Summary
Questo protocollo delinea l'utilizzo della trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens (AMT) per l'integrazione di geni di interesse nel genoma nucleare della microalga verde Chlorella vulgaris, portando alla produzione di trasformanti stabili.
Abstract
La trasformazione mediata dall'Agrobacterium tumefaciens (AMT) funge da strumento ampiamente utilizzato per manipolare i genomi delle piante. Tuttavia, A. tumefaciens mostra la capacità di trasferimento genico a una vasta gamma di specie. Numerose specie di microalghe non dispongono di metodi consolidati per integrare in modo affidabile i geni di interesse nel loro genoma nucleare. Per sfruttare i potenziali benefici della biotecnologia delle microalghe, sono fondamentali strumenti di manipolazione del genoma semplici ed efficienti. In questo articolo, viene presentato un protocollo AMT ottimizzato per la specie di microalghe industriali Chlorella vulgaris, utilizzando la proteina fluorescente verde reporter (mGFP5) e il marcatore di resistenza agli antibiotici per l'igromicina B. I mutanti sono selezionati attraverso la placcatura su terreni Tris-Acetato-Fosfato (TAP) contenenti igromicina B e cefotaxima. L'espressione di mGFP5 è quantificata tramite fluorescenza dopo oltre dieci generazioni di subcoltura, indicando la trasformazione stabile della cassetta T-DNA. Questo protocollo consente la generazione affidabile di più colonie transgeniche di C. vulgaris in meno di due settimane, impiegando il vettore di espressione vegetale pCAMBIA1302 disponibile in commercio.
Introduction
L'Agrobacterium tumefaciens, un batterio gram-negativo trasmesso dal suolo, possiede una capacità unica di trasferimento genico tra regni, che gli è valsa il titolo di "ingegnere genetico naturale"1. Questo batterio può trasferire il DNA (T-DNA) da un plasmide che induce il tumore (Ti-Plasmide) nelle cellule ospiti attraverso un sistema di secrezione di tipo IV, con conseguente integrazione ed espressione del T-DNA all'interno del genoma ospite 1,2,3,4. Nell'ambiente naturale, questo processo porta alla formazione di tumori nelle piante, comunemente noti come malattia della galla della corona. Tuttavia, l'Agrobacterium può anche trasferire il T-DNA in vari altri organismi, tra cui lieviti, funghi, alghe, embrioni di ricci di mare e persino cellule umane in condizioni di laboratorio 5,6,7,8.
Sfruttando questo sistema naturale, la trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens (AMT) consente l'integrazione casuale di geni di interesse nel genoma nucleare di una cellula ospite modificando la regione T-DNA del plasmide Ti. A questo scopo, un vettore di espressione delle piante AMT ampiamente utilizzato è pCAMBIA13029. I ricercatori possono utilizzare semplici flussi di lavoro di clonazione in E. coli prima di trasferire il vettore desiderato in A. tumefaciens per il successivo trasferimento all'ospite di interesse.
Le microalghe verdi sono eucarioti che condividono molte somiglianze con le piante terrestri, ma sono altamente recalcitranti alla modificazione genetica. Tuttavia, la trasformazione genetica svolge un ruolo cruciale sia nella ricerca di base che in quella biotecnologica delle microalghe. In diverse specie di microalghe, in particolare Chlamydomonas reinhardtii, la trasformazione genetica tramite AMT ha introdotto con successo transgeni come l'interleuchina-2 umana (hIL-2), il dominio legante il recettore 2 del coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2 RBD) e due peptidi antimicrobici (AMP)10,11,12,13. Tra queste, la Chlorella vulgaris, una specie di alga verde meno esigente e a crescita rapida, ha un potenziale significativo per la produzione sostenibile di carboidrati, proteine, nutraceutici, pigmenti e altri composti di alto valore14. Tuttavia, la mancanza di strumenti affidabili per la creazione di ceppi transgenici di C. vulgaris ostacola il suo progresso commerciale. Poiché è stato pubblicato solo un numero limitato di lavori che utilizzano AMT in C. vulgaris15, e date le notevoli differenze tra la coltivazione di piante e microalghe, l'ottimizzazione del protocollo AMT diventa essenziale.
In questo studio, i ricercatori hanno inserito la proteina fluorescente verde (mGFP5) a valle del promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore (CamV) e hanno aggiunto un tag di istidina per utilizzarlo come gene reporter per l'espressione proteica. I trasformanti sono stati selezionati utilizzando l'igromicina B e, dopo la subcoltura per oltre venti generazioni, la trasformazione è rimasta stabile. Il plasmide pCAMBIA1302 impiegato in questo lavoro può essere facilmente adattato per contenere qualsiasi gene di interesse. Inoltre, il metodo e i materiali presentati possono essere adattati per altre specie di alghe verdi con un promotore attivo CamV35S, poiché questo promotore viene utilizzato per la selezione dell'igromicina.
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Protocol
Tutti i terreni e le soluzioni devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso, salvo diversa indicazione. Tutte le provette da centrifuga, i puntali delle pipette, ecc., devono essere sterili o sterilizzati in autoclave prima dell'uso. Per una facile consultazione, le ricette dei terreni utilizzati in questo protocollo sono elencate nella Tabella 1.
1. Preparazione di cellule elettrocompetenti di A. tumefaciens
- Inoculare Agrobacterium (AGL-1) in un matraccio sterile da 25 mL di terreno LB (integrato con rifampicina, 20 mg/L-1) da una scorta di glicerolo congelato e far crescere per una notte a 28-30 °C e 150 giri/min.
NOTA: Il ceppo di Agrobacterium AGL-1 è (vedi Tabella dei materiali) resistente alla rifampicina, all'ampicillina, al cloramfenicolo e alla streptomicina e può essere ottenuto da diversi fornitori. - Il giorno seguente, diluire la coltura di 1.00.000 volte aggiungendo 0,5 μL di coltura notturna a 50 mL di acqua ultrapura sterilizzata in autoclave e spargere 10 μL di questa coltura diluita su una piastra LB, quindi incubare a 28-30 °C per 1-3 giorni.
- Prelevare una colonia e iniziare una coltura notturna da 20 mL in LB con rifampicina a 28-30 °C.
- Il giorno successivo, inoculare 500 mL di terreno LB (senza antibiotico) in un matraccio con 9 mL di coltura notturna e far crescere a 28-30 °C fino a quando l'OD600 raggiunge 0,5.
- Dividere uniformemente la coltura in dieci provette da centrifuga da 50 ml e raffreddare su ghiaccio per 30 minuti. Preraffreddare la centrifuga a 4 °C.
- Centrifugare le provette a 4 °C e 4000 x g per 15 min. Successivamente, rimuovere quanto più surnatante possibile utilizzando una pipetta e risospendere il pellet in ciascuna provetta in 50 mL di acqua ghiacciata.
- Centrifugare le cellule a 4 °C e 4000 x g per 15 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 25 mL di acqua ghiacciata in ogni provetta.
- Centrifugare le cellule a 4 °C e 4000 x g per 15 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di glicerolo ghiacciato al 10% (p/v) in ciascuna provetta.
- Unire tutte le provette in un'unica provetta da 50 mL e centrifugare le cellule a 4 °C e 4000 x g per 15 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 400 μL di glicerolo ghiacciato al 10% (p/v). La concentrazione cellulare dovrebbe essere di circa 1-3 x 1010 cellule/mL.
- Distribuire le cellule come aliquote da 50 μL in microprovette sterili preraffreddate. Congelare in azoto liquido e conservare in congelatore a -80 °C.
2. Elettroporazione di A. tumefaciens
- Aggiungere 50 μL di celle elettrocompetenti AGL-1 A. tumefaciens in una cuvetta preraffreddata da 0,1 mm e aggiungere 2 μL di pCAMBIA1302 o plasmide simile (conc 15 ng/μL) (vedere la tabella dei materiali).
- Elettroporare a 2400 V utilizzando un elettroporatore (200 Ω, estensore di capacità 250 μFD, capacità 25 μFD, decadimento esponenziale, vedi Tabella dei materiali). La costante di tempo dovrebbe essere >4,5 ms per un'elettroporazione di successo con decadimento esponenziale.
- Aggiungere immediatamente 1 mL di terreno LB alla cuvetta e pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Trasferire 1 mL di cellule risospese in una microprovetta da 1,5 mL e incubarla a 28-30 °C per almeno 1 ora per recuperare.
- Placcare le cellule su LB agar contenente l'antibiotico appropriato (cioè 50 mg/L di kanamicina per pCAMBIA1302 per la selezione procariotica).
- Incubare a 28-30 °C per 2-3 giorni.
- Selezionare una colonia, coltivare per una notte in LB con la selezione appropriata (50 mg/L di kanamicina per pCAMBIA1302) e crioconservare il ceppo contenente plasmidi utilizzando glicerolo al 50% a -80 °C per un uso futuro.
3. AMT di C. vulgaris
NOTA: Preparare le colture di C. vulgaris (UTEX 395, vedi Tabella dei materiali) e A. tumefaciens in parallelo per la co-coltivazione. Le colture di C. vulgaridevono essere iniziate 3 giorni prima di preparare le colture di A. tumefaciens. Il protocollo è stato modificato sulla base di quello pubblicato da Kumar et al.7.
- Preparare la coltura di C. vulgaris
- C. vulgaris è tradizionalmente conservato in pendenza o mantenuto in colture in fase logaritmica in condizioni di illuminazione. Da una coltura in fase logaritmica a OD600 = 1,0, distribuire 0,5 mL su piastre di agar tris-acetato-fosfato (TAP, vedere tabella 1) ( 1,2% p/v agar A) e far crescere per 5 giorni a 25 °C con illuminazione (50 μE/m2s). In questo modo si otterranno circa 5 x 106 celle.
- Preparare la coltura di A. tumefaciens
- Coltivare il ceppo A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 in un pallone agitatore inoculando 10 mL di terreno LB integrato con 15 mM di glucosio, 20 mg/L di rifampicina e 50 mg/L di kanamicina (vedi Tabella dei materiali) utilizzando la scorta di glicerolo. Incubare a 28-30 °C e 250 rpm per una notte.
- Inoculare 1 mL di coltura notturna in 50 mL di LB con 15 mM di glucosio, 20 mg/L di rifampicina e 50 mg/L di kanamicina e incubare a 28-30 °C e 250 rpm fino a quando l'OD600 raggiunge 1,0.
- Cocoltivare C. vulgaris e A. tumefaciens
- Per preparare la coltura di A. tumefaciens per la co-coltivazione, trasferire la coltura coltivata in una provetta da 50 ml e centrifugare a 4000 x g per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta e lavare le cellule due volte con il mezzo di induzione.
NOTA: Il terreno di induzione utilizzato è un terreno TAP regolato a pH 5,5 e integrato con metalli in tracce e vitamine F/2 con acetosiringone da 200 μM (AS, vedere la tabella dei materiali). Risospendere le cellule in un terreno di induzione in modo tale che OD600 = 0,5. - Per preparare la coltura di C. vulgaris per la co-coltivazione, aggiungere 25 mL di terreno di induzione alla piastra di C. vulgaris contenente ~ 5 x 106 cellule. Trasferire in una provetta da 50 ml. Centrifugare le cellule a 4000 x g per 15 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
- Miscelare il pellet di cellule algali con 200 μL di sospensione batterica (OD600: 0,5) e incubarli in un agitatore rotante a 21-25 °C a 150 giri/min per 1 ora.
- Distribuire la coltura mista (200 μL) su piastre di terreno di induzione integrate con glucosio 15 mM e incubare a 21-25 °C al buio per 3 giorni.
- Dopo 3 giorni, utilizzare 10 mL di terreno TAP integrato con 400 mg/L di cefotaxima o 20 mg/L di tetraciclina (vedi Tabella dei Materiali) per raccogliere le microalghe e incubare al buio a 21-25 °C per 2 giorni per eliminare A. tumefaciens dalla coltura.
- Piastra 500 μL della coltura su terreni selettivi, ad es. terreni TAP integrati con 20-70 mg/L di Igromicina B (quando si utilizza pCAMBIA1302) e 400 mg/L-1 cefotaxima o 20 mg/L di tetraciclina. Incubare a 21-25 °C al buio per 2 giorni prima di metterli in una camera illuminata.
NOTA: Le colonie resistenti appariranno 5-7 giorni dopo l'esposizione alla luce. - Prelevare singole colonie dalla piastra di trasformazione e ri-striarle su piastre di agar TAP integrate con 400 mg/L di cefotaxima o 20 mg/L di tetraciclina e 20-70 mg/L di igromicina B.
- Per preparare la coltura di A. tumefaciens per la co-coltivazione, trasferire la coltura coltivata in una provetta da 50 ml e centrifugare a 4000 x g per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta e lavare le cellule due volte con il mezzo di induzione.
4. PCR di colonia (cPCR) per confermare l'integrazione genica nei trasformanti di C. vulgaris
- Estrarre il DNA genomico da un trasformante di C. vulgaris dopo aver subcolturato almeno due volte da una singola colonia utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico vegetale (vedi Tabella dei materiali). Usando questo come modello per la PCR, progetta primer per la regione mgfp5 del T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' e M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
- Utilizzando un kit di master mix di DNA polimerasi ad alta fedeltà Q5 (vedere la tabella dei materiali), eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) per convalidare l'integrazione del transgene.
NOTA: Per il presente studio sono state utilizzate le seguenti condizioni: 98 °C per 3 min; 35 cicli (98 °C per 10 s, 57 °C per 30 s, 72 °C per 1 min); 72 °C per 5min. Utilizzare pCAMBIA1302 come controllo positivo e DNA genomico di C. vulgaris wild-type come controllo negativo.
- Utilizzando un kit di master mix di DNA polimerasi ad alta fedeltà Q5 (vedere la tabella dei materiali), eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) per convalidare l'integrazione del transgene.
- Per confermare che non è presente pCAMBIA1302 nel campione a causa della contaminazione residua da A. tumefaciens, utilizzare la PCR di colonia. Aggiungere una piccola quantità di cellule trasformanti a 10 μL di acqua sterile e far bollire a 98 °C per 15 minuti. Usalo come modello per la PCR.
- Progettare primer per una regione al di fuori del T-DNA su pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' e B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
NOTA: Per il presente studio sono state utilizzate le seguenti condizioni: 94 °C per 3 minuti; 30 cicli (94 °C per 30 s, 48 °C per 30 s, 68 °C per 5 min); 68 °C per 7 min. Utilizzare una colonia bollita di A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) come controllo positivo e una colonia bollita di C. vulgaris selvatico come controllo negativo.
- Progettare primer per una regione al di fuori del T-DNA su pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' e B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
- Per confermare che non vi sia contaminazione da A. tumerfaciens presente nel campione, utilizzare la PCR di colonia. Aggiungere una piccola quantità di cellule trasformanti a 10 μL di acqua sterile e far bollire a 98 °C per 15 minuti. Usalo come modello per la PCR.
- Progettare primer per il gene virE2 contenuto nel plasmide di virulenza AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' e virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
NOTA: Per il presente studio sono state utilizzate le seguenti condizioni: 94 °C per 3 minuti; 30 cicli (94 °C per 30 s, 53 °C per 30 s, 68 °C per 3 min); 68 °C per 7 min. Utilizzare una colonia bollita di A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) come controllo positivo e una colonia bollita di C. vulgaris selvatico come controllo negativo.
- Progettare primer per il gene virE2 contenuto nel plasmide di virulenza AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' e virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
- Eseguire campioni di PCR su un gel di agarosio di DNA insieme a una scala (scala di DNA da 1 Kbp, vedere la tabella dei materiali) per confermare le dimensioni dei frammenti risultanti16.
5. Misurazione della fluorescenza dei trasformanti
- Inoculare ciascun trasformante da una coltura di mantenimento in fase logaritmica o da un agar TAP inclinato in 50 mL di TAP integrato con 200 mg/L-1 di cefotaxima e 25 mg/L-1 di igromicina B in modo tale che il OD iniziale600 = 0,1. Inoculare una coltura con C. vulgaris wild-type e solo 200 mg/L-1 di cefotaxima come controllo negativo. Incubare a 25 °C a 150 giri/min con 150 μmol/m2s di luce fotosinteticamente attiva (vedi Tabella dei materiali).
- Ogni 24 ore, prelevare un campione di 300 μL e misurare l'assorbanza e la fluorescenza (eccitazione 488 nm, emissione 526 nm) in un lettore di piastre a 96 pozzetti o in uno spettrometro UV/Vis e fluorimetro (vedere la tabella dei materiali). Utilizzare una piastra nera con fondo trasparente per misurazioni simultanee.
6. Estrazione di proteine grezze, purificazione di proteine ed elettroforesi SDS-PAGE
- Inoculare il trasformante (#50) da una coltura di mantenimento in fase logaritmica in 300 mL di TAP integrato con 200 mg/L-1 di cefotaxima e 25 mg/L-1 di igromicina B per raggiungere l'OD680 = 0,1. Inoculare una coltura con C. vulgaris wild-type e solo 200 mg/L-1 di cefotaxima come controllo negativo. Incubare a 25 °C a 150 rpm con 150 μmol/m2s di luce fotosinteticamente attiva.
- Estrarre il campione di proteina grezza dal trasformante (#50) e dai ceppi wild-type utilizzando un tampone di lisi da 5 mL (vedere la Tabella 1), seguito da sonicazione per 4 minuti.
- Purificare il campione di proteina grezza con una resina Ni-NTA attraverso colonne di polipropilene da 5 mL (vedi Tabella dei materiali).
- Liofilizzare i campioni proteici purificati da 15 mL e risospenderli in un tampone di lisi da 1 mL per l'analisi SDS-PAGE17.
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Representative Results
Per dimostrare il successo della trasformazione utilizzando il metodo di cui sopra, C. vulgaris è stato co-coltivato con AGL-1 contenente il plasmide pCAMBIA1302 o senza il plasmide (wild-type e placcato su agar TAP integrato con igromicina B e cefotaxima (Figura 1A). La placca più a sinistra mostra le colonie trasformate in grado di crescere sulle piastre di igromicina B/cefotaxima, mentre la placca centrale mostra che l'AGL-1 wild-type non può crescere sulle piastre di igromicina B/cefotaxima. La piastra più a destra mostra che quando non viene utilizzata alcuna selezione (solo cefotaxima), i trasformatori di C. vulgaris e wild-type possono crescere. Le singole colonie sono state striate sull'agar TAP con igromicina B e cefotaxima (Figura 1B). Le colonie sfuggite dalla piastra più a destra (Figura 1B) sono state inoculate sul liquido TAP con igromicina B e cefotaxima (Figura 1C). A causa dei livelli di espressione variabili dopo l'integrazione casuale del T-DNA, i trasformanti sono stati originariamente recuperati su piastre con concentrazioni crescenti di igromicina B comprese tra 25 e 70 mg/L. Una colonia di ciascuna piastra è stata coltivata in terreni TAP liquidi contenenti la stessa concentrazione di Igromicina B insieme al C . vulgaris wild-type alla concentrazione più bassa (Figura 1D). Il C. vulgaris wild-type non può crescere in presenza di Igromicina, mentre sono state ottenute colonie resistenti fino a 70 mg/L.
Per confermare che la cassetta del T-DNA era stabilmente integrata nel genoma di C. vulgaris, una colonia selezionata da ciascuna delle piastre di igromicina B da 20, 25, 30, 50 e 70 mg/L è stata sottocoltivata mediante striature ripetute su piastre di agar TAP con selezione due volte e poi sottocoltivata di routine in terreni TAP per oltre dieci volte. denominati rispettivamente trasformante #20, #25, #30, #50, #50 e #70. Utilizzando queste colture, è stata eseguita sia la PCR di colonia per escludere la contaminazione da pCAMBIA1302 in AGL1, sia il DNA genomico è stato estratto per confermare che il gene mGFP5 era presente nel genoma di C. vulgaris. Nella Figura 2A, la PCR delle colonie è stata eseguita utilizzando primer mirati a una regione di 5 kbp al di fuori dei bordi sinistro e destro del T-DNA sono stati in grado di amplificare questa regione dal plasmide pCAMBIA1302 come controllo positivo, ma questa regione non era presente in nessuno dei campioni di C. vulgaris , indicando che il DNA pCAMBIA1302 non era presente in nessuna delle colture. Il campione wild-type di C. vulgaris è stato utilizzato come controllo negativo e non è stata osservata alcuna amplificazione.
Il DNA genomico è stato estratto dai trasformanti #25, #50 e #70 ed è stata eseguita la PCR, amplificando una regione di 1763 bp contenente il gene mgfp5 del T-DNA per confermare l'integrazione nei trasformanti (Figura 2B). pCAMBIA1302 è stato utilizzato come controllo positivo e l'amplificazione è stata rilevata in tutti i trasformanti, indicando che il gene mgfp5 era presente in tutto il DNA genomico dei trasformatori. Il C. vulgaris selvatico è stato usato come controllo negativo e non è stata osservata alcuna amplificazione. La Figura 2C mostra l'amplificazione di un frammento di 600 bp della proteina di virulenza E2 (VirE2) che si trova nel plasmide che induce il tumore (plasmide Ti) del ceppo AGl1. Il controllo positivo, costituito dal ceppo AGl1 contenente pCAMIA1302, è stato amplificato con successo con primer, indicando la presenza di A. tumefaciens nel campione. Tuttavia, tutti i campioni di C. vulgaris sono risultati negativi per questa regione, indicando che la subcoltura ripetuta con cefotaxima ha eliminato con successo la contaminazione di AGL1 dalla coltura. Il campione wild-type di C. vulgaris è stato utilizzato come controllo negativo e non è stata osservata alcuna amplificazione. Presi insieme, questi tre test confermano che il T-DNA contenente mgpf5 è stato inserito nel genoma di C. vulgaris, e questi risultati non erano dovuti alla contaminazione di AGL1 nei campioni né alla presenza di pCAMBIA1302 nelle cellule. Questi risultati sono stati ripetuti dopo 20 e circa 100 sottocolture dei trasformanti, confermando l'integrazione a lungo termine del T-DNA nel genoma.
Infine, il fenotipo è stato confermato facendo crescere i trasformanti in terreni TAP con selezione e misurando la fluorescenza. Questo è stato confrontato con il C. vulgaris selvatico. A causa dell'assorbanza di fondo/autofluorescenza della clorofilla, la fluorescenza è stata confrontata normalizzando i dati al ceppo wild-type. Nella Figura 3A, si può osservare che c'è una notevole differenza di crescita tra i trasformanti e il C. vulgaris wild-type. Ciò potrebbe potenzialmente essere attribuito alle molteplici integrazioni casuali del T-DNA nel genoma, che potrebbero avere un impatto su altri processi cellulari e portare a una crescita più lenta. Ciononostante, la Figura 3B evidenzia che, nonostante la crescita inferiore, tutti i ceppi selezionati mostrano livelli di fluorescenza più elevati quando normalizzati per la densità cellulare. In particolare, il ceppo #70 ha dimostrato livelli di fluorescenza significativamente più elevati rispetto agli altri, con un valore p di <0,01. Ciò sottolinea l'importanza di eseguire lo screening di numerose colonie per identificare i trasformanti che esprimono la proteina desiderata senza influire negativamente sul comportamento di crescita complessivo.
Per confermare l'espressione di mGFP5-6xHis, SDS-PAGE è stato utilizzato per analizzare l'estratto proteico grezzo e le proteine purificate his-tag sia da C. vulgaris (WT) che da C. vulgaris transformant (#50). Successivamente, la purificazione della proteina his-tag è stata effettuata utilizzando un kit di flusso a gravità di resina Ni-NTA seguendo il protocollo18 del produttore. La Figura 4 mostra la presenza della proteina mGFP5-6xHis (~30 kDa) nel campione trasformante #50 e nessuna proteina nel controllo negativo (WT C. vulgaris).
Figura 1: Recupero dei trasformanti di C. vulgaris dopo AMT. (A) Dopo la co-coltivazione di C. vulgaris, i trasformanti sono AGL-1 contenenti il plasmide pCAMBIA o senza il plasmide (solo AGL-1) su piastre selettive. (B) Singole colonie ristriate selezionate da piastre di igromicina B (20 mg/L) su agar TAP selettivo. (C) Le colonie sfuggite mancano di crescita dalla sola piastra AGL1 su terreno liquido di igromicina B (20 mg/L). (D) Crescita di singole colonie #25, #50 e #50 da piastre di selezione dell'igromicina cresciute in terreni TAP liquidi contenenti igromicina e C. vulgaris wild-type che non possono crescere in terreni igromicini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rilevamento della contaminazione da pCAMBIA1302. (A) Integrazione del T-DNA nei trasformanti (B) e rilevamento della contaminazione da A. tumefaciens (C). WT indica il ceppo wild-type di C. vulgaris, PC è il controllo positivo (pCAMBIA1302) e AGL1 indica il ceppo AGL1 di A. tumefaciens. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Crescita e fluorescenza dei trasformanti a 3 giorni dall'inoculazione. (A) Crescita misurata mediante assorbanza a 680 nm. (B) Fluorescenza normalizzata al ceppo wild-type. Media di 3-4 repliche biologiche, le barre di errore rappresentano 1 σ. *p < 0,05, **p < 0,01 rispetto al wild-type (WT). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi SDS-PAGE dell'espressione di mGFP5-6xHis in C. vulgaris (WT) e nel campione trasformato di C. vulgaris #50. Gli estratti sono stati preparati rispettivamente da C. vulgaris (WT), corsie 1-4 grezze, purificate (prima lavaggio), purificate (diluite) e purificate (concentrate). Grezzo, purificato (primo lavaggio), purificato (eluito) e purificato (liofilizzato) da C. vulgaris (WT), corsie 5-8, rispettivamente. Il riquadro rosso indica la proteina GFP-6xHis purificata dal trasformante #70. Le proteine sono state separate su un gel di poliacrilammide al 12%. I pesi molecolari (MW) degli standard proteici (Std.) sono mostrati a destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome del supporto/buffer | Composizione | ||
| LB | 5 g/L di estratto di lievito, 10 g/L di triptone, 5 g/L di NaCl | ||
| RUBINETTO | 20 mM Tris base, 1,58 mM K 2 HPO 4, 2,4 mM KH 2 PO 4, 7,0 mM NH 4 Cl, 0,83 mM MgSO4, 0,34 mM CaCl 2, 1 mL/L di acido acetico glaciale e 1 mL/L di ciascuno F/2 metalli in tracce medi e vitamine F/2 | ||
| F/2 metalli in tracce medi | 22 mg/L ZnSO 4·7H 2 O, 180 mg/L MnCl 2·4H 2 O, 6,3 mg/L Na 2 MoO 4·2H 2 O, 14 mg/L CoCl 2·6H 2 O, 9,8 mg/L CuSO 4·5H 2 O, 3,15 g/L FeCl3·6H 2 O, 4,36 g/L Na 2 EDTA·2H 2 O | ||
| F/2 vitamine medie | 0,1 mM di vitamina B12 (cianocobalamina), 25 mg/L di biotina, 335 mg/L di tiamina, 50 mM di tampone HEPES pH 7,8 | ||
| Tampone di lisi | 20 mM Na2HPO 4, 300 mM NaCl, pH7,4 | ||
Tabella 1: Ricette di supporti e buffer.
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Discussion
L'efficienza della trasformazione è associata a diversi parametri. La scelta dei ceppi di A. tumefaciens utilizzati per l'AMT è fondamentale. AGL-1 è uno dei ceppi più invasivi scoperti e, per questo motivo, è stato utilizzato abitualmente nell'AMT vegetale. Anche l'integrazione del mezzo di induzione con glucosio (15-20 mM) è importante per l'efficienza dell'AMT. Considerando che C. vulgaris può crescere sia in condizioni fototrofiche che eterotrofe, il glucosio o altre fonti di carbonio vengono spesso omesse dai terreni di microalghe per prevenire la contaminazione. Ad esempio, il terreno basale di Bold (BBM) è il terreno più comunemente usato per la coltivazione fototrofica di C. vulgaris19. Tuttavia, BBM non supporta la crescita di A. tumefaciens a causa della mancanza di una fonte di carbonio organico e di ammonio come fonte di azoto che preferisce (BBM utilizza nitrato)20. Pertanto, il terreno TAP è stato utilizzato in questo lavoro perché contiene acetato come fonte di carbonio per C. vulgaris, glucosio per A. tumefaciens e ammonio come fonte di azoto che entrambe le specie possono utilizzare. Le piastre di agar TAP consentono inoltre tassi di crescita molto più rapidi per C. vulgaris, riducendo al minimo il tempo necessario per recuperare i trasformanti dopo l'AMT. Per indurre le proteine di virulenza del plasmide di Ti, è necessario aggiungere anche 200 μM di acetosiringone al mezzo di induzione.
Per eliminare A. tumefaciens dalla coltura dopo AMT, è stata utilizzata la cefotaxima, insieme al passaggio seriale. AGL-1 è resistente all'ampicillina, al cloramfenicolo, alla rifamicina e alla streptomicina ed è sensibile alla cefotaxima, alla tetraciclina, alla spectinomicina e alla kanamicina. Nelle piante, la cefotaxima è spesso utilizzata per eliminare A. tumefaciens perché ha un effetto fitotossico inferiore per la rigenerazione dei germogli in molte specie vegetali rispetto ad altri antibiotici21. Tuttavia, abbiamo anche confermato che la tetraciclina (che costa circa 100 volte meno) potrebbe essere utilizzata al posto della cefotaxima in questo protocollo se combinata con il passaggio seriale da una singola colonia (dati non mostrati). Ciò è probabilmente dovuto al fatto che antibiotici come la tetraciclina inibirebbero la sintesi proteica nel cloroplasto nelle piante che dipendono dalla fotosintesi22. Tuttavia, C. vulgaris può crescere al buio se integrato con acetato, il che significa che la disfunzione dei cloroplasti non è necessariamente tossica per questa specie in condizioni accuratamente scelte.
Sebbene 20 mg/L di igromicina B fossero sufficienti per prevenire la crescita di C. vulgaris wild-type, è stato testato un intervallo di concentrazioni di igromicina B (20-70 mg/L). È possibile che le colonie isolate da piastre a concentrazione più elevata possano avere più copie integrate del T-DNA o che il T-DNA si trovi in una regione più trascrizionalmente attiva del genoma, con conseguente maggiore espressione dell'igromicina B fosfotransferasi, con conseguente inattivazione più rapida dell'erbicida e minor tempo di ritardo nella crescita della coltura23. Copie multiple potrebbero essere la ragione delle differenze nell'intensità dei prodotti PCR quando si amplifica mgfp5 dal genoma (Figura 2B). La presenza della proteina GFP-6xHis nel campione purificato durante l'analisi SDS-PAGE (Figura 4, Corsia 8) e la sua assenza nel ceppo wild-type (Figura 4, Corsia 4) confermano che AMT e pCAMBIA1302 possono essere utilizzati per un'espressione di successo e un'integrazione stabile del transgene in C. vulgaris.
In questo lavoro, abbiamo sviluppato e ottimizzato un protocollo per la trasformazione affidabile di C. vulgaris UTEX 395 utilizzando A. tumefaciens AGL-1 e un plasmide del sistema pCAMBIA. Poiché tutti i ceppi e i plasmidi necessari per questo lavoro sono disponibili da diverse fonti, questo metodo sarà facile da replicare in qualsiasi laboratorio. Essendo uno dei più importanti ceppi industriali di microalghe, un metodo di riferimento standard per l'AMT affidabile sarà fondamentale per l'ingegnerizzazione di C. vulgaris per applicazioni biotecnologiche.
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Disclosures
Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Prof. Paul Hooykaas per aver gentilmente fornito il vettore pCAMBIA1302 e l'Agrobacterium tumefaciens AGL1 dell'Istituto di Biologia di Leida, Università di Leiden, Paesi Bassi. Gli autori desiderano anche ringraziare Eva Colic per il suo aiuto nella crescita dei trasformanti fluorescenti. Questo lavoro è stato finanziato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada e dal programma Mitacs Accelerate.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
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