Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Agrobacterium tumefaciens-medieret gensplejsning af grønne mikroalger, Chlorella vulgaris

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65382
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, University of Waterloo

Summary

Denne protokol skitserer udnyttelsen af Agrobacterium tumefaciens-medieret transformation (AMT) til integration af gener af interesse i det nukleare genom af de grønne mikroalger Chlorella vulgaris, hvilket fører til produktion af stabile transformanter.

Abstract

Agrobacterium tumefaciens-medieret transformation (AMT) fungerer som et udbredt værktøj til manipulation af plantegenomer. Imidlertid udviser A. tumefaciens evnen til genoverførsel til en bred vifte af arter. Talrige mikroalgearter mangler veletablerede metoder til pålideligt at integrere gener af interesse i deres nukleare genom. For at udnytte de potentielle fordele ved mikroalgebioteknologi er enkle og effektive genommanipulationsværktøjer afgørende. Heri præsenteres en optimeret AMT-protokol for de industrielle mikroalgeart Chlorella vulgaris, der anvender reporterens grønne fluorescerende protein (mGFP5) og antibiotikaresistensmarkøren for Hygromycin B. Mutanter vælges ved plettering på Tris-acetatphosphat (TAP) medier indeholdende Hygromycin B og cefotaxim. Ekspression af mGFP5 kvantificeres via fluorescens efter over ti generationers subkultur, hvilket indikerer den stabile transformation af T-DNA-kassetten. Denne protokol giver mulighed for pålidelig generering af flere transgene C. vulgaris-kolonier på under to uger ved hjælp af den kommercielt tilgængelige pCAMBIA1302-planteekspressionsvektor.

Introduction

Agrobacterium tumefaciens, en gramnegativ jordbåren bakterie, besidder en unik interkingdom genoverførselsevne, hvilket giver den titlen "naturlig genetisk ingeniør"1. Denne bakterie kan overføre DNA (T-DNA) fra et tumorinducerende plasmid (Ti-plasmid) til værtsceller gennem et type IV-sekretionssystem, hvilket resulterer i integration og ekspression af T-DNA'et i værtsgenomet 1,2,3,4. I den naturlige indstilling fører denne proces til tumordannelse i planter, almindeligvis kendt som kronegaldesygdom. Imidlertid kan Agrobacterium også overføre T-DNA til forskellige andre organismer, herunder gær, svampe, alger, søpindsvinembryoner og endda humane celler under laboratoriebetingelser 5,6,7,8.

Ved at udnytte dette naturlige system muliggør Agrobacterium tumefaciens-medieret transformation (AMT) tilfældig integration af gener af interesse i en værtscelles nukleare genom ved at ændre T-DNA-regionen af Ti-plasmidet. Til dette formål er en meget anvendt AMT-planteekspressionsvektor pCAMBIA13029. Forskere kan anvende enkle kloningsarbejdsgange i E. coli, før de overfører den ønskede vektor til A. tumefaciens til efterfølgende overførsel til værten af interesse.

Grønne mikroalger er eukaryoter, der deler mange ligheder med landplanter, men er meget genstridige over for genetisk modifikation. Genetisk transformation spiller imidlertid en afgørende rolle i både grundlæggende og bioteknologisk forskning i mikroalger. I flere mikroalgearter, især Chlamydomonas reinhardtii, har genetisk transformation via AMT med succes introduceret transgener såsom humant interleukin-2 (hIL-2), det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2-receptorbindende domæne (SARS-CoV-2 RBD) og to antimikrobielle peptider (AMP'er)10,11,12,13. Blandt disse har chlorella vulgaris, en mindre kræsen og hurtigt voksende grønalgeart, et betydeligt potentiale for bæredygtig produktion af kulhydrater, proteiner, nutraceuticals, pigmenter og andre højværdiforbindelser14. Manglen på pålidelige værktøjer til at skabe transgene stammer af C. vulgaris hæmmer imidlertid dets kommercielle fremskridt. Da der kun har været et begrænset antal offentliggjorte værker, der anvender AMT i C. vulgaris15, og i betragtning af de betydelige forskelle mellem dyrkning af planter og mikroalger, bliver optimering af AMT-protokollen afgørende.

I denne undersøgelse indsatte forskere grønt fluorescerende protein (mGFP5) nedstrøms for blomkålmosaikvirus (CamV) 35S-promotoren og tilføjede et histidinmærke for at bruge det som et reportergen til proteinekspression. Transformanter blev valgt ved hjælp af Hygromycin B, og efter subkulturering i over tyve generationer forblev transformationen stabil. Det pCAMBIA1302-plasmid, der anvendes i dette arbejde, kan let tilpasses til at indeholde ethvert gen af interesse. Desuden kan den præsenterede metode og materialer justeres for andre grønalgearter med en aktiv CamV35S-promotor, da denne promotor bruges til valg af Hygromycin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle medier og opløsninger skal autoklaveres før brug, medmindre andet er angivet. Alle centrifugeglas, pipettespidser osv. skal være sterile eller autoklaverede før brug. For nem reference er de medieopskrifter, der anvendes i denne protokol, angivet i tabel 1.

1. Fremstilling af A. tumefaciens elektrokompetente celler

  1. Agrobacterium (AGL-1) podes i en 25 ml steril rystekolbe med LB-medier (suppleret med rifampicin, 20 mg/L-1) fra en frossen glycerolstamme og vokser natten over ved 28-30 °C og 150 omdr./min.
    BEMÆRK: Agrobacterium-stammen AGL-1 er (se materialetabel) resistent over for rifampicin, ampicillin, chloramphenicol og streptomycin og kan fås fra flere leverandører.
  2. Den følgende dag fortyndes kulturen 1,00,000 gange ved at tilsætte 0,5 μL af natkulturen til 50 ml autoklaveret ultrarent vand og spredes 10 μL af denne fortyndede kultur på en LB-plade og inkuberes derefter ved 28-30 °C i 1-3 dage.
  3. Vælg en koloni og start en 20 ml overnatningskultur i LB med rifampicin ved 28-30 °C.
  4. Næste dag podes 500 ml LB medier (intet antibiotikum) i en rystekolbe med 9 ml natkultur og vokser ved 28-30 °C, indtil OD600 når 0,5.
  5. Del kulturen jævnt i ti 50 ml centrifugerør og afkøl på is i 30 min. Centrifugen forafkøles til 4 °C.
  6. Centrifuger glassene ved 4 °C og 4000 x g i 15 min. Derefter fjernes så meget supernatant som muligt med en pipette og pelleten i hvert rør resuspenderes i 50 ml iskoldt vand.
  7. Centrifuger cellerne ved 4 °C og 4000 x g i 15 min. Supernatanten fjernes og pellets resuspenderes i 25 ml iskoldt vand i hvert rør.
  8. Centrifuger cellerne ved 4 °C og 4000 x g i 15 min. Supernatanten fjernes og pelletsen resuspenderes i 1 ml iskold 10% (w/v) glycerol i hvert glas.
  9. Kombiner alle glas i et 50 ml rør og centrifuger cellerne ved 4 °C og 4000 x g i 15 min. Supernatanten fjernes og pellets resuspenderes i 400 μL iskold 10% (w/v) glycerol. Cellekoncentrationen skal være ca. 1-3 x 1010 celler/ml.
  10. Cellerne fordeles som 50 μL alikvoter i sterile forkølede mikrorør. Fryses i flydende nitrogen og opbevares i en fryser på -80 °C.

2. Elektroporation af A. tumefaciens

  1. Der tilsættes 50 μL AGL-1 A. tumefaciens elektrokompetente celler i en forkølet 0,1 mm kuvette, og der tilsættes 2 μL pCAMBIA1302 eller lignende plasmid (konc 15 ng/μL) (se materialetabel).
  2. Elektroporat ved 2400 V ved hjælp af en elektroporator (200 Ω, kapacitansforlænger 250 μFD, kapacitans 25 μFD, eksponentielt henfald, se materialetabel). Tidskonstanten skal være >4,5 ms for vellykket elektroporation med eksponentielt henfald.
  3. Tilsæt straks 1 ml LB-medie til kuvetten og pipette forsigtigt op og ned for at blande. De 1 ml resuspenderede celler overføres til et 1,5 ml mikrorør og inkuberes ved 28-30 °C i mindst 1 time for at komme sig.
  4. Plade cellerne på LB-agar, der indeholder det passende antibiotikum (dvs. 50 mg / L kanamycin til pCAMBIA1302 til prokaryot selektion).
  5. Der inkuberes ved 28-30 °C i 2-3 dage.
  6. Vælg en koloni, dyrk natten over i LB med det passende udvalg (50 mg / l kanamycin til pCAMBIA1302), og kryopræserver den plasmidholdige stamme ved hjælp af 50% glycerol ved -80 ° C til fremtidig brug.

3. AMT af C. vulgaris

BEMÆRK: Forbered C. vulgaris (UTEX 395, se materialetabel) og A. tumefaciens kulturer parallelt til samdyrkning. C. vulgariskulturer bør startes 3 dage før tilberedning af A. tumefaciens kulturer. Protokollen blev ændret på grundlag af den, der blev offentliggjort af Kumar et al.7.

  1. Forbered C. vulgaris kultur
    1. C. vulgaris opbevares traditionelt på skråninger eller vedligeholdes i logfasekulturer under oplyste forhold. Fra en logfasekultur ved OD600 = 1,0 spredes 0,5 ml på en Tris-acetatphosphat (TAP, se tabel 1) agarplader (1,2% w/v agar A) og vokser i 5 dage ved 25 °C med belysning (50 μE/m2s). Dette vil give ca. 5 x 106 celler.
  2. Forbered A. tumefaciens kultur
    1. A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 stammes i en rystekolbe ved podning af 10 ml LB-medier suppleret med 15 mM glucose, 20 mg/l rifampicin og 50 mg/l kanamycin (se materialetabel) ved hjælp af glycerollageret. Der inkuberes ved 28-30 °C og 250 o/min natten over.
    2. Pod 1 ml kultur natten over i 50 ml LB med 15 mM glucose, 20 mg / l rifampicin og 50 mg / l kanamycin og inkuber ved 28-30 ° C og 250 rpm, indtil OD600 når 1,0.
  3. Cocultivate C. vulgaris og A. tumefaciens
    1. For at forberede A. tumefaciens-kulturen til samdyrkning overføres den dyrkede kultur til et 50 ml rør og centrifugeres ved 4000 x g i 30 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes med en pipette og vaskes to gange med induktionsmediet.
      BEMÆRK: Det anvendte induktionsmedie er TAP-medier justeret til pH 5,5 og suppleret med F/2 medium spormetaller og vitaminer med 200 μM acetosyringon (AS, se materialetabel). Resuspender cellerne i induktionsmedier, således at OD600 = 0,5.
    2. For at forberede C. vulgaris-kulturen til samdyrkning tilsættes 25 ml induktionsmedier til C. vulgaris-pladen, der indeholder ~ 5 x 106 celler. Overfør til et 50 ml rør. Cellerne centrifugeres ved 4000 x g i 15 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten kasseres.
    3. Algecellepelletsen blandes med 200 μL bakteriesuspension (OD600: 0,5) og inkuberes i en rotationsryster ved 21-25 °C ved 150 o/min i 1 time.
    4. Den blandede kultur (200 μL) spredes på induktionsmedieplader suppleret med 15 mM glucose og inkuberes ved 21-25 °C i mørke i 3 dage.
    5. Efter 3 dage anvendes 10 ml TAP-medier suppleret med 400 mg/l cefotaxim eller 20 mg/l tetracyklin (se materialetabel) til opsamling af mikroalger og inkubation i mørke ved 21-25 °C i 2 dage for at fjerne A. tumefaciens fra kulturen.
    6. Plade 500 μL af kulturen på selektive medier, f.eks. TAP-medier suppleret med 20-70 mg/l hygromycin B (ved anvendelse af pCAMBIA1302) og 400 mg/L-1 cefotaxim eller 20 mg/l tetracyklin. Der inkuberes 21-25 °C i mørke i 2 dage, før de anbringes i et oplyst kammer.
      BEMÆRK: Resistente kolonier vises 5-7 dage efter lyseksponering.
    7. Pluk enkelte kolonier fra transformationspladen og stribe dem igen på TAP-agarplader suppleret med 400 mg/l cefotaxim eller 20 mg/l tetracyklin og 20-70 mg/l hygromycin B.

4. Colony PCR (cPCR) for at bekræfte genintegration i C. vulgaris transformanter

  1. Uddrag genomisk DNA fra en C. vulgaris-transformant efter subkultur mindst to gange fra en enkelt koloni ved hjælp af et plantegenomisk DNA-ekstraktionssæt (se materialetabel). Brug dette som skabelon til PCR, design primere til mgfp5-regionen af T-DNA'et (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' og M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
    1. Brug et Q5 high-fidelity DNA-polymerase-masterblandingssæt (se materialetabel) til at udføre polymerasekædereaktion (PCR) for at validere transgenintegration.
      BEMÆRK: Følgende betingelser blev anvendt til denne undersøgelse: 98 °C i 3 minutter; 35 cyklusser (98 °C i 10 sekunder, 57 °C i 30 sek., 72 °C i 1 min) 72 °C i 5min. Brug pCAMBIA1302 som en positiv kontrol og vildtype C. vulgaris genomisk DNA som en negativ kontrol.
  2. For at bekræfte, at der ikke er nogen pCAMBIA1302 til stede i prøven på grund af resterende kontaminering med A. tumefaciens, skal du bruge koloni PCR. Tilsæt en lille mængde transformante celler til 10 μL sterilt vand og kog ved 98 °C i 15 minutter. Brug dette som en skabelon til PCR.
    1. Design primere til et område uden for T-DNA'et på pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' og B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      BEMÆRK: Følgende betingelser blev anvendt til denne undersøgelse: 94 °C i 3 minutter; 30 cyklusser (94 °C i 30 s, 48 °C i 30 s, 68 °C i 5 min) 68 °C i 7 min. Brug en kogt koloni af A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) som en positiv kontrol og en kogt koloni af vildtype C. vulgaris som en negativ kontrol.
  3. For at bekræfte, at der ikke er nogen A. tumerfaciens-forurening til stede i prøven, skal du bruge koloni-PCR. Tilsæt en lille mængde transformante celler til 10 μL sterilt vand og kog ved 98 °C i 15 minutter. Brug dette som en skabelon til PCR.
    1. Design primere til virE2-genet indeholdt på AGL-1-virulensplasmidet (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' og virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      BEMÆRK: Følgende betingelser blev anvendt til denne undersøgelse: 94 °C i 3 minutter; 30 cyklusser (94 °C i 30 s, 53 °C i 30 s, 68 °C i 3 minutter) 68 °C i 7 min. Brug en kogt koloni af A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) som en positiv kontrol og en kogt koloni af vildtype C. vulgaris som en negativ kontrol.
  4. Kør PCR-prøver på en DNA-agarosegel sammen med en stige (1 Kbp DNA-stige, se materialetabel) for at bekræfte størrelsen af de resulterende fragmenter16.

5. Måling af fluorescens af transformanter

  1. Hvert transformeringsmiddel podes fra en logfasevedligeholdelseskultur eller TAP-agarskråning i 50 ml TAP suppleret med 200 mg/L-1 cefotaxim og 25 mg/L-1 Hygromycin B, således at start-OD 600 = 0,1. Inokulere en kultur med vildtype C. vulgaris og kun 200 mg / L-1 cefotaxim som den negative kontrol. Der inkuberes ved 25 °C ved 150 o/min med 150 μmol/m2s fotosyntetisk aktivt lys (se materialetabel).
  2. For hver 24. time udtages en prøve på 300 μL, og absorbansen og fluorescensen (excitation 488 nm, emission 526 nm) måles i en pladelæser med 96 huller eller UV/Vis-spektrometer og fluorometer (se materialetabellen). Brug en sort plade med gennemsigtig bund til samtidige målinger.

6. Råproteinekstraktion, proteinoprensning og SDS-PAGE elektroforese

  1. Inokulere transformant (#50) fra en logfasevedligeholdelseskultur til 300 ml TAP suppleret med 200 mg/L-1 cefotaxim og 25 mg/L-1 Hygromycin B for at nå OD680 = 0,1. Inokulere en kultur med vildtype C. vulgaris og kun 200 mg / L-1 cefotaxim som den negative kontrol. Der inkuberes ved 25 °C ved 150 o/min med 150 μmol/m2s fotosyntetisk aktivt lys.
  2. Uddrag råproteinprøven fra transformanten (# 50) og vildtypestammerne ved hjælp af 5 ml lysisbuffer (se tabel 1) efterfulgt af sonikering i 4 minutter.
  3. Rens råproteinprøve med en Ni-NTA-harpiks gennem 5 ml polypropylenkolonner (se materialetabel).
  4. Frysetørrede de 15 ml oprensede proteinprøver og resuspender dem i 1 ml lysisbuffer til SDS-PAGE-analyse17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at vise vellykket transformation ved hjælp af ovenstående metode blev C. vulgaris co-dyrket med enten AGL-1 indeholdende pCAMBIA1302-plasmidet eller uden plasmidet (vildtype og belagt med TAP-agar suppleret med Hygromycin B og cefotaxim (figur 1A). Pladen længst til venstre viser de transformerede kolonier, der er i stand til at vokse på Hygromycin B/cefotaximplader, og den midterste plade viser, at vildtype AGL-1 ikke kan vokse på Hygromycin B/cefotaximpladerne. Pladen længst til højre viser, at når der ikke anvendes selektion (kun cefotaxim), kan C. vulgaris-transformanter og vildtype vokse . Enkelte kolonier blev stribet på TAP-agar med Hygromycin B og cefotaxim (figur 1B). Undslupne kolonier fra pladen yderst til højre (figur 1B) blev podet på TAP-væske med Hygromycin B og cefotaxim (figur 1C). På grund af variable ekspressionsniveauer efter tilfældig integration af T-DNA blev transformanter oprindeligt genfundet på plader med stigende koncentrationer af Hygromycin B fra 25-70 mg/l. En koloni fra hver plade blev dyrket i flydende TAP-medier indeholdende samme koncentration af Hygromycin B sammen med vildtype C. vulgaris i den laveste koncentration (figur 1D). Vildtypen C. vulgaris kan ikke vokse ved tilstedeværelse af Hygromycin, mens der blev opnået kolonier, der var resistente over for op til 70 mg/l.

For at bekræfte, at T-DNA-kassetten var stabilt integreret i genomet af C. vulgaris, blev en koloni udvalgt fra hver af de 20, 25, 30, 50 og 70 mg / L Hygromycin B-plader hver subkultureret ved gentagen stribe på TAP-agarplader med udvælgelse to gange og derefter rutinemæssigt subkultureret i TAP-medier over ti gange, Navngivet Transformant #20, #25, #30, #50, #50 og #70 henholdsvis. Ved hjælp af disse kulturer blev både koloni-PCR udført for at udelukke forurening med pCAMBIA1302 i AGL1, og genomisk DNA blev ekstraheret for at bekræfte, at mGFP5-genet var til stede i C. vulgaris-genomet. I figur 2A blev koloni-PCR udført ved hjælp af primere rettet mod en 5 kbp-region uden for T-DNA'ets venstre og højre grænse var i stand til at forstærke denne region fra pCAMBIA1302-plasmid som en positiv kontrol, men denne region var ikke til stede i nogen af C. vulgaris-prøverne , hvilket indikerer, at pCAMBIA1302-DNA ikke var til stede i nogen af kulturerne. Wild-type C. vulgaris-prøven blev anvendt som negativ kontrol, og der sås ingen forstærkning.

Genomisk DNA blev ekstraheret fra transformanter #25, #50 og #70, og PCR blev udført, hvilket forstærkede en 1763 bp-region indeholdende mgfp5-genet af T-DNA'et for at bekræfte integration i transformanterne (figur 2B). pCAMBIA1302 blev anvendt som en positiv kontrol, og amplifikation blev påvist i alle transformanterne, hvilket indikerer, at mgfp5-genet var til stede i alle transformanternes genomiske DNA. Vildtypen C. vulgaris blev brugt som negativ kontrol, og der blev ikke set nogen forstærkning. Figur 2C viser amplifikationen af et 600 bp fragment af virulensproteinet E2 (VirE2), som findes i det tumorinducerende plasmid (Ti-plasmid) af AGl1-stammen. Den positive kontrol, bestående af AGl1-stammen indeholdende pCAMIA1302, blev med succes forstærket med primere, hvilket indikerer tilstedeværelsen af A. tumefaciens i prøven. Imidlertid testede alle C. vulgaris-prøverne negativt for denne region, hvilket indikerer, at gentagen subkulturation på cefotaxim med succes eliminerede forurening af AGL1 fra kulturen. Vildtype C. vulgaris-prøven blev anvendt som negativ kontrol, og der blev ikke observeret nogen amplifikation. Samlet set bekræfter disse tre tests, at T-DNA'et indeholdende mgpf5 blev indsat i genomet af C. vulgaris, og disse resultater skyldtes ikke forurening af AGL1 i prøverne eller tilstedeværelsen af pCAMBIA1302 i cellerne. Disse resultater blev gentaget efter 20 og ca. 100 subkulturer af transformanterne, hvilket bekræfter den langsigtede integration af T-DNA'et i genomet.

Endelig blev fænotypen bekræftet ved at dyrke transformanterne i TAP-medier med udvælgelse og måling af fluorescensen. Dette blev sammenlignet med vildtypen C. vulgaris. På grund af klorofylens baggrundsabsorbans/autofluorescens blev fluorescensen sammenlignet ved at normalisere dataene til vildtypestammen. I figur 3A kan det observeres, at der er en mærkbar forskel i vækst mellem transformanterne og vildtypen C. vulgaris. Dette kan potentielt tilskrives de mange tilfældige integrationer af T-DNA'et i genomet, hvilket kan påvirke andre cellulære processer og føre til langsommere vækst. Ikke desto mindre fremhæver figur 3B , at på trods af den lavere vækst udviser alle de udvalgte stammer højere fluorescensniveauer, når de normaliseres for celletæthed. Især stamme #70 viste signifikant højere fluorescensniveauer end de andre med en p-værdi på <0,01. Dette understreger vigtigheden af at screene adskillige kolonier for at identificere transformanter, der udtrykker det ønskede protein uden at påvirke den samlede vækstadfærd negativt.

For at bekræfte ekspressionen af mGFP5-6xHis blev SDS-PAGE brugt til at analysere råproteinekstraktet og his-tag oprensede proteiner fra både C. vulgaris (WT) og C. vulgaris transformant (#50). Derefter blev hans tag-proteinrensning udført ved hjælp af et Ni-NTA-harpikstyngdekraftflowsæt efter producentens protokol18. Figur 4 viser tilstedeværelsen af mGFP5-6xHans protein (~30 kDa) i den transformante prøve #50 og intet protein i den negative kontrol (WT C. vulgaris).

Figure 1
Figur 1: Genvinding af C. vulgaris-transformanter efter AMT. (A) Efter samdyrkning af C. vulgaris er transformanter AGL-1 indeholdende pCAMBIA-plasmidet eller uden plasmidet (kun AGL-1) på selektive plader. B) Enkeltkolonier med ny stribe udvalgt blandt Hygromycin B-plader (20 mg/l) på selektiv TAP-agar. (C) Undslupne kolonier mangler vækst fra AGL1-plade på Hygromycin B (20 mg/l) flydende medier. (D) Vækst af enkelte kolonier #25, #50 og #50 fra Hygromycin-selektionsplader dyrket i flydende TAP-medier indeholdende Hygromycin og vildtype C. vulgaris, der ikke kan vokse i Hygromycin-medier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Påvisning af pCAMBIA1302-kontaminering . (A) Integration af T-DNA i transformanter (B) og påvisning af A. tumefaciens-kontaminering (C). WT angiver vildtype C. vulgaris, PC er den positive kontrol (pCAMBIA1302) og AGL1 indikerer A. tumefaciens AGL1-stamme. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Transformanternes vækst og fluorescens 3 dage efter podningen. (A) Vækst målt ved absorbans ved 680 nm. (B) Fluorescens normaliseret til vildtypestammen. Gennemsnit af 3-4 biologiske replikater, fejlbjælker repræsenterer 1 σ. *p < 0,05, **p < 0,01 sammenlignet med vildtypen (WT). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: SDS-PAGE analyse af mGFP5-6xHans udtryk i C. vulgaris (WT) og transformeret C. vulgaris prøve #50. Ekstrakter blev fremstillet af rå, renset (første vask), renset (fortyndet) og renset (koncentreret) fra henholdsvis C. vulgaris (WT), bane 1-4. Rå, renset (første vask), renset (elueret) og renset (frysetørret) fra henholdsvis C. vulgaris (WT), bane 5-8. Den røde boks angiver renset GFP-6xHans protein fra transformant #70. Proteiner blev separeret på en polyacrylamid 12% gel. Molekylvægten (MW) af proteinstandarderne (Std.) er vist til højre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Navn på medie/buffer Sammensætning
LB 5 g/l gærekstrakt, 10 g/l trypton, 5 g/l NaCl
HANE 20 mM Tris base, 1,58 mM K 2 HPO 4, 2,4 mM KH 2 PO 4, 7,0 mM NH 4 Cl, 0,83 mM MgSO4, 0,34 mM CaCl 2, 1 ml / L iseddike og 1 ml / L af hver F / 2 medium spormetaller og F /2vitaminer
F/2 spormetaller til medium 22 mg/L ZnSO 4·7H 2 O, 180 mg/l MnCl 2·4H 2 O, 6,3 mg/l Na 2 MoO 4·2H 2 O, 14 mg/L CoCl 2·6H 2 O, 9,8 mg/l CuSO 4·5H 2 O, 3,15 g/l FeCl3·6H 2 O, 4,36 g/l Na 2 EDTA·2H 2 O
F/2 mellemstore vitaminer 0,1 mM Vitamin B12 (cyanocobalamin), 25 mg/L Biotin, 335 mg/L Thiamin, 50 mM HEPES Buffer pH 7,8
Lysis Buffer 20 mM Na2HPO 4, 300 mM NaCl, pH7,4

Tabel 1: Medie- og bufferopskrifter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Effektiviteten af transformation er forbundet med flere forskellige parametre. Valget af A. tumefaciens-stammer , der anvendes til AMT, er afgørende. AGL-1 er en af de mest invasive stammer, der er opdaget, og er derfor rutinemæssigt blevet brugt i plante-AMT. Supplering af induktionsmediet med glukose (15-20 mM) er også vigtigt for AMT-effektivitet. I betragtning af at C. vulgaris kan vokse under både fototrofe og heterotrofe forhold, udelades glukose eller andre kulstofkilder ofte fra mikroalgemedier for at forhindre forurening. For eksempel er Bold's Basal Medium (BBM) det mest almindeligt anvendte medie til fototrofisk dyrkning af C. vulgaris19. BBM understøtter imidlertid ikke A. tumefaciens vækst på grund af manglen på en organisk kulstofkilde og ammonium som en nitrogenkilde, den foretrækker (BBM bruger nitrat)20. Derfor blev TAP-medier brugt i dette arbejde, fordi det indeholder acetat som kulstofkilde til C. vulgaris , glukose til A. tumefaciens og ammonium som nitrogenkilde, som begge arter kan bruge. TAP agarplader giver også mulighed for meget hurtigere vækstrater for C. vulgaris, hvilket minimerer tiden til at genvinde transformanter efter AMT. For at inducere Ti-plasmidvirulensproteiner skal der også tilsættes 200 μM acetosyringon til induktionsmediet.

For at eliminere A. tumefaciens fra kulturen efter AMT blev cefotaxim sammen med seriel passaging anvendt. AGL-1 er resistent over for ampicillin, chloramphenicol, rifamycin og streptomycin, og det er følsomt over for cefotaxim, tetracyclin, spectinomycin og kanamycin. I planter bruges cefotaxim ofte til at eliminere A. tumefaciens , fordi det har en lavere fytotoksisk virkning til skudregenerering hos mange plantearter end andre antibiotika21. Vi bekræftede imidlertid også, at tetracyklin (som koster ca. 100 gange mindre) kunne bruges i stedet for cefotaxim i denne protokol, når det kombineres med seriel overførsel fra en enkelt koloni (data ikke vist). Dette skyldes sandsynligvis, at antibiotika som tetracyklin ville hæmme proteinsyntese i kloroplasten i planter, der er afhængige af fotosyntese22. Imidlertid kan C. vulgaris vokse i mørke, når de suppleres med acetat, hvilket betyder, at kloroplastdysfunktion ikke nødvendigvis er giftigt for denne art under nøje udvalgte forhold.

Selvom 20 mg/l Hygromycin B var tilstrækkeligt til at forhindre vækst af vildtype C. vulgaris, blev en række Hygromycin B-koncentrationer (20-70 mg/l) testet. Det er muligt, at kolonier isoleret fra plader med højere koncentration kan have flere integrerede kopier af T-DNA'et, eller T-DNA'et er placeret i en mere transkriptionelt aktiv region af genomet, hvilket resulterer i højere ekspression af Hygromycin B-phosphotransferase, hvilket resulterer i hurtigere inaktivering af herbicidet og mindre forsinkelsestid i kulturvækst23. Flere kopier kan være årsagen til forskellene i intensiteten af PCR-produkterne, når mgfp5 forstærkes fra genomet (figur 2B). Tilstedeværelsen af GFP-6xHis protein i den oprensede prøve under SDS-PAGE-analyse (figur 4, bane 8) og dets fravær i vildtypestammen (figur 4, bane 4) bekræfter, at AMT og pCAMBIA1302 kan anvendes til vellykket ekspression og stabil integration af transgen i C. vulgaris.

