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Bioengineering

एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स-ग्रीन माइक्रोएल्गे की मध्यस्थता जेनेटिक इंजीनियरिंग, क्लोरेला वल्गरिस

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65382
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, University of Waterloo

Summary

यह प्रोटोकॉल ग्रीन माइक्रोएल्गे क्लोरेला वल्गरिस के परमाणु जीनोम में रुचि के जीन (ओं) को एकीकृत करने के लिए एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स-मध्यस्थता परिवर्तन (एएमटी) के उपयोग की रूपरेखा तैयार करता है, जिससे स्थिर ट्रांसफार्मर का उत्पादन होता है।

Abstract

एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स-मध्यस्थता परिवर्तन (एएमटी) पौधे जीनोम में हेरफेर करने के लिए व्यापक रूप से नियोजित उपकरण के रूप में कार्य करता है। हालांकि, ए ट्यूमेफेशियन्स प्रजातियों की एक विविध सरणी के लिए जीन हस्तांतरण की क्षमता प्रदर्शित करते हैं। कई सूक्ष्मजीव प्रजातियों में उनके परमाणु जीनोम में रुचि के जीन को मज़बूती से एकीकृत करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित तरीकों की कमी है। माइक्रोएल्गल जैव प्रौद्योगिकी के संभावित लाभों का दोहन करने के लिए, सरल और कुशल जीनोम हेरफेर उपकरण महत्वपूर्ण हैं। इसमें, औद्योगिक सूक्ष्मजीव प्रजातियों क्लोरेला वल्गरिस के लिए एक अनुकूलित एएमटी प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है, जिसमें रिपोर्टर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एमजीएफपी 5) और हाइग्रोमाइसिन बी म्यूटेंट के लिए एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर का उपयोग ट्रिस-एसीटेट-फॉस्फेट (टीएपी) मीडिया पर चढ़ाना के माध्यम से चुना जाता है जिसमें हाइग्रोमाइसिन बी और सेफोटैक्सिम होता है। एमजीएफपी 5 की अभिव्यक्ति उपसंस्कृति के दस से अधिक पीढ़ियों के बाद प्रतिदीप्ति के माध्यम से मात्रा निर्धारित की है, टी डीएनए कैसेट के स्थिर परिवर्तन का संकेत. यह प्रोटोकॉल दो सप्ताह से कम समय में कई ट्रांसजेनिक सी वल्गारिस कॉलोनियों की विश्वसनीय पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध pCAMBIA1302 प्लांट एक्सप्रेशन वेक्टर को नियोजित करता है।

Introduction

एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स, एक ग्राम-नकारात्मक मिट्टी से उत्पन्न जीवाणु, में एक अद्वितीय इंटरकिंगडम जीन स्थानांतरण क्षमता होती है, जिससे इसे "प्राकृतिक आनुवंशिक इंजीनियर"1 शीर्षक मिलता है। इस जीवाणु डीएनए स्थानांतरित कर सकते हैं (टी-डीएनए) एक प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली के माध्यम से मेजबान कोशिकाओं में एक ट्यूमर-उत्प्रेरण प्लास्मिड (तिवारी प्लाज्मिड) से, एकीकरण और मेजबान जीनोम 1,2,3,4 के भीतर डीएनए की अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप. प्राकृतिक सेटिंग में, यह प्रक्रिया पौधों में ट्यूमर के गठन की ओर ले जाती है, जिसे आमतौर पर क्राउन पित्त रोग के रूप में जाना जाता है। हालांकि, एग्रोबैक्टीरियम टी-डीएनए को विभिन्न अन्य जीवों में भी स्थानांतरित कर सकता है, जिसमें खमीर, कवक, शैवाल, समुद्री मूत्र भ्रूण और यहां तक कि प्रयोगशाला स्थितियोंके तहत मानव कोशिकाएं भी शामिल हैं 5,6,7,8.

इस प्राकृतिक प्रणाली का शोषण करते हुए, एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स-मध्यस्थता परिवर्तन (एएमटी) टीआई-प्लास्मिड के टी-डीएनए क्षेत्र को संशोधित करके एक मेजबान सेल के परमाणु जीनोम में ब्याज के जीन (ओं) के यादृच्छिक एकीकरण को सक्षम बनाता है। इस उद्देश्य के लिए, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला एएमटी प्लांट एक्सप्रेशन वेक्टर pCAMBIA13029 है। शोधकर्ता ब्याज के मेजबान के लिए बाद में हस्तांतरण के लिए वांछित वेक्टर को स्थानांतरित करने से पहले ई कोलाई में सरल क्लोनिंग वर्कफ़्लोज़ को नियोजित कर सकते हैं।

ग्रीन माइक्रोएल्गे यूकेरियोट्स हैं जो भूमि पौधों के साथ कई समानताएं साझा करते हैं लेकिन आनुवंशिक संशोधन के लिए अत्यधिक अड़ियल हैं। हालांकि, आनुवंशिक परिवर्तन सूक्ष्मजीव के मौलिक और जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। कई सूक्ष्मजीव प्रजातियों में, विशेष रूप से क्लैमाइडोमोनास रेनहार्डटी, एएमटी के माध्यम से आनुवंशिक परिवर्तन ने मानव इंटरल्यूकिन -2 (एचआईएल -2), गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (SARS-CoV-2 RBD), और दो रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (एएमपी)10,11,12,13जैसे ट्रांसजीन को सफलतापूर्वक पेश किया है। इन बीच, क्लोरेला वल्गारिस, एक कम तेज़ और तेजी से बढ़ती हरी शैवाल प्रजाति, कार्बोहाइड्रेट, प्रोटीन, न्यूट्रास्यूटिकल्स, पिगमेंट, और अन्य उच्च मूल्ययौगिकों 14 के स्थायी उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण क्षमता रखती है. हालांकि, ट्रांसजेनिक उपभेदों को बनाने के लिए विश्वसनीय उपकरणों की कमी सी वल्गरिस इसकी व्यावसायिक प्रगति में बाधा डालती है। चूंकि सी वल्गरिस15 में एएमटी का उपयोग करते हुए केवल सीमित संख्या में प्रकाशित कार्य हुए हैं, और पौधे और सूक्ष्म शैवाल की खेती के बीच काफी अंतर को देखते हुए, एएमटी प्रोटोकॉल का अनुकूलन आवश्यक हो जाता है।

इस अध्ययन में, शोधकर्ताओं ने फूलगोभी मोज़ेक वायरस (CamV) 35S प्रमोटर के नीचे की ओर हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mGFP5) को डाला और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक रिपोर्टर जीन के रूप में इसका उपयोग करने के लिए एक हिस्टिडाइन टैग जोड़ा। ट्रांसफॉर्मर को हाइग्रोमाइसिन बी का उपयोग करके चुना गया था, और बीस पीढ़ियों से अधिक के लिए उप-संवर्धन के बाद, परिवर्तन स्थिर रहा। इस काम में कार्यरत pCAMBIA1302 प्लाज्मिड को ब्याज के किसी भी जीन को शामिल करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रस्तुत विधि और सामग्रियों को एक सक्रिय CamV35S प्रमोटर के साथ अन्य हरी शैवाल प्रजातियों के लिए समायोजित किया जा सकता है, क्योंकि इस प्रमोटर का उपयोग हाइग्रोमाइसिन चयन के लिए किया जाता है।

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Protocol

सभी मीडिया और समाधानों को उपयोग करने से पहले ऑटोक्लेव किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा न कहा गया हो। सभी अपकेंद्रित्र ट्यूब, विंदुक युक्तियाँ, आदि, उपयोग करने से पहले बाँझ या autoclaved होना चाहिए। आसान संदर्भ के लिए, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल मीडिया व्यंजनों तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं.

1. A. tumefacens इलेक्ट्रोकंपीटेंट सेल की तैयारी

  1. एग्रोबैक्टीरियम (एजीएल -1) को एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से एलबी मीडिया (रिफैम्पिसिन, 20 मिलीग्राम / एल -1 के साथ पूरक) के 25 एमएल बाँझ शेकर फ्लास्क में टीका लगाएं और 28-30 डिग्री सेल्सियस और 150 आरपीएम पर रात भर बढ़ें।
    नोट: एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेन एजीएल -1 ( सामग्री की तालिकादेखें) रिफैम्पिसिन, एम्पीसिलीन, क्लोरैम्फेनिकॉल और स्ट्रेप्टोमाइसिन के लिए प्रतिरोधी है और कई आपूर्तिकर्ताओं से प्राप्त किया जा सकता है।
  2. अगले दिन, 50 एमएल ऑटोक्लेव्ड अल्ट्रा-शुद्ध पानी में रातोंरात संस्कृति के 0.5 माइक्रोन जोड़कर संस्कृति को 1,00,000 गुना पतला करें और एलबी प्लेट पर इस पतला संस्कृति के 10 माइक्रोन फैलाएं, और फिर 1-3 दिनों के लिए 28-30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. एक कॉलोनी उठाओ और 28-30 डिग्री सेल्सियस पर रिफैम्पिसिन के साथ एलबी में 20 एमएल रातोंरात संस्कृति शुरू करें।
  4. अगले दिन, रातोंरात संस्कृति के 9 एमएल के साथ एक प्रकार के बरतन फ्लास्क में 500 एमएल एलबी मीडिया (कोई एंटीबायोटिक नहीं) टीका लगाना और 28-30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ना जब तक आयुध डिपो600 0.5 तक पहुंच जाता है।
  5. संस्कृति को समान रूप से दस 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में विभाजित करें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करें। अपकेंद्रित्र को 4 डिग्री सेल्सियस तक प्री-कूल करें।
  6. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 4000 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। इसके बाद, एक विंदुक का उपयोग कर संभव के रूप में ज्यादा सतह पर तैरनेवाला हटा दें और बर्फ के ठंडे पानी के 50 एमएल में प्रत्येक ट्यूब में गोली resuspended है.
  7. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 4000 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें और प्रत्येक ट्यूब में बर्फ ठंडे पानी के 25 एमएल में गोली resuspend.
  8. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 4000 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें और प्रत्येक ट्यूब में बर्फ ठंडा 10% (डब्ल्यू / वी) ग्लिसरॉल के 1 एमएल में गोली फिर से निलंबित करें.
  9. सभी ट्यूबों को एक 50 एमएल ट्यूब में मिलाएं और कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस और 15 मिनट के लिए 4000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और 400 μL बर्फ-ठंडा 10% (w/v) ग्लिसरॉल में गोली को फिर से निलंबित करें। सेल एकाग्रता के बारे में 1-3 x 1010 कोशिकाओं / एमएल होना चाहिए.
  10. बाँझ prechilled microtubes में 50 μL aliquots के रूप में कोशिकाओं वितरित. तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।

2. ए. ट्यूमेफेशियन्स का इलेक्ट्रोपोरेशन

  1. AGL-1 A. tumefacens इलेक्ट्रोकोम्टेंट कोशिकाओं के 50 माइक्रोन को प्रीचिल्ड 0.1 मिमी क्युवेट में जोड़ें और pCAMBIA1302 या इसी तरह के प्लाज्मिड (conc 15 ng/μL) के 2 माइक्रोन जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. इलेक्ट्रोपोरेटर (200 Ω, समाई विस्तारक 250 μFD, समाई 25 μFD, घातांकीय क्षय, सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके 2400 V पर इलेक्ट्रोपोरेट करें। घातीय क्षय के साथ सफल इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए समय स्थिरांक >4.5 एमएस होना चाहिए।
  3. तुरंत क्यूवेट में एलबी मीडिया के 1 एमएल जोड़ें और मिश्रण करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे विंदुक करें। एक 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में resuspended कोशिकाओं के 1 एमएल स्थानांतरण और कम से कम 1 घंटे के लिए 28-30 डिग्री सेल्सियस पर यह सेते हैं.
  4. एलबी अगर पर कोशिकाओं को प्लेट करें जिसमें उपयुक्त एंटीबायोटिक (यानी, प्रोकैरियोटिक चयन के लिए pCAMBIA1302 के लिए 50 मिलीग्राम/एल कनामाइसिन होता है)।
  5. 2-3 दिनों के लिए 28-30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  6. एक कॉलोनी का चयन करें, उपयुक्त चयन (pCAMBIA1302 के लिए 50 मिलीग्राम/एल कनामाइसिन केनामाइसिन) के साथ एलबी में रातोंरात बढ़ें, और भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 50% ग्लिसरॉल का उपयोग करके प्लाज्मिड युक्त तनाव को क्रायोसंरक्षित करें।

3. सी वल्गरिस का एएमटी

नोट: सह-खेती के लिए समानांतर में सी. वल्गरिस (यूटीईएक्स 395, सामग्री की तालिकादेखें) और ए. ट्यूमेफेशियन्स संस्कृतियों को तैयार करें। C. वल्गरीकी संस्कृतियों को तैयार करने से 3 दिन पहले शुरू किया जाना चाहिए ए। प्रोटोकॉल को कुमार एट अल.7 द्वारा प्रकाशित के आधार पर संशोधित किया गया था।

  1. C. वल्गरिस संस्कृति तैयार करें
    1. C. वल्गरिस को पारंपरिक रूप से तिरछा पर संग्रहीत किया जाता है या प्रबुद्ध परिस्थितियों में लॉग-चरण संस्कृतियों में बनाए रखा जाता है। आयुध डिपो600 = 1.0 पर एक लॉग चरण संस्कृति से, एक ट्रिस-एसीटेट-फॉस्फेट (टीएपी, तालिका 1 देखें) अगर प्लेटें ( 1.2% डब्ल्यू / वी अगर ए) पर 0.5 एमएल फैलाएं और रोशनी के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए बढ़ें (50 माइक्रो ई / एम2एस)। यह लगभग 5 x 106 कोशिकाओं का उत्पादन होगा.
  2. A. tumefaceians संस्कृति तैयार करें
    1. ग्लिसरॉल स्टॉक का उपयोग करके 15 एमएम ग्लूकोज, 20 मिलीग्राम/एल रिफैम्पिसिन, और 50 मिलीग्राम/एल केनामाइसिन (सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक एलबी मीडिया के 10 एमएल को टीका लगाकर एक शेकर फ्लास्क में ए. ट्यूमेफेशियन्स एजीएल -1 पीसीएबीआईए 1302 तनाव बढ़ाएं। रात भर 28-30 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें।
    2. 15 एमएम ग्लूकोज, 20 मिलीग्राम/एल रिफैम्पिसिन, और 50 मिलीग्राम/एल कनामाइसिन के साथ एलबी के 50 एमएल में रातोंरात संस्कृति के 1 एमएल को टीका लगाएं और 28-30 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें जब तक कि आयुध डिपो600 1.0 तक न पहुंच जाए।
  3. सह-खेती सी. वल्गरिस और ए. ट्यूमफेशियन्स
    1. सह-खेती के लिए ए. ट्यूमेफेशियन्स संस्कृति तैयार करने के लिए, उगाई गई संस्कृति को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 4000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। एक विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला निकालें और प्रेरण माध्यम के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें.
      नोट: उपयोग किया जाने वाला प्रेरण मीडिया पीएच 5.5 में समायोजित टीएपी मीडिया है और 200 माइक्रोन एसिटोसिरिंगोन (एएस, सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एफ/2 मध्यम ट्रेस धातुओं और विटामिन के साथ पूरक है। प्रेरण मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें जैसे कि आयुध डिपो600 = 0.5।
    2. सह-खेती के लिए सी वल्गरिस संस्कृति तैयार करने के लिए, ~ 5 x 106 कोशिकाओं वाले सी वल्गरिस प्लेट में प्रेरण मीडिया के 25 एमएल जोड़ें। एक 50 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4000 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    3. बैक्टीरियल सस्पेंशन (ओडी 600: 0.5) के200 माइक्रोन के साथ अल्गल सेल गोली मिलाएं और उन्हें 1 घंटे के लिए 150 आरपीएम पर 21-25 डिग्री सेल्सियस पर रोटरी शेकर में इनक्यूबेट करें।
    4. 15 मिमी ग्लूकोज के साथ पूरक प्रेरण मीडिया प्लेटों पर मिश्रित संस्कृति (200 माइक्रोन) फैलाएं और 3 दिनों के लिए अंधेरे में 21-25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. 3 दिनों के बाद, माइक्रोएल्गे को इकट्ठा करने के लिए 400 मिलीग्राम/एल सेफोटैक्सिम या 20 मिलीग्राम/एल टेट्रासाइक्लिन ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पूरक टीएपी मीडिया के 10 एमएल का उपयोग करें और संस्कृति से ए. ट्यूमेफेशियन्स को खत्म करने के लिए 21-25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
    6. चयनात्मक मीडिया पर संस्कृति की प्लेट 500 माइक्रोन, उदाहरण के लिए, टीएपी मीडिया हाइग्रोमाइसिन बी के 20-70 मिलीग्राम / एल (पीसीएबीिया 1302 का उपयोग करते समय) और 400 मिलीग्राम / एल -1 सेफोटैक्सिम या 20 मिलीग्राम / एल टेट्रासाइक्लिन के साथ पूरक है। उन्हें एक प्रबुद्ध कक्ष में रखने से पहले 2 दिनों के लिए अंधेरे में 21-25 डिग्री सेल्सियस सेते हैं.
      नोट: प्रतिरोधी कालोनियों प्रकाश जोखिम के 5-7 दिनों के बाद दिखाई देंगे।
    7. परिवर्तन प्लेट से एकल कालोनियों को चुनें और उन्हें 400 मिलीग्राम / एल सेफोटैक्सिम या टेट्रासाइक्लिन के 20 मिलीग्राम / एल और हाइग्रोमाइसिन बी के 20-70 मिलीग्राम / एल के साथ पूरक टीएपी अगर प्लेटों पर फिर से लकीर दें।

4. कॉलोनी पीसीआर (cPCR) सी वल्गारिस ट्रांसफार्मर में जीन एकीकरण की पुष्टि करने के लिए

  1. एक संयंत्र जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर एक ही कॉलोनी से कम से कम दो बार subculturing के बाद एक सी वल्गारिस ट्रांसफार्मर से जीनोमिक डीएनए निकालें. पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इसका उपयोग करना, टी-डीएनए के mgfp5 क्षेत्र के लिए प्राइमर डिज़ाइन करें (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3', और M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3')।
    1. Q5 उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ मास्टर मिक्स किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके, ट्रांसजीन एकीकरण को मान्य करने के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) करें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए निम्नलिखित स्थितियों का उपयोग किया गया था: 3 मिन के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; 35 चक्र (10 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 57 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस); 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। pCAMBIA1302 का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में करें और जंगली प्रकार C. vulgaris जीनोमिक डीएनए को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें।
  2. पुष्टि करने के लिए कि वहाँ कोई pCAMBIA1302 ए द्वारा अवशिष्ट संदूषण के कारण नमूने में मौजूद है. tumefaceens, कॉलोनी पीसीआर का उपयोग करें. बाँझ पानी के 10 माइक्रोन में ट्रांसफार्मर कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा जोड़ें और 15 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर उबालें। पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस का प्रयोग करें.
    1. pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' और B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3') पर T-DNA के बाहर के क्षेत्र के लिए प्राइमर डिज़ाइन करें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए निम्नलिखित स्थितियों का उपयोग किया गया था: 3 मिन के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; 30 चक्र (30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 48 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस); 7 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में A. tumefaceians AGL-1 (pCAMBIA1302) की उबली हुई कॉलोनी और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में जंगली प्रकार C. vulgaris की उबली हुई कॉलोनी का उपयोग करें।
  3. यह पुष्टि करने के लिए कि नमूने में कोई ए ट्यूमरफेशियन्स संदूषण मौजूद नहीं है, कॉलोनी पीसीआर का उपयोग करें। बाँझ पानी के 10 माइक्रोन में ट्रांसफार्मर कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा जोड़ें और 15 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर उबालें। पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस का प्रयोग करें.
    1. AGL-2 विषाणु प्लाज्मिड (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' और virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3') पर निहित virE2 जीन के लिए डिज़ाइन प्राइमर।
      नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए निम्नलिखित स्थितियों का उपयोग किया गया था: 3 मिन के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; 30 चक्र (30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 53 डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस); 7 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में A. tumefaceians AGL-1 (pCAMBIA1302) की उबली हुई कॉलोनी और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में जंगली प्रकार C. vulgaris की उबली हुई कॉलोनी का उपयोग करें।
  4. परिणामस्वरूप टुकड़े16 के आकार की पुष्टि करने के लिए एक सीढ़ी (1 Kbp डीएनए सीढ़ी, सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एक डीएनए agarose जेल पर पीसीआर नमूने चलाएं.

5. ट्रांसफार्मर के प्रतिदीप्ति को मापना

  1. लॉग-फेज रखरखाव संस्कृति या टीएपी अगर तिरछा से प्रत्येक ट्रांसफार्मर को 200 मिलीग्राम/एल-1 सेफोटैक्सिम और 25 मिलीग्राम/एल-1 हाइग्रोमाइसिन बी के साथ पूरक टीएपी के 50 एमएल में टीका लगाएं, जैसे कि शुरुआती आयुध डिपो600 = 0.1। जंगली प्रकार के साथ एक संस्कृति को टीका लगाएं सी. वल्गरिस और केवल 200 mg/L-1 सेफोटैक्सिम नकारात्मक नियंत्रण के रूप में। प्रकाश संश्लेषक रूप से सक्रिय प्रकाश के 150 μmol/m2s के साथ 150 rpm पर 25 °C पर इनक्यूबेट करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. प्रत्येक 24 घंटे, नमूना का 300 माइक्रोन लें और 96-अच्छी तरह से प्लेट रीडर या यूवी/विज़ स्पेक्ट्रोमीटर और फ्लोरोमीटर (सामग्री की तालिकादेखें) में अवशोषण और प्रतिदीप्ति (उत्तेजना 488 एनएम, उत्सर्जन 526 एनएम) को मापें। एक साथ माप के लिए एक पारदर्शी तल के साथ एक काली प्लेट का प्रयोग करें।

6. क्रूड प्रोटीन निष्कर्षण, प्रोटीन शुद्धि, और एसडीएस-पेज वैद्युतकणसंचलन

  1. OD680 = 0.1 तक पहुंचने के लिए 200 mg/L-1 सेफोटैक्सिम और 25 mg/L-1 हाइग्रोमाइसिन B के साथ पूरक TAP के 300 एमएल में लॉग-फेज रखरखाव संस्कृति से ट्रांसफार्मर (# 50) को टीका लगाएं। जंगली प्रकार के साथ एक संस्कृति को टीका लगाएं सी. वल्गरिस और केवल 200 mg/L-1 सेफोटैक्सिम नकारात्मक नियंत्रण के रूप में। प्रकाश संश्लेषक रूप से सक्रिय प्रकाश के 150 μmol/m2s के साथ 150 rpm पर 25 °C पर इनक्यूबेट करें।
  2. ट्रांसफार्मर (# 50) और जंगली प्रकार के उपभेदों से कच्चे प्रोटीन नमूना निकालें 5 एमएल लाइसिस बफर ( तालिका 1 देखें) का उपयोग करके, इसके बाद 4 मिन के लिए सोनिकेशन करें।
  3. 5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम के माध्यम से नी-एनटीए राल के साथ कच्चे प्रोटीन नमूने को शुद्ध करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  4. Lyophilize 15 एमएल शुद्ध प्रोटीन के नमूने और उन्हें एसडीएस-पेज विश्लेषण17 के लिए 1 एमएल lysis बफर में फिर से निलंबित करें.

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Representative Results

उपरोक्त विधि का उपयोग करके सफल परिवर्तन दिखाने के लिए, सी. वल्गरिस को या तो एजीएल-1 के साथ सहसंवर्धित किया गया था जिसमें पीकैंबिया1302 प्लाज्मिड या प्लाज्मिड के बिना (जंगली प्रकार और हाइग्रोमाइसिन बी और सेफोटैक्सिम(चित्रा 1ए)के साथ पूरक टीएपी अगर पर चढ़ाया गया था। सबसे बाईं प्लेट हाइग्रोमाइसिन बी/सेफोटैक्सिम प्लेटों पर विकास करने में सक्षम रूपांतरित कॉलोनियों को दिखाती है, और मध्य प्लेट से पता चलता है कि जंगली प्रकार के एजीएल -1 हाइग्रोमाइसिन बी/सेफोटैक्सिम प्लेटों पर नहीं बढ़ सकते हैं। सबसे दाहिनी प्लेट से पता चलता है कि जब कोई चयन नहीं किया जाता है (केवल सेफोटैक्सिम), सी। एकल कालोनियों Hygromycin बी और cefotaxime (चित्रा 1B) के साथ नल अगर पर लकीर थे. सबसे दाहिनी प्लेट (चित्रा 1 बी) से बच गए कॉलोनियों को हाइग्रोमाइसिन बी और सेफोटैक्सिम(चित्रा 1सी)के साथ टीएपी तरल पर टीका लगाया गया था। टी-डीएनए के यादृच्छिक एकीकरण के बाद चर अभिव्यक्ति के स्तर के कारण, ट्रांसफार्मर मूल रूप से प्लेटों पर बरामद किए गए थे, जिसमें हाइग्रोमाइसिन बी की बढ़ती सांद्रता 25-70 मिलीग्राम / एल से थी। प्रत्येक प्लेट से एक कॉलोनी तरल टीएपी मीडिया में उगाई गई थी जिसमें सबसे कम एकाग्रता (चित्रा 1डी) पर जंगली प्रकार सी वल्गरिस के साथ हाइग्रोमाइसिन बी की समान एकाग्रता थी। वाइल्ड-टाइप सी. वल्गरिस हाइग्रोमाइसिन की उपस्थिति में विकसित नहीं हो सकते हैं, जबकि 70 मिलीग्राम/एल तक प्रतिरोधी कॉलोनियों को प्राप्त किया गया था।

वल्गरिस के जीनोम में टी-डीएनए कैसेट को स्थिर रूप से एकीकृत किया गया था, 20, 25, 30, 50, और 70 मिलीग्राम/एल हाइग्रोमाइसिन बी प्लेटों में से प्रत्येक से चुनी गई एक कॉलोनी प्रत्येक को दो बार चयन के साथ टीएपी अगर प्लेटों पर बार-बार लकीर करके उपसंस्कृति की गई थी और फिर नियमित रूप से टीएपी मीडिया में दस बार उपसंस्कृति की गई थी, क्रमशः ट्रांसफॉर्मेंट # 20, # 25, # 30, # 50, # 50, और # 70 नामित किया गया। इन संस्कृतियों का उपयोग करते हुए, दोनों कॉलोनी पीसीआर AGL1 में pCAMBIA1302 द्वारा संदूषण का शासन करने के लिए किया गया था, और जीनोमिक डीएनए mGFP5 जीन सी वल्गरिस जीनोम में मौजूद था की पुष्टि करने के लिए निकाला गया था. चित्रा 2 ए में, कॉलोनी पीसीआर टी डीएनए के बाहर एक 5 केबीपी क्षेत्र को लक्षित प्राइमरों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था बाएँ और सही सीमाओं एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में pCAMBIA1302 प्लाज्मिड से इस क्षेत्र को बढ़ाना करने में सक्षम थे, लेकिन इस क्षेत्र में सी वल्गरिस नमूनों में से किसी में मौजूद नहीं था pCAMBIA1302 डीएनए संस्कृतियों में से किसी में मौजूद नहीं था कि संकेत मिलता है. जंगली प्रकार के सी वल्गरिस नमूने का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था, और कोई प्रवर्धन नहीं देखा गया था।

जीनोमिक डीएनए ट्रांसफार्मर # 25, # 50, और # 70 से निकाला गया था, और पीसीआर का प्रदर्शन किया गया था, ट्रांसफार्मर (चित्रा 2 बी) में एकीकरण की पुष्टि करने के लिए टी-डीएनए के एमजीएफपी 5 जीन युक्त 1763 बीपी क्षेत्र को बढ़ाना था। pCAMBIA1302 का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था, और सभी ट्रांसफार्मर में प्रवर्धन का पता चला था, यह दर्शाता है कि mgfp5 जीन सभी ट्रांसफार्मर के जीनोमिक डीएनए में मौजूद था। जंगली प्रकार के सी वल्गरिस का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था, और कोई प्रवर्धन नहीं देखा गया था। चित्रा 2 सी विषाणु प्रोटीन ई 2 (वीर2) के 600 बीपी टुकड़े के प्रवर्धन को दर्शाता है जो एजीएल 1 तनाव के ट्यूमर-उत्प्रेरण प्लास्मिड (टीआई प्लास्मिड) में पाया जाता है। सकारात्मक नियंत्रण, जिसमें pCAMIA1302 युक्त AGl1 स्ट्रेन शामिल था, को प्राइमरों के साथ सफलतापूर्वक प्रवर्धित किया गया था, जो नमूने में उपस्थिति ए ट्यूमेफेशियन्स को दर्शाता है। हालांकि, सभी सी. वल्गरिस नमूनों ने इस क्षेत्र के लिए नकारात्मक परीक्षण किया, यह दर्शाता है कि सेफोटैक्सिम पर बार-बार उपसंस्कृति ने संस्कृति से एजीएल 1 के संदूषण को सफलतापूर्वक समाप्त कर दिया। जंगली प्रकार के सी वल्गरिस नमूने को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में नियोजित किया गया था, और कोई प्रवर्धन नहीं देखा गया था। एक साथ लिया गया, ये तीन परीक्षण इस बात की पुष्टि करते हैं कि एमजीपीएफ 5 युक्त टी-डीएनए को सी. वल्गरिस के जीनोम में डाला गया था, और ये परिणाम नमूनों में एजीएल 1 के संदूषण के कारण नहीं थे और न ही कोशिकाओं में पीसीबीए 1302 की उपस्थिति के कारण थे। इन परिणामों को 20 और ट्रांसफार्मर के लगभग 100 उपसंस्कृतियों के बाद दोहराया गया था, जो जीनोम में टी-डीएनए के दीर्घकालिक एकीकरण की पुष्टि करते थे।

अंत में, फेनोटाइप को चयन के साथ टीएपी मीडिया में ट्रांसफार्मर को बढ़ाकर और प्रतिदीप्ति को मापने की पुष्टि की गई थी। इसकी तुलना जंगली प्रकार के सी वल्गरिस से की गई थी। क्लोरोफिल की पृष्ठभूमि अवशोषण/ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण, प्रतिदीप्ति की तुलना डेटा को जंगली प्रकार के तनाव में सामान्य करके की गई थी। चित्रा 3 ए में, यह ट्रांसफार्मर और जंगली प्रकार सी वल्गरिस के बीच वृद्धि में एक उल्लेखनीय अंतर है कि देखा जा सकता है. यह संभावित रूप से जीनोम में टी-डीएनए के कई यादृच्छिक एकीकरण के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जो अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है और धीमी वृद्धि के लिए अग्रणी हो सकता है। बहरहाल, चित्रा 3 बी कम वृद्धि के बावजूद, चयनित उपभेदों के सभी सेल घनत्व के लिए सामान्यीकृत जब उच्च प्रतिदीप्ति स्तर का प्रदर्शन पर प्रकाश डाला गया. विशेष रूप से, तनाव # 70 ने < 0.01 के पी-मान के साथ दूसरों की तुलना में काफी अधिक प्रतिदीप्ति स्तर का प्रदर्शन किया। यह ट्रांसफार्मर की पहचान करने के लिए कई कॉलोनियों की स्क्रीनिंग के महत्व पर जोर देता है जो समग्र विकास व्यवहार को नकारात्मक रूप से प्रभावित किए बिना वांछित प्रोटीन व्यक्त करते हैं।

mGFP5-6xHis की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए, SDS-PAGE दोनों सी से कच्चे प्रोटीन निकालने और उसके टैग शुद्ध प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. vulgaris (WT) और सी. vulgaris ट्रांसफार्मर (#50). इसके बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल18 के बाद नी-एनटीए राल गुरुत्वाकर्षण प्रवाह किट का उपयोग करके उसका टैग प्रोटीन शुद्धि किया गया था। चित्रा 4 ट्रांसफार्मर नमूना # 50 में mGFP5-6xHis प्रोटीन (~ 30 केडीए) की उपस्थिति और नकारात्मक नियंत्रण (डब्ल्यूटी सी वल्गरिस) में कोई प्रोटीन से पता चलता है.

Figure 1
चित्रा 1: एएमटी के बाद सी वल्गरिस ट्रांसफार्मर की वसूली। (ए) सी वल्गरिस की सह-खेती के बाद, ट्रांसफार्मरएस एजीएल -1 होते हैं जिसमें पीकैंबिया प्लास्मिड होता है या चयनात्मक प्लेटों पर प्लास्मिड (एजीएल -1 केवल) के बिना। (बी) चयनात्मक टीएपी अगर पर हाइग्रोमाइसिन बी (20 मिलीग्राम / एल) प्लेटों से चुनी गई एकल कॉलोनियों को फिर से लकीर दी गई। (सी) बच गई कॉलोनियों में हाइग्रोमाइसिन बी (20 मिलीग्राम / एल) तरल मीडिया पर एजीएल 1 केवल प्लेट से वृद्धि की कमी है। (डी) हाइग्रोमाइसिन और जंगली प्रकार के सी वल्गरिस युक्त तरल टीएपी मीडिया में उगाए गए हाइग्रोमाइसिन चयन प्लेटों से एकल कालोनियों # 25, # 50, और # 50 का विकास जो हाइग्रोमाइसिन मीडिया में नहीं बढ़ सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: pCAMBIA1302 संदूषण का पता लगाना। (ए) ट्रांसफार्मर (बी) में टी-डीएनए का एकीकरण और ए. ट्यूमेफेशियन्स संदूषण (सी) का पता लगाना। WT जंगली प्रकार के C वल्गरिस, PC सकारात्मक नियंत्रण (pCAMBIA1302) को इंगित करता है और AGL1 A. tumefaceians AGL1 तनाव को इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विकास और 3 दिनों के बाद टीकाकरण में ट्रांसफार्मर की प्रतिदीप्ति। (ए) 680 एनएम पर अवशोषण द्वारा मापा के रूप में विकास. (बी)प्रतिदीप्ति जंगली प्रकार तनाव के लिए सामान्यीकृत. 3-4 जैविक प्रतिकृतियों का औसत, त्रुटि पट्टियाँ 1 σ *p < 0.05, **p < 0.01 का प्रतिनिधित्व करती हैं जब जंगली प्रकार (WT) की तुलना में। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एमजीएफपी 5-6 का एसडीएस-पेज विश्लेषणसी वल्गरिस (डब्ल्यूटी) में उनकी अभिव्यक्ति और रूपांतरित सी. वल्गरिस नमूना #50। अर्क क्रमशः सी. वल्गरिस (WT), लेन 1-4 से कच्चे, शुद्ध (पहले धोने), शुद्ध (पतला), और शुद्ध (केंद्रित) से तैयार किए गए थे। क्रूड, शुद्ध (पहला धोने), शुद्ध (एल्यूटेड), और शुद्ध (lyophilized) से सी. वल्गरिस (WT), लेन 5-8, क्रमशः। लाल बॉक्स ट्रांसफार्मर से शुद्ध GFP-6xHis प्रोटीन इंगित करता है #70. प्रोटीन को पॉलीक्रिलामाइड 12% जेल पर अलग किया गया था। प्रोटीन मानकों (एसटीडी) के आणविक भार (मेगावाट) को दाईं ओर दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मीडिया/बफर का नाम संयोजन
एलबी 5 ग्राम/एल खमीर निकालने, 10 ग्राम/एल ट्रिप्टोन, 5 ग्राम/एल एनएसीएल
नल 20 एमएम ट्रिस बेस, 1.58 एमएम के 2 एचपीओ 4, 2.4 एमएम केएच 2 पीओ 4, 7.0 एमएम एनएच 4 सीएल, 0.83 एमएम एमजीएसओ 4, 0.34 एमएम सीएसीएल 2, 1 एमएल/एल ग्लेशियल एसिटिक एसिड, और प्रत्येक एफ/2 मध्यम ट्रेस धातुओं और एफ/2विटामिन के 1 एमएल/एल
F/2 मध्यम ट्रेस धातु 22 मिलीग्राम/एल जेडएनएसओ 4·7एच 2 हे, 180 मिलीग्राम/एल एमएनसीएल 2·4एच 2 ओ, 6.3 मिलीग्राम/एल ना 2 एमओओ 4·2एच 2 ओ, 14 मिलीग्राम/एल सीओसीएल 2·6एच 2 ओ, 9.8 मिलीग्राम/एल सीयूएसओ 4·5एच 2 हे, 3.15 ग्राम/एल एफईसीएल3·6एच 2 ओ, 4.36 ग्राम/एल ना 2 ईडीटीए·2एच 2 ओ
F/2 मध्यम विटामिन 0.1 मिमी विटामिन बी 12 (सायनोकोबालामिन), 25 मिलीग्राम / एल बायोटिन, 335 मिलीग्राम / एल थियामिन, 50 मिमी एचईपीएस बफर पीएच 7.8
लाइसिस बफर 20 मिमी ना2एचपीओ 4, 300 मिमी NaCl, पीएच7.4

तालिका 1: मीडिया और बफर व्यंजनों.

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Discussion

परिवर्तन की दक्षता कई अलग-अलग मापदंडों से जुड़ी है। एएमटी के लिए उपयोग किए जाने वाले ए ट्यूमेफेशियन्स उपभेदों का विकल्प महत्वपूर्ण है। एजीएल -1 खोजे गए सबसे आक्रामक उपभेदों में से एक है और इस कारण से, नियमित रूप से संयंत्र एएमटी में उपयोग किया जाता है। ग्लूकोज के साथ प्रेरण मीडिया का पूरक (15-20 मिमी) एएमटी दक्षता के लिए भी महत्वपूर्ण है। वल्गरिस फोटोट्रॉफिक और हेटरोट्रॉफ़िक दोनों स्थितियों में बढ़ सकते हैं, ग्लूकोज या अन्य कार्बन स्रोतों को अक्सर संदूषण को रोकने के लिए माइक्रोएल्गे मीडिया से छोड़ दिया जाता है। उदाहरण के लिए, बोल्ड का बेसल माध्यम (बीबीएम) फोटोट्रॉफिक खेती के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला मीडिया है सी। हालांकि, बीबीएम ए का समर्थन नहीं करता है एक कार्बनिक कार्बन स्रोत और अमोनियम की कमी के कारण नाइट्रोजन स्रोत के रूप में यह पसंद करता है (बीबीएम नाइट्रेट का उपयोग करता है)20. इसलिए, इस काम में टीएपी मीडिया का उपयोग किया गया था क्योंकि इसमें सी वल्गरिस के लिए कार्बन स्रोत के रूप में एसीटेट, ए ट्यूमेफेशियन्स के लिए ग्लूकोज और नाइट्रोजन स्रोत के रूप में अमोनियम दोनों प्रजातियां उपयोग कर सकती हैं। टीएपी अगर प्लेटें भी सी वल्गरिस के लिए बहुत तेजी से विकास दर की अनुमति देती हैं, एएमटी के बाद ट्रांसफार्मर को पुनर्प्राप्त करने के लिए समय को कम करती हैं। टीआई-प्लास्मिड विषाणु प्रोटीन को प्रेरित करने के लिए, एसिटोसिरिंजोन के 200 माइक्रोन को प्रेरण मीडिया में भी जोड़ा जाना चाहिए।

एएमटी के बाद संस्कृति से ए ट्यूमेफेशियन्स को खत्म करने के लिए, सीरियल पासिंग के साथ सेफोटैक्सिम का उपयोग किया गया था। एजीएल -1 एम्पीसिलीन, क्लोरैम्फेनिकॉल, रिफामाइसिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के लिए प्रतिरोधी है, और यह सेफोटैक्सिम, टेट्रासाइक्लिन, स्पेक्टिनोमाइसिन और केनामाइसिन के प्रति संवेदनशील है। पौधों में, cefotaxime अक्सर ए को खत्म करने के लिए प्रयोग किया जाता है. tumefaceions क्योंकि यह अन्य एंटीबायोटिक दवाओं21 की तुलना में कई पौधों की प्रजातियों में शूट पुनर्जनन के लिए एक कम फाइटोटॉक्सिक प्रभाव है. हालांकि, हमने यह भी पुष्टि की कि टेट्रासाइक्लिन (जिसकी लागत लगभग 100 गुना कम है) का उपयोग इस प्रोटोकॉल में सेफोटैक्सिम के बजाय किया जा सकता है जब एक एकल कॉलोनी से सीरियल पासिंग के साथ जोड़ा जाता है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। यह संभावना है क्योंकि टेट्रासाइक्लिन जैसे एंटीबायोटिक्स पौधों में क्लोरोप्लास्ट में प्रोटीन संश्लेषण को रोकेंगे जो प्रकाश संश्लेषण पर निर्भर हैं22. हालांकि, सी. वल्गरिस एसीटेट के साथ पूरक होने पर अंधेरे में बढ़ सकता है, जिसका अर्थ है कि क्लोरोप्लास्ट डिसफंक्शन सावधानी से चुनी गई परिस्थितियों में इस प्रजाति के लिए जरूरी नहीं है।

हालांकि हाइग्रोमाइसिन बी का 20 मिलीग्राम / एल जंगली प्रकार सी वल्गरिस के विकास को रोकने के लिए पर्याप्त था, हाइग्रोमाइसिन बी सांद्रता (20-70 मिलीग्राम / एल) की एक श्रृंखला का परीक्षण किया गया था। यह उच्च एकाग्रता प्लेटों से अलग कालोनियों टी डीएनए के कई एकीकृत प्रतियां हो सकता है कि संभव है या टी डीएनए जीनोम के एक अधिक transcriptionally सक्रिय क्षेत्र में जिसके परिणामस्वरूप Hygromycin बी phosphotransferase की उच्च अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप तेजी से निष्क्रियता शाकनाशी और संस्कृति विकास23 में कम अंतराल समय में स्थित है. एकाधिक प्रतियां पीसीआर उत्पादों की तीव्रता में अंतर का कारण हो सकता है जब जीनोम(चित्रा 2बी)से mgfp5 प्रवर्धन. एसडीएस-पेज विश्लेषण (चित्रा 4, लेन 8) के दौरान शुद्ध नमूने में जीएफपी -6 एक्स प्रोटीन की उपस्थिति और जंगली प्रकार के तनाव (चित्रा 4, लेन 4) में इसकी अनुपस्थिति पुष्टि करती है कि एएमटी और पीकैम्बिया1302 का उपयोग सफल अभिव्यक्ति और स्थिर एकीकरण के लिए किया जा सकता है सी।

इस काम में, हमने ए ट्यूमेफेशियन्स एजीएल -1 और एक पीसीएबीआईए सिस्टम प्लास्मिड का उपयोग करके विश्वसनीय सी वल्गारिस यूटीएक्स 395 परिवर्तन के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित किया। चूंकि इस काम के लिए आवश्यक सभी उपभेद और प्लास्मिड कई अलग-अलग स्रोतों से उपलब्ध हैं, इसलिए इस विधि को किसी भी प्रयोगशाला में दोहराना आसान होगा। सूक्ष्मजीव के सबसे महत्वपूर्ण औद्योगिक उपभेदों में से एक के रूप में, विश्वसनीय एएमटी के लिए एक मानक संदर्भ विधि जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए इंजीनियरिंग सी वल्गरिस के लिए महत्वपूर्ण होगी।

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Disclosures

हितों के टकराव की घोषणा नहीं की गई थी।

Acknowledgments

लेखक प्रोफेसर पॉल होयकास को धन्यवाद देना चाहते हैं कि उन्होंने नीदरलैंड के लीडेन विश्वविद्यालय के जीवविज्ञान संस्थान लीडेन से pCAMBIA1302 वेक्टर और एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स AGL1 प्रदान किया। लेखक फ्लोरोसेंट ट्रांसफार्मर को बढ़ाने में उनकी मदद के लिए ईवा कोलिक को भी धन्यवाद देना चाहेंगे। इस काम को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद और मिताक्स एक्सेलरेट कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Kb Plus DNA ladder FroggaBio DM015
Acetosyringone Fisher Scientific D26665G
Agrobacterium tumefaciens Gold Biotechnologies Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin Enzo Life Sciences 89151-400
CaCl2·2H2O VWR BDH9224-1KG
Cefotaxime AK Scientific J90010
Chlorella vulgaris University of Texas at Austin Culture Collection of Algae Strain: UTEX 395 Wildtype strain
CoCl2·6H2O Sigma Aldrich C8661-25G
CuSO4·5H2O EMD Millipore CX2185-1
FeCl3·6H2O VWR BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator Bio-Rad 1652662 Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit Thermo Scientific K0791
Glacial acetic acid VWR CABDH3093-2.2P
Glycerol BioBasic GB0232
HEPES Buffer Sigma Aldrich H-3375
Hygromycin B Fisher Scientific AAJ6068103
K2HPO4 VWR BDH9266-500G
Kanamycin Gold Biotechnologies K-250-25
KH2PO4 VWR BDH9268-500G
MgSO4·7H2O VWR 97062-134
MnCl2·4H2O JT Baker BAKR2540-01
Na2CO3 VWR BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O JT Baker 8993-01
Na2MoO4·2H2O JT Baker BAKR3764-01
NaCl VWR BDH7257-7
NaH2PO4 H2O Millipore Sigma CA80058-650
NaNO3  VWR BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin NewEngland BioLabs NEB #S1427
NH4Cl VWR BDH9208-500G
pCAMBIA1302 Leiden University Gift from Prof. Paul Hooykaas pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL) QIAGEN 34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL Bio-Rad 1610363
Rifampicin Millipore Sigma R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch  SunBlaster 210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer  BioTEK S4MLFPTA
Tetracycline Thermo Scientific Chemicals CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% Bio-Rad 1610185
Thiamine TCI America T0181-100G
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Tryptone BioBasic TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin) Enzo Life Sciences 89151-436
Yeast Extract BioBasic G0961
ZnSO4·7H2O JT Baker 4382-01

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References

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Roushan, M. R., Chen, C., Ahmadi, P., Ward, V. C. A. Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris. J. Vis. Exp. (200), e65382, doi:10.3791/65382 (2023).

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