Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Agrobacterium tumefaciens-опосредованная генная инженерия зеленых микроводорослей, Chlorella vulgaris

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65382
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, University of Waterloo

Summary

В этом протоколе описывается использование Agrobacterium tumefaciens-опосредованной трансформации (АМТ) для интеграции интересующего гена (генов) в ядерный геном зеленой микроводоросли Chlorella vulgaris, что приводит к производству стабильных трансформентов.

Abstract

Agrobacterium tumefaciens-опосредованная трансформация (AMT) служит широко используемым инструментом для манипулирования геномами растений. Тем не менее, A. tumefaciens демонстрируют способность к переносу генов к разнообразным видам. У многих видов микроводорослей отсутствуют хорошо зарекомендовавшие себя методы надежной интеграции интересующих генов в их ядерный геном. Чтобы использовать потенциальные преимущества биотехнологии микроводорослей, решающее значение имеют простые и эффективные инструменты манипулирования геномом. В данной работе представлен оптимизированный протокол АМТ для промышленного вида микроводорослей Chlorella vulgaris, использующий репортерный зеленый флуоресцентный белок (mGFP5) и маркер устойчивости к антибиотикам для гигромицина В. Мутанты отбираются путем нанесения покрытия на трис-ацетат-фосфатную (TAP) среду, содержащую гигромицин В и цефотаксим. Экспрессия mGFP5 количественно оценивается с помощью флуоресценции после более чем десяти поколений субкультивирования, что указывает на стабильную трансформацию кассеты Т-ДНК. Этот протокол позволяет надежно генерировать несколько трансгенных колоний C. vulgaris менее чем за две недели, используя коммерчески доступный вектор экспрессии растений pCAMBIA1302.

Introduction

Agrobacterium tumefaciens, грамотрицательная почвенная бактерия, обладает уникальной способностью к переносу генов между царствами, благодаря чему ее называют «природным генным инженером»1. Эта бактерия может переносить ДНК (Т-ДНК) от опухолеобразующей плазмиды (Ti-плазмида) в клетки хозяина через систему секреции IV типа, что приводит к интеграции и экспрессии Т-ДНК в геноме хозяина 1,2,3,4. В естественных условиях этот процесс приводит к образованию опухолей у растений, широко известной как болезнь корончатого галла. Тем не менее, Agrobacterium также может переносить Т-ДНК в различные другие организмы, включая дрожжи, грибы, водоросли, эмбрионы морских ежей и даже клетки человека в лабораторных условиях 5,6,7,8.

Используя эту природную систему, Agrobacterium tumefaciens-опосредованная трансформация (АМТ) обеспечивает случайную интеграцию интересующего гена (генов) в ядерный геном клетки-хозяина путем модификации участка Т-ДНК Ti-плазмиды. Для этой цели широко используется вектор экспрессии растений AMT pCAMBIA13029. Исследователи могут использовать простые рабочие процессы клонирования E. coli перед переносом нужного вектора в A. tumefaciens для последующей передачи интересующему их хозяину.

Зеленые микроводоросли – это эукариоты, которые имеют много общего с наземными растениями, но очень невосприимчивы к генетическим модификациям. Однако генетическая трансформация играет важнейшую роль как в фундаментальных, так и в биотехнологических исследованиях микроводорослей. У нескольких видов микроводорослей, в частности у Chlamydomonas reinhardtii, генетическая трансформация с помощью АМТ привела к успешному внедрению трансгенов, таких как интерлейкин-2 человека (hIL-2), рецептор-связывающий домен коронавируса 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2 RBD) и два антимикробных пептида (АМП)10,11,12,13. Среди них Chlorella vulgaris, менее привередливый и быстрорастущий вид зеленых водорослей, обладает значительным потенциалом для устойчивого производства углеводов, белков, нутрицевтиков, пигментов и других ценных соединений14. Однако отсутствие надежных инструментов для создания трансгенных штаммов C. vulgaris препятствует его коммерческому прогрессу. Поскольку существует лишь ограниченное число опубликованных работ, использующих АМТ у C. vulgaris15, и учитывая значительные различия между культивированием растений и микроводорослей, оптимизация протокола АМТ становится необходимой.

В этом исследовании ученые вставили зеленый флуоресцентный белок (mGFP5) после промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CamV) и добавили метку гистидина, чтобы использовать его в качестве репортерного гена для экспрессии белка. Трансформанты были отобраны с использованием гигромицина В, и после субкультивирования в течение более чем двадцати поколений трансформация оставалась стабильной. Плазмида pCAMBIA1302, используемая в этой работе, может быть легко адаптирована для содержания любого интересующего гена. Кроме того, представленный метод и материалы могут быть адаптированы для других видов зеленых водорослей с активным промотором CamV35S, поскольку этот промотор используется для селекции гигромицина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все среды и растворы должны быть автоклавированы перед использованием, если не указано иное. Все центрифужные пробирки, наконечники для пипеток и т. д. должны быть стерильными или автоклавными перед использованием. Для удобства рецепты сред, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице 1.

1. Подготовка электрокомпетентных клеток A. tumefaciens

  1. Посев Agrobacterium (AGL-1) в стерильную колбу-шейкер объемом 25 мл со средой LB (с добавлением рифампицина, 20 мг/л-1) из замороженного запаса глицерина и выращивание в течение ночи при 28-30 °C и 150 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм агробактерий AGL-1 (см. Таблицу материалов) устойчив к рифампицину, ампициллину, левомицетину и стрептомицину и может быть получен от нескольких поставщиков.
  2. На следующий день разбавляют культуру в 1 00 000 раз, добавляя 0,5 мкл ночной культуры к 50 мл автоклавной сверхчистой воды и распределяют 10 мкл этой разбавленной культуры на планшете LB, а затем инкубируют при 28-30 °C в течение 1-3 дней.
  3. Выберите колонию и начните ночную культуру по 20 мл в LB с рифампицином при 28-30 °C.
  4. На следующий день инокулируют 500 мл LB среды (без антибиотика) в шейкерную колбу 9 мл ночной культуры и выращивают при 28-30 °C до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,5.
  5. Равномерно разделите культуру на десять центрифужных пробирок по 50 мл и охладите на льду в течение 30 минут. Предварительно охладите центрифугу до 4 °C.
  6. Центрифугируйте пробирки при 4 °C и 4000 x g в течение 15 минут. Затем удалите как можно больше надосадочной жидкости с помощью пипетки и повторно суспендируйте гранулу в каждой пробирке в 50 мл ледяной воды.
  7. Центрифугируют клетки при 4 °C и 4000 x g в течение 15 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 25 мл ледяной воды в каждой пробирке.
  8. Центрифугируют клетки при 4 °C и 4000 x g в течение 15 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл ледяного 10% (w/v) глицерина в каждой пробирке.
  9. Объедините все пробирки в одну пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте клетки при 4 °C и 4000 x g в течение 15 минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 400 мкл ледяного 10% (по массе) глицерина. Концентрация клеток должна быть около 1-3 x 10,10 клеток/мл.
  10. Распределите клетки в виде аликвот по 50 мкл в стерильных предварительно охлажденных микропробирках. Заморозьте в жидком азоте и храните в морозильной камере при температуре -80 °C.

2. Электропорация A. tumefaciens

  1. Добавьте 50 мкл электрокомпетентных клеток AGL-1 A. tumefaciens в предварительно охлажденную кювету диаметром 0,1 мм и добавьте 2 мкл pCAMBIA1302 или аналогичной плазмиды (conc 15 нг/мкл) (см. таблицу материалов).
  2. Электропорация при напряжении 2400 В с помощью электропоратора (200 Ω, расширитель емкости 250 мкFD, емкость 25 мкFD, экспоненциальный спад, см. таблицу материалов). Постоянная времени должна быть >4,5 мс для успешной электропорации с экспоненциальным затуханием.
  3. Немедленно добавьте 1 мл среды LB в кювету и осторожно пипеткой вверх и вниз для смешивания. Переложите 1 мл ресуспендированных клеток в микропробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте ее при 28-30 °C не менее 1 ч для восстановления.
  4. Поместите клетки на агар LB, содержащий соответствующий антибиотик (например, 50 мг/л канамицина для pCAMBIA1302 для выбора прокариот).
  5. Выдерживают при температуре 28-30 °С в течение 2-3 дней.
  6. Выберите одну колонию, вырастите в течение ночи в LB с соответствующим отбором (50 мг/л канамицина для pCAMBIA1302) и криоконсервируйте плазмидный штамм, используя 50% глицерин при -80 °C, для дальнейшего использования.

3. АМТ C. vulgaris

ПРИМЕЧАНИЕ: Параллельно подготавливайте культуры C. vulgaris (UTEX 395, см. Таблицу материалов) и A. tumefaciens для совместного культивирования. Посевы C. vulgariследует начинать за 3 дня до подготовки культур A. tumefaciens. Протокол был изменен на основе протокола, опубликованного Kumar et al.7.

  1. Подготовьте культуру C. vulgaris
    1. C. vulgaris традиционно хранят на наклонных участках или в логарифмических культурах в освещенных условиях. Из логарифмической фазовой культуры при OD600 = 1,0 распределить 0,5 мл на агаровые пластины с трис-ацетат-фосфатом (TAP, см. таблицу 1) (1,2% w/v агара A) и выращивать в течение 5 дней при 25 °C при освещении (50 мкЭ/м2с). В результате получится примерно 5 x 106 клеток.
  2. Подготовьте культуру A. tumefaciens
    1. Штамм A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 выращивают в колбе-шейкере путем посева 10 мл среды LB с добавлением 15 мМ глюкозы, 20 мг/л рифампицина и 50 мг/л канамицина (см. таблицу материалов) с использованием глицеринового сырья. Выдерживают при температуре 28-30 °C и 250 об/мин в течение ночи.
    2. Инокулируют 1 мл ночной культуры в 50 мл LB с 15 мМ глюкозы, 20 мг/л рифампицина и 50 мг/л канамицина и инкубируют при 28-30 °C и 250 об/мин до тех пор, пока OD600 не достигнет 1,0.
  3. Совместное культивирование C. vulgaris и A. tumefaciens
    1. Чтобы подготовить культуру A. tumefaciens к совместному культивированию, переложите выращенную культуру в пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 4000 x g в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и дважды промойте клетки индукционной средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве индукционной среды используется среда TAP, рассчитанная на pH 5,5 и дополненная микроэлементами F/2 и витаминами с ацетосирингоном 200 мкМ (AS, см. Таблицу материалов). Ресуспендируйте ячейки в индукционной среде так, чтобы наружный диаметр600 = 0,5.
    2. Чтобы подготовить культуру C. vulgaris к совместному культивированию, добавьте 25 мл индукционной среды в планшет C. vulgaris, содержащий ~ 5 x 106 клеток. Перелейте в пробирку объемом 50 мл. Центрифугируют клетки при концентрации 4000 x g в течение 15 мин при комнатной температуре и выбрасывают надосадочную жидкость.
    3. Смешайте гранулы клеток водорослей с 200 мкл бактериальной суспензии (OD600: 0,5) и инкубируйте их во вращающемся шейкере при 21-25 °C при 150 об/мин в течение 1 ч.
    4. Смешанную культуру (200 мкл) распределить по индукционным планшетам с добавлением 15 мМ глюкозы и инкубировать при 21-25 °C в темноте в течение 3 дней.
    5. Через 3 дня используют 10 мл TAP-среды с добавлением 400 мг/л цефотаксима или 20 мг/л тетрациклина (см. таблицу материалов) для сбора микроводорослей и инкубации в темноте при 21-25 °C в течение 2 дней для удаления A. tumefaciens из культуры.
    6. Распределите 500 мкл культуры на селективную среду, например, TAP-среду, дополненную 20-70 мг/л гигромицина B (при использовании pCAMBIA1302) и 400 мг/л-1 цефотаксима или 20 мг/л тетрациклина. Выдерживают при температуре 21-25 °C в темноте в течение 2 дней, прежде чем поместить их в освещенную камеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Резистентные колонии появляются через 5-7 дней после воздействия света.
    7. Выберите отдельные колонии из трансформационной пластины и повторно нанесите их на планшеты с агаром TAP, добавив 400 мг/л цефотаксима или 20 мг/л тетрациклина и 20-70 мг/л гигромицина В.

4. ПЦР колоний (цПЦР) для подтверждения интеграции генов в трансформантах C. vulgaris

  1. Извлечение геномной ДНК из трансформанта C. vulgaris после не менее двух субкультивирования из одной колонии с помощью набора для экстракции геномной ДНК растений (см. таблицу материалов). Используя его в качестве шаблона для ПЦР, разработайте праймеры для участка Т-ДНК mgfp5 (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' и M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
    1. Используя высокоточный набор мастер-смеси ДНК-полимеразы Q5 (см. таблицу материалов), проведите полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для проверки интеграции трансгенов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования использовались следующие условия: 98 °C в течение 3 мин; 35 циклов (98 °C в течение 10 с, 57 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 1 мин); 72 °C в течение 5 мин. Используйте pCAMBIA1302 в качестве положительного контроля и геномную ДНК C. vulgaris дикого типа в качестве отрицательного контроля.
  2. Чтобы подтвердить, что pCAMBIA1302 отсутствует в образце из-за остаточной контаминации A. tumefaciens, используют ПЦР колонии. Добавьте небольшое количество клеток-трансформантов в 10 мкл стерильной воды и кипятите при 98 °C в течение 15 мин. Используйте это в качестве шаблона для ПЦР.
    1. Проектируйте праймеры для области вне Т-ДНК на pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' и B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования использовались следующие условия: 94 °C в течение 3 мин; 30 циклов (94 °C в течение 30 с, 48 °C в течение 30 с, 68 °C в течение 5 мин); 68 °C в течение 7 мин. В качестве положительного контроля используют кипяченую колонию A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302), а в качестве отрицательного контроля — вареную колонию C. vulgaris дикого типа.
  3. Чтобы убедиться в отсутствии контаминации A. tumerfaciens в образце, используйте ПЦР колонии. Добавьте небольшое количество клеток-трансформантов в 10 мкл стерильной воды и кипятите при 98 °C в течение 15 мин. Используйте это в качестве шаблона для ПЦР.
    1. Разработка праймеров для гена virE2, содержащегося в плазмиде вирулентности AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' и virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования использовались следующие условия: 94 °C в течение 3 мин; 30 циклов (94 °C в течение 30 с, 53 °C в течение 30 с, 68 °C в течение 3 мин); 68 °C в течение 7 мин. В качестве положительного контроля используют кипяченую колонию A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302), а в качестве отрицательного контроля — вареную колонию C. vulgaris дикого типа.
  4. Для подтверждения размера полученных фрагментов16 проводят ПЦР-образцы на агарозном геле ДНК вместе с лестницей (лестница ДНК 1 Кбит/с, см. таблицу материалов).

5. Измерение флуоресценции трансформаторов

  1. Засейте каждый трансформант из культуры поддержания логарифмической фазы или наклона агара TAP в 50 мл TAP с добавлением 200 мг/л цефотаксима и 25 мг/л гигромицина B так, чтобы начальный OD600 = 0,1. Инокуляцию одной культуры C. vulgaris дикого типа и цефотаксима только 200 мг/л в качестве отрицательного контроля. Инкубируют при 25 °C при 150 об/мин при 150 мкмоль/м2с фотосинтетически активного света (см. Таблицу материалов).
  2. Каждые 24 ч берут 300 мкл образца и измеряют поглощение и флуоресценцию (возбуждение 488 нм, излучение 526 нм) в 96-луночном планшетном ридере или УФ/ВИД спектрометре и флуориметре (см. таблицу материалов). Используйте черную пластину с прозрачным дном для одновременных измерений.

6. Экстракция сырого белка, очистка белка и электрофорез SDS-PAGE

  1. Инокулировать трансформант (#50) из логарифмической поддерживающей культуры в 300 мл TAP с добавлением 200 мг/л цефотаксима и 25 мг/л гигромицина B до достижения OD680 = 0,1. Инокуляцию одной культуры C. vulgaris дикого типа и цефотаксима только 200 мг/л в качестве отрицательного контроля. Инкубировать при 25 °C при 150 об/мин при 150 мкмоль/м2с фотосинтетически активного света.
  2. Экстрагируют образец сырого белка из трансформанта (#50) и штаммов дикого типа с помощью 5 мл лизисного буфера (см. таблицу 1) с последующей ультразвуковой обработкой в течение 4 мин.
  3. Очистите образец сырого белка смолой Ni-NTA через полипропиленовые колонки объемом 5 мл (см. таблицу материалов).
  4. Лиофилизировать 15 мл очищенных образцов белка и повторно суспендировать их в 1 мл лизисного буфера для анализа SDS-PAGE17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы продемонстрировать успешную трансформацию с использованием описанного выше метода, C. vulgaris культивировали либо с AGL-1, содержащим плазмиду pCAMBIA1302, либо без плазмиды (дикого типа и покрытой агаром TAP, дополненным гигромицином В и цефотаксимом (рис. 1A). Крайняя левая пластинка показывает трансформированные колонии, способные расти на пластинах Hygromycin B/цефотаксима, а средняя пластина показывает, что AGL-1 дикого типа не может расти на пластинах Hygromycin B/цефотаксима. Крайняя правая табличка показывает, что при отсутствии отбора (только цефотаксим) могут расти трансформанты C. vulgaris и дикий тип. Одиночные колонии наносили на TAP-агар с гигромицином В и цефотаксимом (рис. 1Б). Сбежавшие колонии из крайней правой пластины (рис. 1В) инокулировали на TAP-жидкость с гигромицином В и цефотаксимом (рис. 1С). Из-за различных уровней экспрессии после случайной интеграции Т-ДНК трансформанты первоначально извлекались на планшетах с возрастающей концентрацией гигромицина В в диапазоне от 25 до 70 мг/л. По одной колонии из каждой планшета выращивали в жидкой среде TAP, содержащей ту же концентрацию гигромицина В, а также дикого типа C. vulgaris в самой низкой концентрации (рис. 1D). Дикий вид C. vulgaris не может расти в присутствии Гигромицина, в то время как колонии устойчивы до 70 мг/л.

Чтобы подтвердить, что кассета с Т-ДНК была стабильно интегрирована в геном C. vulgaris, одна колония, отобранная из каждой из 20, 25, 30, 50 и 70 мг/л пластин гигромицина В, была субкультивирована путем многократного нанесения полос на планшеты с агаром TAP с выборкой два раза, а затем рутинно субкультивировалась в среде TAP более десяти раз. Трансформант #20, #25, #30, #50, #50 и #70 соответственно. Используя эти культуры, была проведена ПЦР колонии, чтобы исключить контаминацию pCAMBIA1302 в AGL1, и была выделена геномная ДНК для подтверждения присутствия гена mGFP5 в геноме C. vulgaris. На рисунке 2А ПЦР колонии проводили с использованием праймеров, нацеленных на участок 5 kbp за пределами левой и правой границ Т-ДНК, которые смогли амплифицировать этот участок из плазмиды pCAMBIA1302 в качестве положительного контроля, но этот участок не присутствовал ни в одном из образцов C. vulgaris , что указывает на то, что ДНК pCAMBIA1302 не присутствовала ни в одной из культур. Образец C. vulgaris дикого типа был использован в качестве отрицательного контроля, и амплификации не наблюдалось.

Геномную ДНК выделяли из трансформантов #25, #50 и #70 и проводили ПЦР, амплифицируя участок 1763.н., содержащий ген mgfp5 Т-ДНК, для подтверждения интеграции в трансформентах (рис. 2B). pCAMBIA1302 был использован в качестве положительного контроля, и амплификация была обнаружена во всех трансформентах, что указывает на то, что ген mgfp5 присутствовал в геномной ДНК всех трансформентов. В качестве отрицательного контроля использовали C. vulgaris дикого типа, и амплификации не наблюдалось. На рисунке 2С показана амплификация фрагмента длиной 600.н. белка вирулентности E2 (VirE2), который находится в опухолеобразующей плазмиде (Ti-плазмиде) штамма AGl1. Положительный контроль, состоящий из штамма AGl1, содержащего pCAMIA1302, был успешно амплифицирован праймерами, что свидетельствует о присутствии A. tumefaciens в образце. Тем не менее, все образцы C. vulgaris дали отрицательный результат для этого региона, что указывает на то, что повторное культивирование на цефотаксиме успешно устранило контаминацию AGL1 из культуры. Образец C. vulgaris дикого типа был использован в качестве отрицательного контроля, и амплификации не наблюдалось. Взятые вместе, эти три теста подтверждают, что Т-ДНК, содержащая mgpf5, была вставлена в геном C. vulgaris, и эти результаты не были связаны ни с загрязнением AGL1 в образцах, ни с присутствием pCAMBIA1302 в клетках. Эти результаты были повторены через 20 и около 100 субкультур трансформентов, что подтвердило длительную интеграцию Т-ДНК в геном.

Наконец, фенотип был подтвержден выращиванием трансформантов в TAP-средах с отбором и измерением флуоресценции. Его сравнивали с диким типом C. vulgaris. Из-за фоновой абсорбции/автофлуоресценции хлорофилла флуоресценцию сравнивали путем нормализации данных к штамму дикого типа. На рисунке 3А можно заметить, что существует заметная разница в росте между трансформантами и диким типом C. vulgaris. Потенциально это может быть связано с множественными случайными интеграциями Т-ДНК в геном, которые могут влиять на другие клеточные процессы и приводить к замедлению роста. Тем не менее, на рисунке 3B показано, что, несмотря на более низкий рост, все выбранные штаммы демонстрируют более высокие уровни флуоресценции при нормализации плотности клеток. Примечательно, что штамм #70 продемонстрировал значительно более высокий уровень флуоресценции, чем другие, с p-значением <0,01. Это подчеркивает важность скрининга многочисленных колоний для выявления трансформентов, которые экспрессируют желаемый белок, не оказывая негативного влияния на общее поведение роста.

Для подтверждения экспрессии mGFP5-6xHis, SDS-PAGE был использован для анализа экстракта сырого протеина и очищенных белков его меток как из C. vulgaris (WT), так и из трансформанта C. vulgaris (#50). Впоследствии очистка белка с его меткой была проведена с использованием комплекта для гравитационного потока из смолы Ni-NTA в соответствии с протоколомпроизводителя 18. На рисунке 4 показано наличие белка mGFP5-6xHis (~30 кДа) в образце-трансформанте #50 и отсутствие белка в отрицательном контроле (WT C. vulgaris).

Figure 1
Рисунок 1: Восстановление трансформантов C. vulgaris после АМТ. (A) После совместного культивирования C. vulgaris трансформанты представляют собой AGL-1, содержащие плазмиду pCAMBIA или без плазмиды (только AGL-1) на селективных планшетах. (B) Отдельные колонии, отобранные из планшетов с гигромицином B (20 мг/л) на селективном TAP-агаре. (C) Сбежавшие колонии не растут только из пластины AGL1 на жидкой среде с гигромицином B (20 мг/л). (D) Рост одиночных колоний #25, #50 и #50 из селекционных планшетов Hygromycin, выращенных в жидких средах TAP, содержащих Hygromycin и C. vulgaris дикого типа, которые не могут расти в среде Hygromycin. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Обнаружение загрязнения pCAMBIA1302. (A) Интеграция Т-ДНК в трансформанты (B) и обнаружение загрязнения A. tumefaciens (C). WT указывает на дикий тип C. vulgaris, PC является положительным контролем (pCAMBIA1302), а AGL1 указывает на штамм A. tumefaciens AGL1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Рост и флуоресценция трансформантов через 3 дня после инокуляции. (A) Рост, измеренный по поглощению при длине волны 680 нм. (Б) Флуоресценция, нормированная к штамму дикого типа. В среднем 3-4 биологических репликата, столбцы погрешности представляют собой 1 σ. *p < 0,05, **p < 0,01 по сравнению с диким типом (WT). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: SDS-PAGE анализ экспрессии mGFP5-6xHis у C. vulgaris (WT) и трансформированного образца C. vulgaris #50. Экстракты готовили из сырого, очищенного (первая промывка), очищенного (разбавленного) и очищенного (концентрированного) из C. vulgaris (WT), полосы 1-4 соответственно. Сырая, очищенная (первая промывка), очищенная (элюированная) и очищенная (лиофилизированная) от C. vulgaris (WT), полосы 5-8 соответственно. Красным прямоугольником обозначен очищенный белок GFP-6xHis из трансформанта #70. Белки разделяли на полиакриламидном 12% геле. Молекулярные массы (MWs) белковых стандартов (Std.) показаны справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Имя носителя/буфера Состав
ФУНТ 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л триптона, 5 г/л NaCl
КРАН 20 мМ Tris base, 1,58 мМ K 2 HPO 4,2,4 мМ KH 2 PO 4, 7,0 мМ NH4 Cl, 0,83 мМ MgSO4, 0,34 мМ CaCl 2, 1 мл/л ледяной уксусной кислоты и по 1 мл/л F/2 средних микроэлементов и витаминов F/2
F/2 со средними следами металлов 22 мг/л ZnSO 4·7H2 O, 180 мг/л MnCl 2·4H2 O, 6,3 мг/л Na2 MoO 4·2H2 O, 14 мг/л CoCl2·6H2 O, 9,8 мг/л CuSO 4·5H2O, 3,15 г/л FeCl 3·6H2O, 4,36 г/л Na 2 ЭДТА·2H 2 O
Средние витамины F/2 0,1 мМ Витамин B12 (цианокобаламин), 25 мг/л Биотин, 335 мг/л Тиамин, 50 мМ HEPES Буфер pH 7,8
Лизисный буфер 20 мМ Na2HPO 4, 300 мМ NaCl, pH7,4

Таблица 1: Рецепты сред и буферов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эффективность трансформации связана с несколькими различными параметрами. Выбор штаммов A. tumefaciens , используемых для АМТ, имеет решающее значение. AGL-1 является одним из наиболее инвазивных обнаруженных штаммов и по этой причине регулярно используется в АМТ растений. Добавление в индукционную среду глюкозы (15-20 мМ) также важно для эффективности АМТ. Учитывая, что C. vulgaris может расти как в фототрофных, так и в гетеротрофных условиях, глюкоза или другие источники углерода часто исключаются из среды микроводорослей, чтобы предотвратить загрязнение. Например, базальная среда Болда (BBM) является наиболее часто используемой средой для фототрофного культивирования C. vulgaris19. Тем не менее, BBM не поддерживает рост A. tumefaciens из-за отсутствия источника органического углерода и аммония в качестве источника азота, который она предпочитает (BBM использует нитрат)20. Поэтому в этой работе была использована среда TAP, поскольку она содержит ацетат в качестве источника углерода для C. vulgaris, глюкозу для A. tumefaciens и аммоний в качестве источника азота, который могут использовать оба вида. Агаровые пластины TAP также обеспечивают гораздо более высокие темпы роста C. vulgaris, сводя к минимуму время восстановления трансформантов после АМТ. Чтобы индуцировать белки вирулентности Ti-плазмиды, в индукционную среду также необходимо добавить 200 мкМ ацетосирингона.

Для исключения A. tumefaciens из культуры после АМТ применяли цефотаксим, наряду с серийным пассажом. AGL-1 устойчив к ампициллину, левомицетину, рифамицину и стрептомицину, а также чувствителен к цефотаксиму, тетрациклину, спектиномицину и канамицину. У растений цефотаксим часто используется для уничтожения A. tumefaciens, поскольку он обладает меньшим фитотоксическим действием на регенерацию побегов у многих видов растений, чем другие антибиотики21. Тем не менее, мы также подтвердили, что тетрациклин (который стоит примерно в 100 раз дешевле) может быть использован вместо цефотаксима в этом протоколе в сочетании с последовательным пассажем из одной колонии (данные не показаны). Вероятно, это связано с тем, что антибиотики, такие как тетрациклин, ингибируют синтез белка в хлоропластах у растений, которые зависят отфотосинтеза. Тем не менее, C. vulgaris может расти в темноте при добавлении ацетата, а это означает, что дисфункция хлоропластов не обязательно токсична для этого вида при тщательно подобранных условиях.

Несмотря на то, что 20 мг/л гигромицина В было достаточно для предотвращения роста дикого типа C. vulgaris, был протестирован диапазон концентраций гигромицина В (20-70 мг/л). Возможно, что колонии, выделенные из пластин с более высокой концентрацией, могут иметь несколько интегрированных копий Т-ДНК или Т-ДНК расположена в более транскрипционно активной области генома, что приводит к более высокой экспрессии фосфотрансферазы гигромицина В, что приводит к более быстрой инактивации гербицида и меньшему времени задержки в росте культуры23. Множественные копии могут быть причиной различий в интенсивности продуктов ПЦР при амплификации mgfp5 из генома (рис. 2B). Наличие белка GFP-6xHis в очищенном образце при анализе SDS-PAGE (рис. 4, дорожка 8) и его отсутствие у штамма дикого типа (рис. 4, дорожка 4) подтверждает, что АМТ и pCAMBIA1302 могут быть использованы для успешной экспрессии и стабильной интеграции трансгена у C. vulgaris.

В данной работе разработан и оптимизирован протокол достоверной трансформации C. vulgaris UTEX 395 с использованием A. tumefaciens AGL-1 и плазмиды системы pCAMBIA. Поскольку все штаммы и плазмиды, необходимые для этой работы, доступны из нескольких различных источников, этот метод будет легко воспроизвести в любой лаборатории. Являясь одним из наиболее важных промышленных штаммов микроводорослей, стандартный эталонный метод надежного АМТ будет иметь решающее значение для создания C. vulgaris для биотехнологических применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликт интересов заявлен не был.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить профессора Пауля Хойкааса (Paul Hooykaas) за любезное предоставление вектора pCAMBIA1302 и Agrobacterium tumefaciens AGL1 из Института биологии Лейденского университета, Нидерланды. Авторы также хотели бы поблагодарить Еву Колик за помощь в выращивании флуоресцентных трансформеров. Эта работа финансировалась Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады и программой Mitacs Accelerate.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Kb Plus DNA ladder FroggaBio DM015
Acetosyringone Fisher Scientific D26665G
Agrobacterium tumefaciens Gold Biotechnologies Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin Enzo Life Sciences 89151-400
CaCl2·2H2O VWR BDH9224-1KG
Cefotaxime AK Scientific J90010
Chlorella vulgaris University of Texas at Austin Culture Collection of Algae Strain: UTEX 395 Wildtype strain
CoCl2·6H2O Sigma Aldrich C8661-25G
CuSO4·5H2O EMD Millipore CX2185-1
FeCl3·6H2O VWR BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator Bio-Rad 1652662 Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit Thermo Scientific K0791
Glacial acetic acid VWR CABDH3093-2.2P
Glycerol BioBasic GB0232
HEPES Buffer Sigma Aldrich H-3375
Hygromycin B Fisher Scientific AAJ6068103
K2HPO4 VWR BDH9266-500G
Kanamycin Gold Biotechnologies K-250-25
KH2PO4 VWR BDH9268-500G
MgSO4·7H2O VWR 97062-134
MnCl2·4H2O JT Baker BAKR2540-01
Na2CO3 VWR BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O JT Baker 8993-01
Na2MoO4·2H2O JT Baker BAKR3764-01
NaCl VWR BDH7257-7
NaH2PO4 H2O Millipore Sigma CA80058-650
NaNO3  VWR BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin NewEngland BioLabs NEB #S1427
NH4Cl VWR BDH9208-500G
pCAMBIA1302 Leiden University Gift from Prof. Paul Hooykaas pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL) QIAGEN 34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL Bio-Rad 1610363
Rifampicin Millipore Sigma R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch  SunBlaster 210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer  BioTEK S4MLFPTA
Tetracycline Thermo Scientific Chemicals CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% Bio-Rad 1610185
Thiamine TCI America T0181-100G
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Tryptone BioBasic TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin) Enzo Life Sciences 89151-436
Yeast Extract BioBasic G0961
ZnSO4·7H2O JT Baker 4382-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
  2. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  3. De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
  4. Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
  5. Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
  6. Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
  7. Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
  8. de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
  9. Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
  10. Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
  11. Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
  12. Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
  13. Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
  14. Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
  15. Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
  17. Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
  18. NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
  19. Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 1: Unit 3D.1 (2012).
  21. Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
  22. Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
  23. Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).

Tags

Трансформация опосредованная Agrobacterium Tumefaciens генная инженерия зеленые микроводоросли Chlorella vulgaris протокол AMT репортерный ген зеленый флуоресцентный белок (mGFP5) маркер устойчивости к антибиотикам гигромицин B селекция мутантов трис-ацетат-фосфатная (TAP) среда стабильная трансформация кассета Т-ДНК трансгенные колонии PCAMBIA1302 вектор экспрессии растений
<em>Agrobacterium tumefaciens-опосредованная</em> генная инженерия зеленых микроводорослей, <em>Chlorella vulgaris</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roushan, M. R., Chen, C., Ahmadi,… More

Roushan, M. R., Chen, C., Ahmadi, P., Ward, V. C. A. Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris. J. Vis. Exp. (200), e65382, doi:10.3791/65382 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter