration von Genen von Interesse in das Kerngenom einer Wirtszelle, indem die T-DNA-Region des Ti-Plasmids modifiziert wird. Zu diesem Zweck ist pCAMBIA13029 ein weit verbreiteter AMT-Pflanzenexpressionsvektor. Forscher können einfache Klonierungs-Workflows in E. coli anwenden, bevor sie den gewünschten Vektor in A. tumefaciens übertragen, um ihn anschließend auf den interessierenden Wirt zu übertragen.
Grüne Mikroalgen sind Eukaryoten, die viele Ähnlichkeiten mit Landpflanzen haben, aber sehr widerspenstig gegenüber gentechnischen Veränderungen sind. Die genetische Transformation spielt jedoch sowohl in der Grundlagen- als auch in der biotechnologischen Erforschung von Mikroalgen eine entscheidende Rolle. In mehreren Mikroalgenarten, insbesondere Chlamydomonas reinhardtii, hat die genetische Transformation durch AMT erfolgreich Transgene wie humanes Interleukin-2 (hIL-2), die Coronavirus-2-Rezeptor-Bindungsdomäne des schweren akuten respiratorischen Syndroms (SARS-CoV-2 RBD) und zwei antimikrobielle Peptide (AMPs) eingeführt10,11,12,13. Unter diesen hat Chlorella vulgaris, eine weniger anspruchsvolle und schnell wachsende Grünalgenart, ein erhebliches Potenzial für die nachhaltige Produktion von Kohlenhydraten, Proteinen, Nutrazeutika, Pigmenten und anderen hochwertigen Verbindungen14. Der Mangel an zuverlässigen Werkzeugen zur Herstellung transgener Stämme von C. vulgaris behindert jedoch den kommerziellen Fortschritt. Da es nur eine begrenzte Anzahl von Veröffentlichungen gibt, die AMT in C. vulgaris15 verwenden, und angesichts der erheblichen Unterschiede zwischen Pflanzen- und Mikroalgenkultivierung, ist eine Optimierung des AMT-Protokolls unerlässlich.
In dieser Studie fügten die Forscher grün fluoreszierendes Protein (mGFP5) stromabwärts des 35S-Promotors des Blumenkohlmosaikvirus (CamV) ein und fügten einen Histidin-Tag hinzu, um es als Reportergen für die Proteinexpression zu verwenden. Die Transformanten wurden mit Hygromycin B ausgewählt, und nach einer Subkultivierung über zwanzig Generationen blieb die Transformation stabil. Das in dieser Arbeit verwendete pCAMBIA1302-Plasmid kann leicht angepasst werden, um jedes Gen von Interesse zu enthalten. Des Weiteren können die vorgestellte Methode und Materialien für andere Grünalgenarten mit einem aktiven CamV35S-Promotor angepasst werden, da dieser Promotor für die Hygromycin-Selektion verwendet wird.
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Protocol
Alle Medien und Lösungen müssen vor der Verwendung autoklaviert werden, sofern nicht anders angegeben. Alle Zentrifugenröhrchen, Pipettenspitzen usw. sollten vor Gebrauch steril oder autoklaviert sein. Zur leichteren Referenz sind die in diesem Protokoll verwendeten Medienrezepte in Tabelle 1 aufgeführt.
1. Herstellung von elektrokompetenten Zellen von A. tumefaciens
- Inimpfen Sie Agrobacterium (AGL-1) in einen sterilen 25-ml-Schüttelkolben mit LB-Medien (ergänzt mit Rifampicin, 20 mg/L-1) aus einem gefrorenen Glycerin-Vorrat und lassen Sie es über Nacht bei 28-30 °C und 150 U/min wachsen.
HINWEIS: Der Agrobacterium-Stamm AGL-1 ist (siehe Materialtabelle) resistent gegen Rifampicin, Ampicillin, Chloramphenicol und Streptomycin und kann von mehreren Lieferanten bezogen werden. - Am nächsten Tag wird die Kultur 1.000.000-fach verdünnt, indem 0,5 μl der Übernachtkultur zu 50 ml autoklaviertem Reinstwasser gegeben und 10 μl dieser verdünnten Kultur auf einer LB-Platte verteilt und dann 1-3 Tage lang bei 28-30 °C inkubiert wird.
- Wählen Sie eine Kolonie aus und beginnen Sie eine 20-ml-Kultur über Nacht in LB mit Rifampicin bei 28-30 °C.
