Summary
Ce protocole décrit l’utilisation de la transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) pour intégrer le(s) gène(s) d’intérêt dans le génome nucléaire de la microalgue verte Chlorella vulgaris, conduisant à la production de transformants stables.
Abstract
La transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) est un outil largement utilisé pour manipuler les génomes des plantes. Cependant, A. tumefaciens présente la capacité de transférer des gènes à un large éventail d’espèces. De nombreuses espèces de microalgues ne disposent pas de méthodes bien établies pour intégrer de manière fiable les gènes d’intérêt dans leur génome nucléaire. Pour exploiter les avantages potentiels de la biotechnologie des microalgues, des outils de manipulation du génome simples et efficaces sont essentiels. Dans ce document, un protocole AMT optimisé est présenté pour l’espèce de microalgue industrielle Chlorella vulgaris, en utilisant la protéine fluorescente verte rapporteuse (mGFP5) et le marqueur de résistance aux antibiotiques pour l’hygromycine B. Les mutants sont sélectionnés par placage sur un milieu de tris-acétate-phosphate (TAP) contenant de l’hygromycine B et du céfotaxime. L’expression de mGFP5 est quantifiée par fluorescence après plus de dix générations de sous-culture, ce qui indique la transformation stable de la cassette d’ADN-T. Ce protocole permet de générer de manière fiable plusieurs colonies transgéniques de C. vulgaris en moins de deux semaines, en utilisant le vecteur d’expression végétale pCAMBIA1302 disponible dans le commerce.
Introduction
Agrobacterium tumefaciens, une bactérie à Gram négatif transmise par le sol, possède une capacité unique de transfert de gènes entre règnes, ce qui lui a valu le titre d'« ingénieur génétique naturel »1. Cette bactérie peut transférer l’ADN (ADN-T) d’un plasmide inducteur de tumeur (Ti-Plasmide) dans les cellules hôtes par le biais d’un système de sécrétion de type IV, ce qui entraîne l’intégration et l’expression de l’ADN-T dans le génome de l’hôte 1,2,3,4. Dans le cadre naturel, ce processus conduit à la formation de tumeurs chez les plantes, communément appelée maladie de la galle du collet. Cependant, Agrobacterium peut également transférer l’ADN-T dans divers autres organismes, y compris les levures, les champignons, les algues, les embryons d’oursins et même les cellules humaines dans des conditions de laboratoire 5,6,7,8.
Exploitant ce système naturel, la transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) permet l’intégration aléatoire de gènes d’intérêt dans le génome nucléaire d’une cellule hôte en modifiant la région de l’ADN-T du plasmide Ti. À cette fin, un vecteur d’expression de l’AMT largement utilisé est pCAMBIA13029. Les chercheurs peuvent utiliser des processus de clonage simples chez E. coli avant de transférer le vecteur souhaité dans A. tumefaciens pour un transfert ultérieur à l’hôte d’intérêt.
Les microalgues vertes sont des eucaryotes qui partagent de nombreuses similitudes avec les plantes terrestres mais qui sont très récalcitrantes aux modifications génétiques. Cependant, la transformation génétique joue un rôle crucial dans la recherche fondamentale et biotechnologique sur les microalgues. Chez plusieurs espèces de microalgues, en particulier Chlamydomonas reinhardtii, la transformation génétique via l’AMT a permis d’introduire avec succès des transgènes tels que l’interleukine-2 humaine (hIL-2), le domaine de liaison au récepteur du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2 RBD) et deux peptides antimicrobiens (AMP)10,11,12,13. Parmi celles-ci, Chlorella vulgaris, une espèce d’algue verte moins exigeante et à croissance rapide, présente un potentiel important pour la production durable de glucides, de protéines, de nutraceutiques, de pigments et d’autres composés de grande valeur14. Cependant, le manque d’outils fiables pour créer des souches transgéniques de C. vulgaris entrave son progrès commercial. Étant donné qu’il n’y a eu qu’un nombre limité de travaux publiés utilisant l’AMT chez C. vulgaris15, et compte tenu des différences considérables entre la culture des plantes et celle des microalgues, l’optimisation du protocole AMT devient essentielle.
Dans cette étude, les chercheurs ont inséré une protéine fluorescente verte (mGFP5) en aval du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CamV) et ont ajouté un marqueur d’histidine pour l’utiliser comme gène rapporteur pour l’expression des protéines. Les transformants ont été sélectionnés à l’aide de l’hygromycine B, et après une sous-culture pendant plus de vingt générations, la transformation est restée stable. Le plasmide pCAMBIA1302 utilisé dans ce travail peut être facilement adapté pour contenir n’importe quel gène d’intérêt. De plus, la méthode et les matériaux présentés peuvent être ajustés pour d’autres espèces d’algues vertes avec un promoteur actif CamV35S, car ce promoteur est utilisé pour la sélection de l’hygromycine.
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Protocol
Tous les milieux et solutions doivent être autoclavés avant utilisation, sauf indication contraire. Tous les tubes à centrifuger, les pointes de pipette, etc., doivent être stériles ou autoclavés avant utilisation. Pour faciliter la consultation, les recettes de médias utilisées dans ce protocole sont répertoriées dans le tableau 1.
1. Préparation des cellules électrocompétentes d’A. tumefaciens
- Inoculer Agrobacterium (AGL-1) dans un flacon agitateur stérile de 25 mL de milieu LB (supplémenté en rifampicine, 20 mg/L-1) à partir d’un stock de glycérol congelé et cultiver pendant la nuit à 28-30 °C et 150 tr/min.
REMARQUE : La souche AGL-1 d’Agrobacterium est (voir le tableau des matériaux) résistante à la rifampicine, à l’ampicilline, au chloramphénicol et à la streptomycine et peut être obtenue auprès de plusieurs fournisseurs. - Le lendemain, diluez la culture 1 00 000 fois en ajoutant 0,5 μL de la culture de nuit à 50 mL d’eau ultra-pure autoclavée et étalez 10 μL de cette culture diluée sur une plaque LB, puis incubez à 28-30 °C pendant 1 à 3 jours.
- Choisissez une colonie et commencez une culture de nuit de 20 ml dans LB avec de la rifampicine à 28-30 °C.
- Le lendemain, inoculer 500 mL de milieu LB (sans antibiotique) dans un flacon shaker avec 9 mL de culture de nuit et cultiver à 28-30 °C jusqu’à ce que la OD600 atteigne 0,5.
- Répartir la culture uniformément dans dix tubes à centrifuger de 50 ml et laisser refroidir sur de la glace pendant 30 minutes. Pré-refroidir la centrifugeuse à 4 °C.
- Centrifuger les tubes à 4 °C et 4000 x g pendant 15 min. Par la suite, retirez le plus de surnageant possible à l’aide d’une pipette et remettez en suspension la pastille dans chaque tube dans 50 ml d’eau glacée.
- Centrifuger les cellules à 4 °C et 4000 x g pendant 15 min. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 25 mL d’eau glacée dans chaque tube.
- Centrifuger les cellules à 4 °C et 4000 x g pendant 15 min. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de glycérol glacé à 10 % (p/v) dans chaque tube.
- Combinez tous les tubes en un tube de 50 mL et centrifugez les cellules à 4 °C et 4000 x g pendant 15 min. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 400 μL de glycérol glacé à 10 % (p/v). La concentration cellulaire doit être d’environ 1-3 x10 10 cellules/mL.
- Répartir les cellules sous forme d’aliquotes de 50 μL dans des microtubes stériles préréfrigérés. Congeler dans de l’azote liquide et conserver au congélateur à -80 °C.
2. Électroporation d’A. tumefaciens
- Ajouter 50 μL de cellules électrocompétentes AGL-1 A. tumefaciens dans une cuvette prérefroidie de 0,1 mm et ajouter 2 μL de pCAMBIA1302 ou de plasmide similaire (conc 15 ng/μL) (voir le tableau des matériaux).
- Électroporer à 2400 V à l’aide d’un électroporateur (200 Ω, prolongateur de capacité 250 μFD, capacité 25 μFD, décroissance exponentielle, voir tableau des matériaux). La constante de temps doit être de >4,5 ms pour une électroporation réussie avec une décroissance exponentielle.
- Ajouter immédiatement 1 mL de milieu LB dans la cuvette et pipeter doucement de haut en bas pour mélanger. Transférez 1 mL de cellules remises en suspension dans un microtube de 1,5 mL et incubez-le à 28-30 °C pendant au moins 1 h pour qu’il se rétablisse.
- Plaquer les cellules sur de la gélose LB contenant l’antibiotique approprié (c.-à-d. 50 mg/L de kanamycine pour la pCAMBIA1302 pour la sélection procaryote).
- Incuber à 28-30 °C pendant 2-3 jours.
- Sélectionner une colonie, la cultiver pendant la nuit en LB avec la sélection appropriée (50 mg/L de kanamycine pour pCAMBIA1302) et cryoconserver la souche contenant le plasmide en utilisant 50 % de glycérol à -80 °C pour une utilisation future.
3. AMT de C. vulgaris
NOTE : Préparer les cultures de C. vulgaris (UTEX 395, voir le tableau des matériaux) et d’A. tumefaciens en parallèle pour la coculture. Les cultures de C. vulgaridoivent être commencées 3 jours avant la préparation des cultures d’A. tumefaciens. Le protocole a été modifié sur la base de celui publié par Kumar et al.7.
- Préparer la culture de C. vulgaris
- C. vulgaris est traditionnellement entreposé en biais ou maintenu dans des cultures en phase logarithmique dans des conditions éclairées. À partir d’une culture en phase logarithmique àOD 600 = 1,0, étaler 0,5 mL sur une gélose au tris-acétate-phosphate (TAP, voir tableau 1) ( 1,2 % p/v gélose A) et laisser pousser pendant 5 jours à 25 °C avec éclairage (50 μE/m2s). Cela donnera environ 5 x 106 cellules.
- Préparer la culture d’A. tumefaciens
- Cultiver la souche AGL-1 pCAMBIA1302 d’A. tumefaciens dans un ballon agitateur en inoculant 10 mL de milieu LB additionné de 15 mM de glucose, 20 mg/L de rifampicine et 50 mg/L de kanamycine (voir le tableau des matériaux) à l’aide du stock de glycérol. Incuber à 28-30 °C et 250 tr/min pendant la nuit.
- Inoculer 1 mL de culture de nuit dans 50 mL de LB avec 15 mM de glucose, 20 mg/L de rifampicine et 50 mg/L de kanamycine et incuber à 28-30 °C et 250 tr/min jusqu’à ce que la DO600 atteigne 1,0.
- Cocultiver C. vulgaris et A. tumefaciens
- Pour préparer la culture d’A. tumefaciens à la co-culture, transvaser la culture cultivée dans un tube de 50 mL et centrifuger à 4000 x g pendant 30 min à température ambiante. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et lavez les cellules deux fois avec le milieu d’induction.
REMARQUE : Le milieu d’induction utilisé est un milieu TAP ajusté à un pH de 5,5 et complété par des métaux traces moyens F/2 et des vitamines avec 200 μM d’acétosyringone (AS, voir le tableau des matériaux). Remettre les cellules en suspension dans un milieu d’induction tel que OD600 = 0,5. - Pour préparer la culture de C. vulgaris en vue de la coculture, ajouter 25 mL de milieu d’induction dans la plaque de C. vulgaris contenant ~ 5 x 106 cellules. Transférer dans un tube de 50 ml. Centrifuger les cellules à 4000 x g pendant 15 min à température ambiante et jeter le surnageant.
- Mélanger la pastille de cellules d’algues avec 200 μL de suspension bactérienne (OD600 : 0,5) et les incuber dans un agitateur rotatif à 21-25 °C à 150 tr/min pendant 1 h.
- Étaler la culture mixte (200 μL) sur des plaques de milieu d’induction additionnées de 15 mM de glucose et incuber à 21-25 °C dans l’obscurité pendant 3 jours.
- Après 3 jours, utiliser 10 mL de milieu TAP additionné de 400 mg/L de céfotaxime ou de 20 mg/L de tétracycline (voir le tableau des matériaux) pour recueillir les microalgues et incuber dans l’obscurité à 21-25 °C pendant 2 jours afin d’éliminer A. tumefaciens de la culture.
- Plaquer 500 μL de la culture sur un milieu sélectif, par exemple un milieu TAP complété par 20 à 70 mg/L d’hygromycine B (en cas d’utilisation de pCAMBIA1302) et 400 mg/L-1 de céfotaxime ou 20 mg/L de tétracycline. Incubez-les à 21-25 °C dans l’obscurité pendant 2 jours avant de les placer dans une chambre éclairée.
REMARQUE : Les colonies résistantes apparaîtront 5 à 7 jours après l’exposition à la lumière. - Prélever des colonies individuelles dans la plaque de transformation et les rééstrier sur des plaques de gélose TAP additionnées de 400 mg/L de céfotaxime ou de 20 mg/L de tétracycline et de 20 à 70 mg/L d’hygromycine B.
- Pour préparer la culture d’A. tumefaciens à la co-culture, transvaser la culture cultivée dans un tube de 50 mL et centrifuger à 4000 x g pendant 30 min à température ambiante. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et lavez les cellules deux fois avec le milieu d’induction.
4. PCR de colonie (cPCR) pour confirmer l’intégration des gènes chez les transformants de C. vulgaris
- Extraire l’ADN génomique d’un transformant de C. vulgaris après avoir été sous-cultivé au moins deux fois à partir d’une seule colonie à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN génomique végétal (voir le tableau des matériaux). À l’aide de ce modèle pour la PCR, concevez des amorces pour la région mgfp5 de l’ADN-T (mgfp5-Fwd : 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' et M13-Rev : 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
- À l’aide d’un kit de mélange maître d’ADN polymérase haute fidélité Q5 (voir le tableau des matériaux), effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour valider l’intégration du transgène.
NOTE : Les conditions suivantes ont été utilisées pour la présente étude : 98 °C pendant 3 min ; 35 cycles (98 °C pendant 10 s, 57 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 1 min) ; 72 °C pendant 5min. Utiliser pCAMBIA1302 comme témoin positif et l’ADN génomique de C. vulgaris de type sauvage comme témoin négatif.
- À l’aide d’un kit de mélange maître d’ADN polymérase haute fidélité Q5 (voir le tableau des matériaux), effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour valider l’intégration du transgène.
- Pour confirmer qu’il n’y a pas de pCAMBIA1302 présent dans l’échantillon en raison d’une contamination résiduelle par A. tumefaciens, utiliser la PCR de colonie. Ajouter une petite quantité de cellules transformantes à 10 μL d’eau stérile et faire bouillir à 98 °C pendant 15 min. Utilisez-le comme modèle pour la PCR.
- Amorces de conception pour une région à l’extérieur de l’ADN-T sur pCAMBIA1302 (B1-Fwd : 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' et B1-Rev : 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
NOTE : Les conditions suivantes ont été utilisées pour la présente étude : 94 °C pendant 3 min ; 30 cycles (94 °C pendant 30 s, 48 °C pendant 30 s, 68 °C pendant 5 min) ; 68 °C pendant 7 min. Utiliser une colonie bouillie d’A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) comme témoin positif et une colonie bouillie de C. vulgaris de type sauvage comme témoin négatif.
- Amorces de conception pour une région à l’extérieur de l’ADN-T sur pCAMBIA1302 (B1-Fwd : 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' et B1-Rev : 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
- Pour confirmer qu’il n’y a pas de contamination par A. tumerfaciens dans l’échantillon, utilisez la PCR de la colonie. Ajouter une petite quantité de cellules transformantes à 10 μL d’eau stérile et faire bouillir à 98 °C pendant 15 min. Utilisez-le comme modèle pour la PCR.
- Amorces de conception pour le gène virE2 contenu sur le plasmide de virulence AGL-1 (virE2-Fwd : 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' et virE2-Rev : 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
NOTE : Les conditions suivantes ont été utilisées pour la présente étude : 94 °C pendant 3 min ; 30 cycles (94 °C pendant 30 s, 53 °C pendant 30 s, 68 °C pendant 3 min) ; 68 °C pendant 7 min. Utiliser une colonie bouillie d’A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) comme témoin positif et une colonie bouillie de C. vulgaris de type sauvage comme témoin négatif.
- Amorces de conception pour le gène virE2 contenu sur le plasmide de virulence AGL-1 (virE2-Fwd : 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' et virE2-Rev : 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
- Effectuer des prélèvements PCR sur un gel d’ADN d’agarose avec une échelle (échelle d’ADN de 1 Kbp, voir le tableau des matériaux) pour confirmer la taille des fragments obtenus16.
5. Mesure de la fluorescence des transformants
- Inoculer chaque transformant à partir d’une culture d’entretien en phase logarithmique ou d’une gélose TAP oblique dans 50 mL de TAP additionné de 200 mg/L-1 de céfotaxime et de 25 mg/L-1 d’hygromycine B de sorte que la DO de départ600 = 0,1. Inoculer une culture avec le C. vulgaris de type sauvage et seulement 200 mg/L-1 de céfotaxime comme témoin négatif. Incuber à 25 °C à 150 tr/min avec 150 μmol/m2s de lumière photosynthétiquement active (voir tableau des matériaux).
- Toutes les 24 h, prélever un échantillon de 300 μL et mesurer l’absorbance et la fluorescence (excitation 488 nm, émission 526 nm) dans un lecteur de plaques à 96 puits ou un spectromètre UV/Vis et un fluorimètre (voir Tableau des matériaux). Utilisez une plaque noire avec un fond transparent pour des mesures simultanées.
6. Extraction de protéines brutes, purification de protéines et électrophorèse SDS-PAGE
- Inoculer le transformant (#50) d’une culture d’entretien en phase logarithmique dans 300 mL de TAP additionné de 200 mg/L-1 de céfotaxime et de 25 mg/L-1 d’hygromycine B pour atteindre la DO680 = 0,1. Inoculer une culture avec le C. vulgaris de type sauvage et seulement 200 mg/L-1 de céfotaxime comme témoin négatif. Incuber à 25 °C à 150 tr/min avec 150 μmol/m2s de lumière photosynthétiquement active.
- Extraire l’échantillon de protéines brutes des souches transformantes (#50) et sauvages à l’aide d’un tampon de lyse de 5 mL (voir le tableau 1), suivi d’une sonication pendant 4 minutes.
- Purifier l’échantillon de protéines brutes à l’aide d’une résine Ni-NTA à travers des colonnes de polypropylène de 5 ml (voir le tableau des matériaux).
- Lyophiliser les échantillons de protéines purifiées de 15 mL et les remettre en suspension dans un tampon de lyse de 1 mL pour l’analyse SDS-PAGE17.
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Representative Results
Pour montrer la réussite de la transformation à l’aide de la méthode ci-dessus, C. vulgaris a été cocultivé avec AGL-1 contenant le plasmide pCAMBIA1302 ou sans le plasmide (de type sauvage et plaqué sur gélose TAP complétée par de l’hygromycine B et du céfotaxime (Figure 1A). La plaque la plus à gauche montre les colonies transformées capables de se développer sur les plaques d’hygromycine B/céfotaxime, et la plaque du milieu montre que l’AGL-1 de type sauvage ne peut pas se développer sur les plaques d’hygromycine B/céfotaxime. La planche la plus à droite montre que lorsqu’aucune sélection n’est utilisée (céfotaxime seulement), les transformants de C. vulgaris et le type sauvage peuvent se développer. Des colonies isolées ont été striées sur gélose TAP avec de l’hygromycine B et du céfotaxime (figure 1B). Les colonies qui se sont échappées de la plaque la plus à droite (figure 1B) ont été inoculées sur du liquide TAP avec de l’hygromycine B et du céfotaxime (figure 1C). En raison des niveaux d’expression variables après l’intégration aléatoire de l’ADN-T, les transformants ont été récupérés à l’origine sur des plaques avec des concentrations croissantes d’hygromycine B allant de 25 à 70 mg / L. Une colonie de chaque plaque a été cultivée dans un milieu TAP liquide contenant la même concentration d’hygromycine B que le C. vulgaris de type sauvage à la concentration la plus faible (figure 1D). Le C. vulgaris de type sauvage ne peut pas se développer en présence d’hygromycine, alors que des colonies résistantes jusqu’à 70 mg/L ont été obtenues.
Pour confirmer que la cassette d’ADN-T était intégrée de manière stable dans le génome de C. vulgaris, une colonie sélectionnée dans chacune des plaques d’hygromycine B à 20, 25, 30, 50 et 70 mg/L a été subcultivée par stries répétées sur des plaques de gélose TAP avec sélection deux fois, puis systématiquement sous-cultivée dans des milieux TAP plus de dix fois. nommés respectivement transformant #20, #25, #30, #50, #50 et #70. À l’aide de ces cultures, une PCR de la colonie a été réalisée pour exclure la contamination par pCAMBIA1302 dans AGL1, et l’ADN génomique a été extrait pour confirmer la présence du gène mGFP5 dans le génome de C. vulgaris. Dans la figure 2A, la PCR de la colonie a été réalisée à l’aide d’amorces ciblant une région de 5 kbp à l’extérieur des bords gauche et droit de l’ADN-T et a permis d’amplifier cette région à partir du plasmide pCAMBIA1302 en tant que témoin positif, mais cette région n’était présente dans aucun des échantillons de C. vulgaris , ce qui indique que l’ADN pCAMBIA1302 n’était présent dans aucune des cultures. L’échantillon de C. vulgaris de type sauvage a été utilisé comme témoin négatif, et aucune amplification n’a été observée.
L’ADN génomique a été extrait des transformants #25, #50 et #70, et la PCR a été effectuée, amplifiant une région de 1763 pb contenant le gène mgfp5 de l’ADN-T pour confirmer l’intégration dans les transformants (Figure 2B). pCAMBIA1302 a été utilisé comme témoin positif, et une amplification a été détectée chez tous les transformants, ce qui indique que le gène mgfp5 était présent dans l’ADN génomique de tous les transformants. Le C. vulgaris de type sauvage a été utilisé comme témoin négatif, et aucune amplification n’a été observée. La figure 2C montre l’amplification d’un fragment de 600 pb de la protéine de virulence E2 (VirE2) qui se trouve dans le plasmide inducteur de tumeur (plasmide Ti) de la souche AGl1. Le témoin positif, constitué de la souche AGl1 contenant pCAMIA1302, a été amplifié avec succès avec des amorces, indiquant la présence d’A. tumefaciens dans l’échantillon. Cependant, tous les échantillons de C. vulgaris ont donné des résultats négatifs pour cette région, ce qui indique que la sous-culture répétée au céfotaxime a permis d’éliminer avec succès la contamination par AGL1 de la culture. L’échantillon de C. vulgaris de type sauvage a été utilisé comme témoin négatif, et aucune amplification n’a été observée. Pris ensemble, ces trois tests confirment que l’ADN-T contenant mgpf5 a été inséré dans le génome de C. vulgaris, et ces résultats ne sont pas dus à la contamination d’AGL1 dans les échantillons ni à la présence de pCAMBIA1302 dans les cellules. Ces résultats ont été répétés après 20 et environ 100 sous-cultures de transformants, confirmant l’intégration à long terme de l’ADN-T dans le génome.
Enfin, le phénotype a été confirmé par la culture des transformants dans des milieux TAP avec sélection et mesure de la fluorescence. Cela a été comparé au type sauvage C. vulgaris. En raison de l’absorbance/autofluorescence de fond de la chlorophylle, la fluorescence a été comparée en normalisant les données à la souche de type sauvage. Sur la figure 3A, on peut observer qu’il y a une différence notable de croissance entre les transformants et le C. vulgaris de type sauvage. Cela pourrait potentiellement être attribué aux multiples intégrations aléatoires de l’ADN-T dans le génome, ce qui peut avoir un impact sur d’autres processus cellulaires et entraîner une croissance plus lente. Néanmoins, la figure 3B met en évidence que, malgré la croissance plus faible, toutes les souches sélectionnées présentent des niveaux de fluorescence plus élevés lorsqu’elles sont normalisées en fonction de la densité cellulaire. Notamment, la souche #70 a démontré des niveaux de fluorescence significativement plus élevés que les autres, avec une valeur p de <0,01. Cela souligne l’importance de cribler de nombreuses colonies pour identifier les transformants qui expriment la protéine souhaitée sans avoir d’impact négatif sur le comportement de croissance global.
Pour confirmer l’expression de mGFP5-6xHis, SDS-PAGE a été utilisé pour analyser l’extrait protéique brut et les protéines purifiées par son marqueur à partir du transformant de C. vulgaris (WT) et de C. vulgaris (#50). Par la suite, la purification de la protéine his-tag a été effectuée à l’aide d’un kit d’écoulement par gravité de résine Ni-NTA suivant le protocole18 du fabricant. La figure 4 montre la présence de la protéine mGFP5-6xHis (~30 kDa) dans l’échantillon transformant #50 et aucune protéine dans le témoin négatif (WT C. vulgaris).
Figure 1 : Récupération des transformants de C. vulgaris après AMT. (A) Après co-culture de C. vulgaris, les transformants sont AGL-1 contenant le plasmide pCAMBIA ou sans plasmide (AGL-1 uniquement) sur des plaques sélectives. (B) Colonies individuelles restriées sélectionnées à partir de plaques d’hygromycine B (20 mg/L) sur gélose sélective TAP. (C) Les colonies qui se sont échappées n’ont pas de croissance à partir de la plaque AGL1 seulement sur milieu liquide d’hygromycine B (20 mg/L). (D) Croissance de colonies individuelles #25, #50 et #50 à partir de plaques de sélection d’hygromycine cultivées dans des milieux TAP liquides contenant de l’hygromycine et du C. vulgaris de type sauvage qui ne peuvent pas se développer dans des milieux d’hygromycine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Détection de la contamination par pCAMBIA1302. (A) Intégration de l’ADN-T dans les transformants (B) et détection de la contamination par A. tumefaciens (C). WT indique le type sauvage C. vulgaris, PC est le témoin positif (pCAMBIA1302) et AGL1 indique la souche AGL1 d’A. tumefaciens. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Croissance et fluorescence des transformants 3 jours après l’inoculation. (A) Croissance mesurée par l’absorbance à 680 nm. (B) Fluorescence normalisée à la souche de type sauvage. Moyenne de 3-4 répétitions biologiques, les barres d’erreur représentent 1 σ. *p < 0,05, **p < 0,01 par rapport au type sauvage (WT). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse SDS-PAGE de l’expression de mGFP5-6xHis chez C. vulgaris (WT) et de l’échantillon #50 transformé de C. vulgaris. Des extraits ont été préparés à partir de cru, purifiés (premier lavage), purifiés (dilués) et purifiés (concentrés) de C. vulgaris (WT), voies 1 à 4, respectivement. Brut, purifié (premier lavage), purifié (élué) et purifié (lyophilisé) de C. vulgaris (WT), voies 5 à 8, respectivement. La case rouge indique la protéine GFP-6xHis purifiée du transformant #70. Les protéines ont été séparées sur un gel de polyacrylamide à 12 %. Les poids moléculaires (MW) des étalons protéiques (Std.) sont indiqués à droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nom du média/tampon | Composition | ||
| LB | 5 g/L d’extrait de levure, 10 g/L de tryptone, 5 g/L de NaCl | ||
| ROBINET | 20 mM de base Tris, 1,58 mM K 2 HPO 4, 2,4 mM KH 2 PO 4, 7,0 mM NH 4 Cl, 0,83 mM MgSO4, 0,34 mM CaCl 2, 1 mL/L d’acide acétique glacial et 1 mL/L de métaux traces moyens F/2 et de vitamines F/2 | ||
| F/2 métaux traces moyens | 22 mg/L ZnSO 4·7H 2 O, 180 mg/L MnCl 2·4H 2 O, 6,3 mg/L Na 2 MoO 4·2H 2 O, 14 mg/L CoCl 2·6H 2 O, 9,8 mg/L CuSO 4·5H 2 O, 3,15 g/L FeCl3·6H 2 O, 4,36 g/L Na 2 EDTA·2H 2O | ||
| F/2 vitamines moyennes | 0,1 mM de vitamine B12 (cyanocobalamine), 25 mg/L de biotine, 335 mg/L de thiamine, 50 mM de tampon HEPES pH 7,8 | ||
| Tampon de lyse | 20 mM Na2HPO 4, 300 mM NaCl, pH7,4 | ||
Tableau 1 : Recettes de médias et de tampons.
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Discussion
L’efficacité de la transformation est associée à plusieurs paramètres différents. Le choix des souches d’A. tumefaciens utilisées pour l’AMT est crucial. L’AGL-1 est l’une des souches les plus invasives découvertes et, pour cette raison, a été couramment utilisée dans l’AMT des plantes. La supplémentation du milieu d’induction avec du glucose (15-20 mM) est également importante pour l’efficacité de l’AMT. Étant donné que C. vulgaris peut se développer dans des conditions phototrophes et hétérotrophes, le glucose ou d’autres sources de carbone sont souvent omis des milieux de microalgues pour éviter la contamination. Par exemple, le milieu basal de Bold (BBM) est le milieu le plus couramment utilisé pour la culture phototrophe de C. vulgaris19. Cependant, le BBM ne favorise pas la croissance d’A. tumefaciens en raison de l’absence d’une source de carbone organique et d’ammonium comme source d’azote qu’il préfère (le BBM utilise du nitrate)20. Par conséquent, le milieu TAP a été utilisé dans ce travail parce qu’il contient de l’acétate comme source de carbone pour C. vulgaris, du glucose pour A. tumefaciens et de l’ammonium comme source d’azote que les deux espèces peuvent utiliser. Les plaques de gélose TAP permettent également des taux de croissance beaucoup plus rapides pour C. vulgaris, minimisant ainsi le temps nécessaire pour récupérer les transformants après l’AMT. Pour induire des protéines de virulence Ti-plasmide, 200 μM d’acétosyringone doivent également être ajoutés au milieu d’induction.
Pour éliminer A. tumefaciens de la culture après AMT, le céfotaxime, ainsi que le passage en série, ont été utilisés. L’AGL-1 est résistant à l’ampicilline, au chloramphénicol, à la rifamycine et à la streptomycine, et il est sensible au céfotaxime, à la tétracycline, à la spectinomycine et à la kanamycine. Chez les plantes, le céfotaxime est souvent utilisé pour éliminer A. tumefaciens car il a un effet phytotoxique plus faible pour la régénération des pousses chez de nombreuses espèces végétales que d’autres antibiotiques21. Cependant, nous avons également confirmé que la tétracycline (qui coûte environ 100 fois moins cher) pouvait être utilisée à la place du céfotaxime dans ce protocole lorsqu’elle était associée à un passage en série à partir d’une seule colonie (données non présentées). Cela est probablement dû au fait que des antibiotiques comme la tétracycline inhiberaient la synthèse des protéines dans le chloroplaste chez les plantes qui dépendent de la photosynthèse. Cependant, C. vulgaris peut se développer dans l’obscurité lorsqu’il est complété par de l’acétate, ce qui signifie que le dysfonctionnement du chloroplaste n’est pas nécessairement toxique pour cette espèce dans des conditions soigneusement choisies.
Bien que 20 mg/L d’hygromycine B aient été suffisants pour empêcher la croissance de C. vulgaris de type sauvage, une gamme de concentrations d’hygromycine B (20 à 70 mg/L) a été testée. Il est possible que les colonies isolées à partir de plaques de concentration plus élevée aient plusieurs copies intégrées de l’ADN-T ou que l’ADN-T soit situé dans une région du génome plus active sur le plan transcriptionnel, ce qui entraîne une expression plus élevée de l’hygromycine B phosphotransférase, ce qui entraîne une inactivation plus rapide de l’herbicide et un temps de latence plus court dans la croissance de la culture23. Des copies multiples pourraient être à l’origine des différences d’intensité des produits de PCR lors de l’amplification de mgfp5 à partir du génome (Figure 2B). La présence de la protéine GFP-6xHis dans l’échantillon purifié lors de l’analyse SDS-PAGE (Figure 4, voie 8) et son absence dans la souche de type sauvage (Figure 4, voie 4) confirment que l’AMT et la pCAMBIA1302 peuvent être utilisées pour une expression réussie et une intégration stable du transgène chez C. vulgaris.
Dans ce travail, nous avons développé et optimisé un protocole de transformation UTEX 395 fiable de C. vulgaris à l’aide d’A. tumefaciens AGL-1 et d’un plasmide du système pCambia. Comme toutes les souches et tous les plasmides nécessaires à ce travail sont disponibles à partir de plusieurs sources différentes, cette méthode sera facile à reproduire dans n’importe quel laboratoire. En tant que l’une des souches industrielles de microalgues les plus importantes, une méthode de référence standard pour une AMT fiable sera cruciale pour l’ingénierie de C. vulgaris pour des applications biotechnologiques.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le professeur Paul Hooykaas d’avoir aimablement fourni le vecteur pCAMBIA1302 et Agrobacterium tumefaciens AGL1 de l’Institut de biologie de Leiden, Université de Leiden, Pays-Bas. Les auteurs tiennent également à remercier Eva Colic pour son aide dans la culture des transformants fluorescents. Ces travaux ont été financés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada et le programme Mitacs Accélération.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
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