Summary
Detta protokoll beskriver användningen av Agrobacterium tumefaciens-medierad transformation (AMT) för att integrera gener av intresse i kärngenomet hos den gröna mikroalgen Chlorella vulgaris, vilket leder till produktion av stabila transformanter.
Abstract
Agrobacterium tumefaciens-medierad transformation (AMT) fungerar som ett allmänt använt verktyg för att manipulera växtgenom. A. tumefaciens uppvisar dock förmågan till genöverföring till en mängd olika arter. Många arter av mikroalger saknar väletablerade metoder för att på ett tillförlitligt sätt integrera gener av intresse i sin kärnarvsmassa. För att utnyttja de potentiella fördelarna med bioteknik med mikroalger är enkla och effektiva verktyg för genmanipulation avgörande. Häri presenteras ett optimerat AMT-protokoll för den industriella mikroalgararten Chlorella vulgaris, med hjälp av det gröna fluorescerande proteinet (mGFP5) och markören för antibiotikaresistens för Hygromycin B. Mutanter selekteras genom plätering på Tris-Acetat-Fosfat (TAP) media innehållande Hygromycin B och cefotaxim. Uttrycket av mGFP5 kvantifieras via fluorescens efter över tio generationer av subkultur, vilket indikerar den stabila omvandlingen av T-DNA-kassetten. Detta protokoll möjliggör tillförlitlig generering av flera transgena C. vulgaris-kolonier på mindre än två veckor, med hjälp av den kommersiellt tillgängliga pCAMBIA1302-växtuttrycksvektorn.
Introduction
Agrobacterium tumefaciens, en gramnegativ jordburen bakterie, har en unik genöverföringsförmåga mellan kungadömena, vilket ger den titeln "naturlig genetisk ingenjör"1. Denna bakterie kan överföra DNA (T-DNA) från en tumörinducerande plasmid (Ti-plasmid) till värdceller genom ett typ IV-sekretionssystem, vilket resulterar i integration och uttryck av T-DNA i värdgenomet 1,2,3,4. I den naturliga miljön leder denna process till tumörbildning i växter, allmänt känd som krongallsjukdom. Agrobacterium kan dock också överföra T-DNA till olika andra organismer, inklusive jäst, svampar, alger, sjöborrembryon och till och med mänskliga celler under laboratorieförhållanden 5,6,7,8.
Genom att utnyttja detta naturliga system möjliggör Agrobacterium tumefaciens-medierad transformation (AMT) slumpmässig integration av gener av intresse i en värdcells kärngenom genom genom att modifiera T-DNA-regionen i Ti-plasmiden. För detta ändamål är en allmänt använd AMT-växtuttrycksvektor pCAMBIA13029. Forskare kan använda enkla kloningsarbetsflöden i E. coli innan de överför den önskade vektorn till A. tumefaciens för efterföljande överföring till värden av intresse.
Gröna mikroalger är eukaryoter som har många likheter med landväxter men som är mycket motsträviga mot genetisk modifiering. Genetisk omvandling spelar dock en avgörande roll i både grundforskning och bioteknisk forskning om mikroalger. I flera arter av mikroalger, särskilt Chlamydomonas reinhardtii, har genetisk transformation via AMT framgångsrikt introducerat transgener som humant interleukin-2 (hIL-2), receptorbindande domänen för svårt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2 RBD) och två antimikrobiella peptider (AMP)10,11,12,13. Bland dessa har Chlorella vulgaris, en mindre kräsen och snabbväxande grönalgsart, en betydande potential för hållbar produktion av kolhydrater, proteiner, nutraceuticals, pigment och andra högvärdiga föreningar14. Bristen på tillförlitliga verktyg för att skapa transgena stammar av C. vulgaris hämmar dock dess kommersiella framsteg. Eftersom det bara har publicerats ett begränsat antal arbeten som använder AMT i C. vulgaris15, och med tanke på de stora skillnaderna mellan odling av växter och mikroalger, blir det viktigt att optimera AMT-protokollet.
I denna studie satte forskarna in grönt fluorescerande protein (mGFP5) nedströms blomkålsmosaikviruset (CamV) 35S-promotorn och lade till en histidintagg för att använda den som en reportergen för proteinuttryck. Transformanter valdes ut med hjälp av hygromycin B, och efter subkultivering i över tjugo generationer förblev omvandlingen stabil. Plasmiden pCAMBIA1302 som används i detta arbete kan lätt anpassas för att innehålla vilken gen som helst av intresse. Dessutom kan metoden och materialen som presenteras anpassas för andra grönalgsarter med en aktiv CamV35S-promotor, eftersom denna promotor används för hygromycinselektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla medier och lösningar måste autoklaveras före användning om inget annat anges. Alla centrifugrör, pipettspetsar etc. ska steriliseras eller autoklaveras före användning. För enkel referens listas de mediarecept som används i detta protokoll i tabell 1.
1. Beredning av A. tumefaciens elektrokompetenta celler
- Inokulera Agrobacterium (AGL-1) i en 25 ml steril skakkolv med LB-media (tillsatt med rifampicin, 20 mg/L-1) från ett fryst glycerollager och odla över natten vid 28-30 °C och 150 rpm.
OBS: Agrobacterium-stammen AGL-1 är (se materialtabell) resistent mot rifampicin, ampicillin, kloramfenikol och streptomycin och kan erhållas från flera leverantörer. - Följande dag späds kulturen 1 00 000 gånger genom att 0,5 μl av nattkulturen tillsätts till 50 ml autoklaverat ultrarent vatten och sprids 10 μl av denna utspädda kultur på en LB-platta och inkuberas sedan vid 28–30 °C i 1–3 dagar.
- Välj ett samhälle och starta en 20 ml odling över natten i LB med rifampicin vid 28-30 °C.
- Nästa dag inokuleras 500 ml LB-media (utan antibiotika) i en shakerkolv med 9 ml av nattkulturen och odlas vid 28-30 °C tills OD600 når 0,5.
- Fördela kulturen jämnt i tio 50 ml centrifugrör och kyl på is i 30 min. Kyl centrifugen till 4 °C.
- Centrifugera rören vid 4 °C och 4000 x g i 15 minuter. Ta sedan bort så mycket supernatant som möjligt med hjälp av en pipett och återsuspendera pelleten i varje rör i 50 ml iskallt vatten.
- Centrifugera cellerna vid 4 °C och 4000 x g i 15 minuter. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 25 ml iskallt vatten i varje rör.
- Centrifugera cellerna vid 4 °C och 4000 x g i 15 minuter. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml iskall 10 % (vikt/volym) glycerol i varje rör.
- Blanda alla rör i ett 50 ml rör och centrifugera cellerna vid 4 °C och 4000 x g i 15 minuter. Ta bort supernatanten och blanda pelleten på nytt i 400 μL iskall 10 % (w/v) glycerol. Cellkoncentrationen bör vara ca 1-3 x 1010 celler/ml.
- Fördela cellerna som 50 μL alikvoter i sterila, förkylda mikrorör. Frys in i flytande kväve och förvara i en frys på -80 °C.
2. Elektroporering av A. tumefaciens
- Tillsätt 50 μl AGL-1 A. tumefaciens elektrokompetenta celler i en förkyld 0,1 mm kyvett och tillsätt 2 μl pCAMBIA1302 eller liknande plasmid (conc 15 ng/μL) (se materialförteckning).
- Elektroporera vid 2400 V med hjälp av en elektroporator (200 Ω, kapacitansförlängare 250 μFD, kapacitans 25 μFD, exponentiellt sönderfall, se materialtabell). Tidskonstanten bör vara >4,5 ms för framgångsrik elektroporering med exponentiellt sönderfall.
- Tillsätt omedelbart 1 ml LB-media till kyvetten och pipettera försiktigt upp och ner för att blanda. Överför 1 ml återsuspenderade celler till ett 1,5 ml mikrorör och inkubera det vid 28–30 °C i minst 1 timme för återhämtning.
- Platta cellerna på LB-agar som innehåller lämpligt antibiotikum (dvs. 50 mg/l kanamycin för pCAMBIA1302 för prokaryot selektion).
- Inkubera vid 28-30 °C i 2-3 dagar.
- Välj en koloni, odla över natten i LB med lämpligt urval (50 mg/L kanamycin för pCAMBIA1302) och kryokonservera den plasmidinnehållande stammen med 50 % glycerol vid -80 °C för framtida bruk.
3. AMT av C. vulgaris
OBS: Bered C. vulgaris (UTEX 395, se materialtabell) och A. tumefaciens kulturer parallellt för samodling. C. vulgariskulturer bör påbörjas 3 dagar innan A. tumefaciens kulturer bereds. Protokollet ändrades baserat på det som publicerades av Kumar et al.7.
- Förbered C. vulgaris-kulturen
- C. vulgaris lagras traditionellt på sneda platser eller hålls i logfaskulturer under belysta förhållanden. Från en logfasodling vid OD600 = 1,0, sprid 0,5 ml på en tris-acetatfosfat (TAP, se tabell 1) agarplattor ( 1,2 % vikt/v agar A) och odla i 5 dagar vid 25 °C med belysning (50 μE/m2s). Detta kommer att ge cirka 5 x 106 celler.
- Förbered A. tumefaciens kultur
- Odla A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302-stam i en skakkolv genom att inokulera 10 ml LB-media kompletterat med 15 mM glukos, 20 mg/L rifampicin och 50 mg/L kanamycin (se materialtabell) med hjälp av glycerolstammen. Inkubera vid 28-30 °C och 250 rpm över natten.
- Inokulera 1 ml odling över natten till 50 ml LB med 15 mM glukos, 20 mg/L rifampicin och 50 mg/L kanamycin och inkubera vid 28-30 °C och 250 rpm tills OD600 når 1,0.
- Samodla C. vulgaris och A. tumefaciens
- För att bereda A. tumefaciens-kulturen för samodling, överför den odlade kulturen till ett 50 ml rör och centrifugera vid 4000 x g i 30 minuter vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten med en pipett och tvätta cellerna två gånger med induktionsmediet.
OBS: Induktionsmediet som används är TAP-media justerat till pH 5.5 och kompletterat med F/2 medium spårmetaller och vitaminer med 200 μM acetosyringon (AS, se materialförteckning). Återsuspendera cellerna i induktionsmedia så att OD600 = 0,5. - För att förbereda C. vulgaris-kulturen för samodling, tillsätt 25 ml induktionsmedium till C. vulgaris-plattan som innehåller ~ 5 x 106 celler. Överför till ett 50 ml rör. Centrifugera cellerna vid 4000 x g i 15 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Blanda algcellpelleten med 200 μl av bakteriesuspensionen (OD600: 0,5) och inkubera dem i en roterande skakapparat vid 21–25 °C vid 150 varv per minut i 1 timme.
- Sprid ut blandkulturen (200 μL) på induktionsmedieplattor kompletterade med 15 mM glukos och inkubera vid 21-25 °C i mörker i 3 dagar.
- Efter 3 dagar används 10 ml TAP-media kompletterat med 400 mg/l cefotaxim eller 20 mg/l tetracyklin (se Materialtabell) för att samla upp mikroalgerna och inkubera i mörker vid 21-25 °C i 2 dagar för att eliminera A. tumefaciens från kulturen.
- Platta 500 μL av kulturen på selektiva medier, t.ex. TAP-media kompletterat med 20-70 mg/L hygromycin B (vid användning av pCAMBIA1302) och 400 mg/L-1 cefotaxim eller 20 mg/L tetracyklin. Inkubera 21-25 °C i mörker i 2 dagar innan de placeras i en upplyst kammare.
OBS: Resistenta kolonier kommer att dyka upp 5-7 dagar efter ljusexponering. - Plocka enstaka kolonier från transformationsplattan och stryk dem på nytt på TAP-agarplattor kompletterade med 400 mg/L cefotaxim eller 20 mg/L tetracyklin och 20-70 mg/L hygromycin B.
- För att bereda A. tumefaciens-kulturen för samodling, överför den odlade kulturen till ett 50 ml rör och centrifugera vid 4000 x g i 30 minuter vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten med en pipett och tvätta cellerna två gånger med induktionsmediet.
4. Koloni-PCR (cPCR) för att bekräfta genintegration i C. vulgaris-transformanter
- Extrahera genomiskt DNA från en C. vulgaris-transformant efter subkulturation minst två gånger från en enda koloni med hjälp av ett växtgenomiskt DNA-extraktionskit (se materialförteckning). Använd detta som mall för PCR, designa primers för mgfp5-regionen av T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3', och M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
- Använd ett Q5 high-fidelity DNA-polymerasmasterblandningssats (se materialtabell), utför polymeraskedjereaktion (PCR) för att validera transgenintegration.
OBS: Följande förhållanden användes för denna studie: 98 °C i 3 min; 35 cykler (98 °C i 10 s, 57 °C i 30 s, 72 °C i 1 min); 72 °C i 5 min. Använd pCAMBIA1302 som en positiv kontroll och vildtyp C. vulgaris genomiskt DNA som en negativ kontroll.
- Använd ett Q5 high-fidelity DNA-polymerasmasterblandningssats (se materialtabell), utför polymeraskedjereaktion (PCR) för att validera transgenintegration.
- För att bekräfta att det inte finns någon pCAMBIA1302 närvarande i sample på grund av kvarvarande kontaminering av A. tumefaciens, använd koloni-PCR. Tillsätt en liten mängd transformantceller till 10 μl sterilt vatten och koka vid 98 °C i 15 minuter. Använd detta som mall för PCR.
- Designa primers för en region utanför T-DNA på pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' och B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
OBS: Följande betingelser användes för denna studie: 94 °C i 3 min; 30 cykler (94 °C i 30 s, 48 °C i 30 s, 68 °C i 5 min); 68 °C i 7 min. Använd en kokt koloni av A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) som en positiv kontroll och en kokt koloni av vildtyp C. vulgaris som en negativ kontroll.
- Designa primers för en region utanför T-DNA på pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' och B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
- För att bekräfta att det inte finns någon A. tumerfaciens-kontaminering i provet, använd koloni-PCR. Tillsätt en liten mängd transformantceller till 10 μl sterilt vatten och koka vid 98 °C i 15 minuter. Använd detta som mall för PCR.
- Designprimers för virE2-genen som finns på AGL-1-virulensplasmiden (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' och virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
OBS: Följande betingelser användes för denna studie: 94 °C i 3 min; 30 cykler (94 °C i 30 s, 53 °C i 30 s, 68 °C i 3 min); 68 °C i 7 min. Använd en kokt koloni av A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) som en positiv kontroll och en kokt koloni av vildtyp C. vulgaris som en negativ kontroll.
- Designprimers för virE2-genen som finns på AGL-1-virulensplasmiden (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' och virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
- Kör PCR-prover på en DNA-agarosgel tillsammans med en stege (1 Kbp DNA-stege, se Materialförteckning) för att bekräfta storleken på de resulterande fragmenten16.
5. Mätning av fluorescensen hos transformanter
- Inokulera varje transformant från en logfasunderhållskultur eller TAP-agarlutning till 50 ml TAP kompletterat med 200 mg/L-1 cefotaxim och 25 mg/L-1 hygromycin B så att start-OD 600 = 0,1. Inokulera en kultur med vildtyp C. vulgaris och endast 200 mg/L-1 cefotaxim som negativ kontroll. Inkubera vid 25 °C vid 150 rpm med 150 μmol/m2s fotosyntetiskt aktivt ljus (se materialförteckning).
- Var 24:e timme, ta ett prov på 300 μL och mät absorbansen och fluorescensen (excitation 488 nm, emission 526 nm) i en 96-håls plattläsare eller UV/Vis-spektrometer och fluorometer (se materialförteckning). Använd en svart platta med genomskinlig botten för samtidiga mätningar.
6. Råproteinextraktion, proteinrening och SDS-PAGE-elektrofores
- Inokulera transformant (#50) från en underhållskultur i logfas till 300 ml TAP kompletterat med 200 mg/L-1 cefotaxim och 25 mg/L-1 hygromycin B för att nå OD680 = 0,1. Inokulera en kultur med vildtyp C. vulgaris och endast 200 mg/L-1 cefotaxim som negativ kontroll. Inkubera vid 25 °C vid 150 rpm med 150 μmol/m2s fotosyntetiskt aktivt ljus.
- Extrahera råproteinprovet från transformanten (#50) och vildtypsstammarna med hjälp av 5 ml lysbuffert (se tabell 1), följt av ultraljudsbehandling i 4 min.
- Rena råproteinprovet med ett Ni-NTA-harts genom 5 ml polypropenkolonner (se materialförteckning).
- Frystorkade 15 ml renade proteinprover och återsuspendera dem i 1 ml lysbuffert för SDS-PAGE-analys17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att visa framgångsrik transformation med hjälp av metoden ovan samodlades C. vulgaris med antingen AGL-1 innehållande pCAMBIA1302-plasmiden eller utan plasmiden (vildtyp och pläterad på TAP-agar kompletterad med hygromycin B och cefotaxim (Figur 1A). Plattan längst till vänster visar de transformerade kolonierna som kan växa på hygromycin B/cefotaximplattor, och den mellersta plattan visar att vildtyp AGL-1 inte kan växa på hygromycin B/cefotaximplattorna. Tavlan längst till höger visar att när ingen selektion används (endast cefotaxim) kan C. vulgaris transformants och vildtyp växa. Enstaka kolonier ströddes på TAP-agar med hygromycin B och cefotaxim (Figur 1B). Kolonier som rymt från plattan längst till höger (Figur 1B) inokulerades på TAP-vätska med Hygromycin B och cefotaxim (Figur 1C). På grund av varierande uttrycksnivåer efter slumpmässig integration av T-DNA, återfanns transformanter ursprungligen på plattor med ökande koncentrationer av hygromycin B som varierade från 25-70 mg/L. En koloni från varje platta odlades i flytande TAP-medium innehållande samma koncentration av Hygromycin B tillsammans med vildtypen C. vulgaris i den lägsta koncentrationen (Figur 1D). Vildtypen C. vulgaris kan inte växa i närvaro av Hygromycin, medan kolonier som är resistenta upp till 70 mg/L erhölls.
För att bekräfta att T-DNA-kassetten var stabilt integrerad i genomet hos C. vulgaris, subodlades en koloni som valdes ut från var och en av 20, 25, 30, 50 och 70 mg/L Hygromycin B-plattorna var och en genom upprepad strimning på TAP-agarplattor med selektion två gånger och subodlades sedan rutinmässigt i TAP-media över tio gånger. Transformant #20, #25, #30, #50, #50 respektive #70. Med hjälp av dessa kulturer utfördes både koloni-PCR för att utesluta kontaminering av pCAMBIA1302 i AGL1, och genomiskt DNA extraherades för att bekräfta att mGFP5-genen fanns i C. vulgaris-genomet. I figur 2A utfördes koloni-PCR med hjälp av primers riktade mot en 5 kbp-region utanför T-DNA:ts vänstra och högra gränser och kunde amplifiera denna region från pCAMBIA1302-plasmiden som en positiv kontroll, men denna region fanns inte i något av C. vulgaris-proverna , vilket indikerar att pCAMBIA1302-DNA inte fanns i någon av kulturerna. Vildtypsprovet av C. vulgaris användes som en negativ kontroll, och ingen amplifiering sågs.
Genomiskt DNA extraherades från transformanterna #25, #50 och #70, och PCR utfördes, vilket amplifierade en 1763 bp-region som innehöll mgfp5-genen i T-DNA för att bekräfta integration i transformanterna (Figur 2B). pCAMBIA1302 användes som en positiv kontroll, och amplifiering detekterades i alla transformanter, vilket indikerar att mgfp5-genen var närvarande i alla transformanternas genomiska DNA. Vildtypen C. vulgaris användes som en negativ kontroll, och ingen förstärkning sågs. Figur 2C visar amplifieringen av ett 600 bp-fragment av virulensproteinet E2 (VirE2) som finns i den tumörinducerande plasmiden (Ti-plasmiden) av AGl1-stammen. Den positiva kontrollen, bestående av AGl1-stammen innehållande pCAMIA1302, amplifierades framgångsrikt med primrar, vilket indikerar närvaron av A. tumefaciens i provet. Alla prover från C. vulgaris testades dock negativt för denna region, vilket tyder på att upprepad subkultivering på cefotaxim framgångsrikt eliminerade kontaminering av AGL1 från kulturen. Vildtypsprovet av C. vulgaris användes som en negativ kontroll, och ingen amplifiering observerades. Sammantaget bekräftar dessa tre tester att T-DNA innehållande mgpf5 sattes in i genomet hos C. vulgaris, och dessa resultat berodde inte på kontaminering av AGL1 i proverna eller på förekomsten av pCAMBIA1302 i cellerna. Dessa resultat upprepades efter 20 och cirka 100 subkulturer av transformanterna, vilket bekräftade den långsiktiga integrationen av T-DNA i genomet.
Slutligen bekräftades fenotypen genom att odla transformanterna i TAP-media med selektion och mätning av fluorescensen. Detta jämfördes med vildtypen C. vulgaris. På grund av bakgrundsabsorbansen/autofluorescensen av klorofyll jämfördes fluorescensen genom att normalisera data till vildtypsstammen. I figur 3A kan man se att det finns en märkbar skillnad i tillväxt mellan transformanterna och vildtypen C. vulgaris. Detta kan potentiellt tillskrivas de många slumpmässiga integrationerna av T-DNA i genomet, vilket kan påverka andra cellulära processer och leda till långsammare tillväxt. Icke desto mindre visar figur 3B att trots den lägre tillväxten uppvisar alla de utvalda stammarna högre fluorescensnivåer när de normaliseras för celltäthet. Noterbart är att stam #70 uppvisade signifikant högre fluorescensnivåer än de andra, med ett p-värde på <0,01. Detta understryker vikten av att screena många kolonier för att identifiera transformanter som uttrycker det önskade proteinet utan att negativt påverka det övergripande tillväxtbeteendet.
För att bekräfta uttrycket av mGFP5-6xHis användes SDS-PAGE för att analysera råproteinextraktet och his-tag-renade proteiner från både C. vulgaris (WT) och C. vulgaris transformant (#50). Därefter gjordes rening av his-tag-proteinet med hjälp av ett Ni-NTA-harts gravitationsflödessats enligt tillverkarens protokoll18. Figur 4 visar närvaron av mGFP5-6xHis protein (~30 kDa) i transformantprovet #50 och inget protein i den negativa kontrollen (WT C. vulgaris).
Figur 1: Återhämtning av C. vulgaris-transformanter efter AMT. (A) Efter samodling av C. vulgaris är transformanter AGL-1 som innehåller pCAMBIA-plasmiden eller utan plasmiden (endast AGL-1) på selektiva plattor. (B) Omstrimmiga enstaka kolonier utvalda från Hygromycin B (20 mg/L) plattor på selektiv TAP-agar. (C) Förrymda kolonier saknar tillväxt från endast AGL1-plattan på Hygromycin B (20 mg/L) flytande media. (D) Tillväxt av enskilda kolonier #25, #50 och #50 från Hygromycin-urvalsplattor odlade i flytande TAP-medier som innehåller Hygromycin och vildtyp C. vulgaris som inte kan växa i Hygromycin-media. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Detektion av pCAMBIA1302-kontaminering . (A) Integrering av T-DNA i transformanter (B) och detektion av A. tumefaciens-kontamination (C). WT indikerar vildtyp C. vulgaris, PC är den positiva kontrollen (pCAMBIA1302) och AGL1 indikerar A. tumefaciens AGL1-stam. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Tillväxt och fluorescens hos transformanterna 3 dagar efter inokulering. (A) Tillväxt mätt som absorbans vid 680 nm. (B) Fluorescens normaliserad till vildtypsstammen. Medelvärdet av 3-4 biologiska replikat, felstaplarna representerar 1 σ. *p < 0,05, **p < 0,01 jämfört med vildtypen (WT). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: SDS-PAGE-analys av mGFP5-6xHis uttryck i C. vulgaris (WT) och transformerat C. vulgaris-prov #50. Extrakt framställdes från råolja, renad (första tvätten), renad (utspädd) och renad (koncentrerad) från C. vulgaris (WT), bana 1-4, respektive. Rå, renad (första tvätten), renad (eluerad) och renad (frystorkad) från C. vulgaris (WT), bana 5-8, respektive. Den röda rutan indikerar renat GFP-6xHis protein från transformant #70. Proteinerna separerades på en 12-procentig polyakrylamidgel. Molekylvikterna (MW) för proteinstandarderna (Std.) visas till höger. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Namn på media/buffert | Sammansättning | ||
| LB | 5 g/L jästextrakt, 10 g/L trypton, 5 g/L NaCl | ||
| KNACKA | 20 mM Tris-bas, 1,58 mM K 2 HPO 4, 2,4 mM KH 2 PO 4, 7,0 mM NH 4 Cl, 0,83 mM MgSO4, 0,34 mM CaCl 2, 1 ml/l isättika och 1 ml/l av varje F/2-medium spårmetaller och F/2-vitaminer | ||
| F/2 medelstora spårmetaller | 22 mg/L ZnSO 4·7H 2 O, 180 mg/L MnCl 2·4H 2 O, 6,3 mg/L Na 2 MoO 4·2H 2 O, 14 mg/L CoCl 2·6H 2 O, 9,8 mg/L CuSO 4·5H 2 O, 3,15 g/L FeCl3·6H 2 O, 4,36 g/L Na 2 EDTA·2H 2 O | ||
| F/2 medelstora vitaminer | 0,1 mM Vitamin B12 (cyanokobalamin), 25 mg/L Biotin, 335 mg/L tiamin, 50 mM HEPES Buffert pH 7,8 | ||
| Lysis buffert | 20 mM Na2HPO 4, 300 mM NaCl, pH7,4 | ||
Tabell 1: Medie- och buffertrecept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omvandlingens effektivitet är förknippad med flera olika parametrar. Valet av A. tumefaciens-stammar som används för AMT är avgörande. AGL-1 är en av de mest invasiva stammarna som upptäckts och har därför använts rutinmässigt i AMT. Att komplettera induktionsmediet med glukos (15-20 mM) är också viktigt för AMT-effektiviteten. Med tanke på att C. vulgaris kan växa under både fototrofa och heterotrofa förhållanden, utelämnas ofta glukos eller andra kolkällor från mikroalgmedier för att förhindra kontaminering. Till exempel är Bold's Basal Medium (BBM) det mest använda mediet för fototrofisk odling av C. vulgaris19. BBM stöder dock inte tillväxt av A. tumefaciens på grund av avsaknaden av en organisk kolkälla och ammonium som kvävekälla som den föredrar (BBM använder nitrat)20. Därför användes TAP-media i detta arbete eftersom det innehåller acetat som kolkälla för C. vulgaris, glukos för A. tumefaciens och ammonium som en kvävekälla som båda arterna kan använda. TAP-agarplattor möjliggör också mycket snabbare tillväxthastigheter för C. vulgaris, vilket minimerar tiden för att återvinna transformanter efter AMT. För att inducera virulensproteiner i Ti-plasmider måste även 200 μM acetosyringon tillsättas till induktionsmediet.
För att eliminera A. tumefaciens från odlingen efter AMT användes cefotaxim, tillsammans med seriell passage. AGL-1 är resistent mot ampicillin, kloramfenikol, rifamycin och streptomycin, och den är känslig för cefotaxim, tetracyklin, spektinomycin och kanamycin. I växter används cefotaxim ofta för att eliminera A. tumefaciens eftersom det har en lägre fytotoxisk effekt för skottregenerering hos många växtarter än andra antibiotika21. Men vi bekräftade också att tetracyklin (som kostar cirka 100 gånger mindre) kunde användas istället för cefotaxim i detta protokoll i kombination med seriell passage från en enda koloni (data visas inte). Detta beror sannolikt på att antibiotika som tetracyklin skulle hämma proteinsyntesen i kloroplasten i växter som är beroende av fotosyntes22. C. vulgaris kan dock växa i mörker när den kompletteras med acetat, vilket innebär att kloroplastdysfunktion inte nödvändigtvis är giftigt för denna art under noggrant utvalda förhållanden.
Även om 20 mg/l hygromycin B var tillräckligt för att förhindra tillväxt av vildtyp C. vulgaris, testades ett intervall av hygromycin B-koncentrationer (20-70 mg/L). Det är möjligt att kolonier som isolerats från plattor med högre koncentration kan ha flera integrerade kopior av T-DNA:t eller att T-DNA:t är beläget i en mer transkriptionellt aktiv region av genomet, vilket resulterar i högre uttryck av hygromycin B-fosfotransferas, vilket resulterar i snabbare inaktivering av herbiciden och mindre fördröjningstid ikulturtillväxten. Flera kopior kan vara orsaken till skillnaderna i intensiteten hos PCR-produkterna vid amplifiering av mgfp5 från genomet (figur 2B). Närvaron av GFP-6xHis-protein i det renade provet under SDS-PAGE-analys (Figur 4, Lane 8) och dess frånvaro i vildtypsstammen (Figur 4, Lane 4) bekräftar att AMT och pCAMBIA1302 kan användas för framgångsrikt uttryck och stabil integration av transgen i C. vulgaris.
I detta arbete utvecklade och optimerade vi ett protokoll för tillförlitlig C. vulgaris UTEX 395-transformation med hjälp av A. tumefaciens AGL-1 och en pCAMBIA-systemplasmid. Eftersom alla stammar och plasmider som behövs för detta arbete finns tillgängliga från flera olika källor, kommer denna metod att vara lätt att replikera i vilket laboratorium som helst. Som en av de viktigaste industriella stammarna av mikroalger kommer en standardreferensmetod för tillförlitlig AMT att vara avgörande för att konstruera C. vulgaris för biotekniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter har konstaterats.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Prof. Paul Hooykaas för att ha tillhandahållit pCAMBIA1302-vektorn och Agrobacterium tumefaciens AGL1 från Institute of Biology Leiden, Leiden University, Nederländerna. Författarna vill också tacka Eva Colic för hennes hjälp med att odla de fluorescerande transformanterna. Detta arbete finansierades av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada och Mitacs Accelerate-programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
References
- Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
- Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
- Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
- Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W.
- Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
- de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G.
- Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
- Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
- Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
- Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
- Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
- Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
- NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
- Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
- Morton, E. R., Fuqua, C.
- Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
- Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
- Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).