- Am nächsten Tag werden 500 ml LB-Medien (kein Antibiotikum) in einem Schüttelkolben mit 9 ml der Nachtkultur geimpft und bei 28-30 °C angebaut, bis der OD600 0,5 erreicht.
- Verteilen Sie die Kultur gleichmäßig auf zehn 50-ml-Zentrifugenröhrchen und kühlen Sie sie 30 Minuten lang auf Eis. Die Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen.
- Die Röhrchen werden bei 4 °C und 4000 x g 15 min zentrifugiert. Anschließend wird mit einer Pipette so viel Überstand wie möglich entfernt und das Pellet in jedem Röhrchen in 50 ml eiskaltem Wasser resuspendiert.
- Die Zellen werden bei 4 °C und 4000 x g für 15 min zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 25 ml eiskaltem Wasser in jedem Röhrchen.
- Die Zellen werden bei 4 °C und 4000 x g für 15 min zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 1 ml eiskaltem 10%igem (w/v) Glycerin in jedem Röhrchen.
- Kombinieren Sie alle Röhrchen zu einem 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 4 °C und 4000 x g 15 Minuten lang. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in 400 μl eiskaltem 10% (w/v) Glycerin. Die Zellkonzentration sollte etwa 1-3 x10 10 Zellen/ml betragen.
- Verteilen Sie die Zellen als 50-μl-Aliquots in sterilen, vorgekühlten Mikroröhrchen. In flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C im Gefrierschrank aufbewahren.
2. Elektroporation von A. tumefaciens
- Geben Sie 50 μl elektrokompetente AGL-1 A. tumefaciens Zellen in eine vorgekühlte 0,1 mm Küvette und fügen Sie 2 μl pCAMBIA1302 oder ein ähnliches Plasmid (konz. 15 ng/μl) hinzu (siehe Materialtabelle).
- Elektroporat bei 2400 V mit einem Elektroporator (200 Ω, kapazitiver Extender 250 μFD, Kapazität 25 μFD, exponentieller Zerfall, siehe Materialtabelle). Die Zeitkonstante sollte für eine erfolgreiche Elektroporation mit exponentiellem Zerfall >4,5 ms betragen.
- Geben Sie sofort 1 ml LB-Medium in die Küvette und pipettieren Sie es vorsichtig auf und ab, um es zu mischen. Überführen Sie die 1 ml resuspendierten Zellen in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen und inkubieren Sie es bei 28-30 °C für mindestens 1 Stunde, um sich zu erholen.
- Die Zellen werden auf LB-Agar aufgetragen, der das geeignete Antibiotikum enthält (d. h. 50 mg/l Kanamycin für pCAMBIA1302 für die prokaryotische Selektion).
- 2-3 Tage bei 28-30 °C inkubieren.
- Wählen Sie eine Kolonie aus, züchten Sie über Nacht in LB mit der entsprechenden Selektion (50 mg/l Kanamycin für pCAMBIA1302) und konservieren Sie den plasmidhaltigen Stamm unter Verwendung von 50 % Glycerin bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.
3. AMT von C. vulgaris
HINWEIS: Bereiten Sie die Kulturen von C. vulgaris (UTEX 395, siehe Materialtabelle) und A. tumefaciens parallel für die Co-Kultivierung vor. Mit der Kultivierung von C. vulgarisollte 3 Tage vor der Aufbereitung von A. tumefaciens-Kulturen begonnen werden. Das Protokoll wurde auf der Grundlage des von Kumar et al. veröffentlichten Protokolls modifiziert.7.
- C. vulgaris-Kultur vorbereiten
- C. vulgaris wird traditionell schräg gelagert oder in Log-Phase-Kulturen unter beleuchteten Bedingungen aufbewahrt. Aus einer Log-Phase-Kultur bei OD600 = 1,0 0,5 mL auf eine Tris-Acetat-Phosphat-Agarplatte (TAP, siehe Tabelle 1) ( 1,2 Gew.-% Agar Agar) auftragen und 5 Tage lang bei 25 °C mit Beleuchtung (50 μE/m2s) wachsen lassen. Dies ergibt ca. 5 x 106 Zellen.
- A . tumefaciens-Kultur vorbereiten
- Züchten Sie den Stamm A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 in einem Schüttelkolben, indem Sie 10 ml LB-Medien, ergänzt mit 15 mM Glukose, 20 mg/l Rifampicin und 50 mg/l Kanamycin (siehe Materialtabelle) unter Verwendung des Glycerinstamms inokulieren. Bei 28-30 °C und 250 U/min über Nacht inkubieren.
- 1 ml Kultur über Nacht in 50 ml LB mit 15 mM Glukose, 20 mg/l Rifampicin und 50 mg/l Kanamycin intubieren und bei 28-30 °C und 250 U/min inkubieren, bis der OD600 1,0 erreicht.
- Kokultivierung von C. vulgaris und A. tumefaciens
- Um die A. tumefaciens-Kultur für die Co-Kultivierung vorzubereiten, wird die gezüchtete Kultur in ein 50-ml-Röhrchen überführt und bei 4000 x g 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen zweimal mit dem Induktionsmedium.
HINWEIS: Als Induktionsmedium werden TAP-Medien verwendet, die auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt sind und mit F/2-Medium Spurenmetallen und Vitaminen mit 200 μM Acetosyringon (AS, siehe Materialtabelle) ergänzt werden. Resuspendieren Sie die Zellen in Induktionsmedien, so dass OD600 = 0,5 ist. - Um die C. vulgaris-Kultur für die Co-Kultivierung vorzubereiten, geben Sie 25 ml Induktionsmedien auf die C. vulgaris-Platte mit ~ 5 x 106 Zellen. In ein 50-ml-Röhrchen umfüllen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 4000 x g für 15 min bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand.
- Mischen Sie das Algenzellpellet mit 200 μl der Bakteriensuspension (OD600: 0,5) und inkubieren Sie sie in einem Rotationsschüttler bei 21-25 °C bei 150 U/min für 1 h.
- Die Mischkultur (200 μl) wird auf Induktionsmedienplatten verteilt, die mit 15 mM Glukose angereichert sind, und 3 Tage lang bei 21-25 °C im Dunkeln inkubiert.
- Verwenden Sie nach 3 Tagen 10 ml TAP-Medien, ergänzt mit 400 mg/l Cefotaxim oder 20 mg/l Tetracyclin (siehe Materialtabelle), um die Mikroalgen zu sammeln und 2 Tage lang im Dunkeln bei 21-25 °C zu inkubieren, um A. tumefaciens aus der Kultur zu entfernen.
- Tragen Sie 500 μl der Kultur auf selektive Medien auf, z. B. TAP-Medien, die mit 20-70 mg/l Hygromycin B (bei Verwendung von pCAMBIA1302) und 400 mg/l-1 Cefotaxim oder 20 mg/l Tetracyclin ergänzt werden. 2 Tage bei 21-25 °C im Dunkeln inkubieren, bevor sie in eine beleuchtete Kammer gestellt werden.
HINWEIS: Resistente Kolonien erscheinen 5-7 Tage nach der Lichtexposition. - Nehmen Sie einzelne Kolonien von der Transformationsplatte und streifen Sie sie erneut auf TAP-Agarplatten, ergänzt mit 400 mg/l Cefotaxim oder 20 mg/l Tetracyclin und 20-70 mg/l Hygromycin B.
- Um die A. tumefaciens-Kultur für die Co-Kultivierung vorzubereiten, wird die gezüchtete Kultur in ein 50-ml-Röhrchen überführt und bei 4000 x g 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen zweimal mit dem Induktionsmedium.
4. Kolonie-PCR (cPCR) zur Bestätigung der Genintegration in C. vulgaris-Transformanten
- Extrahieren Sie genomische DNA aus einem C. vulgaris-Transformanten nach mindestens zweimaliger Subkultivierung aus einer einzigen Kolonie mit einem pflanzlichen genomischen DNA-Extraktionskit (siehe Materialtabelle). Unter Verwendung dieses Templates für die PCR werden Primer für die mgfp5-Region der T-DNA entworfen (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' und M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
- Führen Sie mit einem Q5-High-Fidelity-DNA-Polymerase-Mastermix-Kit (siehe Materialtabelle) eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch, um die Transgenintegration zu validieren.
ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie wurden die folgenden Bedingungen verwendet: 98 °C für 3 min; 35 Zyklen (98 °C für 10 s, 57 °C für 30 s, 72 °C für 1 min); 72 °C für 5min. Verwenden Sie pCAMBIA1302 als Positivkontrolle und genomische Wildtyp-DNA von C. vulgaris als Negativkontrolle.
- Führen Sie mit einem Q5-High-Fidelity-DNA-Polymerase-Mastermix-Kit (siehe Materialtabelle) eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch, um die Transgenintegration zu validieren.
- Um zu bestätigen, dass aufgrund einer Restkontamination durch A. tumefaciens kein pCAMBIA1302 in der Probe vorhanden ist, verwenden Sie die Kolonie-PCR. Eine kleine Menge transformierender Zellen wird in 10 μl steriles Wasser gegeben und bei 98 °C 15 Minuten lang gekocht. Verwenden Sie dies als Vorlage für die PCR.
- Design von Primern für eine Region außerhalb der T-DNA auf pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' und B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie wurden die folgenden Bedingungen verwendet: 94 °C für 3 min; 30 Zyklen (94 °C für 30 s, 48 °C für 30 s, 68 °C für 5 min); 68 °C für 7 Min. Verwenden Sie eine gekochte Kolonie von A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) als Positivkontrolle und eine gekochte Kolonie von Wildtyp C. vulgaris als Negativkontrolle.
- Design von Primern für eine Region außerhalb der T-DNA auf pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' und B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
- Um zu bestätigen, dass keine A. tumerfaciens-Kontamination in der Probe vorhanden ist, verwenden Sie eine Kolonie-PCR. Eine kleine Menge transformierender Zellen wird in 10 μl steriles Wasser gegeben und bei 98 °C 15 Minuten lang gekocht. Verwenden Sie dies als Vorlage für die PCR.
- Design von Primern für das virE2-Gen, das auf dem AGL-1-Virulenzplasmid enthalten ist (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' und virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie wurden die folgenden Bedingungen verwendet: 94 °C für 3 min; 30 Zyklen (94 °C für 30 s, 53 °C für 30 s, 68 °C für 3 min); 68 °C für 7 Min. Verwenden Sie eine gekochte Kolonie von A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) als Positivkontrolle und eine gekochte Kolonie von Wildtyp C. vulgaris als Negativkontrolle.
- Design von Primern für das virE2-Gen, das auf dem AGL-1-Virulenzplasmid enthalten ist (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' und virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
- PCR-Proben werden auf einem DNA-Agarose-Gel zusammen mit einer Leiter (1 Kbp DNA-Leiter, siehe Materialtabelle) durchgeführt, um die Größe der resultierenden Fragmentezu bestätigen 16.
5. Messung der Fluoreszenz von Transformanten
- Jeder Transformant aus einer logarithmischen Erhaltungskultur oder einem TAP-Agar-Schräggang wird in 50 ml TAP, ergänzt mit 200 mg/L-1 Cefotaxim und 25 mg/L-1 Hygromycin B, geimpft, so dass der Ausgangs-OD 600 = 0,1 ist. Inokulieren Sie eine Kultur mit Wildtyp C. vulgaris und nur 200 mg/L-1 Cefotaxim als Negativkontrolle. Inkubieren bei 25 °C bei 150 U/min mit 150 μmol/m2s photosynthetisch aktivem Licht (siehe Materialtabelle).
- Entnehmen Sie alle 24 Stunden eine 300-μl-Probe und messen Sie die Absorption und Fluoreszenz (Anregung 488 nm, Emission 526 nm) in einem 96-Well-Plattenleser oder UV/Vis-Spektrometer und Fluorometer (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine schwarze Platte mit transparentem Boden für gleichzeitige Messungen.
6. Rohproteinextraktion, Proteinreinigung und SDS-PAGE-Elektrophorese
- Transformant (#50) aus einer Log-Phase-Erhaltungskultur in 300 ml TAP infizieren, ergänzt mit 200 mg/L-1 Cefotaxim und 25 mg/L-1 Hygromycin B, um den OD680 = 0,1 zu erreichen. Inokulieren Sie eine Kultur mit Wildtyp C. vulgaris und nur 200 mg/L-1 Cefotaxim als Negativkontrolle. Inkubieren bei 25 °C bei 150 U/min mit 150 μmol/m2s photosynthetisch aktivem Licht.
- Extrahieren Sie die Rohproteinprobe aus dem Transformanten (#50) und den Wildtyp-Stämmen unter Verwendung von 5 ml Lysepuffer (siehe Tabelle 1), gefolgt von einer 4-minütigen Beschallung.
- Reinigen Sie die Rohproteinprobe mit einem Ni-NTA-Harz durch 5-ml-Polypropylensäulen (siehe Materialtabelle).
- Gefrierophilisieren Sie die gereinigten 15-ml-Proteinproben und resuspendieren Sie sie in 1-ml-Lysepuffer für die SDS-PAGE-Analyse17.
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Representative Results
Um eine erfolgreiche Transformation mit der oben genannten Methode zu zeigen, wurde C. vulgaris entweder mit AGL-1 kokultiviert, das das pCAMBIA1302-Plasmid enthielt, oder ohne das Plasmid (Wildtyp und plattiert auf TAP-Agar, ergänzt mit Hygromycin B und Cefotaxim (Abbildung 1A). Die linke Platte zeigt die transformierten Kolonien, die auf Hygromycin B/Cefotaxim-Platten wachsen können, und die mittlere Platte zeigt, dass Wildtyp-AGL-1 nicht auf den Hygromycin B/Cefotaxim-Platten wachsen kann. Die Platte ganz rechts zeigt, dass C. vulgaris-Transformanten und Wildtyp-Typen wachsen können, wenn keine Selektion verwendet wird (nur Cefotaxim). Einzelne Kolonien wurden mit Hygromycin B und Cefotaxim auf TAP-Agar gestreift (Abbildung 1B). Entwichene Kolonien von der äußersten rechten Platte (Abbildung 1B) wurden mit Hygromycin B und Cefotaxim (Abbildung 1C) auf TAP-Flüssigkeit inokuliert. Aufgrund der unterschiedlichen Expressionsniveaus nach zufälliger Integration von T-DNA wurden die Transformanten ursprünglich auf Platten mit steigenden Konzentrationen von Hygromycin B im Bereich von 25-70 mg/L gefunden. Eine Kolonie von jeder Platte wurde in flüssigen TAP-Medien gezüchtet, die die gleiche Konzentration an Hygromycin B zusammen mit dem Wildtyp C. vulgaris in der niedrigsten Konzentration enthielten (Abbildung 1D). Der Wildtyp C. vulgaris kann in Gegenwart von Hygromycin nicht wachsen, während Kolonien erhalten wurden, die bis zu 70 mg/L resistent sind.
Um zu bestätigen, dass die T-DNA-Kassette stabil in das Genom von C. vulgaris integriert war, wurde jeweils eine Kolonie, die aus den 20, 25, 30, 50 und 70 mg/L Hygromycin-B-Platten ausgewählt wurde, durch wiederholtes Streifen auf TAP-Agarplatten mit zweimaliger Selektion subkultiviert und dann routinemäßig über zehnmal in TAP-Medien subkultiviert. mit den Namen Transformant #20, #25, #30, #50, #50 bzw. #70. Unter Verwendung dieser Kulturen wurde sowohl eine Kolonie-PCR durchgeführt, um eine Kontamination durch pCAMBIA1302 in AGL1 auszuschließen, als auch genomische DNA extrahiert, um zu bestätigen, dass das mGFP5-Gen im Genom von C. vulgaris vorhanden war. In Abbildung 2A wurde die Kolonie-PCR unter Verwendung von Primern durchgeführt, die auf eine 5 kbp-Region außerhalb der T-DNA-Grenze abzielten. Die linke und rechte Grenze der T-DNA konnte diese Region aus dem pCAMBIA1302-Plasmid als Positivkontrolle amplifizieren, aber diese Region war in keiner der C. vulgaris-Proben vorhanden, was darauf hindeutet, dass pCAMBIA1302-DNA in keiner der Kulturen vorhanden war. Die Wildtyp-Probe von C. vulgaris wurde als Negativkontrolle verwendet, und es wurde keine Amplifikation beobachtet.
Genomische DNA wurde aus den Transformanten #25, #50 und #70 extrahiert, und es wurde eine PCR durchgeführt, bei der eine 1763 bp-Region amplifiziert wurde, die das mgfp5-Gen der T-DNA enthielt, um die Integration in die Transformanten zu bestätigen (Abbildung 2B). pCAMBIA1302 wurde als Positivkontrolle verwendet, und die Amplifikation wurde in allen Transformanten nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass das mgfp5-Gen in der gesamten genomischen DNA der Transformanten vorhanden war. Der Wildtyp C. vulgaris wurde als Negativkontrolle verwendet, und es wurde keine Amplifikation beobachtet. Abbildung 2C zeigt die Amplifikation eines 600 bp großen Fragments des Virulenzproteins E2 (VirE2), das im tumorinduzierenden Plasmid (Ti-Plasmid) des AGl1-Stammes gefunden wird. Die Positivkontrolle, bestehend aus dem AGl1-Stamm, der pCAMIA1302 enthielt, wurde erfolgreich mit Primern amplifiziert, was auf das Vorhandensein von A. tumefaciens in der Probe hinweist. Alle Proben von C. vulgaris wurden jedoch negativ auf diese Region getestet, was darauf hindeutet, dass die wiederholte Subkultivierung von Cefotaxim die Kontamination mit AGL1 erfolgreich aus der Kultur eliminierte. Die Wildtyp-Probe von C. vulgaris wurde als Negativkontrolle verwendet, und es wurde keine Amplifikation beobachtet. Zusammengenommen bestätigen diese drei Tests, dass die T-DNA, die mgpf5 enthält, in das Genom von C. vulgaris eingefügt wurde, und diese Ergebnisse waren weder auf die Kontamination mit AGL1 in den Proben noch auf das Vorhandensein von pCAMBIA1302 in den Zellen zurückzuführen. Diese Ergebnisse wiederholten sich nach 20 und etwa 100 Subkulturen der Transformanten, was die langfristige Integration der T-DNA in das Genom bestätigte.
Schließlich wurde der Phänotyp durch Züchtung der Transformanten in TAP-Medien mit Selektion und Messung der Fluoreszenz bestätigt. Dies wurde mit dem Wildtyp C. vulgaris verglichen. Aufgrund der Hintergrundabsorption/Autofluoreszenz von Chlorophyll wurde die Fluoreszenz durch Normalisierung der Daten mit dem Wildtyp-Stamm verglichen. In Abbildung 3A ist zu sehen, dass es einen deutlichen Unterschied im Wachstum zwischen den Transformanten und dem Wildtyp C. vulgaris gibt. Dies könnte möglicherweise auf die mehrfache zufällige Integration der T-DNA in das Genom zurückgeführt werden, die andere zelluläre Prozesse beeinflussen und zu einem langsameren Wachstum führen könnte. Nichtsdestotrotz zeigt Abbildung 3B , dass trotz des geringeren Wachstums alle ausgewählten Stämme höhere Fluoreszenzwerte aufweisen, wenn sie auf die Zelldichte normalisiert werden. Bemerkenswert ist, dass Stamm #70 mit einem p-Wert von <0,01 signifikant höhere Fluoreszenzwerte aufwies als die anderen. Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, zahlreiche Kolonien zu screenen, um Transformanten zu identifizieren, die das gewünschte Protein exprimieren, ohne das allgemeine Wachstumsverhalten negativ zu beeinflussen.
Um die Expression von mGFP5-6xHis zu bestätigen, wurde SDS-PAGE verwendet, um den Rohproteinextrakt und die gereinigten Proteine von C. vulgaris (WT) und C. vulgaris zu analysieren (#50). Anschließend wurde die Aufreinigung des His-Tag-Proteins mit einem Ni-NTA-Harz-Schwerkraft-Flow-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers18 durchgeführt. Abbildung 4 zeigt das Vorhandensein von mGFP5-6xHis Protein (~30 kDa) in der transformativen Probe #50 und kein Protein in der Negativkontrolle (WT C. vulgaris).
Abbildung 1: Wiederfindung von C. vulgaris-Transformanten nach AMT. (A) Nach der Co-Kultivierung von C. vulgaris sind die Transformanten AGL-1, die das pCAMBIA-Plasmid enthalten, oder ohne das Plasmid (nur AGL-1) auf selektiven Platten. (B) Re-streaked Einzelkolonien, ausgewählt aus Hygromycin B (20 mg/L)-Platten auf selektivem TAP-Agar. (C) Entflohenen Kolonien fehlt das Wachstum von AGL1-Platten auf flüssigen Hygromycin-B-Medien (20 mg/l). (D) Wachstum einzelner Kolonien #25, #50 und #50 aus Hygromycin-Selektionsplatten, die in flüssigen TAP-Medien gezüchtet wurden, die Hygromycin und Wildtyp C. vulgaris enthalten, die nicht in Hygromycin-Medien wachsen können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Nachweis einer pCAMBIA1302-Kontamination. (A) Integration von T-DNA in Transformanten (B) und Nachweis einer Kontamination mit A. tumefaciens (C). WT steht für den Wildtyp C. vulgaris, PC für die Positivkontrolle (pCAMBIA1302) und AGL1 für den AGL1-Stamm von A. tumefaciens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Wachstum und Fluoreszenz der Transformanten 3 Tage nach der Inokulation. (A) Wachstum, gemessen an der Absorption bei 680 nm. (B) Fluoreszenz normalisiert auf den Wildtyp-Stamm. Durchschnitt von 3-4 biologischen Replikaten, Fehlerbalken stellen 1 σ dar. *p < 0,05, **p < 0,01 im Vergleich zum Wildtyp (WT). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: SDS-PAGE-Analyse der mGFP5-6xIs-Expression in C. vulgaris (WT) und transformierte C. vulgaris-Probe #50. Die Extrakte wurden aus rohen, gereinigten (erste Wäsche), gereinigten (verdünnten) und gereinigten (konzentrierten) Extrakten aus C. vulgaris (WT), Spuren 1-4, hergestellt. Roh, gereinigt (erste Wäsche), gereinigt (eluiert) und gereinigt (lyophilisiert) von C. vulgaris (WT), Spuren 5-8. Das rote Kästchen zeigt das gereinigte GFP-6xIs-Protein aus dem Transformanten #70 an. Die Proteine wurden auf einem 12%igen Polyacrylamid-Gel getrennt. Die Molekulargewichte (MWs) der Proteinstandards (Std.) sind auf der rechten Seite dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Name des Mediums/Puffers | Zusammensetzung | ||
| PFUND | 5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L Trypton, 5 g/L NaCl | ||
| KLOPFEN | 20 mM Trisbase, 1,58 mMK2HPO4, 2,4 mM KH2PO4, 7,0mM NH4 Cl, 0,83 mM MgSO4, 0,34 mM CaCl2, 1 ml/L Eisessig und je 1 mL/L F/2 mittlere Spurenmetalle und F/2-Vitamine | ||
| F/2 mittlere Spurenmetalle | 22 mg/L ZnSO 4·7H 2O, 180 mg/L MnCl 2·4H 2O, 6,3 mg/L Na 2 MoO 4·2H 2 O, 14 mg/L CoCl 2·6H 2 O, 9,8 mg/L CuSO 4,5H 2 O, 3,15 g/L FeCl3,6H 2 O, 4,36 g/L Na 2 EDTA·2H 2 O | ||
| F/2 mittlere Vitamine | 0,1 mM Vitamin B12 (Cyanocobalamin), 25 mg/L Biotin, 335 mg/L Thiamin, 50 mM HEPES-Puffer pH 7,8 | ||
| Lyse-Puffer | 20 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, pH7,4 | ||
Tabelle 1: Medien- und Pufferrezepte.
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Discussion
Die Effizienz der Transformation ist mit mehreren verschiedenen Parametern verbunden. Die Wahl der A. tumefaciens-Stämme, die für AMT verwendet werden, ist entscheidend. AGL-1 ist einer der invasivsten Stämme, die entdeckt wurden, und wird aus diesem Grund routinemäßig in pflanzlichen AMT eingesetzt. Die Ergänzung des Induktionsmediums mit Glukose (15-20 mM) ist ebenfalls wichtig für die AMT-Effizienz. In Anbetracht der Tatsache, dass C. vulgaris sowohl unter phototrophen als auch unter heterotrophen Bedingungen wachsen kann, werden Glukose oder andere Kohlenstoffquellen oft in Mikroalgenmedien weggelassen, um eine Kontamination zu verhindern. Zum Beispiel ist Bold's Basal Medium (BBM) das am häufigsten verwendete Medium für die phototrophe Kultivierung von C. vulgaris19. BBM unterstützt jedoch nicht das Wachstum von A. tumefaciens, da es keine organische Kohlenstoffquelle und Ammonium als bevorzugte Stickstoffquelle gibt (BBM verwendet Nitrat)20. Daher wurde in dieser Arbeit TAP-Medien verwendet, da sie Acetat als Kohlenstoffquelle für C. vulgaris, Glukose für A. tumefaciens und Ammonium als Stickstoffquelle enthalten, die beide Arten nutzen können. TAP-Agarplatten ermöglichen auch viel schnellere Wachstumsraten für C. vulgaris, wodurch die Zeit für die Rückgewinnung von Transformanten nach AMT minimiert wird. Um Ti-Plasmid-Virulenzproteine zu induzieren, müssen dem Induktionsmedium zusätzlich 200 μM Acetosyringon zugesetzt werden.
Um A. tumefaciens nach AMT aus der Kultur zu eliminieren, wurde Cefotaxim zusammen mit serieller Passage eingesetzt. AGL-1 ist resistent gegen Ampicillin, Chloramphenicol, Rifamycin und Streptomycin und empfindlich gegen Cefotaxim, Tetracyclin, Spectinomycin und Kanamycin. In Pflanzen wird Cefotaxim häufig zur Eliminierung von A. tumefaciens eingesetzt, da es bei vielen Pflanzenarten eine geringere phytotoxische Wirkung auf die Sprossenregeneration hat als andere Antibiotika21. Wir haben jedoch auch bestätigt, dass Tetracyclin (das etwa 100-mal weniger kostet) anstelle von Cefotaxim in diesem Protokoll verwendet werden kann, wenn es mit einer seriellen Passage aus einer einzigen Kolonie kombiniert wird (Daten nicht gezeigt). Dies liegt wahrscheinlich daran, dass Antibiotika wie Tetracyclin die Proteinsynthese im Chloroplasten von Pflanzen hemmen würden, die auf die Photosynthese angewiesen sind22. C. vulgaris kann jedoch im Dunkeln wachsen, wenn es mit Acetat ergänzt wird, was bedeutet, dass eine Chloroplasten-Dysfunktion unter sorgfältig ausgewählten Bedingungen nicht unbedingt toxisch für diese Art ist.
Obwohl 20 mg/l Hygromycin B ausreichten, um das Wachstum von Wildtyp C. vulgaris zu verhindern, wurde eine Reihe von Hygromycin-B-Konzentrationen (20-70 mg/l) getestet. Es ist möglich, dass Kolonien, die von Platten mit höherer Konzentration isoliert wurden, mehrere integrierte Kopien der T-DNA aufweisen oder dass sich die T-DNA in einer transkriptionell aktiveren Region des Genoms befindet, was zu einer höheren Expression der Hygromycin-B-Phosphotransferase führt, was zu einer schnelleren Inaktivierung des Herbizids und einer geringeren Verzögerung des Kulturwachstums führt23. Mehrere Kopien könnten der Grund für die Unterschiede in der Intensität der PCR-Produkte bei der Amplifikation von mgfp5 aus dem Genom sein (Abbildung 2B). Das Vorhandensein von GFP-6xHis Protein in der gereinigten Probe während der SDS-PAGE-Analyse (Abbildung 4, Spur 8) und seine Abwesenheit im Wildtyp-Stamm (Abbildung 4, Spur 4) bestätigt, dass AMT und pCAMBIA1302 für eine erfolgreiche Expression und stabile Integration von Transgen in C. vulgaris verwendet werden können.
In dieser Arbeit haben wir ein Protokoll für die zuverlässige Transformation von C. vulgaris UTEX 395 unter Verwendung von A. tumefaciens AGL-1 und einem pCAMBIA Systemplasmid entwickelt und optimiert. Da alle Stämme und Plasmide, die für diese Arbeit benötigt werden, aus verschiedenen Quellen verfügbar sind, ist diese Methode in jedem Labor leicht zu replizieren. Als einer der wichtigsten industriellen Mikroalgenstämme wird eine Standard-Referenzmethode für eine zuverlässige AMT entscheidend sein, um C. vulgaris für biotechnologische Anwendungen zu entwickeln.
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Disclosures
Es wurden keine Interessenkonflikte gemeldet.
Acknowledgments
Die Autoren danken Prof. Paul Hooykaas für die freundliche Bereitstellung des pCAMBIA1302-Vektors und des Agrobacterium tumefaciens AGL1 vom Institut für Biologie Leiden, Universität Leiden, Niederlande. Die Autoren danken auch Eva Colic für ihre Hilfe bei der Züchtung der fluoreszierenden Transformanten. Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada und dem Mitacs Accelerate-Programm finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
References
- Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
- Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
- Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
- Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W.
- Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
- de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G.
- Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
- Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
- Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
- Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
- Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
- Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
- NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
- Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
- Morton, E. R., Fuqua, C.
- Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
- Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
- Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).
