Summary
Bu protokol, ilgilenilen gen(ler)i yeşil mikroalgler Chlorella vulgaris'in nükleer genomuna entegre etmek için Agrobacterium tumefaciens aracılı dönüşümün (AMT) kullanımını ana hatlarıyla belirtir ve kararlı dönüştürücülerin üretimine yol açar.
Abstract
Agrobacterium tumefaciens aracılı transformasyon (AMT), bitki genomlarını manipüle etmek için yaygın olarak kullanılan bir araç olarak hizmet eder. Bununla birlikte, A. tumefaciens , çeşitli türlere gen aktarımı için kapasite sergiler. Çok sayıda mikroalg türü, ilgilenilen genleri nükleer genomlarına güvenilir bir şekilde entegre etmek için köklü yöntemlerden yoksundur. Mikroalg biyoteknolojisinin potansiyel faydalarından yararlanmak için basit ve verimli genom manipülasyon araçları çok önemlidir. Burada, endüstriyel mikroalg türleri Chlorella vulgaris için, raportör yeşil floresan proteini (mGFP5) ve Higromisin B için antibiyotik direnç belirteci kullanılarak optimize edilmiş bir AMT protokolü sunulmuştur. mGFP5'in ekspresyonu, on nesilden fazla alt kültürlemeden sonra floresan yoluyla ölçülür ve bu da T-DNA kasetinin kararlı dönüşümünü gösterir. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen pCAMBIA1302 bitki ekspresyon vektörünü kullanarak, iki haftadan kısa bir sürede çoklu transgenik C. vulgaris kolonilerinin güvenilir bir şekilde oluşturulmasına izin verir.
Introduction
Gram negatif toprak kaynaklı bir bakteri olan Agrobacterium tumefaciens, benzersiz bir krallıklar arası gen aktarım yeteneğine sahiptir ve ona "doğal genetik mühendisi" unvanını kazandırır1. Bu bakteri, DNA'YI (T-DNA) tümöre neden olan bir plazmitten (Ti-Plazmit) bir Tip IV salgılama sistemi yoluyla konakçı hücrelere aktarabilir, bu da T-DNA'nın konakçı genomu 1,2,3,4 içinde entegrasyonu ve ekspresyonu ile sonuçlanır. Doğal ortamda, bu süreç bitkilerde tümör oluşumuna yol açar, genellikle taç safra hastalığı olarak bilinir. Bununla birlikte, Agrobacterium, T-DNA'yı laboratuvar koşullarında maya, mantarlar, algler, deniz kestanesi embriyoları ve hatta insan hücreleri dahil olmak üzere çeşitli diğer organizmalara da aktarabilir 5,6,7,8.
Bu doğal sistemden yararlanan Agrobacterium tumefaciens aracılı transformasyon (AMT), Ti-plazmidin T-DNA bölgesini değiştirerek ilgilenilen gen(ler)in bir konakçı hücrenin nükleer genomuna rastgele entegrasyonunu sağlar. Bu amaçla, yaygın olarak kullanılan bir AMT bitki ekspresyon vektörü pCAMBIA13029'dur. Araştırmacılar, istenen vektörü daha sonra ilgilenilen konakçıya aktarmak için A. tumefaciens'e aktarmadan önce E. coli'de basit klonlama iş akışlarını kullanabilirler.
Yeşil mikroalgler, kara bitkileriyle birçok benzerliği paylaşan, ancak genetik modifikasyona karşı oldukça inatçı olan ökaryotlardır. Bununla birlikte, genetik dönüşüm, mikroalglerin hem temel hem de biyoteknolojik araştırmalarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Çeşitli mikroalg türlerinde, özellikle Chlamydomonas reinhardtii, AMT yoluyla genetik dönüşüm, insan interlökin-2 (hIL-2), şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 reseptör bağlama alanı (SARS-CoV-2 RBD) ve iki antimikrobiyal peptit (AMP) gibi transgenleri başarıyla tanıttı10,11,12,13. Bunlar arasında, daha az titiz ve hızlı büyüyen bir yeşil alg türü olan Chlorella vulgaris, karbonhidratların, proteinlerin, nutrasötiklerin, pigmentlerin ve diğer yüksek değerli bileşiklerin sürdürülebilir üretimi için önemli bir potansiyele sahiptir14. Bununla birlikte, C. vulgaris'in transgenik suşlarını oluşturmak için güvenilir araçların bulunmaması, ticari ilerlemesini engellemektedir. C. vulgaris15'te AMT'yi kullanan sınırlı sayıda yayınlanmış çalışma olduğundan ve bitki ve mikroalg yetiştiriciliği arasındaki önemli farklılıklar göz önüne alındığında, AMT protokolünü optimize etmek gerekli hale gelir.
Bu çalışmada araştırmacılar, Karnabahar Mozaik Virüsü (CamV) 35S promotörün akış aşağısına yeşil floresan proteini (mGFP5) yerleştirdiler ve protein ekspresyonu için bir raportör gen olarak kullanmak için bir histidin etiketi eklediler. Dönüştürücüler, Higromisin B kullanılarak seçildi ve yirmiden fazla nesil boyunca alt kültürlemeden sonra, dönüşüm sabit kaldı. Bu çalışmada kullanılan pCAMBIA1302 plazmidi, ilgilenilen herhangi bir geni içerecek şekilde kolayca uyarlanabilir. Ayrıca, sunulan yöntem ve malzemeler, aktif bir CamV35S promotörü olan diğer yeşil alg türleri için ayarlanabilir, çünkü bu promotör Higromisin seçimi için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aksi belirtilmedikçe tüm ortamlar ve çözümler kullanımdan önce otoklavlanmalıdır. Tüm santrifüj tüpleri, pipet uçları vb. kullanımdan önce steril veya otoklavlanmış olmalıdır. Kolay başvuru için, bu protokolde kullanılan medya tarifleri Tablo 1'de listelenmiştir.
1. A. tumefaciens elektrokompetan hücrelerinin hazırlanması
- Agrobacterium'u (AGL-1) donmuş bir gliserol stoğundan 25 mL'lik steril çalkalayıcı LB ortamı şişesine (rifampisin, 20 mg / L-1 ile desteklenmiş) aşılayın ve gece boyunca 28-30 ° C ve 150 rpm'de büyütün.
NOT: Agrobacterium suşu AGL-1 ( Malzeme Tablosuna bakınız) rifampisin, ampisilin, kloramfenikol ve streptomisine karşı dirençlidir ve birkaç tedarikçiden temin edilebilir. - Ertesi gün, 50 mL otoklavlanmış ultra saf suya 0,5 μL gece kültürü ekleyerek kültürü 1,00,000 kat seyreltin ve bu seyreltilmiş kültürün 10 μL'sini bir LB plakasına yayın ve ardından 28-30 °C'de 1-3 gün inkübe edin.
- Bir koloni seçin ve 28-30 ° C'de rifampisin ile LB'de 20 mL'lik bir gece kültürüne başlayın.
- Ertesi gün, 500 mL LB ortamını (antibiyotik yok) bir çalkalayıcı şişesinde 9 mL gece kültürü ile aşılayın ve OD600 0.5'e ulaşana kadar 28-30 ° C'de büyütün.
- Kültürü on adet 50 mL'lik santrifüj tüpüne eşit olarak bölün ve 30 dakika buz üzerinde soğutun. Santrifüjü 4 °C'ye önceden soğutun.
- Tüpleri 4 °C ve 4000 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, bir pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla süpernatanı çıkarın ve her tüpteki peleti 50 mL buz gibi soğuk suda yeniden süspanse edin.
- Hücreleri 4 ° C'de ve 4000 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti her tüpte 25 mL buz gibi soğuk suda yeniden süspanse edin.
- Hücreleri 4 ° C'de ve 4000 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti her tüpte 1 mL buz gibi %10 (a/h) gliserol içinde yeniden süspanse edin.
- Tüm tüpleri 50 mL'lik bir tüpte birleştirin ve hücreleri 15 dakika boyunca 4 ° C ve 4000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 400 μL buz gibi %10 (a/h) gliserol içinde yeniden süspanse edin. Hücre konsantrasyonu yaklaşık 1-3 x 1010 hücre / mL olmalıdır.
- Hücreleri steril önceden soğutulmuş mikrotüplerde 50 μL'lik alikotlar olarak dağıtın. Sıvı nitrojen içinde dondurun ve -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
2. A. tumefaciens'in elektroporasyonu
- Önceden soğutulmuş 0,1 mm'lik bir küvete 50 μL AGL-1 A. tumefaciens elektroyetkin hücre ekleyin ve 2 μL pCAMBIA1302 veya benzeri plazmit (conc 15 ng/μL) ekleyin (bkz.
- Bir elektroporatör kullanarak 2400 V'ta elektroporasyon yapın (200 Ω, kapasitans genişletici 250 μFD, kapasitans 25 μFD, üstel bozunma, Malzeme Tablosuna bakınız). Üstel bozunma ile başarılı elektroporasyon için zaman sabiti >4,5 ms olmalıdır.
- Küvete hemen 1 mL LB ortamı ekleyin ve karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. 1 mL yeniden süspanse edilmiş hücreleri 1.5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın ve iyileşmesi için en az 1 saat 28-30 ° C'de inkübe edin.
- Hücreleri uygun antibiyotik içeren LB agar üzerine yerleştirin (yani, prokaryotik seçim için pCAMBIA1302 için 50 mg / L kanamisin).
- 28-30 °C'de 2-3 gün inkübe edin.
- Bir koloni seçin, uygun seçimle (pCAMBIA1302 için 50 mg/L kanamisin) LB'de gece boyunca büyütün ve ileride kullanmak üzere -80 °C'de %50 gliserol kullanarak plazmit içeren suşu kriyoprezervasyon.
3. AMT C. vulgaris
NOT: C. vulgaris (UTEX 395, Malzeme Tablosuna bakınız) ve A. tumefaciens kültürlerini birlikte yetiştirme için paralel olarak hazırlayın. C. vulgari kültürleri, A. tumefaciens kültürleri hazırlanmadan 3 gün önce başlatılmalıdır. Protokol, Kumar ve ark.7 tarafından yayınlananlara göre değiştirildi.
- C. vulgaris kültürünü hazırlayın
- C. vulgaris geleneksel olarak eğimler üzerinde depolanır veya aydınlatılmış koşullarda log faz kültürlerinde tutulur. OD600 = 1.0'daki bir log faz kültüründen, bir Tris-Asetat-Fosfat (TAP, bkz. Tablo 1) agar plakalarına (% 1.2 w/v agar A) 0.5 mL yayın ve aydınlatma ile 25 °C'de 5 gün boyunca büyütün (50 μE/m2s). Bu, yaklaşık 5 x 106 hücre verecektir.
- A. tumefaciens kültürünü hazırlayın
- Gliserol stoğu kullanılarak 15 mM glikoz, 20 mg/L rifampisin ve 50 mg/L kanamisin ile takviye edilmiş 10 mL LB ortamını aşılayarak bir çalkalayıcı şişesinde A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 suşunu büyütün (Malzeme Tablosuna bakınız). Gece boyunca 28-30 °C ve 250 rpm'de inkübe edin.
- 15 mM glikoz, 20 mg/L rifampisin ve 50 mg/L kanamisin ile 1 mL gece kültürüne 50 mL LB'ye aşılayın ve OD600 1.0'a ulaşana kadar 28-30 °C ve 250 rpm'de inkübe edin.
- C. vulgaris ve A. tumefaciens'i birlikte yetiştirin
- A. tumefaciens kültürünü birlikte yetiştirmeye hazırlamak için, yetiştirilen kültürü 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 4000 x g'da santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın ve hücreleri indüksiyon ortamıyla iki kez yıkayın.
NOT: Kullanılan indüksiyon ortamı, pH 5.5'e ayarlanmış ve F/2 orta eser metaller ve 200 μM asetosiringonlu vitaminlerle desteklenmiş TAP ortamıdır (AS, bkz. İndüksiyon ortamındaki hücreleri, OD600 = 0.5 olacak şekilde yeniden süspanse edin. - C. vulgaris kültürünü birlikte yetiştirmeye hazırlamak için, ~ 5 x 106 hücre içeren C. vulgaris plakasına 25 mL indüksiyon ortamı ekleyin. 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 4000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Alg hücresi peletini 200 μL bakteri süspansiyonu (OD600: 0.5) ile karıştırın ve 1 saat boyunca 150 rpm'de 21-25 °C'de döner bir çalkalayıcıda inkübe edin.
- Karışık kültürü (200 μL) 15 mM glikoz ile desteklenmiş indüksiyon ortamı plakalarına yayın ve 3 gün boyunca karanlıkta 21-25 ° C'de inkübe edin.
- 3 gün sonra, mikroalgleri toplamak için 400 mg/L sefotaksim veya 20 mg/L tetrasiklin (Malzeme Tablosuna bakınız) ile takviye edilmiş 10 mL TAP ortamı kullanın ve A. tumefaciens'i kültürden çıkarmak için 21-25 °C'de karanlıkta 2 gün inkübe edin.
- Kültürün 500 μL'sini seçici ortama, örneğin 20-70 mg / L Higromisin B (pCAMBIA1302 kullanıldığında) ve 400 mg / L-1 sefotaksim veya 20 mg / L tetrasiklin ile desteklenmiş TAP ortamı üzerine plakalayın. Işıklı bir odaya yerleştirmeden önce 21-25 ° C'de karanlıkta 2 gün inkübe edin.
NOT: Dirençli koloniler ışığa maruz kaldıktan 5-7 gün sonra ortaya çıkacaktır. - Dönüşüm plakasından tek kolonileri seçin ve bunları 400 mg / L sefotaksim veya 20 mg / L tetrasiklin ve 20-70 mg / L Higromisin B ile desteklenmiş TAP agar plakalarına yeniden çizin.
- A. tumefaciens kültürünü birlikte yetiştirmeye hazırlamak için, yetiştirilen kültürü 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 4000 x g'da santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın ve hücreleri indüksiyon ortamıyla iki kez yıkayın.
4. C. vulgaris transformantlarında gen entegrasyonunu doğrulamak için Koloni PCR (cPCR)
- Bir bitki genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak tek bir koloniden en az iki kez alt kültürlemeden sonra bir C. vulgaris transformantından genomik DNA'yı çıkarın (bkz. Bunu PCR için bir şablon olarak kullanarak, T-DNA'nın mgfp5 bölgesi için primerler tasarlayın (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' ve M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
- Bir Q5 yüksek kaliteli DNA polimeraz ana karışım kiti kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız), transgen entegrasyonunu doğrulamak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin.
NOT: Bu çalışma için aşağıdaki koşullar kullanılmıştır: 3 dakika boyunca 98 ° C; 35 döngü (10 sn için 98 °C, 30 sn için 57 °C, 1 dakika boyunca 72 °C); esnasında 72 °C 5dk. Pozitif kontrol olarak pCAMBIA1302 ve negatif kontrol olarak vahşi tip C. vulgaris genomik DNA kullanın.
- Bir Q5 yüksek kaliteli DNA polimeraz ana karışım kiti kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız), transgen entegrasyonunu doğrulamak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin.
- A. tumefaciens tarafından kalıntı kontaminasyon nedeniyle numunede pCAMBIA1302 bulunmadığını doğrulamak için koloni PCR kullanın. 10 μL steril suya az miktarda dönüştürücü hücre ekleyin ve 98 °C'de 15 dakika kaynatın. Bunu PCR için bir şablon olarak kullanın.
- pCAMBIA1302'de T-DNA'nın dışındaki bir bölge için primerler tasarlayın (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' ve B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
NOT: Bu çalışma için aşağıdaki koşullar kullanılmıştır: 3 dakika boyunca 94 ° C; 30 döngü (30 sn için 94 °C, 30 sn için 48 °C, 5 dakika boyunca 68 °C); 68 °C esnasında 7 dk. Pozitif kontrol olarak haşlanmış bir A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) kolonisi ve negatif kontrol olarak haşlanmış bir yabani tip C. vulgaris kolonisi kullanın.
- pCAMBIA1302'de T-DNA'nın dışındaki bir bölge için primerler tasarlayın (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' ve B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
- Numunede A. tumerfaciens kontaminasyonu bulunmadığını doğrulamak için koloni PCR kullanın. 10 μL steril suya az miktarda dönüştürücü hücre ekleyin ve 98 °C'de 15 dakika kaynatın. Bunu PCR için bir şablon olarak kullanın.
- AGL-1 virülans plazmidinde bulunan virE2 geni için primerler tasarlayın (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' ve virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
NOT: Bu çalışma için aşağıdaki koşullar kullanılmıştır: 3 dakika boyunca 94 ° C; 30 döngü (30 sn için 94 °C, 30 sn için 53 °C, 3 dakika boyunca 68 °C); 68 °C esnasında 7 dk. Pozitif kontrol olarak haşlanmış bir A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) kolonisi ve negatif kontrol olarak haşlanmış bir yabani tip C. vulgaris kolonisi kullanın.
- AGL-1 virülans plazmidinde bulunan virE2 geni için primerler tasarlayın (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' ve virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
- Elde edilen parçaların boyutunu doğrulamak için PCR örneklerini bir merdivenle birlikte bir DNA agaroz jeli üzerinde çalıştırın (1 Kbp DNA merdiveni, Malzeme Tablosuna bakın)16.
5. Transformatörlerin floresansının ölçülmesi
- Her bir dönüştürücüyü bir log faz bakım kültüründen veya TAP agar eğiminden 200 mg / L-1 sefotaksim ve 25 mg / L-1 Higromisin B ile desteklenmiş 50 mL TAP'a aşılayın, böylece başlangıç OD600 = 0.1. Bir kültürü vahşi tip C. vulgaris ve negatif kontrol olarak sadece 200 mg / L-1 sefotaksim ile aşılayın. 25 °C'de 150 rpm'de 150 μmol/m2s fotosentetik olarak aktif ışıkla inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakın).
- Her 24 saatte bir, 300 μL'lik bir numune alın ve 96 oyuklu bir plaka okuyucuda veya UV/Vis spektrometresi ve florometrede absorbans ve floresanı (uyarma 488 nm, emisyon 526 nm) ölçün (bkz. Eşzamanlı ölçümler için şeffaf tabanlı siyah bir plaka kullanın.
6. Ham protein ekstraksiyonu, protein saflaştırması ve SDS-PAGE elektroforezi
- OD 680 = 0.1'e ulaşmak için log-faz idame kültüründen dönüştürücüyü (#50) 200 mg / L-1 sefotaksim ve 25 mg / L-1 Higromisin B ile takviye edilmiş300 mL TAP'a aşılayın. Bir kültürü vahşi tip C. vulgaris ve negatif kontrol olarak sadece 200 mg / L-1 sefotaksim ile aşılayın. 25 °C'de 150 rpm'de 150 μmol/m2s fotosentetik olarak aktif ışıkla inkübe edin.
- Ham protein örneğini 5 mL lizis tamponu (bkz. Tablo 1) kullanarak dönüştürücü (# 50) ve vahşi tip suşlardan çıkarın, ardından 4 dakika boyunca sonikasyon yapın.
- Ham protein numunesini bir Ni-NTA reçinesi ile 5 mL polipropilen kolonlardan saflaştırın (bkz.
- 15 mL saflaştırılmış protein örneklerini liyofilize edin ve SDS-PAGE analizi için 1 mL lizis tamponunda yeniden süspanse edin17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki yöntemi kullanarak başarılı bir dönüşüm göstermek için, C. vulgaris , pCAMBIA1302 plazmidi içeren AGL-1 ile veya plazmid olmadan (vahşi tip ve Higromisin B ve sefotaksim ile desteklenmiş TAP agar üzerine kaplanmıştır) birlikte kültürlenmiştir (Şekil 1A). En soldaki plaka, Higromisin B / sefotaksim plakaları üzerinde büyüyebilen dönüştürülmüş kolonileri gösterir ve orta plaka, vahşi tip AGL-1'in Higromisin B / sefotaksim plakaları üzerinde büyüyemeyeceğini gösterir. En sağdaki plaka, hiçbir seleksiyon kullanılmadığında (sadece sefotaksim), C. vulgaris transformantların ve vahşi tipin büyüyebileceğini göstermektedir. Tek koloniler Higromisin B ve sefotaksim ile TAP agar üzerine çizildi (Şekil 1B). En sağdaki plakadan (Şekil 1B) kaçan koloniler, Higromisin B ve sefotaksim ile TAP sıvısına aşılandı (Şekil 1C). T-DNA'nın rastgele entegrasyonundan sonra değişken ekspresyon seviyeleri nedeniyle, dönüştürücüler orijinal olarak 25-70 mg / L arasında değişen artan Higromisin B konsantrasyonlarına sahip plakalar üzerinde geri kazanıldı. Her plakadan bir koloni, en düşük konsantrasyonda yabani tip C. vulgaris ile birlikte aynı konsantrasyonda Higromisin B içeren sıvı TAP ortamında büyütüldü (Şekil 1D). Yabani tip C. vulgaris , Higromisin varlığında büyüyemezken, 70 mg/L'ye kadar dirençli koloniler elde edilmiştir.
T-DNA kasetinin C. vulgaris'in genomuna stabil bir şekilde entegre olduğunu doğrulamak için, 20, 25, 30, 50 ve 70 mg / L Higromisin B plakalarının her birinden seçilen bir koloninin her biri, iki kez seçilerek TAP agar plakaları üzerinde tekrarlanan çizgilerle alt kültüre edildi ve daha sonra rutin olarak TAP ortamında on defadan fazla alt kültürlendi, Transformant #20, #25, #30, #50, #50 ve #70 olarak adlandırılmıştır. Bu kültürler kullanılarak, AGL1'de pCAMBIA1302 tarafından kontaminasyonu ekarte etmek için her iki koloni PCR gerçekleştirildi ve mGFP5 geninin C. vulgaris genomunda mevcut olduğunu doğrulamak için genomik DNA ekstrakte edildi. Şekil 2A'da, koloni PCR'si, T-DNA'nın sol ve sağ sınırlarının dışında 5 kbp'lik bir bölgeyi hedefleyen primerler kullanılarak gerçekleştirildi, bu bölgeyi pozitif bir kontrol olarak pCAMBIA1302 plazmidinden çoğaltabildi, ancak bu bölge C. vulgaris örneklerinin hiçbirinde mevcut değildi, bu da pCAMBIA1302 DNA'sının kültürlerin hiçbirinde bulunmadığını gösteriyor. Yabani tip C. vulgaris örneği negatif kontrol olarak kullanıldı ve amplifikasyon görülmedi.
Genomik DNA, #25, #50 ve #70 transformantlarından ekstrakte edildi ve transformantlara entegrasyonu doğrulamak için T-DNA'nın mgfp5 genini içeren 1763 bp'lik bir bölgeyi çoğaltarak PCR gerçekleştirildi (Şekil 2B). pCAMBIA1302 pozitif kontrol olarak kullanıldı ve tüm transformantlarda amplifikasyon tespit edildi, bu da mgfp5 geninin tüm transformantların genomik DNA'sında mevcut olduğunu gösterdi. Yabani tip C. vulgaris negatif kontrol olarak kullanıldı ve amplifikasyon görülmedi. Şekil 2C , AGl1 suşunun tümör indükleyici plazmidinde (Ti plazmid) bulunan virülans proteini E2'nin (VirE2) 600 bp'lik bir fragmanının amplifikasyonunu göstermektedir. pCAMIA1302 içeren AGl1 suşundan oluşan pozitif kontrol, numunede A. tumefaciens'in varlığını gösteren primerlerle başarılı bir şekilde amplifiye edildi. Bununla birlikte, tüm C. vulgaris örnekleri bu bölge için negatif test edildi, bu da sefotaksim üzerinde tekrarlanan alt kültürlemenin AGL1'in kültürden kontaminasyonunu başarıyla ortadan kaldırdığını gösterdi. Yabani tip C. vulgaris örneği negatif kontrol olarak kullanıldı ve amplifikasyon gözlenmedi. Birlikte ele alındığında, bu üç test, mgpf5 içeren T-DNA'nın C. vulgaris'in genomuna eklendiğini ve bu sonuçların örneklerde AGL1'in kontaminasyonundan veya hücrelerde pCAMBIA1302'nin varlığından kaynaklanmadığını doğrulamaktadır. Bu sonuçlar, dönüştürücülerin 20 ve yaklaşık 100 alt kültüründen sonra tekrarlandı ve T-DNA'nın genoma uzun vadeli entegrasyonunu doğruladı.
Son olarak, fenotip, TAP ortamındaki dönüştürücülerin seleksiyon ile büyütülmesi ve floresansın ölçülmesiyle doğrulandı. Bu, vahşi tip C. vulgaris ile karşılaştırıldı. Klorofilin arka plan absorbansı/otofloresansı nedeniyle, floresan, veriler vahşi tip suşla normalleştirilerek karşılaştırıldı. Şekil 3A'da, transformantlar ile vahşi tip C. vulgaris arasında büyümede gözle görülür bir fark olduğu gözlemlenebilir. Bu, potansiyel olarak T-DNA'nın genoma çoklu rastgele entegrasyonlarına bağlanabilir, bu da diğer hücresel süreçleri etkileyebilir ve daha yavaş büyümeye yol açabilir. Bununla birlikte, Şekil 3B , daha düşük büyümeye rağmen, seçilen tüm suşların hücre yoğunluğu için normalleştirildiğinde daha yüksek floresan seviyeleri sergilediğini vurgulamaktadır. Özellikle, suş #70, <0.01'lik bir p değeri ile diğerlerinden önemli ölçüde daha yüksek floresan seviyeleri gösterdi. Bu, genel büyüme davranışını olumsuz etkilemeden istenen proteini ifade eden dönüştürücüleri belirlemek için çok sayıda koloniyi taramanın önemini vurgulamaktadır.
mGFP5-6xHis'in ekspresyonunu doğrulamak için, hem C. vulgaris (WT) hem de C. vulgaris transformanttan (#50) ham protein ekstraktını ve his etiketi saflaştırılmış proteinlerini analiz etmek için SDS-PAGE kullanıldı. Daha sonra, his etiketli protein saflaştırması, üreticininprotokolü 18'i takiben bir Ni-NTA reçine yerçekimi akış kiti kullanılarak yapıldı. Şekil 4, dönüştürücü numune #50'de mGFP5-6xHis proteininin (~30 kDa) varlığını ve negatif kontrolde (WT C. vulgaris) protein olmadığını göstermektedir.
Şekil 1: AMT'den sonra C. vulgaris transformantlarının geri kazanımı. (A) C. vulgaris'in birlikte yetiştirilmesinden sonra, dönüştürücüs, pCAMBIA plazmidini içeren veya seçici plakalar üzerinde plazmid içermeyen (sadece AGL-1) AGL-1'dir. (B) Seçici TAP agar üzerinde Higromisin B (20 mg / L) plakalarından seçilen yeniden çizgili tek koloniler. (C) Kaçan koloniler, sadece Higromisin B (20 mg / L) sıvı ortamındaki AGL1 plakasından büyümeden yoksundur. (D) Higromisin ve Higromisin ortamında büyüyemeyen vahşi tip C. vulgaris içeren sıvı TAP ortamında yetiştirilen Higromisin seçim plakalarından #25, #50 ve #50 numaralı tek kolonilerin büyümesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: pCAMBIA1302 kontaminasyonunun tespiti. (A) T-DNA'nın transformantlara entegrasyonu (B) ve A. tumefaciens kontaminasyonunun (C) tespiti. WT, vahşi tip C. vulgaris'i, PC pozitif kontroldür (pCAMBIA1302) ve AGL1, A. tumefaciens AGL1 suşunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Aşılamadan 3 gün sonra transformantların büyümesi ve floresansı. (A) 680 nm'de absorbans ile ölçülen büyüme. (B) Vahşi tip suşa normalize edilmiş floresan. Ortalama 3-4 biyolojik kopya, hata çubukları 1 σ'yi temsil eder. *p < 0.05, **p < 0.01 vahşi tip (WT) ile karşılaştırıldığında. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: C. vulgaris'te (WT) mGFP5-6xHis ekspresyonunun SDS-PAGE analizi ve dönüştürülmüş C. vulgaris örnek #50. Ekstraktlar sırasıyla ham, saflaştırılmış (ilk yıkama), saflaştırılmış (seyreltilmiş) ve saflaştırılmış (konsantre) C. vulgaris'ten (WT), şerit 1-4'ten hazırlandı. C. vulgaris'ten (WT) sırasıyla ham, saflaştırılmış (ilk yıkama), saflaştırılmış (ayrıştırılmış) ve saflaştırılmış (liyofilize), şeritler 5-8. Kırmızı kutu, transformant #70'ten saflaştırılmış GFP-6xHis proteinini gösterir. Proteinler bir poliakrilamid% 12 jel üzerinde ayrıldı. Protein standartlarının (Std.) moleküler ağırlıkları (MW'ler) sağda gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Ortamın/arabelleğin adı | Kompozisyon | ||
| LB | 5 g/L maya özütü, 10 g/L tripton, 5 g/L NaCl | ||
| MUSLUK | 20 mM Tris baz, 1.58 mM K 2 HPO 4, 2.4 mM KH 2 PO 4, 7.0 mM NH4 Cl, 0.83 mM MgSO4, 0.34 mM CaCl 2, 1 mL/L buzlu asetik asit ve her biri 1 mL/L F/2 orta eser metal ve F/2vitaminleri | ||
| F/2 orta eser metaller | 22 mg/L ZnSO 4·7H2O, 180 mg/L MnCl 2·4H2O, 6.3 mg/LNa2-MoO4·2H2O, 14 mg/LCoCl 2·6H2O, 9.8 mg/L CuSO4·5H2O, 3.15 g/L FeCl3·6H2O,4.36 g/L Na2-EDTA·2H2O | ||
| F/2 orta boy vitaminler | 0.1 mM Vitamin B12 (siyanokobalamin), 25 mg/L Biotin, 335 mg/L Tiamin, 50 mM HEPES Tampon pH 7.8 | ||
| Lizis Tamponu | 20 mM Na2HPO 4, 300 mM NaCl, pH7.4 | ||
Tablo 1: Ortam ve tampon tarifleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dönüşümün verimliliği birkaç farklı parametre ile ilişkilidir. AMT için kullanılan A. tumefaciens suşlarının seçimi çok önemlidir. AGL-1, keşfedilen en invaziv suşlardan biridir ve bu nedenle AMT bitkisinde rutin olarak kullanılmıştır. İndüksiyon ortamının glikoz (15-20 mM) ile desteklenmesi de AMT verimliliği için önemlidir. C. vulgaris'in hem fototrofik hem de heterotrofik koşullarda büyüyebileceği göz önüne alındığında, kontaminasyonu önlemek için glikoz veya diğer karbon kaynakları genellikle mikroalg ortamından çıkarılır. Örneğin, Bold'un Bazal Besiyeri (BBM), C. vulgaris19'un fototrofik ekimi için en yaygın kullanılan ortamdır. Bununla birlikte, BBM, organik bir karbon kaynağı ve tercih ettiği bir azot kaynağı olarak amonyum eksikliği nedeniyle A. tumefaciens büyümesini desteklememektedir (BBM nitrat kullanır)20. Bu nedenle, bu çalışmada TAP ortamı kullanılmıştır çünkü C. vulgaris için karbon kaynağı olarak asetat, A. tumefaciens için glikoz ve her iki türün de kullanabileceği bir nitrojen kaynağı olarak amonyum içerir. TAP agar plakaları ayrıca C. vulgaris için çok daha hızlı büyüme oranlarına izin vererek, AMT'den sonra dönüştürücüleri geri kazanma süresini en aza indirir. Ti-plazmid virülans proteinlerini indüklemek için, indüksiyon ortamına 200 μM asetosiringon da eklenmelidir.
AMT'den sonra kültürden A. tumefaciens'i ortadan kaldırmak için, seri pasaj ile birlikte sefotaksim kullanıldı. AGL-1, ampisilin, kloramfenikol, rifamisin ve streptomisine dirençlidir ve sefotaksim, tetrasiklin, spektinomisin ve kanamisine duyarlıdır. Bitkilerde sefotaksim, A. tumefaciens'i ortadan kaldırmak için sıklıkla kullanılır, çünkü birçok bitki türünde sürgün rejenerasyonu için diğer antibiyotiklere göre daha düşük fitotoksik etkiye sahiptir21. Bununla birlikte, tek bir koloniden seri geçiş ile birleştirildiğinde bu protokolde sefotaksim yerine tetrasiklin (yaklaşık 100 kat daha az maliyetli) kullanılabileceğini de doğruladık (veriler gösterilmemiştir). Bunun nedeni, tetrasiklin gibi antibiyotiklerin, fotosenteze bağımlı bitkilerde kloroplastta protein sentezini inhibe etmesidir22. Bununla birlikte, C. vulgaris, asetat ile desteklendiğinde karanlıkta büyüyebilir, yani kloroplast disfonksiyonu, dikkatlice seçilmiş koşullar altında bu tür için mutlaka toksik değildir.
Yabani tip C. vulgaris'in büyümesini önlemek için 20 mg / L Higromisin B yeterli olmasına rağmen, bir dizi Higromisin B konsantrasyonu (20-70 mg / L) test edildi. Daha yüksek konsantrasyon plakalarından izole edilen kolonilerin, T-DNA'nın birden fazla entegre kopyasına sahip olması veya T-DNA'nın, genomun transkripsiyonel olarak daha aktif bir bölgesinde yer alması, bunun sonucunda Higromisin B fosfotransferazın daha yüksek ekspresyonu ile sonuçlanması, herbisitin daha hızlı inaktivasyonu ve kültür büyümesinde daha az gecikme süresi ile sonuçlanması mümkündür23. Genomdan mgfp5 amplifiye edilirken PCR ürünlerinin yoğunluğundaki farklılıkların nedeni çoklu kopyalar olabilir (Şekil 2B). SDS-PAGE analizi sırasında saflaştırılmış numunede GFP-6xHis proteininin varlığı (Şekil 4, Şerit 8) ve vahşi tip suşta yokluğu (Şekil 4, şerit 4), AMT ve pCAMBIA1302'nin transgenin başarılı ekspresyonu ve stabil entegrasyonu için kullanılabileceğini doğrulamaktadır.
Bu çalışmada, A. tumefaciens AGL-1 ve bir pCAMBIA sistem plazmidi kullanarak güvenilir C. vulgaris UTEX 395 dönüşümü için bir protokol geliştirdik ve optimize ettik. Bu çalışma için gerekli olan tüm suşlar ve plazmitler birkaç farklı kaynaktan temin edilebildiğinden, bu yöntemin herhangi bir laboratuvarda çoğaltılması kolay olacaktır. Mikroalglerin en önemli endüstriyel suşlarından biri olarak, güvenilir AMT için standart bir referans yöntemi, biyoteknolojik uygulamalar için C. vulgaris'in mühendisliği için çok önemli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.
Acknowledgments
Yazarlar, Hollanda Leiden Üniversitesi Leiden Biyoloji Enstitüsü'nden pCAMBIA1302 vektörünü ve Agrobacterium tumefaciens AGL1'i sağladığı için Prof. Paul Hooykaas'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca floresan dönüştürücülerin yetiştirilmesindeki yardımları için Eva Colic'e teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi ve Mitacs Accelerate programı tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
References
- Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
- Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
- Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
- Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W.
- Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
- de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G.
- Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
- Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
- Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
- Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
- Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
- Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
- NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
- Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
- Morton, E. R., Fuqua, C.
- Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
- Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
- Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).
