Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Agrobacterium tumefaciens- الهندسة الوراثية بوساطة الطحالب الدقيقة الخضراء ، شلوريلا الشائع

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65382
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, University of Waterloo

Summary

يحدد هذا البروتوكول استخدام التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) لدمج الجينات (الجينات) ذات الأهمية في الجينوم النووي للطحالب الدقيقة الخضراء Chlorella vulgaris ، مما يؤدي إلى إنتاج محولات مستقرة.

Abstract

يعمل التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) كأداة مستخدمة على نطاق واسع لمعالجة جينومات النبات. ومع ذلك ، تظهر A. tumefaciens القدرة على نقل الجينات إلى مجموعة متنوعة من الأنواع. تفتقر العديد من أنواع الطحالب الدقيقة إلى طرق راسخة لدمج الجينات ذات الأهمية بشكل موثوق في جينومها النووي. لتسخير الفوائد المحتملة للتكنولوجيا الحيوية للطحالب الدقيقة ، تعد أدوات معالجة الجينوم البسيطة والفعالة أمرا بالغ الأهمية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول AMT محسن لأنواع الطحالب الدقيقة الصناعية Chlorella vulgaris ، باستخدام بروتين الفلورسنت الأخضر المراسل (mGFP5) وعلامة مقاومة المضادات الحيوية ل Hygromycin B. يتم اختيار الطفرات من خلال الطلاء على وسائط Tris-Acetate-Phosphate (TAP) التي تحتوي على Hygromycin B و cefotaxime. يتم قياس التعبير عن mGFP5 عن طريق التألق بعد أكثر من عشرة أجيال من الزراعة الفرعية ، مما يشير إلى التحول المستقر لكاسيت T-DNA. يسمح هذا البروتوكول بتوليد موثوق به للعديد من مستعمرات C. vulgaris المعدلة وراثيا في أقل من أسبوعين ، باستخدام ناقل التعبير النباتي pCAMBIA1302 المتاح تجاريا.

Introduction

تمتلك Agrobacterium tumefaciens، وهي بكتيريا سالبة الجرام تنقلها التربة، قدرة فريدة على نقل الجينات بين المملكة، مما أكسبها لقب "مهندس وراثي طبيعي"1. يمكن لهذه البكتيريا نقل الحمض النووي (T-DNA) من البلازميد الذي يحفز الورم (Ti-Plasmid) إلى الخلايا المضيفة من خلال نظام إفراز من النوع الرابع ، مما يؤدي إلى تكامل الحمض النووي التائي والتعبير عنه داخل جينوم المضيف1،2،3،4. في البيئة الطبيعية ، تؤدي هذه العملية إلى تكوين الورم في النباتات ، والمعروف باسم مرض المرارة التاجية. ومع ذلك ، يمكن ل Agrobacterium أيضا نقل T-DNA إلى كائنات حية أخرى مختلفة ، بما في ذلك الخميرة والفطريات والطحالب وأجنة قنفذ البحر وحتى الخلايا البشرية في ظل ظروف المختبر5،6،7،8.

باستغلال هذا النظام الطبيعي ، يتيح التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) التكامل العشوائي للجين (الجينات) ذات الأهمية في الجينوم النووي للخلية المضيفة عن طريق تعديل منطقة T-DNA في Ti-plasmid. لهذا الغرض ، فإن ناقل التعبير النباتي AMT المستخدم على نطاق واسع هو pCAMBIA13029. يمكن للباحثين استخدام تدفقات عمل استنساخ بسيطة في الإشريكية القولونية قبل نقل المتجه المطلوب إلى A. tumefaciens لنقله لاحقا إلى المضيف محل الاهتمام.

الطحالب الدقيقة الخضراء هي حقيقيات النوى التي تشترك في العديد من أوجه التشابه مع النباتات البرية ولكنها متمردة للغاية على التعديل الوراثي. ومع ذلك ، يلعب التحول الجيني دورا حاسما في كل من البحوث الأساسية والتكنولوجيا الحيوية للطحالب الدقيقة. في العديد من أنواع الطحالب الدقيقة ، وخاصة Chlamydomonas reinhardtii ، نجح التحول الجيني عبر AMT في إدخال جينات محورة مثل إنترلوكين -2 البشري (hIL-2) ، ومجال ربط مستقبلات فيروس كورونا 2 للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2 RBD) ، واثنين من الببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) 10،11،12،13. من بين هذه الأنواع ، شلوريلا الشائع ، وهو نوع من الطحالب الخضراء أقل سرعة وأسرع نموا ، يحمل إمكانات كبيرة للإنتاج المستدام للكربوهيدرات والبروتينات والمغذيات والأصباغ وغيرها من المركبات عالية القيمة14. ومع ذلك ، فإن عدم وجود أدوات موثوقة لإنشاء سلالات معدلة وراثيا من C. vulgaris يعوق تقدمها التجاري. نظرا لوجود عدد محدود فقط من الأعمال المنشورة التي تستخدم AMT في C. vulgaris15 ، وبالنظر إلى الاختلافات الكبيرة بين زراعة النباتات والطحالب الدقيقة ، يصبح تحسين بروتوكول AMT ضروريا.

في هذه الدراسة ، أدخل الباحثون بروتين الفلورسنت الأخضر (mGFP5) في اتجاه مجرى فيروس فسيفساء القرنبيط (CamV) 35S المروج وأضافوا علامة الهستيدين لاستخدامها كجين مراسل للتعبير عن البروتين. تم اختيار المحولات باستخدام Hygromycin B ، وبعد الاستزراع الفرعي لأكثر من عشرين جيلا ، ظل التحول مستقرا. يمكن تكييف بلازميد pCAMBIA1302 المستخدم في هذا العمل بسهولة لاحتواء أي جين مهم. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل الطريقة والمواد المقدمة لأنواع الطحالب الخضراء الأخرى باستخدام مروج CamV35S نشط ، حيث يتم استخدام هذا المروج لاختيار Hygromycin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يجب تعقيم جميع الوسائط والحلول قبل الاستخدام ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب أن تكون جميع أنابيب الطرد المركزي ، وأطراف الماصة ، وما إلى ذلك ، معقمة أو معقمة قبل الاستخدام. لسهولة الرجوع إليها ، يتم سرد وصفات الوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1.

1. تحضير خلايا A. tumefaciens ذات الكفاءة الكهربائية

  1. تلقيح Agrobacterium (AGL-1) في دورق شاكر معقم سعة 25 مل من وسائط LB (مكمل بالريفامبيسين ، 20 مجم / لتر -1) من مخزون الجلسرين المجمد وينمو طوال الليل عند 28-30 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: سلالة Agrobacterium AGL-1 (انظر جدول المواد) مقاومة للريفامبيسين والأمبيسلين والكلورامفينيكول والستربتومايسين ويمكن الحصول عليها من العديد من الموردين.
  2. في اليوم التالي ، قم بتخفيف المزرعة بمقدار 1،00،000 ضعف عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر من الاستزراع الليلي إلى 50 مل من الماء النقي للغاية المعقم ونشر 10 ميكرولتر من هذه المزرعة المخففة على طبق LB ، ثم احتضانها عند 28-30 درجة مئوية لمدة 1-3 أيام.
  3. اختر مستعمرة وابدأ استزراع 20 مل بين عشية وضحاها في LB مع ريفامبيسين عند 28-30 درجة مئوية.
  4. في اليوم التالي ، قم بتلقيح 500 مل LB media (بدون مضاد حيوي) في دورق شاكر مع 9 مل من المزرعة الليلية وتنمو عند 28-30 درجة مئوية حتى يصل OD600 إلى 0.5.
  5. قسم المزرعة بالتساوي إلى عشرة أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل واتركها تبرد على الثلج لمدة 30 دقيقة. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
  6. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب عند 4 درجات مئوية و 4000 × جم لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الحبيبات في كل أنبوب في 50 مل من الماء المثلج.
  7. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 4 درجات مئوية و 4000 × جم لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 25 مل من الماء المثلج في كل أنبوب.
  8. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 4 درجات مئوية و 4000 × جم لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الجلسرين المثلج البارد 10٪ (وزن / حجم) في كل أنبوب.
  9. الجمع بين جميع الأنابيب في أنبوب واحد 50 مل وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 4 °C و 4000 × غرام لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من الجلسرين المثلج البارد بنسبة 10٪ (وزن / حجم). يجب أن يكون تركيز الخلية حوالي 1-3 × 1010 خلايا / مل.
  10. قم بتوزيع الخلايا على شكل حصص 50 ميكرولتر في أنابيب دقيقة معقمة مبردة. تجمد في النيتروجين السائل وتخزن في فريزر -80 درجة مئوية.

2. التثقيب الكهربائي ل A. tumefaciens

  1. أضف 50 ميكرولتر من خلايا AGL-1 A. tumefaciens ذات الكفاءة الكهربائية إلى كوفيت 0.1 مم مبرد مسبقا وأضف 2 ميكرولتر من pCAMBIA1302 أو بلازميد مماثل (conc 15 نانوغرام / ميكرولتر) (انظر جدول المواد).
  2. إلكتروبورات عند 2400 فولت باستخدام مثقاب كهربائي (200 Ω ، موسع السعة 250 μFD ، السعة 25 μFD ، الاضمحلال الأسي ، انظر جدول المواد). يجب أن يكون ثابت الوقت >4.5 مللي ثانية للتثقيب الكهربائي الناجح مع الاضمحلال الأسي.
  3. أضف على الفور 1 مل من وسائط LB إلى الكوفيت وماصة برفق لأعلى ولأسفل للخلط. انقل 1 مل من الخلايا المعاد تعليقها إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل واحتضانه عند 28-30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل للتعافي.
  4. ضع الخلايا على أجار LB الذي يحتوي على المضاد الحيوي المناسب (أي 50 مجم / لتر من الكانامايسين ل pCAMBIA1302 للانتقاء بدائي النواة).
  5. احتضان في 28-30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
  6. اختر مستعمرة واحدة ، وتنمو بين عشية وضحاها في LB مع الاختيار المناسب (50 مجم / لتر من الكانامايسين ل pCAMBIA1302) ، وتحفظ السلالة المحتوية على البلازميد بالتبريد باستخدام 50٪ جلسرين عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

3. AMT من C. الشائع

ملاحظة: قم بإعداد C. vulgaris (UTEX 395 ، انظر جدول المواد) و A. tumefaciens الثقافات بالتوازي للزراعة المشتركة. يجب أن تبدأ ثقافات C. vulgariقبل 3 أيام من إعداد ثقافات A. tumefaciens. تم تعديل البروتوكول بناء على البروتوكول الذي نشره Kumar et al.7.

  1. إعداد ثقافة C. الشائع
    1. يتم تخزين C. vulgaris تقليديا على المنحدرات أو الاحتفاظ بها في ثقافات المرحلة اللوغاريتمية في ظروف مضيئة. من استزراع طور اللوغاريتم عند OD600 = 1.0 ، انشر 0.5 مل على ألواح أجار Tris-Acetate-Phosphate (TAP ، انظر الجدول 1) (1.2٪ وزن / v agar A) وتنمو لمدة 5 أيام عند 25 درجة مئوية مع الإضاءة (50 μE / m2s). هذا سوف ينتج ما يقرب من 5 × 106 خلايا.
  2. تحضير ثقافة A. tumefaciens
    1. تنمو سلالة A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 في دورق شاكر عن طريق تلقيح 10 مل من وسائط LB المكملة ب 15 مللي مول من الجلوكوز و 20 مجم / لتر ريفامبيسين و 50 مجم / لتر كاناميسين (انظر جدول المواد) باستخدام مخزون الجلسرين. احتضان في 28-30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
    2. تلقيح 1 مل من الاستزراع الليلي إلى 50 مل من LB مع 15 مللي مول من الجلوكوز و 20 ملغ / لتر ريفامبيسين و 50 ملغ / لتر كاناميسين واحتضانها عند 28-30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة حتى يصل OD600 إلى 1.0.
  3. Cocultivate C. vulgaris و A. tumefaciens
    1. لتحضير استزراع A. tumefaciens للزراعة المشتركة ، انقل الاستزراع المزروع إلى أنبوب 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة واغسل الخلايا مرتين بوسط الحث.
      ملاحظة: وسائط الحث المستخدمة هي وسائط TAP معدلة على الرقم الهيدروجيني 5.5 وتستكمل بمعادن وفيتامينات متوسطة F/2 مع 200 ميكرومتر أسيتوسيرينجون (AS، انظر جدول المواد). أعد تعليق الخلايا في وسائط الحث بحيث يكون OD600 = 0.5.
    2. لتحضير ثقافة C. vulgaris للزراعة المشتركة ، أضف 25 مل من وسائط الحث إلى لوحة C. vulgaris التي تحتوي على ~ 5 × 106 خلايا. نقل إلى أنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 4000 × غرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتخلص من المادة الطافية.
    3. امزج حبيبات الخلايا الطحلبية مع 200 ميكرولتر من المعلق البكتيري (OD600: 0.5) واحتضانها في شاكر دوار عند 21-25 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
    4. انشر المستنبتة المختلطة (200 ميكرولتر) على ألواح وسائط الحث المكملة بجلوكوز 15 مللي متر واحتضانها عند 21-25 درجة مئوية في الظلام لمدة 3 أيام.
    5. بعد 3 أيام، استخدم 10 مل من وسائط TAP المكملة ب 400 ملغم/لتر سيفوتاكسيم أو 20 ملغ/لتر من التتراسيكلين (انظر جدول المواد) لجمع الطحالب الدقيقة وحضنها في الظلام عند 21-25 درجة مئوية لمدة يومين للقضاء على A. tumefaciens من المستزرع.
    6. صفيحة 500 ميكرولتر من المستنبتة على وسائط انتقائية ، على سبيل المثال ، وسائط TAP مكملة ب 20-70 مجم / لتر من Hygromycin B (عند استخدام pCAMBIA1302) و 400 مجم / لتر -1 سيفوتاكسيم أو 20 مجم / لتر من التتراسيكلين. احتضان 21-25 درجة مئوية في الظلام لمدة يومين قبل وضعها في غرفة مضيئة.
      ملاحظة: ستظهر المستعمرات المقاومة بعد 5-7 أيام من التعرض للضوء.
    7. اختر مستعمرات مفردة من لوحة التحويل وأعد ربطها على ألواح أجار TAP مكملة ب 400 مجم / لتر من سيفوتاكسيم أو 20 مجم / لتر من التتراسيكلين و 20-70 مجم / لتر من Hygromycin B.

4. مستعمرة PCR (cPCR) لتأكيد التكامل الجيني في محولات C. vulgaris

  1. استخرج الحمض النووي الجينومي من محول C. vulgaris بعد الاستزراع الفرعي مرتين على الأقل من مستعمرة واحدة باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي النباتي (انظر جدول المواد). باستخدام هذا كقالب لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، صمم الاشعال لمنطقة mgfp5 من T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3 '، و M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
    1. باستخدام مجموعة مزيج بوليميراز الحمض النووي الرئيسي عالي الدقة Q5 (انظر جدول المواد) ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للتحقق من تكامل الجينات المحورة.
      ملاحظة: تم استخدام الشروط التالية لهذه الدراسة: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 35 دورة (98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 57 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة) ؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. استخدم pCAMBIA1302 كعنصر تحكم إيجابي والحمض النووي الجيني C. vulgaris من النوع البري كعنصر تحكم سلبي.
  2. للتأكد من عدم وجود pCAMBIA1302 في العينة بسبب التلوث المتبقي بواسطة A. tumefaciens، استخدم مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل. أضف كمية صغيرة من الخلايا المحولة إلى 10 ميكرولتر من الماء المعقم واغلي عند 98 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. استخدم هذا كقالب ل PCR.
    1. تصميم الاشعال لمنطقة خارج T-DNA على pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' و B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      ملاحظة: تم استخدام الشروط التالية لهذه الدراسة: 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 30 دورة (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 48 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق) ؛ 68 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. استخدم مستعمرة مسلوقة من A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) كعنصر تحكم إيجابي ومستعمرة مسلوقة من النوع البري C. vulgaris كعنصر تحكم سلبي.
  3. للتأكد من عدم وجود تلوث A. tumerfaciens في العينة ، استخدم مستعمرة PCR. أضف كمية صغيرة من الخلايا المحولة إلى 10 ميكرولتر من الماء المعقم واغلي عند 98 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. استخدم هذا كقالب ل PCR.
    1. تصميم الاشعال لجين virE2 الموجود على بلازميد الفوعة AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' و virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      ملاحظة: تم استخدام الشروط التالية لهذه الدراسة: 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 30 دورة (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 53 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق) ؛ 68 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. استخدم مستعمرة مسلوقة من A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) كعنصر تحكم إيجابي ومستعمرة مسلوقة من النوع البري C. vulgaris كعنصر تحكم سلبي.
  4. قم بتشغيل عينات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام أغاروز الحمض النووي جنبا إلى جنب مع سلم (سلم الحمض النووي 1 كيلو بايت ، انظر جدول المواد) لتأكيد حجم الأجزاء الناتجة16.

5. قياس مضان المحولات

  1. تلقيح كل محول من مزرعة صيانة في مرحلة السجل أو ميل أجار TAP إلى 50 مل من TAP المكمل ب 200 مجم / لتر -1 سيفوتاكسيم و 25 مجم / لتر -1 هيجروميسين ب بحيث يكون OD600 = 0.1. تلقيح مزرعة واحدة مع النوع البري C. vulgaris وفقط 200 ملغ / L-1 سيفوتاكسيم كعنصر تحكم سلبي. احتضان عند 25 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة مع 150 ميكرومول / م2ثانية من الضوء النشط ضوئيا (انظر جدول المواد).
  2. كل 24 ساعة ، خذ عينة 300 ميكرولتر وقم بقياس الامتصاص والتألق (الإثارة 488 نانومتر ، الانبعاث 526 نانومتر) في قارئ لوحة 96 بئرا أو مطياف الأشعة المرئية والأشعة المرئية ومقياس الفلور (انظر جدول المواد). استخدم صفيحة سوداء ذات قاع شفاف للقياسات المتزامنة.

6. استخراج البروتين الخام ، تنقية البروتين ، والرحلان الكهربائي SDS-PAGE

  1. تلقيح المحول (# 50) من ثقافة صيانة لوغاريتمية المرحلة إلى 300 مل من TAP مكملة ب 200 مجم / لتر -1 سيفوتاكسيم و 25 مجم / لتر -1 هيجروميسين ب للوصول إلى OD680 = 0.1. تلقيح مزرعة واحدة مع النوع البري C. vulgaris وفقط 200 ملغ / L-1 سيفوتاكسيم كعنصر تحكم سلبي. احتضان عند 25 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة مع 150 ميكرومول / م2ثانية من الضوء النشط ضوئيا.
  2. استخرج عينة البروتين الخام من المحول (# 50) والسلالات البرية باستخدام مخزن تحلل 5 مل (انظر الجدول 1) ، متبوعا بصوتنة لمدة 4 دقائق.
  3. تنقية عينة البروتين الخام باستخدام راتنج Ni-NTA من خلال أعمدة البولي بروبلين سعة 5 مل (انظر جدول المواد).
  4. التجفيد لعينات البروتين المنقى 15 مل وإعادة تعليقها في محلول تحلل 1 مل لتحليل SDS-PAGE17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لإظهار التحول الناجح باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه ، تم استزراع C. vulgaris إما مع AGL-1 الذي يحتوي على بلازميد pCAMBIA1302 أو بدون البلازميد (من النوع البري ومطلي على أجار TAP المكمل ب Hygromycin B و cefotaxime (الشكل 1 أ). تظهر اللوحة الموجودة في أقصى اليسار المستعمرات المحولة القادرة على النمو على ألواح Hygromycin B / cefotaxime ، وتظهر اللوحة الوسطى أن AGL-1 من النوع البري لا يمكن أن ينمو على ألواح Hygromycin B / cefotaxime. تظهر اللوحة الموجودة في أقصى اليمين أنه عند عدم استخدام أي اختيار (سيفوتاكسيم فقط) ، يمكن أن تنمو محولات C. vulgaris والنوع البري. تم وضع مستعمرات مفردة على أجار TAP مع Hygromycin B و cefotaxime (الشكل 1B). تم تلقيح المستعمرات الهاربة من الصفيحة الموجودة في أقصى اليمين (الشكل 1 ب) على سائل TAP باستخدام Hygromycin B و cefotaxime (الشكل 1C). بسبب مستويات التعبير المتغيرة بعد التكامل العشوائي ل T-DNA ، تم استرداد المحولات في الأصل على ألواح ذات تركيزات متزايدة من Hygromycin B تتراوح من 25-70 مجم / لتر. نمت مستعمرة واحدة من كل صفيحة في وسط TAP سائل يحتوي على نفس تركيز Hygromycin B جنبا إلى جنب مع النوع البري C. vulgaris عند أدنى تركيز (الشكل 1D). لا يمكن أن تنمو C. vulgaris من النوع البري في وجود Hygromycin ، بينما تم الحصول على مستعمرات مقاومة تصل إلى 70 مجم / لتر.

للتأكد من أن كاسيت T-DNA قد تم دمجه بثبات في جينوم C. vulgaris ، تم اختيار مستعمرة واحدة من كل من ألواح Hygromycin B 20 و 25 و 30 و 50 و 70 مجم / لتر عن طريق الخطوط المتكررة على ألواح أجار TAP مع الاختيار مرتين ثم تمت زراعتها بشكل روتيني في وسائط TAP أكثر من عشر مرات ، المسمى المحول # 20 و # 25 و # 30 و # 50 و # 50 و # 70 على التوالي. باستخدام هذه الثقافات ، تم إجراء كل من مستعمرة PCR لاستبعاد التلوث بواسطة pCAMBIA1302 في AGL1 ، وتم استخراج الحمض النووي الجينومي لتأكيد وجود جين mGFP5 في جينوم C. vulgaris. في الشكل 2 أ ، تم إجراء مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات التي تستهدف منطقة 5 كيلو بايت خارج الحدود اليسرى واليمنى ل T-DNA وتمكنت من تضخيم هذه المنطقة من بلازميد pCAMBIA1302 كعنصر تحكم إيجابي ، لكن هذه المنطقة لم تكن موجودة في أي من عينات C. vulgaris التي تشير إلى أن الحمض النووي pCAMBIA1302 لم يكن موجودا في أي من الثقافات. تم استخدام عينة C. vulgaris من النوع البري كعنصر تحكم سلبي ، ولم يلاحظ أي تضخيم.

تم استخراج الحمض النووي الجينومي من المحولات # 25 و # 50 و # 70 ، وتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما أدى إلى تضخيم منطقة 1763 bp تحتوي على جين mgfp5 من T-DNA لتأكيد التكامل في المحولات (الشكل 2B). تم استخدام pCAMBIA1302 كعنصر تحكم إيجابي ، وتم الكشف عن التضخيم في جميع المحولات ، مما يشير إلى أن جين mgfp5 كان موجودا في جميع الحمض النووي الجيني للمحولات. تم استخدام C. vulgaris من النوع البري كعنصر تحكم سلبي ، ولم يلاحظ أي تضخيم. يوضح الشكل 2C تضخيم جزء 600 bp من بروتين الفوعة E2 (VirE2) الموجود في البلازميد المسبب للورم (Ti plasmid) من سلالة AGl1. تم تضخيم السيطرة الإيجابية ، التي تتكون من سلالة AGl1 التي تحتوي على pCAMIA1302 ، بنجاح باستخدام الاشعال ، مما يشير إلى وجود A. tumefaciens في العينة. ومع ذلك ، فإن جميع عينات C. vulgaris كانت سلبية لهذه المنطقة ، مما يشير إلى أن الاستزراع الفرعي المتكرر على سيفوتاكسيم نجح في القضاء على تلوث AGL1 من الثقافة. تم استخدام عينة C. vulgaris من النوع البري كعنصر تحكم سلبي ، ولم يلاحظ أي تضخيم. مجتمعة ، تؤكد هذه الاختبارات الثلاثة أن T-DNA الذي يحتوي على mgpf5 قد تم إدخاله في جينوم C. vulgaris ، ولم تكن هذه النتائج بسبب تلوث AGL1 في العينات ولا بسبب وجود pCAMBIA1302 في الخلايا. تكررت هذه النتائج بعد 20 وحوالي 100 مزرعة فرعية من المحولات تؤكد التكامل طويل الأمد للحمض النووي التائي في الجينوم.

أخيرا ، تم تأكيد النمط الظاهري من خلال تنمية المحولات في وسائط TAP مع الاختيار وقياس التألق. تمت مقارنة هذا بالنوع البري C. vulgaris. بسبب امتصاص الخلفية / التألق الذاتي للكلوروفيل ، تمت مقارنة التألق عن طريق تطبيع البيانات إلى سلالة النوع البري. في الشكل 3 أ ، يمكن ملاحظة أن هناك فرقا ملحوظا في النمو بين المحولات والنوع البري C. vulgaris. يمكن أن يعزى ذلك إلى عمليات التكامل العشوائية المتعددة للحمض النووي التائي في الجينوم ، مما قد يؤثر على العمليات الخلوية الأخرى ويؤدي إلى تباطؤ النمو. ومع ذلك ، يسلط الشكل 3B الضوء على أنه على الرغم من انخفاض النمو ، فإن جميع السلالات المختارة تظهر مستويات مضان أعلى عند تطبيعها لكثافة الخلية. والجدير بالذكر أن السلالة # 70 أظهرت مستويات مضان أعلى بكثير من غيرها ، مع قيمة p تبلغ <0.01. هذا يؤكد على أهمية فحص العديد من المستعمرات لتحديد المحولات التي تعبر عن البروتين المطلوب دون التأثير سلبا على سلوك النمو العام.

لتأكيد تعبير mGFP5-6xHis، تم استخدام SDS-PAGE لتحليل مستخلص البروتين الخام والبروتينات المنقاة من كل من C. vulgaris (WT) و C. vulgaris transformant (# 50). بعد ذلك ، تم إجراء تنقية البروتين باستخدام مجموعة تدفق الجاذبية لراتنج Ni-NTA وفقا لبروتوكولالشركة المصنعة 18. يوضح الشكل 4 وجود بروتين mGFP5-6xHis (~ 30 كيلو دالتون) في عينة المحول # 50 ولا يوجد بروتين في التحكم السلبي (WT C. vulgaris).

Figure 1
الشكل 1: استعادة محولات C. vulgaris بعد AMT. (A) بعد الزراعة المشتركة ل C. vulgaris ، تكون المحولاتAGL-1 تحتوي على بلازميد pCAMBIA أو بدون البلازميد (AGL-1 فقط) على ألواح انتقائية. (ب) مستعمرات مفردة معاد تخطيطها مختارة من ألواح Hygromycin B (20 مجم / لتر) على أجار TAP انتقائي. (ج) تفتقر المستعمرات الهاربة إلى النمو من صفيحة AGL1 فقط على الوسائط السائلة Hygromycin B (20 مجم / لتر). (د) نمو المستعمرات الفردية # 25 و # 50 و # 50 من ألواح اختيار Hygromycin المزروعة في وسائط TAP السائلة التي تحتوي على Hygromycin و C. vulgaris من النوع البري والتي لا يمكن أن تنمو في وسائط Hygromycin. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الكشف عن تلوث pCAMBIA1302 . (أ) تكامل الحمض النووي التائي في المحولات (ب) والكشف عن تلوث A. tumefaciens (C). يشير WT إلى النوع البري C. vulgaris ، والكمبيوتر الشخصي هو عنصر التحكم الإيجابي (pCAMBIA1302) ويشير AGL1 إلى سلالة A. tumefaciens AGL1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نمو وتألق المحولات في 3 أيام بعد التلقيح. أ: النمو مقيسا بالامتصاص عند 680 nm. (ب) التألق الطبيعي للسلالة البرية. متوسط 3-4 مكررات بيولوجية ، تمثل أشرطة الخطأ 1 σ. * p < 0.05 ، ** p < 0.01 عند مقارنتها بالنوع البري (WT). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل SDS-PAGE ل mGFP5-6xتعبيره في C. vulgaris (WT) وتحويل عينة C. vulgaris # 50. تم تحضير المستخلصات من الخام ، المنقى (الغسيل الأول) ، المنقى (المخفف) ، المنقى (المركز) من C. vulgaris (WT) ، الممرات 1-4 ، على التوالي. الخام ، المنقى (الغسيل الأول) ، المنقى (المثقوب) ، والمنقى (المجفف بالتجميد) من C. vulgaris (WT) ، الممرات 5-8 ، على التوالي. يشير المربع الأحمر إلى بروتين GFP-6xHis المنقى من المحول # 70. تم فصل البروتينات على هلام بولي أكريلاميد 12 ٪. تظهر الأوزان الجزيئية (MWs) لمعايير البروتين (Std.) على اليمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم الوسائط/المخزن المؤقت تكوين
رطل 5 جم/لتر من خلاصة الخميرة، 10 جم/لتر من التربتون، 5 جم/لتر كلوريد الصوديوم
حنفية 20 مللي متر قاعدة Tris ، 1.58 مللي متر K 2 HPO 4 ، 2.4 مللي متر KH 2 PO 4 ، 7.0 مللي مول NH 4 Cl ، 0.83 ملليمول MgSO 4 ، 0.34 مللي مول CaCl 2 ، 1 مل / لتر حمض الخليك الجليدي ، و 1 مل / لتر من كل F / 2 من المعادن النزرة المتوسطة وفيتامينات F /2
F / 2 المعادن النزرة المتوسطة 22 ملغم / لتر ZnSO 4 · 7H 2 O ، 180 مجم / لتر MnCl 2 · 4H 2 O ، 6.3 مجم / لتر Na 2 MoO 4 · 2H 2 O ، 14 مجم / لتر CoCl 2 · 6H 2 O ، 9.8 مجم / لتر CuSO 4 · 5H 2 O ، 3.15 جم / لتر FeCl3 · 6H 2 O ، 4.36 جم / لتر Na 2 EDTA · 2H 2 O
F / 2 الفيتامينات المتوسطة 0.1 ملليمتر فيتامين ب 12 (سيانوكوبالامين)، 25 ملغ/لتر بيوتين، 335 ملغ/لتر ثيامين، 50 ملليمتر HEPES درجة حموضة عازلة 7.8
تحلل العازلة 20 مللي متر Na2HPO 4 ، 300 مللي متر كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة7.4

الجدول 1: وصفات الوسائط والمخزن المؤقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ترتبط كفاءة التحول بعدة معايير مختلفة. يعد اختيار سلالات A. tumefaciens المستخدمة في AMT أمرا بالغ الأهمية. AGL-1 هي واحدة من أكثر السلالات الغازية المكتشفة ، ولهذا السبب ، تم استخدامها بشكل روتيني في نبات AMT. يعد استكمال وسائط الحث بالجلوكوز (15-20 مللي مول) مهما أيضا لكفاءة AMT. بالنظر إلى أن C. vulgaris يمكن أن تنمو في كل من الظروف الضوئية وغير الذاتية التغذية ، غالبا ما يتم حذف الجلوكوز أو مصادر الكربون الأخرى من وسائط الطحالب الدقيقة لمنع التلوث. على سبيل المثال ، يعد Bold's Basal Medium (BBM) هو الوسائط الأكثر استخداما للزراعة الضوئية ل C. vulgaris19. ومع ذلك ، لا يدعم BBM نمو A. tumefaciens بسبب عدم وجود مصدر للكربون العضوي والأمونيوم كمصدر للنيتروجين الذي يفضله (يستخدم BBM النترات)20. لذلك ، تم استخدام وسائط TAP في هذا العمل لأنها تحتوي على أسيتات كمصدر للكربون ل C. vulgaris ، والجلوكوز ل A. tumefaciens، والأمونيوم كمصدر للنيتروجين يمكن لكلا النوعين استخدامه. تسمح لوحات أجار TAP أيضا بمعدلات نمو أسرع بكثير ل C. vulgaris ، مما يقلل من الوقت اللازم لاستعادة المحولات بعد AMT. للحث على بروتينات ضراوة Ti-plasmid ، يجب أيضا إضافة 200 ميكرومتر من الأسيتوسيرينغون إلى وسائط الحث.

للقضاء على A. tumefaciens من الثقافة بعد AMT ، تم استخدام سيفوتاكسيم ، جنبا إلى جنب مع التمرير التسلسلي. AGL-1 مقاوم للأمبيسيلين والكلورامفينيكول والريفاميسين والستربتومايسين ، وهو حساس للسيفوتاكسيم والتتراسيكلين والسبكتينومايسين والكاناميسين. في النباتات ، غالبا ما يستخدم سيفوتاكسيم للقضاء على A. tumefaciens لأنه له تأثير سمي نباتي أقل لتجديد البراعم في العديد من الأنواع النباتية مقارنة بالمضادات الحيوية الأخرى21. ومع ذلك ، أكدنا أيضا أنه يمكن استخدام التتراسيكلين (الذي يكلف حوالي 100 مرة أقل) بدلا من سيفوتاكسيم في هذا البروتوكول عند دمجه مع المرور التسلسلي من مستعمرة واحدة (البيانات غير معروضة). ويرجع ذلك على الأرجح إلى أن المضادات الحيوية مثل التتراسيكلين تمنع تخليق البروتين في البلاستيدة الخضراء في النباتات التي تعتمد على عملية التمثيل الضوئي22. ومع ذلك ، يمكن أن تنمو C. vulgaris في الظلام عند استكمالها بالأسيتات ، مما يعني أن خلل البلاستيدات الخضراء ليس بالضرورة ساما لهذا النوع في ظل ظروف مختارة بعناية.

على الرغم من أن 20 ملغم / لتر من Hygromycin B كانت كافية لمنع نمو النوع البري C. vulgaris ، تم اختبار مجموعة من تركيزات Hygromycin B (20-70 مجم / لتر). من الممكن أن تحتوي المستعمرات المعزولة من صفائح التركيز الأعلى على نسخ متكاملة متعددة من T-DNA أو يقع T-DNA في منطقة أكثر نشاطا نسخيا من الجينوم مما يؤدي إلى تعبير أعلى عن Hygromycin B phosphotransferase مما يؤدي إلى تعطيل أسرع لمبيدات الأعشاب ووقت تأخر أقل في نمو الثقافة23. قد تكون النسخ المتعددة هي سبب الاختلافات في شدة منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عند تضخيم mgfp5 من الجينوم (الشكل 2B). يؤكد وجود بروتين GFP-6xHis في العينة المنقاة أثناء تحليل SDS-PAGE (الشكل 4 ، الحارة 8) وغيابه في السلالة البرية (الشكل 4 ، الحارة 4) أنه يمكن استخدام AMT و pCAMBIA1302 للتعبير الناجح والتكامل المستقر لجين التحوير في C. vulgaris.

في هذا العمل ، قمنا بتطوير وتحسين بروتوكول لتحويل C. vulgaris UTEX 395 الموثوق به باستخدام A. tumefaciens AGL-1 وبلازميد نظام pCAMBIA. نظرا لأن جميع السلالات والبلازميدات اللازمة لهذا العمل متوفرة من عدة مصادر مختلفة ، فسيكون من السهل تكرار هذه الطريقة في أي مختبر. باعتبارها واحدة من أهم السلالات الصناعية للطحالب الدقيقة ، فإن الطريقة المرجعية القياسية ل AMT الموثوقة ستكون حاسمة لهندسة C. vulgaris لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا البروفيسور بول هويكاس على تفضله بتوفير ناقل pCAMBIA1302 و Agrobacterium tumefaciens AGL1 من معهد علم الأحياء في ليدن ، جامعة ليدن ، هولندا. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا إيفا كوليك على مساعدتها في زراعة محولات الفلورسنت. تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا وبرنامج Mitacs Accelerate.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Kb Plus DNA ladder FroggaBio DM015
Acetosyringone Fisher Scientific D26665G
Agrobacterium tumefaciens Gold Biotechnologies Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin Enzo Life Sciences 89151-400
CaCl2·2H2O VWR BDH9224-1KG
Cefotaxime AK Scientific J90010
Chlorella vulgaris University of Texas at Austin Culture Collection of Algae Strain: UTEX 395 Wildtype strain
CoCl2·6H2O Sigma Aldrich C8661-25G
CuSO4·5H2O EMD Millipore CX2185-1
FeCl3·6H2O VWR BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator Bio-Rad 1652662 Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit Thermo Scientific K0791
Glacial acetic acid VWR CABDH3093-2.2P
Glycerol BioBasic GB0232
HEPES Buffer Sigma Aldrich H-3375
Hygromycin B Fisher Scientific AAJ6068103
K2HPO4 VWR BDH9266-500G
Kanamycin Gold Biotechnologies K-250-25
KH2PO4 VWR BDH9268-500G
MgSO4·7H2O VWR 97062-134
MnCl2·4H2O JT Baker BAKR2540-01
Na2CO3 VWR BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O JT Baker 8993-01
Na2MoO4·2H2O JT Baker BAKR3764-01
NaCl VWR BDH7257-7
NaH2PO4 H2O Millipore Sigma CA80058-650
NaNO3  VWR BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin NewEngland BioLabs NEB #S1427
NH4Cl VWR BDH9208-500G
pCAMBIA1302 Leiden University Gift from Prof. Paul Hooykaas pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL) QIAGEN 34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL Bio-Rad 1610363
Rifampicin Millipore Sigma R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch  SunBlaster 210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer  BioTEK S4MLFPTA
Tetracycline Thermo Scientific Chemicals CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% Bio-Rad 1610185
Thiamine TCI America T0181-100G
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Tryptone BioBasic TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin) Enzo Life Sciences 89151-436
Yeast Extract BioBasic G0961
ZnSO4·7H2O JT Baker 4382-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
  2. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  3. De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
  4. Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
  5. Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
  6. Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
  7. Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
  8. de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
  9. Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
  10. Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
  11. Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
  12. Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
  13. Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
  14. Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
  15. Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
  17. Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
  18. NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
  19. Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 1: Unit 3D.1 (2012).
  21. Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
  22. Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
  23. Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).

Tags

التحول بوساطة Agrobacterium Tumefaciens، الهندسة الوراثية، الطحالب الدقيقة الخضراء، شلوريلا الشائع، بروتوكول AMT، جين المراسل، بروتين الفلورسنت الأخضر (mGFP5)، علامة مقاومة المضادات الحيوية، Hygromycin B، اختيار الطفرات، وسائط Tris-Acetate-Phosphate (TAP)، التحول المستقر، كاسيت T-DNA، المستعمرات المعدلة وراثيا، ناقل التعبير النباتي PCAMBIA1302
<em>Agrobacterium tumefaciens</em>- الهندسة الوراثية بوساطة الطحالب الدقيقة الخضراء ، <em>شلوريلا الشائع</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roushan, M. R., Chen, C., Ahmadi,… More

Roushan, M. R., Chen, C., Ahmadi, P., Ward, V. C. A. Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris. J. Vis. Exp. (200), e65382, doi:10.3791/65382 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter