Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65382
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, University of Waterloo

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטרנספורמציה בתיווך גידולים אגרובקטריום (AMT) לשילוב גנים בעלי עניין בגנום הגרעיני של המיקרו-אצות הירוקות Chlorella vulgaris, מה שמוביל לייצור טרנספורמנטים יציבים.

Abstract

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) משמש ככלי נפוץ למניפולציה של גנומים צמחיים. עם זאת, A. tumefaciens מפגינים יכולת העברת גנים למגוון רחב של מינים. למיני מיקרו-אצות רבים חסרות שיטות מבוססות היטב לשילוב אמין של גנים מעניינים בגנום הגרעיני שלהם. כדי לרתום את היתרונות הפוטנציאליים של ביוטכנולוגיה מיקרו-אצות, כלים פשוטים ויעילים למניפולציה גנומית הם חיוניים. כאן, פרוטוקול AMT ממוטב מוצג עבור מיני מיקרו-אצות תעשייתיות Chlorella vulgaris, תוך שימוש בחלבון הפלואורסצנטי הירוק (mGFP5) ובסמן העמידות לאנטיביוטיקה עבור Hygromycin B. מוטנטים נבחרים באמצעות ציפוי על מדיה Tris-אצטט-פוספט (TAP) המכילה Hygromycin B ו cefotaxime. ביטוי של mGFP5 מכומת באמצעות פלואורסצנטיות לאחר יותר מעשרה דורות של תת-תרבית, מה שמצביע על השינוי היציב של קלטת T-DNA. פרוטוקול זה מאפשר ייצור אמין של מושבות C. vulgaris טרנסגניות מרובות תוך פחות משבועיים, תוך שימוש בווקטור ביטוי הצמחים pCAMBIA1302 הזמין מסחרית.

Introduction

Agrobacterium tumefaciens, חיידק גראם-שלילי הנישא בקרקע, הוא בעל יכולת העברת גנים בין-מלכותית ייחודית, מה שזיכה אותו בתואר "מהנדס גנטי טבעי"1. חיידק זה יכול להעביר DNA (T-DNA) מפלסמיד הגורם לגידול (Ti-Plasmid) לתאים מארחים באמצעות מערכת הפרשת סוג IV, וכתוצאה מכך אינטגרציה וביטוי של T-DNA בתוך הגנום המארח 1,2,3,4. בסביבה הטבעית, תהליך זה מוביל להיווצרות גידולים בצמחים, הידוע בכינויו מחלת כיס המרה. עם זאת, אגרובקטריום יכול גם להעביר T-DNA לאורגניזמים שונים אחרים, כולל שמרים, פטריות, אצות, עוברים של קיפודי ים, ואפילו תאים אנושיים בתנאי מעבדה 5,6,7,8.

תוך ניצול מערכת טבעית זו, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) מאפשר שילוב אקראי של גנים מעניינים לתוך הגנום הגרעיני של התא המארח על ידי שינוי אזור T-DNA של Ti-plasmid. למטרה זו, וקטור ביטוי צמח AMT בשימוש נרחב הוא pCAMBIA13029. חוקרים יכולים להשתמש בתהליכי שיבוט פשוטים ב- E. coli לפני העברת הווקטור הרצוי ל- A. tumefaciens לצורך העברה לאחר מכן למארח העניין.

מיקרו-אצות ירוקות הן איקריוטים שחולקים קווי דמיון רבים עם צמחי יבשה, אך הם עקשנים מאוד לשינוי גנטי. עם זאת, טרנספורמציה גנטית ממלאת תפקיד מכריע במחקר בסיסי וביוטכנולוגי של מיקרו-אצות. בכמה מיני מיקרו-אצות, במיוחד Chlamydomonas reinhardtii, טרנספורמציה גנטית באמצעות AMT החדירה בהצלחה טרנסגנים כגון אינטרלוקין-2 אנושי (hIL-2), תחום קשירת קולטן קורונה 2 (SARS-CoV-2 RBD), ושני פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs)10,11,12,13. בין אלה, Chlorella vulgaris, מין אצות ירוקות פחות קפדני וגדל במהירות, טומן בחובו פוטנציאל משמעותי לייצור בר-קיימא של פחמימות, חלבונים, חומרים מזינים, פיגמנטים ותרכובות אחרות בעלות ערך גבוה14. עם זאת, היעדר כלים אמינים ליצירת זנים טרנסגניים של C. vulgaris מעכב את התקדמותה המסחרית. מאחר שפורסמו רק מספר מוגבל של עבודות המשתמשות ב-AMT ב-C. vulgaris15, ובהתחשב בהבדלים הניכרים בין גידול צמחים למיקרו-אצות, אופטימיזציה של פרוטוקול AMT הופכת חיונית.

במחקר זה, החוקרים הכניסו חלבון פלואורסצנטי ירוק (mGFP5) במורד הזרם של מקדם וירוס פסיפס הכרובית (CamV) 35S והוסיפו תג היסטידין כדי להשתמש בו כגן כתב לביטוי חלבונים. טרנספורמטורים נבחרו באמצעות היגרומיצין B, ולאחר תרבית משנה במשך למעלה מעשרים דורות, השינוי נשאר יציב. פלסמיד pCAMBIA1302 המשמש בעבודה זו יכול להיות מותאם בקלות להכיל כל גן מעניין. יתר על כן, ניתן להתאים את השיטה והחומרים המוצגים למיני אצות ירוקות אחרות עם מקדם CamV35S פעיל, מכיוון שמקדם זה משמש לבחירת היגרומיצין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המדיה והפתרונות חייבים להיות אוטומטיים לפני השימוש, אלא אם צוין אחרת. כל צינורות הצנטריפוגות, קצוות פיפטה וכו ', צריכים להיות סטריליים או autoclaved לפני השימוש. לעיון קל, מתכוני המדיה המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלה 1.

1. הכנת תאים אלקטרוכשירים של A. tumefaciens

  1. יש לחסן את אגרובקטריום (AGL-1) לתוך בקבוק שייקר סטרילי בנפח 25 מ"ל של חומר LB (בתוספת ריפמפיצין, 20 מ"ג/L-1) ממלאי גליצרול קפוא ולגדול בן לילה ב-28-30 מעלות צלזיוס וב-150 סל"ד.
    הערה: זן אגרובקטריום AGL-1 עמיד (ראה טבלת חומרים) בפני ריפמפיצין, אמפיצילין, כלוראמפניקול וסטרפטומיצין וניתן להשיג אותו ממספר ספקים.
  2. למחרת, לדלל את התרבית פי 1,00,000 על ידי הוספת 0.5 μL של תרבית הלילה ל 50 מ"ל מים טהורים במיוחד autoclaved ולהפיץ 10 μL של תרבית מדוללת זו על צלחת LB, ולאחר מכן לדגור ב 28-30 ° C במשך 1-3 ימים.
  3. בחר מושבה והתחל תרבית לילה של 20 מ"ל ב- LB עם ריפמפיצין ב 28-30 מעלות צלזיוס.
  4. למחרת, לחסן 500 מ"ל LB מדיה (ללא אנטיביוטיקה) בבקבוק שייקר עם 9 מ"ל של תרבית לילה ולגדול ב 28-30 ° C עד OD600 מגיע 0.5.
  5. מחלקים את התרבית באופן שווה לעשרה צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל וצוננים על קרח במשך 30 דקות. מצננים מראש את הצנטריפוגה ל-4°C.
  6. צנטריפוגה את הצינורות ב 4 ° C ו 4000 x גרם במשך 15 דקות. לאחר מכן, להסיר כמה supernatant ככל האפשר באמצעות פיפטה להשעות מחדש את הגלולה בכל צינור ב 50 מ"ל של מים קרים כקרח.
  7. צנטריפוגה את התאים ב 4 ° C ו 4000 x גרם במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 25 מ"ל של מים קרים כקרח בכל צינור.
  8. צנטריפוגה את התאים ב 4 ° C ו 4000 x גרם במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 1 מ"ל של קר כקרח 10% (w/v) גליצרול בכל צינור.
  9. שלב את כל הצינורות לתוך צינור אחד 50 מ"ל וצנטריפוגה את התאים ב 4 ° C ו 4000 x g במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 400 μL קר כקרח 10% (w/v) גליצרול. ריכוז התא צריך להיות בערך 1-3 x10 10 תאים / מ"ל.
  10. להפיץ את התאים כמו 50 μL aliquots ב microtubes precooled סטרילי. יש להקפיא בחנקן נוזלי ולאחסן במקפיא בטמפרטורה של -80°C.

2. אלקטרופורציה של A. tumefaciens

  1. הוסף 50 μL של תאים אלקטרוכשירים AGL-1 A. tumefaciens לקובט 0.1 מ"מ מקורר מראש והוסף 2 μL של pCAMBIA1302 או פלסמיד דומה (conc 15 ng/μL) (ראה טבלת חומרים).
  2. אלקטרופורטים ב 2400 V באמצעות אלקטרופורטור (200 Ω, מאריך קיבוליות 250 μFD, קיבוליות 25 μFD, דעיכה מעריכית, ראה טבלת חומרים). קבוע הזמן צריך להיות >4.5 אלפיות השנייה עבור אלקטרופורציה מוצלחת עם דעיכה מעריכית.
  3. מיד להוסיף 1 מ"ל של מדיה LB לקובט ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב. להעביר את 1 מ"ל של תאים מרחפים לתוך microtube 1.5 מ"ל לדגור אותו ב 28-30 ° C לפחות 1 שעה כדי להתאושש.
  4. צלחת את התאים על אגר LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (כלומר, 50 מ"ג / ליטר של kanamycin עבור pCAMBIA1302 עבור בחירה פרוקריוטית).
  5. לדגור ב 28-30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
  6. בחר מושבה אחת, גדל לילה ב- LB עם הבחירה המתאימה (50 מ"ג / ליטר קנמיצין עבור pCAMBIA1302), ושמור בהקפאה את הזן המכיל פלסמיד באמצעות 50% גליצרול ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

3. AMT של C. vulgaris

הערה: הכינו תרביות C. vulgaris (UTEX 395, ראו טבלת חומרים) ו-A. tumefaciens במקביל לטיפוח משותף. C. vulgaris cultures יש להתחיל 3 ימים לפני הכנת תרביות A. tumefaciens. הפרוטוקול שונה בהתבסס על זה שפורסם על ידי Kumar et al.7.

  1. הכנת תרבות C. vulgaris
    1. C. vulgaris מאוחסן באופן מסורתי על סלנטים או נשמר בתרביות לוג-פאזה בתנאים מוארים. מתרבית שלב יומן ב- OD600 = 1.0, יש למרוח 0.5 מ"ל על לוחות אגר Tris-אצטט-פוספט (TAP, ראה טבלה 1) ( 1.2% w / v אגר A) ולגדול במשך 5 ימים ב 25 ° C עם תאורה (50 μE / m2שניות). זה יניב בערך 5 x 106 תאים.
  2. הכנת תרבית A. tumefaciens
    1. יש לגדל את זן A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 בבקבוק שייקר על ידי חיסון 10 מ"ל של חומר LB בתוספת גלוקוז של 15 mM, 20 mg/L rifampicin ו-50 mg/L kanamycin (ראה טבלת חומרים) באמצעות מלאי גליצרול. יש לדגור ב-28-30 מעלות צלזיוס וב-250 סל"ד למשך הלילה.
    2. יש לחסן 1 מ"ל של תרבית לילה לתוך 50 מ"ל של LB עם 15 מ"מ גלוקוז, 20 מ"ג / ליטר ריפמפיצין, ו 50 מ"ג / ליטר קנמיצין ולדגור ב 28-30 ° C ו 250 סל"ד עד OD600 מגיע 1.0.
  3. Coלטפח C. vulgaris ו A. tumefaciens
    1. כדי להכין את תרבית A. tumefaciens לגידול משותף, להעביר את התרבות הגדלה לצינור 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 4000 x גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ושוטפים את התאים פעמיים עם מדיום האינדוקציה.
      הערה: מדיית האינדוקציה המשמשת היא מדיית TAP המותאמת ל- pH 5.5 ומשלימה מתכות קורט בינוניות F/2 וויטמינים עם אצטוסירינגון של 200 מיקרומטר (AS, ראה טבלת חומרים). השעה מחדש את התאים במדיית אינדוקציה כך ש- OD600 = 0.5.
    2. כדי להכין את תרבית C. vulgaris לגידול משותף, הוסף 25 מ"ל של מדיה אינדוקציה לצלחת C. vulgaris המכילה ~ 5 x 106 תאים. מעבירים לצינור 50 מ"ל. צנטריפוגו את התאים ב 4000 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant.
    3. מערבבים את גלולת תא האצות עם 200 μL של תרחיף החיידקים (OD600: 0.5) ודגרים אותם בשייקר סיבובי ב 21-25 ° C ב 150 סל"ד במשך 1 שעה.
    4. יש לפזר את התרבית המעורבת (200 μL) על צלחות מדיה אינדוקציה בתוספת גלוקוז של 15 מ"מ ולדגור בטמפרטורה של 21-25 מעלות צלזיוס בחושך למשך 3 ימים.
    5. לאחר 3 ימים, יש להשתמש ב-10 מ"ל של מדיית TAP בתוספת 400 מ"ג/ליטר cefotaxime או 20 מ"ג/ליטר טטרציקלין (ראה טבלת חומרים) כדי לאסוף את המיקרו-אצות ולדגור בחושך בטמפרטורה של 21-25 מעלות צלזיוס למשך יומיים כדי לסלק את A. tumefaciens מהתרבית.
    6. צלחת 500 μL של התרבית על מדיה סלקטיבית, למשל, מדיה TAP בתוספת 20-70 מ"ג / ליטר של Hygromycin B (בעת שימוש pCAMBIA1302) ו 400 מ"ג / L-1 cefotaxime או 20 מ"ג / ליטר של טטרציקלין. לדגור 21-25 מעלות צלזיוס בחושך במשך 2 ימים לפני הצבתם בתא מואר.
      הערה: מושבות עמידות יופיעו 5-7 ימים לאחר החשיפה לאור.
    7. בחר מושבות בודדות מצלחת הטרנספורמציה ופזר אותן מחדש על צלחות אגר TAP בתוספת 400 מ"ג / ליטר של cefotaxime או 20 מ"ג / ליטר של טטרציקלין ו 20-70 מ"ג / ליטר של היגרומיצין B.

4. PCR מושבה (cPCR) כדי לאשר שילוב גנים טרנספורמנטים C. vulgaris

  1. חילוץ DNA גנומי מטרנספורמנט C. vulgaris לאחר תרבית משנה לפחות פעמיים ממושבה אחת באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומי של צמחים (ראה טבלת חומרים). באמצעות זה כתבנית עבור PCR, לעצב פריימרים עבור אזור mgfp5 של T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3', ו M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
    1. באמצעות ערכת תערובת מאסטר Q5 של DNA פולימראז באיכות גבוהה (ראה טבלת חומרים), בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי לאמת אינטגרציה טרנסגנית.
      הערה: התנאים הבאים שימשו במחקר הנוכחי: 98 ° C למשך 3 דקות; 35 מחזורים (98°C למשך 10 שניות, 57°C למשך 30 שניות, 72°C למשך דקה אחת); 72°C למשך 5 דקות. השתמש ב- pCAMBIA1302 כבקרה חיובית וב- DNA גנומי מסוג פראי C. vulgaris כבקרה שלילית.
  2. כדי לאשר כי אין pCAMBIA1302 נוכח במדגם עקב זיהום שיורי על ידי A. tumefaciens, להשתמש PCR מושבה. הוסיפו כמות קטנה של תאי טרנספורמציה ל-10 מיקרוליטר מים סטריליים והרתיחו ב-98°C למשך 15 דקות. השתמש באפשרות זו כתבנית עבור PCR.
    1. עיצוב פריימרים לאזור מחוץ ל-T-DNA ב-pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTT 3' ו-B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTTTC 3').
      הערה: התנאים הבאים שימשו במחקר הנוכחי: 94 ° C במשך 3 דקות; 30 מחזורים (94°C למשך 30 שניות, 48°C למשך 30 שניות, 68°C למשך 5 דקות); 68°C למשך 7 דקות. השתמש במושבה מבושלת של A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) כבקרה חיובית ומושבה מבושלת של בר מסוג C. vulgaris כבקרה שלילית.
  3. כדי לאשר כי אין זיהום A. tumerfaciens נוכח המדגם, להשתמש PCR מושבה. הוסיפו כמות קטנה של תאי טרנספורמציה ל-10 מיקרוליטר מים סטריליים והרתיחו ב-98°C למשך 15 דקות. השתמש באפשרות זו כתבנית עבור PCR.
    1. תכנון פריימרים לגן virE2 הכלול בפלסמיד האלים AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' ו-virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      הערה: התנאים הבאים שימשו במחקר הנוכחי: 94 ° C במשך 3 דקות; 30 מחזורים (94°C למשך 30 שניות, 53°C למשך 30 שניות, 68°C למשך 3 דקות); 68°C למשך 7 דקות. השתמש במושבה מבושלת של A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) כבקרה חיובית ומושבה מבושלת של בר מסוג C. vulgaris כבקרה שלילית.
  4. הפעל דגימות PCR על ג'ל אגרוז DNA יחד עם סולם (סולם DNA 1 Kbp, ראה רשימת חומרים) כדי לאשר את גודל המקטעים המתקבלים16.

5. מדידת הפלואורסצנטיות של טרנספורמציות

  1. חסן כל טרנספורמטור מתרבית תחזוקה בשלב היומן או שיפוע אגר TAP ל- 50 מ"ל של TAP בתוספת 200 מ"ג / L-1 cefotaxime ו- 25 מ"ג / L-1 היגרומיצין B כך שה- ODההתחלתי 600 = 0.1. חסן תרבית אחת עם סוג פראי C. vulgaris ורק 200 מ"ג / L-1 cefotaxime כמו הביקורת השלילית. דגירה ב-25°C ב-150 סל"ד עם 150 μmol/m2שניות של אור פעיל פוטוסינתטי (ראו טבלת חומרים).
  2. כל 24 שעות, לקחת דגימה של 300 מיקרוליטר ולמדוד את הספיגה והפלואורסצנטיות (עירור 488 ננומטר, פליטה 526 ננומטר) בקורא לוחות 96 בארות או ספקטרומטר UV/Vis ופלואורומטר (ראה טבלת חומרים). השתמש בלוח שחור עם תחתית שקופה למדידות בו-זמנית.

6. מיצוי חלבון גולמי, טיהור חלבונים ואלקטרופורזה SDS-PAGE

  1. חסן טרנספורמנט (#50) מתרבית תחזוקה בשלב היומן לתוך 300 מ"ל של TAP בתוספת 200 מ"ג / L-1 cefotaxime ו 25 מ"ג / L-1 Hygromycin B כדי להגיע OD680 = 0.1. חסן תרבית אחת עם סוג פראי C. vulgaris ורק 200 מ"ג / L-1 cefotaxime כמו הביקורת השלילית. דגירה ב-25°C ב-150 סל"ד עם 150 μmol/m,2שניות של אור פעיל פוטוסינתטי.
  2. חלצו את דגימת החלבון הגולמי מזני הטרנספורמנט (#50) והפרא באמצעות חיץ ליזה של 5 מ"ל (ראו טבלה 1), ולאחר מכן סוניקציה למשך 4 דקות.
  3. יש לטהר דגימת חלבון גולמי עם שרף Ni-NTA דרך עמודי פוליפרופילן בנפח 5 מ"ל (ראו טבלת חומרים).
  4. Lyophilize דגימות חלבון מטוהר 15 מ"ל להשעות אותם מחדש 1 מ"ל חיץ ליזה עבור ניתוח SDS-PAGE17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להראות טרנספורמציה מוצלחת באמצעות השיטה לעיל, C. vulgaris עבר תרבית משותפת עם AGL-1 שהכיל את הפלסמיד pCAMBIA1302 או ללא הפלסמיד (מסוג פראי ומצופה על אגר TAP בתוספת Hygromycin B ו-cefotaxime (איור 1A). הלוח השמאלי ביותר מראה את המושבות שעברו טרנספורמציה המסוגלות לצמוח על לוחות היגרומיצין B/cefotaxime, והלוח האמצעי מראה כי AGL-1 מסוג פרא אינו יכול לגדול על לוחות Hygromycin B/cefotaxime. הצלחת הימנית ביותר מראה כי כאשר לא נעשה שימוש בסלקציה (cefotaxime בלבד), C. vulgaris transformants וסוג פראי יכולים לגדול. מושבות בודדות פוזרו על אגר TAP עם היגרומיצין B וצפוטקסי (איור 1B). מושבות שנמלטו מהצלחת הימנית ביותר (איור 1B) חוסנו על נוזל TAP עם היגרומיצין B וצפוטקסים (איור 1C). בשל רמות ביטוי משתנות לאחר אינטגרציה אקראית של T-DNA, טרנספורמנטים נמצאו במקור על לוחות עם ריכוזים הולכים וגדלים של היגרומיצין B בטווח של 25-70 מ"ג / ליטר. מושבה אחת מכל צלחת גודלה במצע TAP נוזלי שהכיל את אותו ריכוז של היגרומיצין B יחד עם סוג הבר C. vulgaris בריכוז הנמוך ביותר (איור 1D). סוג הבר C. vulgaris אינו יכול לגדול בנוכחות היגרומיצין, בעוד מושבות עמידות עד 70 מ"ג / ליטר התקבלו.

כדי לאשר שקלטת T-DNA שולבה ביציבות בגנום של C. vulgaris, מושבה אחת שנבחרה מכל אחת מלוחות 20, 25, 30, 50 ו-70 מ"ג/ליטר היגרומיצין B עברה כל אחת מתת-תרבית על ידי פסים חוזרים ונשנים על לוחות אגר TAP עם סלקציה פעמיים ולאחר מכן באופן שגרתי תת-תרבית במדיה של TAP יותר מעשר פעמים, בשם transformant #20, #25, #30, #50, #50 ו- #70 בהתאמה. באמצעות תרביות אלה, שני PCR מושבה בוצע כדי לשלול זיהום על ידי pCAMBIA1302 ב AGL1, ו DNA גנומי הופק כדי לאשר את הגן mGFP5 היה נוכח בגנום C. vulgaris. באיור 2A, PCR מושבה בוצע באמצעות פריימרים המכוונים לאזור של 5kbp מחוץ לגבולות T-DNA שמאליים וימניים הצליחו להגביר את האזור הזה מפלסמיד pCAMBIA1302 כבקרה חיובית, אולם אזור זה לא היה נוכח באף אחת מדגימות C. vulgaris המצביעות על כך שדנ"א pCAMBIA1302 לא היה נוכח באף אחת מהתרביות. דגימת הבר C. vulgaris שימשה כביקורת שלילית, ולא נראתה הגברה.

דנ"א גנומי הופק מטרנספורמנטים #25, #50 ו-#70, ובוצע PCR, שהגביר אזור של 1763 bp המכיל את הגן mgfp5 של ה-T-DNA כדי לאשר אינטגרציה בטרנספורמנטים (איור 2B). pCAMBIA1302 שימש כבקרה חיובית, והגברה זוהתה בכל הטרנספורמנטים, מה שמצביע על כך שהגן mgfp5 היה נוכח בכל הדנ"א הגנומי של הטרנספורמנטים. הסוג הפראי C. vulgaris שימש כבקרה שלילית, ולא נראתה הגברה. איור 2C מראה את ההגברה של מקטע של 600 bp של חלבון האלימות E2 (VirE2) שנמצא בפלסמיד מעורר הגידול (פלסמיד Ti) של זן AGl1. הבקרה החיובית, המורכבת מזן AGl1 המכיל pCAMIA1302, הוגברה בהצלחה עם פריימרים, המעידים על נוכחות A. tumefaciens בדגימה. עם זאת, כל דגימות C. vulgaris נבדקו שלילי עבור אזור זה, מה שמצביע על כך subculturing חוזר על cefotaxime בהצלחה לחסל זיהום של AGL1 מן התרבית. דגימת הבר C. vulgaris שימשה כבקרה שלילית, ולא נצפתה הגברה. יחד, שלוש בדיקות אלה מאשרות כי T-DNA המכיל mgpf5 הוכנס לגנום של C. vulgaris, ותוצאות אלה לא נבעו מזיהום AGL1 בדגימות ולא בשל נוכחות pCAMBIA1302 בתאים. תוצאות אלה חזרו על עצמן לאחר 20 וכ-100 תת-תרביות של טרנספורמנטים, שאישרו את השילוב ארוך הטווח של ה-T-DNA בגנום.

לבסוף, הפנוטיפ אושר על ידי גידול הטרנספורמנטים במדיה TAP עם בחירה ומדידה של הפלואורסצנטיות. זה הושווה לסוג הבר C. vulgaris. בשל ספיגת הרקע / אוטופלואורסנציה של כלורופיל, הפלואורסצנטיות הושוותה על ידי נרמול הנתונים לזן מסוג פראי. באיור 3A אפשר לראות שיש הבדל ניכר בגדילה בין הטרנספורמנטים לבין הפרא מסוג C. vulgaris. ניתן לייחס זאת באופן פוטנציאלי לשילובים אקראיים מרובים של T-DNA לתוך הגנום, אשר עשויים להשפיע על תהליכים תאיים אחרים ולהוביל לצמיחה איטית יותר. אף על פי כן, איור 3B מדגיש שלמרות הצמיחה הנמוכה יותר, כל הזנים שנבחרו מפגינים רמות פלואורסצנטיות גבוהות יותר כאשר מנורמלים את צפיפות התאים. יש לציין כי זן #70 הראה רמות פלואורסצנטיות גבוהות משמעותית מהאחרים, עם ערך p של <0.01. זה מדגיש את החשיבות של סינון מושבות רבות כדי לזהות טרנספורמנטים המבטאים את החלבון הרצוי מבלי להשפיע לרעה על התנהגות הצמיחה הכוללת.

כדי לאשר את הביטוי של mGFP5-6xHis, נעשה שימוש ב-SDS-PAGE כדי לנתח את תמצית החלבון הגולמי ואת החלבונים המטוהרים שלו הן מ-C. vulgaris (WT) והן מ-C. vulgaris transformant (#50). לאחר מכן, טיהור חלבון התג שלו נעשה באמצעות ערכת זרימת כבידה של שרף Ni-NTA בהתאם לפרוטוקול18 של היצרן. איור 4 מראה נוכחות של חלבון mGFP5-6xHis (~30 kDa) במדגם הטרנספורמנט #50 וללא חלבון בבקרה השלילית (WT C. vulgaris).

Figure 1
איור 1: התאוששות של טרנספורמנטים מסוג C. vulgaris לאחר AMT. (A) לאחר טיפוח משותף של C. vulgaris, טרנספורמנטים s הם AGL-1 המכילים את פלסמיד pCAMBIA או ללא פלסמיד (AGL-1 בלבד) על לוחות סלקטיביים. (B) מושבות בודדות מפוספסות מחדש שנבחרו מלוחות היגרומיצין B (20 מ"ג/ליטר) על אגר TAP סלקטיבי. (C) מושבות שנמלטו חסרות צמיחה מצלחת AGL1 בלבד על מצע נוזלי היגרומיצין B (20 מ"ג/ליטר). (D) גידול מושבות בודדות #25, #50 ו- #50 מצלחות בחירה של היגרומיצין הגדלות במדיית TAP נוזלית המכילה היגרומיצין וסוג בר C. vulgaris שאינם יכולים לגדול במדיה היגרומיצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זיהוי זיהום pCAMBIA1302. (A) אינטגרציה של T-DNA בטרנספורמנטים (B) וזיהוי זיהום A. tumefaciens (C). WT מציין סוג פראי C. vulgaris, PC הוא הבקרה החיובית (pCAMBIA1302) ו- AGL1 מציין זן A. tumefaciens AGL1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: גדילה ופלואורסצנטיות של הטרנספורמטים לאחר 3 ימים לאחר החיסון. (A) גדילה כפי שנמדדה על ידי ספיגה ב 680 ננומטר. (B) פלואורסצנטיות מנורמלת לזן הפראי. ממוצע של 3-4 משכפלים ביולוגיים, קווי שגיאה מייצגים 1 σ. *p < 0.05, **p < 0.01 בהשוואה לסוג הבר (WT). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח SDS-PAGE של ביטוי mGFP5-6xHis ב-C. vulgaris (WT) ומדגם C. vulgaris #50 שעבר טרנספורמציה. התמציות הוכנו מגולם, מטוהרות (שטיפה ראשונה), מטוהרות (מדוללות) ומטוהרות (מרוכזות) מ-C. vulgaris (WT), נתיבים 1-4, בהתאמה. גס, מטוהר (כביסה ראשונה), מטוהר (eluted), ומטוהר (lyophilized) מ C. vulgaris (WT), נתיבים 5-8, בהתאמה. התיבה האדומה מציינת חלבון מטוהר GFP-6xHis מ transformant #70. חלבונים הופרדו על ג'ל פוליאקרילאמיד 12%. המשקלים המולקולריים (MWs) של תקני החלבונים (Std.) מוצגים מימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שם המדיה/מאגר הרכב
ליברות 5 גרם / ליטר תמצית שמרים, 10 גרם / ליטר טריפטון, 5 גרם / ליטר NaCl
ברז 20 mM בסיס טריס, 1.58 mM K 2 HPO 4, 2.4 mM KH 2 PO 4, 7.0 mM NH 4 Cl, 0.83mM MgSO 4, 0.34 mM CaCl 2, 1 מ"ל/L חומצה אצטית קרחונית, ו-1 מ"ל/ליטר מכל F/2 מתכות קורט בינוניות וויטמינים F/2
F/2 מתכות קורט בינוניות 22 מ"ג/ליטר ZnSO 4·7H 2 O, 180 מ"ג/ליטר MnCl 2·4H 2 O, 6.3 מ"ג/ליטר Na 2 MoO 4·2H 2 O, 14 מ"ג/ליטר CoCl 2·6H 2 O, 9.8 מ"ג/ליטר CuSO 4·5H 2 O, 3.15 גרם/ליטר FeCl3·6H 2 O, 4.36 גרם/ליטר Na 2 EDTA·2H 2 O
F/2 ויטמינים בינוניים 0.1 מ"מ ויטמין B12 (ציאנוקובלמין), 25 מ"ג/ליטר ביוטין, 335 מ"ג/ליטר תיאמין, 50 מ"מ HEPES Buffer pH 7.8
חיץ ליזיס 20 mM Na2HPO 4, 300 mM NaCl, pH7.4

טבלה 1: מתכוני מדיה וחיץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יעילות הטרנספורמציה קשורה למספר פרמטרים שונים. הבחירה בזני A. tumefaciens המשמשים ל- AMT היא קריטית. AGL-1 הוא אחד הזנים הפולשים ביותר שהתגלו, ומסיבה זו נעשה בו שימוש שגרתי ב-AMT צמחי. תוספת של גלוקוז (15-20 מילימול) חשובה גם היא ליעילות AMT. בהתחשב בכך ש-C. vulgaris יכול לגדול הן בתנאים פוטוטרופיים והן בתנאים הטרוטרופיים, גלוקוז או מקורות פחמן אחרים מושמטים לעתים קרובות ממדיה מיקרו-אצות כדי למנוע זיהום. לדוגמה, המדיום הבסיסי של בולד (BBM) הוא המדיה הנפוצה ביותר לטיפוח פוטוטרופי של C. vulgaris19. עם זאת, BBM אינו תומך בצמיחת A. tumefaciens בשל היעדר מקור פחמן אורגני ואמוניום כמקור חנקן המועדף עליו (BBM משתמש בחנקה)20. לכן, נעשה שימוש במדיה TAP בעבודה זו מכיוון שהיא מכילה אצטט כמקור פחמן עבור C. vulgaris , גלוקוז עבור A. tumefaciens, ואמוניום כמקור חנקן ששני המינים יכולים להשתמש בו. צלחות אגר TAP מאפשרות גם קצבי גדילה מהירים בהרבה עבור C. vulgaris, וממזערות את הזמן לשחזור שנאים לאחר AMT. כדי לגרום לחלבוני אלימות Ti-plasmid, יש להוסיף 200 מיקרומטר של אצטוסירינגון גם למדיית האינדוקציה.

כדי לחסל A. tumefaciens מן התרבית לאחר AMT, cefotaxime, יחד עם פסידה סדרתית, שימש. AGL-1 עמיד לאמפיצילין, כלוראמפניקול, ריפמיצין וסטרפטומיצין, והוא רגיש לצפוטקסימה, טטרציקלין, ספקטינומיצין וקנמיצין. בצמחים, cefotaxime משמש לעתים קרובות כדי לחסל A. tumefaciens כי יש לו השפעה phytotoxic נמוכה יותר עבור התחדשות יורה במינים רבים צמחים מאשר אנטיביוטיקה אחרים21. עם זאת, אישרנו גם כי טטרציקלין (שעולה בערך פי 100 פחות) יכול לשמש במקום cefotaxime בפרוטוקול זה בשילוב עם מעבר טורי ממושבה אחת (נתונים לא מוצגים). סביר להניח שהסיבה לכך היא שאנטיביוטיקה כמו טטרציקלין תעכב סינתזת חלבונים בכלורופלסט בצמחים התלויים בפוטוסינתזה22. עם זאת, C. vulgaris יכול לגדול בחושך כאשר מוסיפים לו אצטט, כלומר תפקוד לקוי של כלורופלסט אינו בהכרח רעיל למין זה בתנאים שנבחרו בקפידה.

למרות 20 מ"ג / ליטר של היגרומיצין B היה מספיק כדי למנוע את הצמיחה של סוג בר C. vulgaris, טווח של ריכוזי היגרומיצין B (20-70 מ"ג / ליטר) נבדקו. ייתכן שלמושבות המבודדות מלוחיות ריכוז גבוהות יותר יש עותקים משולבים מרובים של ה-T-DNA או שה-T-DNA ממוקם באזור פעיל יותר בשעתוק של הגנום, וכתוצאה מכך ביטוי גבוה יותר של Hygromycin B phosphotransferase, וכתוצאה מכך השבתה מהירה יותר של קוטל העשבים ופחות זמן פיגור בצמיחת התרבית23. עותקים מרובים עשויים להיות הסיבה להבדלים בעוצמה של תוצרי PCR בעת הגברת mgfp5 מהגנום (איור 2B). נוכחותו של חלבון GFP-6xHis בדגימה המטוהרת במהלך ניתוח SDS-PAGE (איור 4, נתיב 8) והיעדרו בזן פראי (איור 4, נתיב 4) מאשרים כי AMT ו-pCAMBIA1302 יכולים לשמש לביטוי מוצלח ולאינטגרציה יציבה של טרנסגנים ב-C. vulgaris.

בעבודה זו, פיתחנו וביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול לטרנספורמציה אמינה של C. vulgaris UTEX 395 באמצעות A. tumefaciens AGL-1 ופלסמיד מערכת pCAMBIA. מכיוון שכל הזנים והפלסמידים הדרושים לעבודה זו זמינים ממספר מקורות שונים, שיטה זו תהיה קלה לשכפול בכל מעבדה. כאחד הזנים התעשייתיים החשובים ביותר של מיקרו-אצות, שיטת ייחוס סטנדרטית עבור AMT אמין תהיה חיונית להנדסת C. vulgaris עבור יישומים ביוטכנולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לפרופ' פול הויקאס על שסיפק באדיבותו את וקטור pCAMBIA1302 ואת Agrobacterium tumefaciens AGL1 מהמכון לביולוגיה בליידן, אוניברסיטת ליידן, הולנד. המחברים רוצים גם להודות לאווה קוליק על עזרתה בגידול טרנספורמטורים פלואורסצנטיים. עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה ותוכנית Mitacs Accelerate.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Kb Plus DNA ladder FroggaBio DM015
Acetosyringone Fisher Scientific D26665G
Agrobacterium tumefaciens Gold Biotechnologies Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin Enzo Life Sciences 89151-400
CaCl2·2H2O VWR BDH9224-1KG
Cefotaxime AK Scientific J90010
Chlorella vulgaris University of Texas at Austin Culture Collection of Algae Strain: UTEX 395 Wildtype strain
CoCl2·6H2O Sigma Aldrich C8661-25G
CuSO4·5H2O EMD Millipore CX2185-1
FeCl3·6H2O VWR BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator Bio-Rad 1652662 Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit Thermo Scientific K0791
Glacial acetic acid VWR CABDH3093-2.2P
Glycerol BioBasic GB0232
HEPES Buffer Sigma Aldrich H-3375
Hygromycin B Fisher Scientific AAJ6068103
K2HPO4 VWR BDH9266-500G
Kanamycin Gold Biotechnologies K-250-25
KH2PO4 VWR BDH9268-500G
MgSO4·7H2O VWR 97062-134
MnCl2·4H2O JT Baker BAKR2540-01
Na2CO3 VWR BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O JT Baker 8993-01
Na2MoO4·2H2O JT Baker BAKR3764-01
NaCl VWR BDH7257-7
NaH2PO4 H2O Millipore Sigma CA80058-650
NaNO3  VWR BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin NewEngland BioLabs NEB #S1427
NH4Cl VWR BDH9208-500G
pCAMBIA1302 Leiden University Gift from Prof. Paul Hooykaas pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL) QIAGEN 34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL Bio-Rad 1610363
Rifampicin Millipore Sigma R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch  SunBlaster 210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer  BioTEK S4MLFPTA
Tetracycline Thermo Scientific Chemicals CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% Bio-Rad 1610185
Thiamine TCI America T0181-100G
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Tryptone BioBasic TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin) Enzo Life Sciences 89151-436
Yeast Extract BioBasic G0961
ZnSO4·7H2O JT Baker 4382-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
  2. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  3. De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
  4. Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
  5. Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
  6. Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
  7. Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
  8. de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
  9. Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
  10. Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
  11. Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
  12. Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
  13. Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
  14. Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
  15. Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
  17. Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
  18. NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
  19. Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 1: Unit 3D.1 (2012).
  21. Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
  22. Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
  23. Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).

Tags

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation הנדסה גנטית מיקרו-אצות ירוקות Chlorella vulgaris פרוטוקול AMT גן כתב חלבון פלואורסצנטי ירוק (mGFP5) סמן עמידות לאנטיביוטיקה היגרומיצין B בחירת מוטנטים מדיית טריס-אצטט-פוספט (TAP) טרנספורמציה יציבה קלטת T-DNA מושבות טרנסגניות וקטור ביטוי צמחים PCAMBIA1302
<em>Agrobacterium tumefaciens-מתווך</em> גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, <em>Chlorella vulgaris</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roushan, M. R., Chen, C., Ahmadi,… More

Roushan, M. R., Chen, C., Ahmadi, P., Ward, V. C. A. Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris. J. Vis. Exp. (200), e65382, doi:10.3791/65382 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter