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Bioengineering

Engenharia Genética Mediada por Agrobacterium tumefaciens de Microalgas Verdes, Chlorella vulgaris

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65382
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, University of Waterloo

Summary

Este protocolo descreve a utilização da transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) para integrar gene(s) de interesse no genoma nuclear da microalga verde Chlorella vulgaris, levando à produção de transformantes estáveis.

Abstract

A transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) serve como uma ferramenta amplamente empregada para manipular genomas de plantas. No entanto, A. tumefaciens exibe a capacidade de transferência gênica para diversas espécies. Numerosas espécies de microalgas carecem de métodos bem estabelecidos para integrar de forma confiável genes de interesse em seu genoma nuclear. Para aproveitar os benefícios potenciais da biotecnologia de microalgas, ferramentas simples e eficientes de manipulação do genoma são cruciais. Neste trabalho, um protocolo AMT otimizado é apresentado para a espécie de microalgas industriais Chlorella vulgaris, utilizando a proteína fluorescente verde repórter (mGFP5) e o marcador de resistência a antibióticos para Hygromycin B. Os mutantes são selecionados através de plaqueamento em meio Tris-Acetato-Fosfato (TAP) contendo Higromicina B e cefotaxima. A expressão de mGFP5 é quantificada via fluorescência após mais de dez gerações de subcultivo, indicando a transformação estável do de T-DNA. Este protocolo permite a geração confiável de múltiplas colônias transgênicas de C. vulgaris em menos de duas semanas, empregando o vetor de expressão vegetal pCAMBIA1302 comercialmente disponível.

Introduction

Agrobacterium tumefaciens, uma bactéria gram-negativa transmitida pelo solo, possui uma capacidade única de transferência de genes entre reinos, o que lhe rendeu o título de "engenheiro genético natural"1. Essa bactéria pode transferir DNA (T-DNA) de um plasmídeo indutor de tumor (Ti-Plasmid) para as células hospedeiras através de um sistema de secreção Tipo IV, resultando na integração e expressão do DNA-T no genoma do hospedeiro1,2,3,4. No ambiente natural, esse processo leva à formação de tumores em plantas, comumente conhecida como doença da galha da coroa. No entanto, a Agrobacterium também pode transferir o DNA-T para vários outros organismos, incluindo leveduras, fungos, algas, embriões de ouriço-do-mar e até mesmo células humanas em condições de laboratório 5,6,7,8.

Explorando este sistema natural, a transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) permite a integração aleatória de gene(s) de interesse no genoma nuclear de uma célula hospedeira, modificando a região T-DNA do plasmídeo Ti. Para isso, um vetor de expressão de plantas AMT amplamente utilizado é o pCAMBIA13029. Os pesquisadores podem empregar fluxos de trabalho de clonagem simples em E. coli antes de transferir o vetor desejado para A. tumefaciens para posterior transferência para o hospedeiro de interesse.

As microalgas verdes são eucariotos que compartilham muitas semelhanças com as plantas terrestres, mas são altamente recalcitrantes à modificação genética. No entanto, a transformação genética desempenha um papel crucial na pesquisa fundamental e biotecnológica de microalgas. Em várias espécies de microalgas, particularmente Chlamydomonas reinhardtii, a transformação genética via AMT introduziu com sucesso transgenes como a interleucina-2 humana (hIL-2), o domínio de ligação ao receptor 2 da síndrome respiratória aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2 RBD) e dois peptídeos antimicrobianos (AMPs)10,11,12,13. Dentre estas, Chlorella vulgaris, uma espécie de alga verde menos fastidiosa e de crescimento rápido, possui significativo potencial para a produção sustentável de carboidratos, proteínas, nutracêuticos, pigmentos e outros compostos de alto valor14. No entanto, a falta de ferramentas confiáveis para a criação de cepas transgênicas de C. vulgaris dificulta seu progresso comercial. Uma vez que há apenas um número limitado de trabalhos publicados utilizando AMT em C. vulgaris15, e dadas as diferenças consideráveis entre o cultivo de plantas e microalgas, a otimização do protocolo AMT torna-se essencial.

Neste estudo, os pesquisadores inseriram a proteína fluorescente verde (mGFP5) a jusante do promotor 35S do Cauliflower Mosaic Virus (CamV) e adicionaram uma etiqueta de histidina para usá-la como um gene repórter para a expressão da proteína. Os transformantes foram selecionados usando higromicina B e, após subcultivo por mais de vinte gerações, a transformação permaneceu estável. O plasmídeo pCAMBIA1302 empregado neste trabalho pode ser facilmente adaptado para conter qualquer gene de interesse. Além disso, o método e os materiais apresentados podem ser ajustados para outras espécies de algas verdes com um promotor CamV35S ativo, uma vez que este promotor é usado para a seleção de higromicina.

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Protocol

Todos os suportes e soluções devem ser autoclavados antes da utilização, salvo indicação em contrário. Todos os tubos de centrífuga, pontas de pipeta, etc., devem ser estéreis ou autoclavados antes do uso. Para facilitar a consulta, as receitas de mídia utilizadas neste protocolo estão listadas na Tabela 1.

1. Preparação de células eletrocompetentes de A. tumefaciens

  1. Inocular Agrobacterium (AGL-1) em um frasco de 25 mL de agitador estéril de meio LB (suplementado com rifampicina, 20 mg/L-1) a partir de um estoque congelado de glicerol e crescer durante a noite a 28-30 °C e 150 rpm.
    NOTA: A estirpe Agrobacterium AGL-1 é (ver Tabela de Materiais) resistente à rifampicina, ampicilina, cloranfenicol e estreptomicina e pode ser obtida de vários fornecedores.
  2. No dia seguinte, diluir a cultura em 1.00.000 vezes adicionando 0,5 μL da cultura noturna a 50 mL de água ultrapura autoclavada e espalhar 10 μL dessa cultura diluída em uma placa LB e, em seguida, incubar a 28-30 °C por 1-3 dias.
  3. Escolher uma colônia e iniciar uma cultura noturna de 20 mL em LB com rifampicina a 28-30 °C.
  4. No dia seguinte, inocular 500 mL de LB (sem antibiótico) em um frasco agitador com 9 mL da cultura noturna e crescer a 28-30 °C até que o OD600 atinja 0,5.
  5. Divida a cultura uniformemente em dez tubos de centrífuga de 50 mL e resfrie no gelo por 30 min. Pré-resfriar a centrífuga a 4 °C.
  6. Centrifugar os tubos a 4 °C e 4000 x g durante 15 min. Em seguida, remova o sobrenadante possível usando uma pipeta e ressuspenda o pellet em cada tubo em 50 mL de água gelada.
  7. Centrifugar as células a 4 °C e 4000 x g durante 15 min. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 25 mL de água gelada em cada tubo.
  8. Centrifugar as células a 4 °C e 4000 x g durante 15 min. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de glicerol gelado a 10% (p/v) em cada tubo.
  9. Juntar todos os tubos num tubo de 50 ml e centrifugar as células a 4 °C e 4000 x g durante 15 minutos. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 400 μL de glicerol gelado a 10% (p/v). A concentração celular deve ser de cerca de 1-3 x 1010 células/mL.
  10. Distribuir as células como alíquotas de 50 μL em microtubos pré-resfriados estéreis. Congelar em azoto líquido e conservar num congelador de -80 °C.

2. Eletroporação de A. tumefaciens

  1. Adicionar 50 μL de células eletrocompetentes de AGL-1 A. tumefaciens a uma cubeta pré-refrigerada de 0,1 mm e adicionar 2 μL de pCAMBIA1302 ou plasmídeo similar (conc 15 ng/μL) (ver Tabela de Materiais).
  2. Electroporato a 2400 V utilizando um electroporator (200 Ω, extensor de capacitância 250 μFD, capacitância 25 μFD, decaimento exponencial, ver Tabela de Materiais). A constante de tempo deve ser de >4,5 ms para eletroporação bem-sucedida com decaimento exponencial.
  3. Adicione imediatamente 1 ml de meio LB à cubeta e pipete suavemente para cima e para baixo para misturar. Transfira o 1 mL de células ressuspensas para um microtubo de 1,5 mL e incube-o a 28-30 °C por pelo menos 1 h para se recuperar.
  4. Plaquear as células em ágar LB contendo o antibiótico apropriado (ou seja, 50 mg/L de canamicina para pCAMBIA1302 para seleção procariótica).
  5. Incubar a 28-30 °C durante 2-3 dias.
  6. Selecionar uma colônia, crescer durante a noite em LB com a seleção apropriada (50 mg/L de canamicina para pCAMBIA1302) e criopreservar a cepa contendo plasmídeo usando glicerol a 50% a -80 °C para uso futuro.

3. AMT de C. vulgaris

NOTA: Preparar as culturas de C. vulgaris (UTEX 395, ver Tabela de Materiais) e A. tumefaciens em paralelo para co-cultivo. As culturas de C. vulgaridevem ser iniciadas 3 dias antes do preparo das culturas de A. tumefaciens. O protocolo foi modificado com base no publicado por Kumar et al.7.

  1. Preparar a cultura de C. vulgaris
    1. C. vulgaris é tradicionalmente armazenada em inclinações ou mantida em culturas de fase logarítmica em condições iluminadas. A partir de uma cultura em fase logarítmica a OD600 = 1,0, espalhe 0,5 mL em placas de ágar Tris-Acetato-Fosfato (TAP, ver Tabela 1) ( 1,2% p/v ágar A) e cresça por 5 dias a 25 °C com iluminação (50 μE/m2s). Isso produzirá aproximadamente 5 x 106 células.
  2. Preparar a cultura de A. tumefaciens
    1. Cultivar A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 em um frasco agitador inoculando 10 mL de meio LB suplementado com 15 mM de glicose, 20 mg/L de rifampicina e 50 mg/L de canamicina (ver Tabela de Materiais) usando o estoque de glicerol. Incubar a 28-30 °C e 250 rpm durante a noite.
    2. Inocular 1 mL de cultura noturna em 50 mL de LB com 15 mM de glicose, 20 mg/L de rifampicina e 50 mg/L de canamicina e incubar a 28-30 °C e 250 rpm até que o OD600 atinja 1,0.
  3. Cocultivar C. vulgaris e A. tumefaciens
    1. Para preparar a cultura de A. tumefaciens para o co-cultivo, transferir a cultura cultivada para um tubo de 50 mL e centrifugar a 4000 x g por 30 min à temperatura ambiente. Retire o sobrenadante com pipeta e lave as células duas vezes com o meio de indução.
      NOTA: O meio de indução utilizado é o meio TAP ajustado para pH 5,5 e suplementado com metais traços do meio F/2 e vitaminas com 200 μM de acetosirona (AS, ver Tabela de Materiais). Ressuspender as células em meios de indução de forma que OD600 = 0,5.
    2. Para preparar a cultura de C. vulgaris para co-cultivo, adicionar 25 mL de meio de indução à placa de C. vulgaris contendo ~ 5 x 106 células. Transfira para um tubo de 50 mL. Centrifugar as células a 4000 x g durante 15 min à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante.
    3. Misturar o pellet de células algais com 200 μL da suspensão bacteriana (OD600: 0,5) e incubá-los num agitador rotativo a 21-25 °C a 150 rpm durante 1 h.
    4. Espalhar a cultura mista (200 μL) em placas de indução suplementadas com 15 mM de glicose e incubar a 21-25 °C no escuro por 3 dias.
    5. Após 3 dias, utilizar 10 mL de meio TAP suplementado com 400 mg/L de cefotaxima ou 20 mg/L de tetraciclina (ver Tabela de Materiais) para coletar as microalgas e incubar no escuro a 21-25 °C por 2 dias para eliminar A. tumefaciens da cultura.
    6. Placa de 500 μL da cultura em meio seletivo, por exemplo, meio TAP suplementado com 20-70 mg/L de higromicina B (quando usando pCAMBIA1302) e 400 mg/L-1 de cefotaxima ou 20 mg/L de tetraciclina. Incubar 21-25 °C no escuro por 2 dias antes de colocá-los em uma câmara iluminada.
      NOTA: Colônias resistentes aparecerão 5-7 dias após a exposição à luz.
    7. Escolher colônias únicas da placa de transformação e re-estriá-las em placas de ágar TAP suplementadas com 400 mg/L de cefotaxima ou 20 mg/L de tetraciclina e 20-70 mg/L de higromicina B.

4. PCR de colônia (cPCR) para confirmar a integração gênica em transformadores de C. vulgaris

  1. Extrair DNA genômico de um transformador de C. vulgaris após subcultivo de pelo menos duas vezes de uma única colônia usando um kit de extração de DNA genômico vegetal (ver Tabela de Materiais). Usando isso como um modelo para PCR, projetam primers para a região mgfp5 do T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3', e M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
    1. Usando um kit mestre de mistura de DNA polimerase de alta fidelidade Q5 (consulte Tabela de Materiais), realize a reação em cadeia da polimerase (PCR) para validar a integração transgênica.
      OBS: As seguintes condições foram utilizadas para o presente estudo: 98 °C por 3 min; 35 ciclos (98 °C por 10 s, 57 °C por 30 s, 72 °C por 1 min); 72 °C por 5min. Utilizar o pCAMBIA1302 como controle positivo e o DNA genômico selvagem de C. vulgaris como controle negativo.
  2. Para confirmar que não há pCAMBIA1302 presente na amostra devido à contaminação residual por A. tumefaciens, utilizar PCR de colônia. Adicionar uma pequena quantidade de células transformantes a 10 μL de água estéril e ferver a 98 °C durante 15 minutos. Use isso como um modelo para PCR.
    1. Primers de projeto para uma região fora do T-DNA em pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' e B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      LEGENDA: As seguintes condições foram utilizadas para o presente estudo: 94 °C por 3 min; 30 ciclos (94 °C por 30 s, 48 °C por 30 s, 68 °C por 5 min); 68 °C por 7 min. Utilizar uma colônia fervida de A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) como controle positivo e uma colônia fervida de C. vulgaris selvagem como controle negativo.
  3. Para confirmar que não há contaminação por A. tumerfaciens presente na amostra, use PCR de colônia. Adicionar uma pequena quantidade de células transformantes a 10 μL de água estéril e ferver a 98 °C durante 15 minutos. Use isso como um modelo para PCR.
    1. Iniciar o projeto do gene virE2 contido no plasmídeo de virulência AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' e virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      LEGENDA: As seguintes condições foram utilizadas para o presente estudo: 94 °C por 3 min; 30 ciclos (94 °C por 30 s, 53 °C por 30 s, 68 °C por 3 min); 68 °C por 7 min. Utilizar uma colônia fervida de A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) como controle positivo e uma colônia fervida de C. vulgaris selvagem como controle negativo.
  4. Executar amostras de PCR em um gel de DNA agarose juntamente com uma escada (escada de DNA de 1 Kbp, ver Tabela de Materiais) para confirmar o tamanho dos fragmentos resultantes16.

5. Medição da fluorescência de transformantes

  1. Inocular cada transformador a partir de uma cultura de manutenção log-fase ou ágar TAP inclinado em 50 mL de TAP suplementado com 200 mg/L-1 de cefotaxima e 25 mg/L-1 de higromicina B de tal forma que o OD inicialseja de 600 = 0,1. Inocular uma cultura com C. vulgaris selvagem e apenas 200 mg/L-1 de cefotaxima como controle negativo. Incubar a 25 °C a 150 rpm com 150 μmol/m2s de luz fotossinteticamente activa (ver Tabela de Materiais).
  2. A cada 24 h, pegue 300 μL de amostra e meça a absorbância e fluorescência (excitação 488 nm, emissão 526 nm) em um leitor de placas de 96 poços ou espectrômetro e fluorômetro UV/Vis (ver Tabela de Materiais). Use uma placa preta com fundo transparente para medições simultâneas.

6. Extração de proteína bruta, purificação de proteínas e eletroforese em SDS-PAGE

  1. Inocular o transformador (#50) de uma cultura de manutenção log-fase em 300 mL de TAP suplementado com 200 mg/L-1 de cefotaxima e 25 mg/L-1 de higromicina B para atingir o OD680 = 0,1. Inocular uma cultura com C. vulgaris selvagem e apenas 200 mg/L-1 de cefotaxima como controle negativo. Incubar a 25 °C a 150 rpm com 150 μmol/m2s de luz fotossinteticamente ativa.
  2. Extrair a amostra de proteína bruta do transformador (#50) e das estirpes selvagens utilizando 5 ml de tampão de lise (ver Tabela 1), seguido de sonicação durante 4 minutos.
  3. Purificar a amostra de proteína bruta com uma resina Ni-NTA através de colunas de polipropileno de 5 ml (ver Tabela de Materiais).
  4. Liofilizar as amostras de proteína purificada de 15 mL e ressuspendê-las em tampão de lise de 1 mL para análise de SDS-PAGE17.

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Representative Results

Para mostrar sucesso na transformação usando o método acima, C. vulgaris foi cocultivada com AGL-1 contendo o plasmídeo pCAMBIA1302 ou sem o plasmídeo (selvagem e plaqueado em ágar TAP suplementado com higromicina B e cefotaxima (Figura 1A). A placa mais à esquerda mostra as colônias transformadas capazes de crescer nas placas de higromicina B/cefotaxima, e a placa do meio mostra que a AGL-1 selvagem não pode crescer nas placas de higromicina B/cefotaxima. A placa mais à direita mostra que, quando nenhuma seleção é usada (somente cefotaxima), os transformadores de C. vulgaris e o tipo selvagem podem crescer. Colônias únicas foram semeadas em ágar TAP com higromicina B e cefotaxima (Figura 1B). As colônias que escaparam da placa mais à direita (Figura 1B) foram inoculadas no líquido TAP com higromicina B e cefotaxima (Figura 1C). Devido aos níveis variáveis de expressão após a integração aleatória do T-DNA, os transformantes foram originalmente recuperados em placas com concentrações crescentes de higromicina B variando de 25-70 mg/L. Uma colônia de cada placa foi cultivada em meio líquido TAP contendo a mesma concentração de higromicina B juntamente com C . vulgaris selvagem na menor concentração (Figura 1D). O selvagem C. vulgaris não pode crescer na presença de higromicina, enquanto colônias resistentes até 70 mg/L foram obtidas.

Para confirmar que o de T-DNA foi integrado de forma estável ao genoma de C. vulgaris, uma colônia selecionada de cada uma das placas de 20, 25, 30, 50 e 70 mg/L de higromicina B foi subcultivada por dedilhados repetidos em placas de ágar TAP com seleção duas vezes e, em seguida, rotineiramente subcultivada em meios TAP mais de dez vezes, nomeado transformador #20, #25, #30, #50, #50 e #70, respectivamente. Usando essas culturas, ambas as PCR de colônias foram realizadas para descartar contaminação por pCAMBIA1302 em AGL1, e DNA genômico foi extraído para confirmar a presença do gene mGFP5 no genoma de C. vulgaris. Na Figura 2A, a PCR das colônias foi realizada utilizando primers direcionados a uma região de 5 kbp fora das bordas esquerda e direita do T-DNA foram capazes de amplificar essa região do plasmídeo pCAMBIA1302 como controle positivo, mas esta região não estava presente em nenhuma das amostras de C. vulgaris , indicando que o DNA pCAMBIA1302 não estava presente em nenhuma das culturas. A amostra selvagem de C. vulgaris foi utilizada como controle negativo, não sendo observada amplificação.

O DNA genômico foi extraído dos transformantes #25, #50 e #70, e a PCR foi realizada, amplificando uma região de 1763 pb contendo o gene mgfp5 do T-DNA para confirmar a integração nos transformantes (Figura 2B). pCAMBIA1302 foi usado como controle positivo, e amplificação foi detectada em todos os transformantes, indicando que o gene mgfp5 estava presente em todo o DNA genômico dos transformantes. O selvagem C. vulgaris foi usado como controle negativo, e nenhuma amplificação foi observada. A Figura 2C mostra a amplificação de um fragmento de 600 pb da proteína de virulência E2 (VirE2) encontrada no plasmídeo indutor de tumor (plasmídeo Ti) da cepa AGl1. O controle positivo, constituído pela linhagem AGl1 contendo pCAMIA1302, foi amplificado com sucesso com primers, indicando a presença de A. tumefaciens na amostra. No entanto, todas as amostras de C. vulgaris foram negativas para esta região, indicando que subculturas repetidas em cefotaxima eliminaram com sucesso a contaminação de AGL1 da cultura. A amostra selvagem de C. vulgaris foi empregada como controle negativo, e nenhuma amplificação foi observada. Em conjunto, esses três testes confirmam que o DNA-T contendo mgpf5 foi inserido no genoma de C. vulgaris, e esses resultados não foram devidos à contaminação de AGL1 nas amostras nem à presença de pCAMBIA1302 nas células. Estes resultados foram repetidos após 20 e aproximadamente 100 subculturas dos transformantes, confirmando a integração a longo prazo do T-DNA no genoma.

Finalmente, o fenótipo foi confirmado pelo crescimento dos transformantes em meios TAP com seleção e medição da fluorescência. Isso foi comparado com o tipo selvagem C. vulgaris. Devido à absorbância/autofluorescência de fundo da clorofila, a fluorescência foi comparada normalizando os dados para a cepa selvagem. Na Figura 3A, observa-se que há uma diferença notável no crescimento entre os transformadores e o selvagem C. vulgaris. Isso poderia ser potencialmente atribuído às múltiplas integrações aleatórias do T-DNA no genoma, que podem estar impactando outros processos celulares e levando a um crescimento mais lento. No entanto, a Figura 3B destaca que, apesar do menor crescimento, todas as cepas selecionadas exibem níveis mais elevados de fluorescência quando normalizadas para densidade celular. Notavelmente, a cepa #70 demonstrou níveis de fluorescência significativamente maiores que as demais, com um valor de p de <0,01. Isso enfatiza a importância de rastrear numerosas colônias para identificar transformantes que expressam a proteína desejada sem afetar negativamente o comportamento de crescimento global.

Para confirmar a expressão de mGFP5-6xHis, SDS-PAGE foi usado para analisar o extrato de proteína bruta e suas proteínas purificadas de C. vulgaris (WT) e C. vulgaris transformante (#50). Posteriormente, a purificação da proteína foi feita com um kit de fluxo gravitacional de resina Ni-NTA, seguindo o protocolo do fabricante18. A Figura 4 mostra a presença da proteína mGFP5-6xHis (~30 kDa) na amostra transformante #50 e nenhuma proteína no controle negativo (WT C. vulgaris).

Figure 1
Figura 1: Recuperação de transformadores de C. vulgaris após AMT. (A) Após o co-cultivo de C. vulgaris,os transformantes são AGL-1 contendo o plasmídeo pCAMBIA ou sem o plasmídeo (AGL-1 apenas) em placas seletivas. (B) Colônias únicas com estrias selecionadas de placas de higromicina B (20 mg/L) em ágar TAP seletivo. (C) As colônias escapadas não apresentam crescimento da placa AGL1 apenas em meio líquido de higromicina B (20 mg/L). (D) Crescimento de colônias únicas #25, #50 e #50 a partir de placas de seleção de Hygromycin cultivadas em meios TAP líquidos contendo Hygromycin e C. vulgaris selvagem que não podem crescer em meios de Hygromycin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Detecção de contaminação por pCAMBIA1302. (A) Integração do DNA-T em transformadores (B) e detecção da contaminação por A. tumefaciens (C). WT indica C. vulgaris selvagem, PC é o controle positivo (pCAMBIA1302) e AGL1 indica cepa AGL1 de A. tumefaciens AGL1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Crescimento e fluorescência dos transformantes aos 3 dias pós-inoculação. (A) Crescimento medido pela absorbância a 680 nm. (B) Fluorescência normalizada para a cepa selvagem. Média de 3-4 réplicas biológicas, barras de erro representam 1 σ. *p < 0,05, **p < 0,01 quando comparado ao selvagem-tipo (WT). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise em SDS-PAGE da expressão de mGFP5-6xHis em C. vulgaris (WT) e transformada C. vulgaris amostra #50. Os extratos foram preparados a partir de crude, purificado (primeira lavagem), purificado (diluído) e purificado (concentrado) de C. vulgaris (WT), raias 1-4, respectivamente. Bruto, purificado (primeira lavagem), purificado (eluído) e purificado (liofilizado) de C. vulgaris (WT), faixas 5-8, respectivamente. A caixa vermelha indica a proteína GFP-6xHis purificada do transformante #70. As proteínas foram separadas em gel de poliacrilamida a 12%. Os pesos moleculares (MWs) dos padrões proteicos (Std.) são mostrados à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome da mídia/buffer Composição
LB 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de triptona, 5 g/L de NaCl
TORNEIRA 20 mM Tris base, 1,58 mM K 2 HPO 4, 2,4 mM KH 2 PO 4, 7,0 mM NH 4 Cl, 0,83 mM MgSO 4, 0,34 mM CaCl 2, 1 mL/L de ácido acético glacial e 1 mL/L de cada meio F/2 metais traço e vitaminas F/2
F/2 metais traços médios 22 mg/L ZnSO 4·7H 2 O, 180 mg/L MnCl 2·4H 2 O, 6,3 mg/L Na 2 MoO 4·2H 2 O, 14 mg/L CoCl 2·6H 2 O, 9,8 mg/L CuSO 4·5H 2 O, 3,15 g/L FeCl3·6H 2 O, 4,36 g/L Na 2 EDTA·2H 2O
F/2 vitaminas médias 0,1 mM Vitamina B12 (cianocobalamina), 25 mg/L Biotina, 335 mg/L Tiamina, 50 mM Tampão HEPES pH 7,8
Buffer de lise 20 mM Na2HPO 4, 300 mM NaCl, pH7,4

Tabela 1: Receitas de mídia e buffer.

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Discussion

A eficiência da transformação está associada a vários parâmetros diferentes. A escolha das cepas de A. tumefaciens utilizadas para TMA é crucial. A AGL-1 é uma das cepas mais invasivas descobertas e, por esse motivo, tem sido rotineiramente utilizada em plantas AMT. A suplementação do meio de indução com glicose (15-20 mM) também é importante para a eficiência da AMT. Considerando que C. vulgaris pode crescer em condições fototróficas e heterotróficas, glicose ou outras fontes de carbono são frequentemente omitidas dos meios de microalgas para evitar contaminação. Por exemplo, o meio basal de Bold (BBM) é o meio mais comumente usado para o cultivo fototrófico de C. vulgaris19. No entanto, a BBM não suporta o crescimento de A. tumefaciens devido à falta de uma fonte de carbono orgânico e amônio como fonte de nitrogênio que prefere (BBM usa nitrato)20. Portanto, o meio TAP foi utilizado neste trabalho por conter acetato como fonte de carbono para C. vulgaris, glicose para A. tumefaciens e amônio como fonte de nitrogênio que ambas as espécies podem utilizar. As placas de ágar TAP também permitem taxas de crescimento muito mais rápidas para C. vulgaris, minimizando o tempo de recuperação de transformantes após AMT. Para induzir proteínas de virulência do plasmídeo Ti, 200 μM de acetoseringona também devem ser adicionados ao meio de indução.

Para eliminar A. tumefaciens da cultura após TMA, foi utilizada cefotaxima, juntamente com passagem seriada. O AGL-1 é resistente à ampicilina, cloranfenicol, rifamicina e estreptomicina, e é sensível à cefotaxima, tetraciclina, espectinomicina e canamicina. Em plantas, a cefotaxima é frequentemente utilizada para eliminar A. tumefaciens por apresentar menor efeito fitotóxico para a regeneração da parte aérea em muitas espécies vegetais do que outros antibióticos21. No entanto, também confirmamos que a tetraciclina (que custa cerca de 100 vezes menos) poderia ser usada em vez da cefotaxima neste protocolo quando combinada com a passagem seriada de uma única colônia (dados não mostrados). Isso provavelmente ocorre porque antibióticos como a tetraciclina inibiriam a síntese proteica no cloroplasto em plantas dependentes da fotossíntese22. No entanto, C. vulgaris pode crescer no escuro quando suplementado com acetato, o que significa que a disfunção dos cloroplastos não é necessariamente tóxica para esta espécie sob condições cuidadosamente escolhidas.

Embora 20 mg/L de Hygromycin B tenham sido suficientes para prevenir o crescimento de C. vulgaris selvagem, uma faixa de concentrações de Hygromycin B (20-70 mg/L) foi testada. É possível que colônias isoladas de placas de maior concentração possam ter múltiplas cópias integradas do T-DNA ou que o T-DNA esteja localizado em uma região transcricionalmente mais ativa do genoma, resultando em maior expressão da higromicina B fosfotransferase, resultando em inativação mais rápida do herbicida e menor tempo de retardo no crescimento da cultura23. Múltiplas cópias podem ser a razão para as diferenças na intensidade dos produtos da PCR ao amplificar mgfp5 a partir do genoma (Figura 2B). A presença da proteína GFP-6xHis na amostra purificada durante a análise de SDS-PAGE (Figura 4, pista 8) e sua ausência na cepa selvagem (Figura 4, raia 4) confirmam que AMT e pCAMBIA1302 podem ser usados para expressão bem sucedida e integração estável do transgene em C. vulgaris.

Neste trabalho, desenvolvemos e otimizamos um protocolo para transformação UTEX 395 confiável de C. vulgaris usando A. tumefaciens AGL-1 e um plasmídeo do sistema pCAMBIA. Como todas as cepas e plasmídeos necessários para este trabalho estão disponíveis de várias fontes diferentes, este método será fácil de replicar em qualquer laboratório. Como uma das mais importantes linhagens industriais de microalgas, um método de referência padrão para AMT confiável será crucial para a engenharia de C. vulgaris para aplicações biotecnológicas.

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Disclosures

Não foram declarados conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Paul Hooykaas por gentilmente fornecer o vetor pCAMBIA1302 e Agrobacterium tumefaciens AGL1 do Instituto de Biologia de Leiden, Universidade de Leiden, Holanda. Os autores também gostariam de agradecer a Eva Colic por sua ajuda no crescimento dos transformantes fluorescentes. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá e pelo programa Mitacs Acelerar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Kb Plus DNA ladder FroggaBio DM015
Acetosyringone Fisher Scientific D26665G
Agrobacterium tumefaciens Gold Biotechnologies Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin Enzo Life Sciences 89151-400
CaCl2·2H2O VWR BDH9224-1KG
Cefotaxime AK Scientific J90010
Chlorella vulgaris University of Texas at Austin Culture Collection of Algae Strain: UTEX 395 Wildtype strain
CoCl2·6H2O Sigma Aldrich C8661-25G
CuSO4·5H2O EMD Millipore CX2185-1
FeCl3·6H2O VWR BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator Bio-Rad 1652662 Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit Thermo Scientific K0791
Glacial acetic acid VWR CABDH3093-2.2P
Glycerol BioBasic GB0232
HEPES Buffer Sigma Aldrich H-3375
Hygromycin B Fisher Scientific AAJ6068103
K2HPO4 VWR BDH9266-500G
Kanamycin Gold Biotechnologies K-250-25
KH2PO4 VWR BDH9268-500G
MgSO4·7H2O VWR 97062-134
MnCl2·4H2O JT Baker BAKR2540-01
Na2CO3 VWR BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O JT Baker 8993-01
Na2MoO4·2H2O JT Baker BAKR3764-01
NaCl VWR BDH7257-7
NaH2PO4 H2O Millipore Sigma CA80058-650
NaNO3  VWR BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin NewEngland BioLabs NEB #S1427
NH4Cl VWR BDH9208-500G
pCAMBIA1302 Leiden University Gift from Prof. Paul Hooykaas pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL) QIAGEN 34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL Bio-Rad 1610363
Rifampicin Millipore Sigma R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch  SunBlaster 210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer  BioTEK S4MLFPTA
Tetracycline Thermo Scientific Chemicals CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% Bio-Rad 1610185
Thiamine TCI America T0181-100G
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Tryptone BioBasic TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin) Enzo Life Sciences 89151-436
Yeast Extract BioBasic G0961
ZnSO4·7H2O JT Baker 4382-01

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References

  1. Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
  2. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  3. De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
  4. Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
  5. Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
  6. Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
  7. Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
  8. de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
  9. Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
  10. Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
  11. Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
  12. Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
  13. Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
  14. Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
  15. Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
  17. Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
  18. NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
  19. Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 1: Unit 3D.1 (2012).
  21. Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
  22. Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
  23. Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).

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Transformação mediada por Agrobacterium Tumefaciens Engenharia Genética Microalgas Verdes Chlorella Vulgaris Protocolo AMT Gene Reporter Proteína Verde Fluorescente (mGFP5) Marcador de Resistência a Antibióticos Higromicina B Seleção de Mutantes Meio Tris-Acetato-Fosfato (TAP) Transformação Estável de T-DNA Colônias Transgênicas PCAMBIA1302 Vetor de Expressão Vegetal
Engenharia Genética Mediada por <em>Agrobacterium tumefaciens</em> de Microalgas Verdes, <em>Chlorella vulgaris</em>
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Roushan, M. R., Chen, C., Ahmadi, P., Ward, V. C. A. Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris. J. Vis. Exp. (200), e65382, doi:10.3791/65382 (2023).

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