Summary
Dit protocol schetst het gebruik van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) voor het integreren van gen(en) van belang in het nucleaire genoom van de groene microalg Chlorella vulgaris, wat leidt tot de productie van stabiele transformatoren.
Abstract
Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) dient als een veelgebruikt hulpmiddel voor het manipuleren van plantengenomen. A. tumefaciens vertoont echter het vermogen tot genoverdracht naar een breed scala aan soorten. Talloze soorten microalgen missen gevestigde methoden om genen die van belang zijn betrouwbaar te integreren in hun nucleaire genoom. Om de potentiële voordelen van microalgenbiotechnologie te benutten, zijn eenvoudige en efficiënte hulpmiddelen voor genoommanipulatie cruciaal. Hierin wordt een geoptimaliseerd AMT-protocol gepresenteerd voor de industriële microalgensoort Chlorella vulgaris, waarbij gebruik wordt gemaakt van het reporter groen fluorescerend eiwit (mGFP5) en de antibioticaresistentiemarker voor Hygromycine B. Mutanten worden geselecteerd door middel van plating op Tris-Acetaat-Fosfaat (TAP) media die Hygromycine B en cefotaxime bevatten. De expressie van mGFP5 wordt gekwantificeerd via fluorescentie na meer dan tien generaties subculturing, wat wijst op de stabiele transformatie van de T-DNA-cassette. Dit protocol maakt het mogelijk om in minder dan twee weken op betrouwbare wijze meerdere transgene C. vulgaris-kolonies te genereren, waarbij gebruik wordt gemaakt van de in de handel verkrijgbare pCAMBIA1302 plantenexpressievector.
Introduction
Agrobacterium tumefaciens, een gramnegatieve bodembacterie, bezit een uniek vermogen tot genoverdracht tussen koninkrijken, waardoor het de titel "natuurlijke genetische ingenieur" heeft gekregen1. Deze bacterie kan DNA (T-DNA) overbrengen van een tumor-inducerend plasmide (Ti-Plasmide) naar gastheercellen via een Type IV-secretiesysteem, wat resulteert in de integratie en expressie van het T-DNA in het gastheergenoom 1,2,3,4. In de natuurlijke omgeving leidt dit proces tot tumorvorming in planten, algemeen bekend als kroongalziekte. Agrobacterium kan echter ook T-DNA overbrengen naar verschillende andere organismen, waaronder gist, schimmels, algen, zee-egelembryo's en zelfs menselijke cellen onder laboratoriumomstandigheden 5,6,7,8.
Door gebruik te maken van dit natuurlijke systeem, maakt Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) de willekeurige integratie van gen(en) van belang in het nucleaire genoom van een gastheercel mogelijk door het T-DNA-gebied van het Ti-plasmide te wijzigen. Voor dit doel is een veelgebruikte AMT-plantenexpressievector pCAMBIA13029. Onderzoekers kunnen eenvoudige kloonworkflows gebruiken in E. coli voordat ze de gewenste vector overbrengen naar A. tumefaciens voor latere overdracht naar de gastheer van belang.
Groene microalgen zijn eukaryoten die veel overeenkomsten vertonen met landplanten, maar zeer recalcitrant zijn voor genetische modificatie. Genetische transformatie speelt echter een cruciale rol in zowel fundamenteel als biotechnologisch onderzoek naar microalgen. In verschillende microalgensoorten, met name Chlamydomonas reinhardtii, heeft genetische transformatie via AMT met succes transgenen geïntroduceerd zoals humaan interleukine-2 (hIL-2), het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2-receptorbindende domein (SARS-CoV-2 RBD) en twee antimicrobiële peptiden (AMP's)10,11,12,13. Chlorella vulgaris, een minder kieskeurige en snelgroeiende groene algensoort, heeft een aanzienlijk potentieel voor de duurzame productie van koolhydraten, eiwitten, nutraceuticals, pigmenten en andere hoogwaardigeverbindingen14. Het gebrek aan betrouwbare instrumenten voor het creëren van transgene stammen van C. vulgaris belemmert echter de commerciële vooruitgang ervan. Aangezien er slechts een beperkt aantal gepubliceerde werken zijn gepubliceerd waarin AMT in C. vulgaris15 wordt gebruikt, en gezien de aanzienlijke verschillen tussen de kweek van planten en microalgen, wordt het optimaliseren van het AMT-protocol essentieel.
In deze studie plaatsten onderzoekers groen fluorescerend eiwit (mGFP5) stroomafwaarts van de Cauliflower Mosaic Virus (CamV) 35S-promotor en voegden een histidine-tag toe om het te gebruiken als een reporter-gen voor eiwitexpressie. Transformanten werden geselecteerd met behulp van hygromycine B en na meer dan twintig generaties subculturatie bleef de transformatie stabiel. Het pCAMBIA1302-plasmide dat in dit werk wordt gebruikt, kan gemakkelijk worden aangepast om elk interessant gen te bevatten. Bovendien kunnen de gepresenteerde methode en materialen worden aangepast voor andere groene algensoorten met een actieve CamV35S-promotor, aangezien deze promotor wordt gebruikt voor hygromycineselectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle media en oplossingen moeten voor gebruik worden geautoclaveerd, tenzij anders vermeld. Alle centrifugebuisjes, pipetpunten, enz. moeten voor gebruik steriel of geautoclaveerd zijn. Voor het gemak zijn de mediarecepten die in dit protocol worden gebruikt, vermeld in tabel 1.
1. Bereiding van elektrocompetente cellen van A. tumefaciens
- Inoculeer Agrobacterium (AGL-1) in een steriele schudkolf van 25 ml LB-media (aangevuld met rifampicine, 20 mg/L-1) uit een bevroren glycerolvoorraad en laat een nacht groeien bij 28-30 °C en 150 rpm.
OPMERKING: De Agrobacterium-stam AGL-1 is (zie materiaaltabel) resistent tegen rifampicine, ampicilline, chlooramfenicol en streptomycine en kan bij verschillende leveranciers worden verkregen. - Verdun de volgende dag de cultuur 1,00,000-voudig door 0,5 μL van de nachtelijke cultuur toe te voegen aan 50 ml geautoclaveerd ultrazuiver water en verdeel 10 μL van deze verdunde cultuur op een LB-plaat en incubeer vervolgens gedurende 1-3 dagen bij 28-30 °C.
- Kies een kolonie en start een nachtelijke kweek van 20 ml in LB met rifampicine bij 28-30 °C.
- Inoculeer de volgende dag 500 ml LB-media (geen antibioticum) in een schudkolf met 9 ml van de nachtcultuur en kweek bij 28-30 °C totdat de OD600 0,5 bereikt.
- Verdeel de cultuur gelijkmatig over tien centrifugebuisjes van 50 ml en zet 30 minuten op ijs in de koelkast. Koel de centrifuge voor op 4 °C.
- Centrifugeer de buisjes bij 4 °C en 4000 x g gedurende 15 min. Verwijder vervolgens zoveel mogelijk supernatant met behulp van een pipet en resuspendeer de pellet in elk buisje in 50 ml ijskoud water.
- Centrifugeer de cellen bij 4 °C en 4000 x g gedurende 15 min. Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 25 ml ijskoud water in elke buis.
- Centrifugeer de cellen bij 4 °C en 4000 x g gedurende 15 min. Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoude 10% (w/v) glycerol in elke tube.
- Combineer alle buisjes in één buisje van 50 ml en centrifugeer de cellen bij 4 °C en 4000 x g gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 400 μL ijskoude 10% (m/v) glycerol. De celconcentratie moet ongeveer 1-3 x 1010 cellen/ml zijn.
- Verdeel de cellen als aliquots van 50 μl in steriele voorgekoelde microbuisjes. Vries in vloeibare stikstof in en bewaar in een vriezer van -80 °C.
2. Elektroporatie van A. tumefaciens
- Voeg 50 μl elektrocompetente cellen AGL-1 A. tumefaciens toe aan een voorgekoelde cuvet van 0,1 mm en voeg 2 μl pCAMBIA1302 of een soortgelijk plasmide (conc 15 ng/μl) toe (zie materiaaltabel).
- Elektroporaat bij 2400 V met behulp van een elektroporator (200 Ω, capaciteitsversterker 250 μFD, capaciteit 25 μFD, exponentieel verval, zie Materiaaltabel). De tijdconstante moet >4,5 ms zijn voor succesvolle elektroporatie met exponentieel verval.
- Voeg onmiddellijk 1 ml LB-media toe aan de cuvet en pipetteer voorzichtig op en neer om te mengen. Breng de 1 ml geresuspendeerde cellen over in een microbuis van 1,5 ml en incubeer deze bij 28-30 °C gedurende ten minste 1 uur om te herstellen.
- Plaat de cellen op LB-agar met het juiste antibioticum (d.w.z. 50 mg/L kanamycine voor pCAMBIA1302 voor prokaryote selectie).
- Incubeer bij 28-30 °C gedurende 2-3 dagen.
- Selecteer een kolonie, kweek 's nachts in LB met de juiste selectie (50 mg/L kanamycine voor pCAMBIA1302) en cryopreservatie van de plasmidebevattende stam met 50% glycerol bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
3. AMT van C. vulgaris
OPMERKING: Bereid C. vulgaris (UTEX 395, zie materiaaltabel) en A. tumefaciens culturen parallel voor voor co-cultivatie. Met de culturen van C. vulgarimoet 3 dagen voor de bereiding van de culturen van A. tumefaciens worden begonnen. Het protocol is aangepast op basis van het protocol dat is gepubliceerd door Kumar et al.7.
- Bereid C. vulgaris-cultuur voor
- C. vulgaris wordt traditioneel op hellingen opgeslagen of in logfaseculturen onder verlichte omstandigheden gehouden. Verspreid 0,5 ml van een logfasecultuur bij OD600 = 1,0 op een agarplaten van trisacetaatfosfaat (TAP, zie tabel 1) ( 1,2% m/v agar A) en kweek gedurende 5 dagen bij 25 °C met belichting (50 μE/m2s). Dit levert ongeveer 5 x 106 cellen op.
- Bereid A. tumefaciens-cultuur voor
- Kweek de A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302-stam in een schudkolf door 10 ml LB-media te inoculeren, aangevuld met 15 mM glucose, 20 mg/l rifampicine en 50 mg/l kanamycine (zie materiaaltabel) met behulp van de glycerolvoorraad. Incubeer bij 28-30 °C en 250 tpm gedurende een nacht.
- Inoculeer 1 ml 's nachts in 50 ml LB met 15 mM glucose, 20 mg/L rifampicine en 50 mg/L kanamycine en incubeer bij 28-30 °C en 250 tpm totdat de OD600 1,0 bereikt.
- Cocultiveer C. vulgaris en A. tumefaciens
- Om de A. tumefaciens-cultuur voor te bereiden op co-cultivatie, brengt u de gekweekte cultuur over in een buis van 50 ml en centrifugeert u deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op 4000 x g . Verwijder het supernatans met behulp van een pipet en was de cellen twee keer met het inductiemedium.
OPMERKING: De gebruikte inductiemedia zijn TAP-media aangepast aan pH 5,5 en aangevuld met F/2 medium sporenmetalen en vitaminen met 200 μM acetosyringon (AS, zie Materiaaltabel). Resuspendeer de cellen in inductiemedia zodanig dat OD600 = 0,5. - Om de C. vulgaris-cultuur voor te bereiden op co-cultivatie, voegt u 25 ml inductiemedia toe aan de C. vulgaris-plaat met ~ 5 x 106 cellen. Breng over naar een tube van 50 ml. Centrifugeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur bij 4000 x g en gooi het supernatant weg.
- Meng de algencelkorrel met 200 μL van de bacteriële suspensie (OD600: 0,5) en incubeer ze gedurende 1 uur in een roterende schudder bij 21-25 °C bij 150 rpm.
- Verdeel de mengcultuur (200 μL) over inductieplaten aangevuld met 15 mM glucose en incubeer gedurende 3 dagen bij 21-25 °C in het donker.
- Gebruik na 3 dagen 10 ml TAP-media aangevuld met 400 mg/l cefotaxime of 20 mg/l tetracycline (zie materiaaltabel) om de microalgen te verzamelen en gedurende 2 dagen in het donker bij 21-25 °C te incuberen om A. tumefaciens uit de kweek te verwijderen.
- Plaat 500 μL van de kweek op selectieve media, bijv. TAP-media aangevuld met 20-70 mg/L Hygromycine B (bij gebruik van pCAMBIA1302) en 400 mg/L-1 cefotaxime of 20 mg/L tetracycline. Incubeer 21-25 °C gedurende 2 dagen in het donker voordat u ze in een verlichte kamer plaatst.
OPMERKING: Resistente kolonies verschijnen 5-7 dagen na blootstelling aan licht. - Pluk enkele kolonies van de transformatieplaat en streep ze opnieuw op TAP-agarplaten aangevuld met 400 mg/L cefotaxime of 20 mg/L tetracycline en 20-70 mg/L Hygromycine B.
- Om de A. tumefaciens-cultuur voor te bereiden op co-cultivatie, brengt u de gekweekte cultuur over in een buis van 50 ml en centrifugeert u deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op 4000 x g . Verwijder het supernatans met behulp van een pipet en was de cellen twee keer met het inductiemedium.
4. Kolonie-PCR (cPCR) om genintegratie in C. vulgaris-transformanten te bevestigen
- Genoom-DNA extraheren uit een C. vulgaris-transformant na ten minste twee keer subcultureren uit een enkele kolonie met behulp van een DNA-extractiekit voor het genoom van planten (zie Materiaaltabel). Gebruik dit als sjabloon voor PCR en ontwerp primers voor het mgfp5-gebied van het T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3', en M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
- Gebruik een Q5 high-fidelity DNA-polymerase master mix kit (zie Tabel met materialen) om polymerasekettingreactie (PCR) uit te voeren om transgenintegratie te valideren.
OPMERKING: Voor dit onderzoek zijn de volgende omstandigheden gebruikt: 98 °C gedurende 3 minuten; 35 cycli (98 °C gedurende 10 s, 57 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 1 min); 72 °C gedurende 5min. Gebruik pCAMBIA1302 als positieve controle en wildtype C. vulgaris genoom-DNA als negatieve controle.
- Gebruik een Q5 high-fidelity DNA-polymerase master mix kit (zie Tabel met materialen) om polymerasekettingreactie (PCR) uit te voeren om transgenintegratie te valideren.
- Om te bevestigen dat er geen pCAMBIA1302 in het monster aanwezig is als gevolg van restbesmetting door A. tumefaciens, gebruikt u kolonie-PCR. Voeg een kleine hoeveelheid transformatorcellen toe aan 10 μL steriel water en kook op 98 °C gedurende 15 min. Gebruik dit als sjabloon voor PCR.
- Ontwerpprimers voor een gebied buiten het T-DNA op pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' en B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
OPMERKING: Voor dit onderzoek zijn de volgende voorwaarden gebruikt: 94 °C gedurende 3 minuten; 30 cycli (94 °C gedurende 30 s, 48 °C gedurende 30 s, 68 °C gedurende 5 min); 68 °C gedurende 7 min. Gebruik een gekookte kolonie van A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) als positieve controle en een gekookte kolonie van wildtype C. vulgaris als negatieve controle.
- Ontwerpprimers voor een gebied buiten het T-DNA op pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' en B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
- Om te bevestigen dat er geen besmetting met A. tumerfaciens in het monster aanwezig is, gebruikt u kolonie-PCR. Voeg een kleine hoeveelheid transformatorcellen toe aan 10 μL steriel water en kook op 98 °C gedurende 15 min. Gebruik dit als sjabloon voor PCR.
- Ontwerp primers voor het virE2-gen op het AGL-1-virulentieplasmide (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' en virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
OPMERKING: Voor dit onderzoek zijn de volgende voorwaarden gebruikt: 94 °C gedurende 3 minuten; 30 cycli (94 °C gedurende 30 s, 53 °C gedurende 30 s, 68 °C gedurende 3 min); 68 °C gedurende 7 min. Gebruik een gekookte kolonie van A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) als positieve controle en een gekookte kolonie van wildtype C. vulgaris als negatieve controle.
- Ontwerp primers voor het virE2-gen op het AGL-1-virulentieplasmide (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' en virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
- Voer PCR-monsters uit op een DNA-agarosegel samen met een ladder (1 Kbp DNA-ladder, zie Tabel met materialen) om de grootte van de resulterende fragmenten te bevestigen16.
5. Meten van de fluorescentie van transformatoren
- Inoculeer elk transformatiemiddel uit een log-fase onderhoudscultuur of TAP-agar-helling in 50 ml TAP aangevuld met 200 mg/L-1 cefotaxime en 25 mg/L-1 hygromycine B, zodanig dat de begin-OD 600 = 0,1. Inoculeer één kweek met wildtype C. vulgaris en slechts 200 mg/L-1 cefotaxime als negatieve controle. Incubeer bij 25 °C bij 150 omw/min met 150 μmol/m2s fotosynthetisch actief licht (zie materiaaltabel).
- Neem elke 24 uur een monster van 300 μl en meet de extinctie en fluorescentie (excitatie 488 nm, emissie 526 nm) in een plaatlezer met 96 putjes of UV/Vis-spectrometer en fluorometer (zie materiaaltabel). Gebruik een zwarte plaat met een transparante bodem voor gelijktijdige metingen.
6. Extractie van ruw eiwit, eiwitzuivering en SDS-PAGE-elektroforese
- Inoculeer transformant (#50) uit een log-fase onderhoudscultuur in 300 ml TAP aangevuld met 200 mg/L-1 cefotaxime en 25 mg/L-1 hygromycine B om de OD680 = 0,1 te bereiken. Inoculeer één kweek met wildtype C. vulgaris en slechts 200 mg/L-1 cefotaxime als negatieve controle. Incubeer bij 25 °C bij 150 omw/min met 150 μmol/m2s fotosynthetisch actief licht.
- Extraheer het ruw eiwitmonster uit de transformant (#50) en wildtype stammen met behulp van 5 ml lysisbuffer (zie tabel 1), gevolgd door sonicatie gedurende 4 minuten.
- Zuiver het ruw eiwitmonster met een Ni-NTA-hars door polypropyleenkolommen van 5 ml (zie materiaaltabel).
- Lyofiliseer de 15 ml gezuiverde eiwitmonsters en resuspendeer ze in 1 ml lysisbuffer voor SDS-PAGE-analyse17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om een succesvolle transformatie met behulp van de bovenstaande methode aan te tonen, werd C. vulgaris gecoculteerd met AGL-1 met het pCAMBIA1302-plasmide of zonder het plasmide (wildtype en verguld op TAP-agar aangevuld met hygromycine B en cefotaxime (figuur 1A). De meest linkse plaat toont de getransformeerde kolonies die in staat zijn om te groeien op Hygromycine B/cefotaxime-platen, en de middelste plaat laat zien dat wild-type AGL-1 niet kan groeien op de Hygromycine B/cefotaxime-platen. De meest rechtse plaat laat zien dat wanneer er geen selectie wordt gebruikt (alleen cefotaxime), C. vulgaris transformanten en wildtype kunnen groeien. Enkelvoudige kolonies werden gestreept op TAP-agar met hygromycine B en cefotaxime (figuur 1B). Ontsnapte kolonies van de meest rechtse plaat (Figuur 1B) werden geënt op TAP-vloeistof met Hygromycine B en cefotaxime (Figuur 1C). Als gevolg van variabele expressieniveaus na willekeurige integratie van T-DNA, werden transformanten oorspronkelijk teruggevonden op platen met toenemende concentraties Hygromycine B variërend van 25-70 mg/L. Van elke plaat werd één kolonie gekweekt in vloeibare TAP-media die dezelfde concentratie hygromycine B bevatten, samen met het wildtype C. vulgaris in de laagste concentratie (figuur 1D). Het wildtype C. vulgaris kan niet groeien in aanwezigheid van hygromycine, terwijl kolonies werden verkregen die resistent zijn tot 70 mg/l.
Om te bevestigen dat de T-DNA-cassette stabiel was geïntegreerd in het genoom van C. vulgaris, werd één kolonie geselecteerd uit elk van de 20, 25, 30, 50 en 70 mg/L Hygromycine B-platen die elk werden gesubcultureerd door herhaalde strepen op TAP-agarplaten met selectie twee keer en vervolgens routinematig meer dan tien keer gesubcultureerd in TAP-media, genaamd Transformant #20, #25, #30, #50, #50 en #70 respectievelijk. Met behulp van deze culturen werd zowel kolonie-PCR uitgevoerd om besmetting door pCAMBIA1302 in AGL1 uit te sluiten, als werd genomisch DNA geëxtraheerd om te bevestigen dat het mGFP5-gen aanwezig was in het C. vulgaris-genoom. In figuur 2A werd kolonie-PCR uitgevoerd met behulp van primers gericht op een gebied van 5 kbp buiten de linker- en rechtergrens van het T-DNA, die in staat waren om dit gebied te amplificeren van pCAMBIA1302-plasmide als een positieve controle, maar dit gebied was niet aanwezig in een van de C. vulgaris-monsters, wat aangeeft dat pCAMBIA1302-DNA in geen van de culturen aanwezig was. Het wildtype C. vulgaris-monster werd gebruikt als negatieve controle en er werd geen amplificatie gezien.
Genoom-DNA werd geëxtraheerd uit transformanten #25, #50 en #70, en PCR werd uitgevoerd, waarbij een regio van 1763 bp met het mgfp5-gen van het T-DNA werd geamplificeerd om de integratie in de transformanten te bevestigen (Figuur 2B). pCAMBIA1302 werd gebruikt als positieve controle en amplificatie werd gedetecteerd in alle transformatoren, wat aangeeft dat het mgfp5-gen aanwezig was in het genomische DNA van alle transformanten. De wildtype C. vulgaris werd gebruikt als negatieve controle en er werd geen versterking gezien. Figuur 2C toont de amplificatie van een fragment van 600 bp van het virulentie-eiwit E2 (VirE2) dat wordt aangetroffen in het tumor-inducerende plasmide (Ti-plasmide) van de AGl1-stam. De positieve controle, bestaande uit de AGl1-stam die pCAMIA1302 bevat, werd met succes geamplificeerd met primers, wat wijst op de aanwezigheid van A. tumefaciens in het monster. Alle C. vulgaris-monsters testten echter negatief voor deze regio, wat aangeeft dat herhaalde subculturatie op cefotaxime met succes de besmetting van AGL1 uit de cultuur elimineerde. Het wildtype C. vulgaris-monster werd gebruikt als negatieve controle en er werd geen amplificatie waargenomen. Alles bij elkaar genomen bevestigen deze drie tests dat het T-DNA dat mgpf5 bevat, in het genoom van C. vulgaris is ingebracht, en deze resultaten waren niet te wijten aan de besmetting van AGL1 in de monsters, noch aan de aanwezigheid van pCAMBIA1302 in de cellen. Deze resultaten werden herhaald na 20 en ongeveer 100 subculturen van de transformanten, wat de langetermijnintegratie van het T-DNA in het genoom bevestigde.
Ten slotte werd het fenotype bevestigd door de transformanten in TAP-media te kweken met selectie en het meten van de fluorescentie. Dit werd vergeleken met de wildtype C. vulgaris. Vanwege de achtergrondabsorptie/autofluorescentie van chlorofyl werd de fluorescentie vergeleken door de gegevens te normaliseren naar de wildtype stam. In figuur 3A is te zien dat er een merkbaar verschil in groei is tussen de transformanten en de wildtype C. vulgaris. Dit kan mogelijk worden toegeschreven aan de meerdere willekeurige integraties van het T-DNA in het genoom, die andere cellulaire processen kunnen beïnvloeden en tot een langzamere groei kunnen leiden. Desalniettemin benadrukt figuur 3B dat ondanks de lagere groei, alle geselecteerde stammen hogere fluorescentieniveaus vertonen wanneer ze worden genormaliseerd voor celdichtheid. Met name stam #70 vertoonde significant hogere fluorescentieniveaus dan de andere, met een p-waarde van <0,01. Dit benadrukt het belang van het screenen van talrijke kolonies om transformanten te identificeren die het gewenste eiwit tot expressie brengen zonder het algehele groeigedrag negatief te beïnvloeden.
Om de expressie van mGFP5-6xHis te bevestigen, werd SDS-PAGE gebruikt om het ruw eiwitextract en de gezuiverde eiwitten van zowel C. vulgaris (WT) als C. vulgaris transformant (#50) te analyseren . Vervolgens werd de his-tag-eiwitzuivering uitgevoerd met behulp van een Ni-NTA-harszwaartekrachtstroomkit volgens het protocol van de fabrikant18. Figuur 4 toont de aanwezigheid van mGFP5-6xHis eiwit (~30 kDa) in het transformatiemonster #50 en geen eiwit in de negatieve controle (WT C. vulgaris).
Figuur 1: Recuperatie van C. vulgaris-transformanten na AMT. (A) Na co-cultivatie van C. vulgaris zijn transformanten AGL-1 met het pCMBIA-plasmide of zonder het plasmide (alleen AGL-1) op selectieve platen. (B) Opnieuw gestreepte enkelvoudige kolonies geselecteerd uit Hygromycine B (20 mg/L)-platen op selectieve TAP-agar. (C) Ontsnapte kolonies missen groei van AGL1-plaat met alleen Hygromycine B (20 mg/L) vloeibare media. (D) Groei van enkelvoudige kolonies #25, #50 en #50 uit Hygromycine-selectieplaten gekweekt in vloeibare TAP-media die Hygromycine en wildtype C. vulgaris bevatten die niet kunnen groeien in Hygromycine-media. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Detectie van pCAMBIA1302-contaminatie . (A) Integratie van T-DNA in transformatoren (B) en detectie van A. tumefaciens contaminatie (C). WT geeft wildtype C. vulgaris aan, PC is de positieve controle (pCAMBIA1302) en AGL1 geeft A. tumefaciens AGL1-stam aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Groei en fluorescentie van de transformatoren 3 dagen na inoculatie. (A) Groei gemeten aan de hand van de extinctie bij 680 nm. (B) Fluorescentie genormaliseerd naar de wild-type stam. Gemiddelde van 3-4 biologische replicaten, foutbalken vertegenwoordigen 1 σ. *p < 0,05, **p < 0,01 in vergelijking met het wildtype (WT). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: SDS-PAGE-analyse van mGFP5-6xHis expressie in C. vulgaris (WT) en getransformeerde C. vulgaris sample #50. Extracten werden bereid uit respectievelijk ruw, gezuiverd (eerste wasbeurt), gezuiverd (verdund) en gezuiverd (geconcentreerd) uit C. vulgaris (WT), banen 1-4. Ruw, gezuiverd (eerste wasbeurt), gezuiverd (geëlueerd) en gezuiverd (gevriesdroogd) van C. vulgaris (WT), respectievelijk banen 5-8. Het rode vakje geeft gezuiverd GFP-6xHis eiwit van transformant #70 aan. Eiwitten werden gescheiden op een polyacrylamide 12% gel. De molecuulgewichten (MW's) van de eiwitstandaarden (Std.) worden rechts weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam van het medium/buffer | Compositie | ||
| POND | 5 g/l gistextract, 10 g/l trypton, 5 g/l NaCl | ||
| KRAAN | 20 mM Tris-base, 1,58 mM K 2 HPO 4, 2,4 mM KH 2 PO 4, 7,0 mM NH 4 Cl, 0,83 mM MgSO4, 0,34 mM CaCl 2, 1 ml/l ijsazijn en 1 ml/l van elk F/2 medium sporenmetaal en F/2-vitamines | ||
| F/2 middelmatige sporenmetalen | 22 mg/L ZnSO 4·7H 2 O, 180 mg/L MnCl 2·4H 2 O, 6,3 mg/L Na 2 MoO 4·2H 2 O, 14 mg/L CoCl 2·6H 2 O, 9,8 mg/L CuSO 4·5H 2 O, 3,15 g/L FeCl3·6H 2 O, 4,36 g/L Na 2 EDTA·2H 2 O | ||
| F/2 medium vitaminen | 0,1 mM Vitamine B12 (cyanocobalamine), 25 mg/L Biotine, 335 mg/L Thiamine, 50 mM HEPES Buffer pH 7,8 | ||
| Lysis Buffer | 20 mM Na2HPO 4, 300 mM NaCl, pH7,4 | ||
Tabel 1: Media- en bufferrecepten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De efficiëntie van transformatie wordt geassocieerd met verschillende parameters. De keuze van A. tumefaciens-stammen die voor AMT worden gebruikt, is cruciaal. AGL-1 is een van de meest invasieve stammen die is ontdekt en wordt om deze reden routinematig gebruikt in AMT van planten. Het aanvullen van de inductiemedia met glucose (15-20 mM) is ook belangrijk voor de AMT-efficiëntie. Aangezien C. vulgaris kan groeien in zowel fototrofe als heterotrofe omstandigheden, worden glucose of andere koolstofbronnen vaak weggelaten uit microalgenmedia om besmetting te voorkomen. Bold's Basal Medium (BBM) is bijvoorbeeld het meest gebruikte medium voor de fototrofe teelt van C. vulgaris19. BBM ondersteunt de groei van A. tumefaciens echter niet vanwege het ontbreken van een organische koolstofbron en ammonium als stikstofbron die de voorkeur heeft (BBM gebruikt nitraat)20. Daarom werd TAP-media in dit werk gebruikt omdat het acetaat bevat als koolstofbron voor C. vulgaris, glucose voor A. tumefaciens en ammonium als stikstofbron die beide soorten kunnen gebruiken. TAP-agarplaten zorgen ook voor veel snellere groeisnelheden voor C. vulgaris, waardoor de tijd om transformatoren na AMT te herstellen tot een minimum wordt beperkt. Om Ti-plasmide-virulentie-eiwitten te induceren, moet ook 200 μM acetosyringon aan de inductiemedia worden toegevoegd.
Om A. tumefaciens na AMT uit de kweek te elimineren, werd cefotaxime, samen met seriële passaging, gebruikt. AGL-1 is resistent tegen ampicilline, chlooramfenicol, rifamycine en streptomycine, en het is gevoelig voor cefotaxime, tetracycline, spectinomycine en kanamycine. In planten wordt cefotaxime vaak gebruikt om A. tumefaciens te elimineren, omdat het bij veel plantensoorten een lager fytotoxisch effect heeft op de regeneratie van scheuten dan andere antibiotica21. We hebben echter ook bevestigd dat tetracycline (dat ongeveer 100 keer minder kost) in dit protocol kan worden gebruikt in plaats van cefotaxime in combinatie met seriële passaging van een enkele kolonie (gegevens niet getoond). Dit komt waarschijnlijk omdat antibiotica zoals tetracycline de eiwitsynthese in de chloroplast zouden remmen in planten die afhankelijk zijn van fotosynthese. C. vulgaris kan echter in het donker groeien wanneer het wordt aangevuld met acetaat, wat betekent dat chloroplastdisfunctie onder zorgvuldig gekozen omstandigheden niet noodzakelijkerwijs giftig is voor deze soort.
Hoewel 20 mg/L Hygromycine B voldoende was om de groei van wildtype C. vulgaris te voorkomen, werd een reeks Hygromycine B-concentraties (20-70 mg/L) getest. Het is mogelijk dat kolonies die zijn geïsoleerd uit platen met een hogere concentratie meerdere geïntegreerde kopieën van het T-DNA hebben of dat het T-DNA zich in een meer transcriptioneel actief gebied van het genoom bevindt, wat resulteert in een hogere expressie van het hygromycine B-fosfotransferase, wat resulteert in een snellere inactivatie van het herbicide en minder vertraging in de kweekgroei23. Meerdere kopieën kunnen de reden zijn voor de verschillen in de intensiteit van de PCR-producten bij het amplificeren van mgfp5 uit het genoom (Figuur 2B). De aanwezigheid van GFP-6xHis eiwit in het gezuiverde monster tijdens SDS-PAGE-analyse (Figuur 4, Lane 8) en de afwezigheid ervan in de wild-type stam (Figuur 4, Lane 4) bevestigt dat AMT en pCAMBIA1302 kunnen worden gebruikt voor succesvolle expressie en stabiele integratie van transgen in C. vulgaris.
In dit werk hebben we een protocol ontwikkeld en geoptimaliseerd voor betrouwbare C. vulgaris UTEX 395-transformatie met behulp van A. tumefaciens AGL-1 en een pCMBIA-systeemplasmide. Aangezien alle stammen en plasmiden die nodig zijn voor dit werk beschikbaar zijn uit verschillende bronnen, zal deze methode gemakkelijk te repliceren zijn in elk laboratorium. Als een van de belangrijkste industriële stammen van microalgen zal een standaard referentiemethode voor betrouwbare AMT cruciaal zijn voor het ontwikkelen van C. vulgaris voor biotechnologische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er werden geen belangenconflicten gemeld.
Acknowledgments
De auteurs willen Prof. Paul Hooykaas bedanken voor het beschikbaar stellen van de pCAMBIA1302 vector en Agrobacterium tumefaciens AGL1 van het Instituut Biologie Leiden, Universiteit Leiden, Nederland. De auteurs willen ook Eva Colic bedanken voor haar hulp bij het kweken van de fluorescerende transformatoren. Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada en het Mitacs Accelerate-programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
References
- Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
- Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
- Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
- Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W.
- Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
- de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G.
- Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
- Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
- Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
- Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
- Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
- Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
- NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
- Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
- Morton, E. R., Fuqua, C.
- Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
- Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
- Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).