I dette arbejde udviklede og optimerede vi en protokol til pålidelig C. vulgaris UTEX 395-transformation ved hjælp af A. tumefaciens AGL-1 og et pCAMBIA-systemplasmid. Da alle de stammer og plasmider, der er nødvendige for dette arbejde, er tilgængelige fra flere forskellige kilder, vil denne metode være let at replikere i ethvert laboratorium. Som en af de vigtigste industrielle stammer af mikroalger vil en standardreferencemetode for pålidelig AMT være afgørende for konstruktion af C. vulgaris til bioteknologiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der blev ikke erklæret interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke professor Paul Hooykaas for venligt at levere pCAMBIA1302-vektoren og Agrobacterium tumefaciens AGL1 fra Institute of Biology Leiden, Leiden University, Holland. Forfatterne vil også gerne takke Eva Colic for hendes hjælp med at dyrke de fluorescerende transformanter. Dette arbejde blev finansieret af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada og Mitacs Accelerate-programmet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Kb Plus DNA ladder FroggaBio DM015
Acetosyringone Fisher Scientific D26665G
Agrobacterium tumefaciens Gold Biotechnologies Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin Enzo Life Sciences 89151-400
CaCl2·2H2O VWR BDH9224-1KG
Cefotaxime AK Scientific J90010
Chlorella vulgaris University of Texas at Austin Culture Collection of Algae Strain: UTEX 395 Wildtype strain
CoCl2·6H2O Sigma Aldrich C8661-25G
CuSO4·5H2O EMD Millipore CX2185-1
FeCl3·6H2O VWR BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator Bio-Rad 1652662 Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit Thermo Scientific K0791
Glacial acetic acid VWR CABDH3093-2.2P
Glycerol BioBasic GB0232
HEPES Buffer Sigma Aldrich H-3375
Hygromycin B Fisher Scientific AAJ6068103
K2HPO4 VWR BDH9266-500G
Kanamycin Gold Biotechnologies K-250-25
KH2PO4 VWR BDH9268-500G
MgSO4·7H2O VWR 97062-134
MnCl2·4H2O JT Baker BAKR2540-01
Na2CO3 VWR BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O JT Baker 8993-01
Na2MoO4·2H2O JT Baker BAKR3764-01
NaCl VWR BDH7257-7
NaH2PO4 H2O Millipore Sigma CA80058-650
NaNO3  VWR BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin NewEngland BioLabs NEB #S1427
NH4Cl VWR BDH9208-500G
pCAMBIA1302 Leiden University Gift from Prof. Paul Hooykaas pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL) QIAGEN 34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL Bio-Rad 1610363
Rifampicin Millipore Sigma R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch  SunBlaster 210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer  BioTEK S4MLFPTA
Tetracycline Thermo Scientific Chemicals CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% Bio-Rad 1610185
Thiamine TCI America T0181-100G
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Tryptone BioBasic TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin) Enzo Life Sciences 89151-436
Yeast Extract BioBasic G0961
ZnSO4·7H2O JT Baker 4382-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
  2. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  3. De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
  4. Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
  5. Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
  6. Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
  7. Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
  8. de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
  9. Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
  10. Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
  11. Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
  12. Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
  13. Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
  14. Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
  15. Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
  17. Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
  18. NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
  19. Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 1: Unit 3D.1 (2012).
  21. Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
  22. Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
  23. Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).

Tags

Agrobacterium tumefaciens-medieret transformation Genteknologi Grønne mikroalger Chlorella vulgaris AMT-protokol Reportergen Grønt fluorescerende protein (mGFP5) Antibiotikaresistensmarkør Hygromycin B Valg af mutanter Tris-acetatphosphat (TAP) medier Stabil transformation T-DNA-kassette Transgene kolonier PCAMBIA1302 planteekspressionsvektor
<em>Agrobacterium tumefaciens-medieret</em> gensplejsning af grønne mikroalger, <em>Chlorella vulgaris</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roushan, M. R., Chen, C., Ahmadi,… More

Roushan, M. R., Chen, C., Ahmadi, P., Ward, V. C. A. Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris. J. Vis. Exp. (200), e65382, doi:10.3791/65382 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter