Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

عزل وتحديد الخلايا المتخصصة في الحوفي

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل وتحديد الخلايا المتخصصة في الحوفي البشري.

Abstract

نبلغ هنا عن إجراء قياسي لعزل وتحديد الخلايا المتخصصة القزحية (LNCs). تم استخدام أنسجة الليمبوس التي تم الحصول عليها من بنك العين لعزل LNCs. تم تقسيم الأنسجة إلى 12 قطعة تحت ظروف معقمة وهضمها لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا باستخدام كولاجيناز A للحصول على مجموعات الخلايا مع LNCs والخلايا السلفية الظهارية القزحية. تم هضم مجموعات الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام 0.25٪ trypsin-EDTA للحصول على خلايا مفردة ثم زرعها في وسط الخلايا الجذعية الجنينية المعدلة (MESCM) على سطح بلاستيكي مغطى ب 5٪ Matrigel. تم تمرير الخلايا عند التقاء 70٪ ، وتم تحديد LNCs باستخدام التألق المناعي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) ، وقياس التدفق الخلوي. تم عزل LNCs الأولية ومرورها أكثر من 12 مرة. كان نشاط انتشار LNCs من P4 إلى P6 هو الأعلى. عبرت LNCs عن علامات خلايا جذعية أعلى من BMMSCs (SCF و Nestin و Rex1 و SSEA4 و CD73 و CD90 و MSX1 و P75NTR و PDGFRβ). علاوة على ذلك ، أظهرت النتائج أن P4 LNCs عبرت بشكل موحد عن VIM و CD90 و CD105 و PDGFRβ ، ولكن ليس Pan-CK ، والتي يمكن استخدامها كعلامة لتحديد LNCs. أظهر تحليل التدفق الخلوي أن ما يقرب من 95٪ و 97٪ و 92٪ و 11٪ من LNCs عبرت عن CD73 و CD90 و CD105 و SCF على التوالي ، بينما كانت 68٪ و 99٪ و 20٪ و 3٪ في BMMSCs. ويمكن أن توفر العملية المعيارية لعزل البلدان غير الطبيعية وتحديد هويتها أساسا مختبريا موثوقا به للاستخدام الواسع النطاق للبلدان غير الطبيعية.

Introduction

أصبح حدوث نقص الخلايا الجذعية الظهارية القرنية (CESD) ، ويسمى أيضا نقص الخلايا الجذعية الطرفية (LSCD) 1 ، وتجديد ظهارة القرنية (CES) أكثر إلحاحا بسبب عدوى القرنية وإصابتها. إذا لم يتم علاجها بشكل صحيح ، يمكن أن يؤدي CESD إلى العمى الذي يتطلب زرع القرنية. نتيجة لذلك ، أصبح تجديد CES أكثر أهمية. هناك مجموعة من الخلايا الداعمة تسمى الخلايا المتخصصة القزحية (LNCs) التي توفر الدعم الأساسي لوظيفة CES. تم عزل الخلايا الجذعية اللحمية القزحية لأول مرة بواسطة Polisetty et al.2 وتم تحديدها بواسطة Xie et al.3 على أنها LNCs المترجمة في ظهارة القزحية تحت الانبساط وسدى الليمبوس. LNCs هي الخلايا الجذعية الداعمة الرئيسية لحافة القرنية ، ومع وظيفة MSC المشتقة من نخاع العظم (BMMSCs) ، ويمكن تحريضها على التطور إلى خلايا ظهارية القرنية وخلايا انسجة القرنية ، إلخ.3،4،5،6،7. أظهرت الدراسات السابقة أن صفات الخلايا الجذعية ل LNCs أكثر بدائية منBMMSCs 8 ، والتي تستخدم بالفعل على نطاق واسع في العيادة. قد تصبح LNCs الخيار التالي القابل للتطبيق بعد MSC ، خاصة لعلاج CESD. كخلايا داعمة مهمة ل CES ، فإن LNCs هي أيضا خلايا جذعية مشتقة من البنية "المتخصصة" للطرف. قد تلعب LNCs دورا رئيسيا في إلغاء تمايز الخلايا الظهارية القرنية الناضجة (MCEC) إلى CES9. ومع ذلك، لا تزال الدراسات المتعلقة بالشركات غير المحلية غير كافية نسبيا، ولا يوجد توافق في الآراء بشأن مصطلحات الشركات غير الساحلية وعزلها وتنقيتها وتحديدها وخصائصها. قام بعض الباحثين بتسمية LNCs الخلايا الجذعية اللحمية المشتقة من الخزعة الطرفية 10 ، والخلايا الجذعية الوسيطة الطرفية11 ، والخلايا الجذعية الليفية الطرفية12 ، والخلايا اللحمية المتوسطةالطرفية 13. نظرا لأن خصائص نمو LNCs لم يتم وصفها بالتفصيل ، وبسبب تطبيقاتها العلمية والسريرية الواعدة ، وقد تكون واحدة من أهم الأدوات السريرية في المستقبل ، فمن الضروري تلخيص عزل وتنقية وتحديد وخصائص LNCs.

وفقا لدراسة سابقة14 ، توجد LNCs بشكل رئيسي في ظهارة القزحية تحت وسدى الليمبوس. يتضمن هذا البروتوكول علاج أنسجة الأطراف باستخدام كولاجيناز أ ، والحصول على مجموعة تتكون من LEPC و LNCs ، وهضمها في خلايا مفردة مع 0.25٪ trypsin-EDTA (TE). ثم تم استزراع LNCs بشكل انتقائي في وسط الخلايا الجذعية الجنينية المعدلة (MESCM) لتنقيتها. البروتوكول المذكور في هذه الورقة بسيط وله كفاءة عالية في الحصول على LNCs البشرية بكميات كبيرة.

تم تسجيل الإجراء التفصيلي لعزل LNC وثقافته وتحديد هويته في الفيديو للعلماء المهتمين بدراسة LNC ، ويمكن تكراره بسهولة عند الحاجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على أنسجة ليمبوس من متبرعين تتراوح أعمارهم بين 50 و 60 عاما من بنك العيون التابع للصليب الأحمر ، مستشفى تونغجي (ووهان ، الصين). تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات في تونغجي وتم إجراؤه وفقا لإعلان هلسنكي.

1. العزلة

  1. احصل على أنسجة الحواف من وسط تخزين القرنية على المدى المتوسط واعمل في ظل ظروف معقمة على طاولة عمل فائقة النظافة.
  2. كشط وإزالة القزحية والبطانة حول القرنية باستخدام شفرة جراحية مستديرة معقمة.
  3. قطع الأنسجة الطرفية إلى اثني عشر قطعة متساوية الحجم مع شفرة جراحية مع ترك 1 مم على جانبي القرنية والصلبة.
  4. انقل أنسجة الأطراف إلى طبق استزراع 3.5 سم ، أضف 1 مل من كولاجيناز أ (2 مجم / مل ، في وسط DF-12) ، لغمر جميع الأنسجة للهضم.
  5. ضع اللوحة في حاضنة الخلايا 37 درجة مئوية ، وهضم الأنسجة الداكنة حول القزحية لمدة 18 ساعة.
    ملاحظة: عادة ما يتم تنفيذ إجراءات المتابعة في اليوم الثاني.
  6. قم بإعداد مصفوفة غشاء قاعدي بنسبة 5٪ (Matrigel) مطلية بلوحة استزراع 6 آبار.
    1. قم بتغطية مصفوفة غشاء القاع بنسبة 5٪ (مذابة في MESCM [الجدول 1]) في قاع البئر.
    2. قم بإعداد أطراف 200 ميكرولتر و 1 مل ، وأنبوب طرد مركزي واحد سعة 15 مل ، ولوحة واحدة من 6 آبار في كيس معقم.
    3. ضع الكيس المعقم (بما في ذلك النصائح وأنبوب الطرد المركزي) ولوحة جديدة من 6 آبار في بيئة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي في الثلاجة عند 4 درجات مئوية.
    4. أخرج الأطراف المبردة مسبقا وأنبوب الطرد المركزي ولوحة 6 آبار من بيئة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية ، ثم قم بإجراء العمليات التالية على طاولة العمل فائقة النظافة.
    5. انقل مصفوفة غشاء القاعدية 50 ميكرولتر 5٪ إلى 1 مل MESCM باستخدام طرف 200 ميكرولتر ، واخلطهم برفق وبشكل متساو.
    6. انقل مصفوفة غشاء القاع بنسبة 5٪ (مذابة في MESCM) إلى بئر واحد من صفيحة استزراع ذات 6 آبار باستخدام طرف 1 مل المبرد مسبقا.
    7. هز لوحة 6 آبار برفق وأفقيا ، ضع لوحة الاستزراع المكونة من 6 آبار في حاضنة الخلايا 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة تقريبا ، ثم قم بتنفيذ الخطوة التالية.
  7. بعد 18 ساعة من الهضم ، أخرج الكولاجين من الأنسجة الطرفية المهضومة ، وستبقى فقط بعض المجموعات الصغيرة المرئية والأنسجة الصلبة غير المهضومة.
    ملاحظة: يكشف الفحص المجهري عالي التكبير عن مجموعة مكونة من العديد من الخلايا المعبأة بكثافة (بما في ذلك LNCs).
  8. استخدم طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لفصل المجموعات عن الأنسجة الصلبة غير المهضومة تحت المجهر المجسم.
  9. انقل المجموعات إلى لوحة الاستزراع التي يبلغ قطرها 3.5 سم واغمرها في 0.25٪ TE ، ثم ضع اللوحة في حاضنة الخلايا لمدة 15 دقيقة.
  10. أضف 1 مل MESCM مع مصل بالضربة القاضية بنسبة 10٪ لإيقاف هضم الخلايا وماصة بلطف لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق المجموعات في خلايا فردية باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل.
  11. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  12. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج ترسيب الخلية ، ثم أضف 1 مل MESCM لإعادة تعليق الخلايا.
  13. ماصة صعودا وهبوطا 2-3 مرات حتى يتم تعليق ترسيب الخلية السفلية بالتساوي في MESCM باستخدام طرف ماصة 1 مل ، واتخاذ تعليق خلية 20 ميكرولتر لعد الخلايا.
  14. انقل تعليق الخلية إلى لوحة 6 آبار مطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي بنسبة 5٪ مع طرف ماصة سعة 1 مل وقم بزيادة حجم MESCM إلى 2.5 مل.
  15. هز برفق لوحة 6 آبار أفقيا لتوزيع الخلايا بالتساوي.
  16. نقل الخلايا إلى حاضنة الثقافة بعد تصويرها وتسجيلها. مراقبة وتصوير الخلايا يوميا ، وتغيير الوسيط كل 3-4 أيام.

2. تحديد LNC

  1. تلطيخ المناعي
    1. قم بهضم LNCs من أسفل اللوحة باستخدام 1 مل 0.25٪ TE لمدة 5 دقائق في حاضنة الخلايا 37 درجة مئوية.
    2. قم بإنهاء عملية الهضم عن طريق إضافة 1 مل MESCM (يحتوي على مصل بالضربة القاضية) ، والطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، ونضح المادة الطافية بعناية.
    3. أضف 1 مل MESCM لإعادة تعليق الخلايا في التعليق. قم بإعداد تعليق خلية 80 ميكرولتر (4 × 103 خلايا لكل شريحة) ل 4 شرائح (20 ميكرولتر / شريحة) واستخدم نظام الطرد المركزي لإيداع الخلايا على شرائح المجهر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    4. قم بإصلاح الخلايا (الملتصقة بالشرائح في الخطوة 3) باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق تقريبا ، ثم قم بتخلل الخلايا على الشرائح بنسبة 0.2٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة.
    5. قم بسد الخلايا لمدة ساعة واحدة مع 2٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) قبل احتضانها بالأجسام المضادة الأولية (Pan-CK [1: 1000] ، Vim [1: 100] ، CD90 [1: 100] ، CD105 [1: 200] ، SCF [1: 100] ، PDGFRβ [1: 100]) على شاكر طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المنضمة عن طريق غسل (5 دقائق / غسل ، 3x) الشرائح باستخدام PBST (PBS + 0.1٪ Tween 20).
    6. احتضان الأجسام المضادة الثانوية المقابلة (حمار مضاد للفأر IgG الجسم المضاد الثانوي TRITC [1: 1000] ، حمار مضاد للأرانب IgG FITC [1: 500] ، حمار مضاد للفأر IgG 488 [1: 300] ، حمار مضاد للأرانب IgG 594 [1: 400]) لمدة ساعة واحدة مع أجسام مضادة IgG غير محددة مناسبة. قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي غير المنضم باستخدام PBST (5 دقائق / غسل ، 3x).
    7. قم بتلطيخ النوى ب 5 ميكروغرام / مل DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole) وأغلق الشرائح.
    8. إجراء التصوير الفلوري باستخدام مجهر مضان (التكبير: 400x; وقت التعرض: 50 مللي ثانية).
  2. تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي (qPCR)
    1. خذ مجموعة عزل الحمض النووي الريبي لاستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. استخدم مجموعة نسخ cDNA عالية السعة لعكس نسخ 1-2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى cDNA.
    3. قم بإجراء النسخ العكسي (42 درجة مئوية ، 2 دقيقة ؛ 50 درجة مئوية ، 85 دقيقة) و qPCR (95 درجة مئوية ، 5 دقائق ؛ 95 درجة مئوية ، 10 ثوان ، 40 دورة) في محلول 20 ميكرولتر يحتوي على cDNA (100 نانوغرام) ، مزيج فحص التعبير الجيني TaqMan (1 ميكرولتر) ، مزيج PCR Master العالمي (10 ميكرولتر) و ddH2O (إلى 20 ميكرولتر).
    4. استخدم تقنية التصوير المقطعي المحوسب المقارن (ΔΔCT)4,9 لفحص التعبير الجيني النسبي.

3. توصيف LNC

  1. عد الخلايا (مقياس الدم)
    1. قم بهضم LNCs من أسفل اللوحة باستخدام 0.25٪ TE لمدة 5 دقائق في حاضنة الخلايا 37 درجة مئوية.
    2. قم بإنهاء عملية الهضم عن طريق إضافة 1 مل MESCM (يحتوي على مصل بالضربة القاضية) ، والطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، ونضح المادة الطافية بعناية.
    3. أضف 1 مل MESCM لإعادة تعليق الخلايا ، ثم خذ تعليق خلية 10 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي 0.5 مل. أضف حجما متساويا من محلول تلطيخ أزرق Trypan بنسبة 0.4٪.
    4. ضع معلق خلية ملطخة 10 ميكرولتر على منطقة العد في مقياس الدم وقم بتغطيته بغطاء للعد.
      ملاحظة: يتم تعريف عدد الخلايا في مناطق المربع الأوسط الخمسة على أنها "A" ؛ يتم حساب رقم الخلية في 1 مل على أنه 5A × 104 × 2.
  2. فحص علامات LNC و BMMSC مع قياس التدفق الخلوي15
    1. الكشف عن تعبير SCF و CD73 و CD90 و CD105 في LNCs و BMMSCs باستخدام قياس التدفق الخلوي 15 (2-4 ×10 6 أحداث / عينة ، تم الحصول على 2000 خلية من كل عينة ، بإجمالي 550000 خلية تم إغلاقها في وقت واحد).
    2. اجمع الخلايا وقم بتلطيخها عند 20-30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في مخزن مؤقت مانع (3٪ BSA و 0.05٪ Tween-20 في PBS) باستخدام الأجسام المضادة المصنفة مسبقا (SCF [1:50] و CD70 [1:50] و CD90 [1:50] و CD105 [1:50]) وفقا لتعليمات المجموعة.
    3. قم بإجراء تحليل فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) باستخدام مقياس التدفق الخلوي. في هذه الدراسة ، تم استخدام برنامج FACS Diva وبرنامج FlowJo. لكل عينة ، سجل 10000 حدث وقم ببوابة الخلايا الحية وتحليلها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نمو LNC
تم عزل LNCs بنجاح وفقا لطريقة هضم كولاجيناز A (2 مجم / مل) لهضم أنسجة حافة القرنية الصلبة ، كما هو موضح أعلاه (الشكل 1). تمشيا مع دراسة تم الإبلاغ عنهاسابقا 3 ، بعد هضم كولاجيناز أ ، تم تصور مجموعات تشبه اليرقة تحت المجهر (الشكل 2). زادت نسبة خلايا المغزل تدريجيا مع مرور الخلية. يمكن أن تنمو الخلايا على شكل مغزل على ألواح مصفوفة غشاء قاعدي مطلية بنسبة 5٪ ، على عكس نظيراتها المزروعة على البلاستيك بدون مصفوفة غشاء القاعدية المطلية3. أظهرت الخلايا من P1 إلى P12 معدل تكاثر موحد ، مع مضاعفة وقت الخلية بين يومين و 7 أيام (الجدول 2). في هذه الدراسة ، تم استزراع LNCs إلى 13 مقطعا ، و 34 مضاعفة (الشكل 3) 3. تم استزراع LNCs من الخلايا الأولية (LNC P0) ؛ نما LNC P0 ببطء واستغرق حوالي 12 يوما. احتاجت LNCs إلى حوالي 3 أيام فقط للمرور في P1-P8 ، وانخفض معدل نمو LNCs بعد P9 بشكل ملحوظ (الجدول 2). من حيث مورفولوجيا الخلية ، كانت LNCs على شكل مغزل ، ومستديرة في P0. بعد P3 ، كانت LNCs على شكل مغزل بنفس الحجم المورفولوجي (الشكل 2). تم قياس مدى التوسع الكلي على أنه عدد السكان الذين يتضاعف من P0 إلى P13 باستخدام الصيغة التالية: عدد مضاعفة الخلايا (NCD) = log10 (y / x) / log102 ، حيث y هي الكثافة النهائية للخلايا و x هي كثافة البذر الأولية للخلايا3. وتمثل الأمراض غير المعدية معدل نمو البلدان غير الساحلية (الشكل 3 ألف). من منحنيات NCD و NCD التراكمية (الشكل 3B) ، استغرقت LNCs أقل وقت لزيادة أضعافا مضاعفة ونمت بشكل أسرع من P3-P5 (الشكل 3). بعد P5 ، انخفض معدل نمو الخلايا بشكل ملحوظ ، وعاد NCD إلى 1.32 في P13 ، وتوقف النمو تقريبا.

تحديد LNC
بعد عزلة وثقافة LNCs ، كانت المهمة المهمة الأخرى هي تحديد الهوية. تم التعبير عن LNCs ل Vim و CD90 و CD105 و SCF و PDGFRβ ، ولكن ليس Pan-CK ، وفقا للدراسات الحالية ذات الصلة حول LNCs (الشكل 4)9. كشف LNC P4 المناعي المزدوج أن هذه الخلايا كانت باستمرار Pan-CK- / Vim + / CD90 + / CD105 + / SCF + / PDGFR + (الشكل 4). كشف qPCR أيضا عن انخفاض تعبير Pan-CK في P2 وزيادة نصوص Vim و CD90 و CD105 و SCF و PDGFR في P3. زادت مستويات النسخ من Vim و CD90 و CD105 و SCF و PDGFR بشكل كبير في P4 مقارنة ب P1 (p < 0.01) (الشكل 4)9.

خصائص LNC
أظهر تحليل إضافي أن LNCs عبرت عن المزيد من علامات الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) (Nestin و Rex1 و SSEA4) ، وعلامات الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) (CD73 و CD90 و CD105) ، وعلامات الخلايا المتخصصة (NC) (MSX1 و P75NTR و PDGFRβ) (الشكل 5) 15. أشار قياس التدفق الخلوي إلى أن خصائص المستضد السطحي ل MSCs ، بما في ذلك CD73 و CD90 و CD105 ، تم التعبير عنها في كل من LNCs و BMMSCs15. كانت النسب المئوية للشركات غير التجارية التي عبرت عن CD73 و CD90 و CD105 و SCF حوالي 95٪ و 97٪ و 92٪ و 11٪ على التوالي ، في حين كانت نسب BMMSCs 68٪ و 99٪ و 20٪ و 3٪ على التوالي. هذا يدل على أن LNCs تعبر عن مستويات أعلى بكثير من علامات MSC الإيجابية CD73 و CD105 والسيتوكين SCF (p < 0.01) ومستوى مماثل من CD90 (p > 0.05) مقارنة ب BMMSCs (الشكل 6) 15.

Figure 1
الشكل 1: عملية عزل LNCs. أ: نسيج حافة القرنية الصلبوية. (ب) التجمعات بعد هضم كولاجيناز أ عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: P0 إلى P13 LNCs المستزرعة على مصفوفة غشاء قاعدي 5٪ مطلية بلوحة 6 آبار في MESCM. (بار = 50 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نمط نمو الشركات غير الساحلية من P0-P13. (أ) الأمراض غير السارية للبلدان غير المشروعة من P0-P13؛ (ب) الأمراض غير السارية التراكمية للبلدان غير الساحلية من P0-P13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التألق المناعي و qPCR. كشف التألق المناعي و qPCR أن LNCs عبرت بشكل موحد عن Vim و CD90 و CD105 و SCF و PDGFRβ ، ولكن ليس Pan-CK. وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من Zhu et al.9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تعبر LNCs عن علامات ESC و MSC و NC أكثر من BMMSCs. تم إخضاع P4 LNCs و P4 BMMSCs إلى qPCR للتعبير عن النسخ لعلامات ESC (A) و MSC وعلامات القمة العصبية (B) (n = 3 و * P < 0.05 و # P < 0.05 و ** p < 0.01 على التوالي). التلوين المناعي لعلامات ESC (C) وعلامات MSC ، NC (D) ، مع الصبغة النووية المضادة بواسطة Hoechst 33342. قضبان المقياس = 25 ميكرومتر. وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من Li et al.15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: فرز الخلايا المنشطة بالتألق ل P4 LNCs و BMMSCs (A-F). تحليل فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) لعلامات MSC بما في ذلك CD73 و CD90 و CD105 (n = 3). وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من Li et al.15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكاشف تركيز محلول المخزون حجم التركيز النهائي بيئة التخزين
DME/F-12 1:1(1×) الوسط الأساسي 180 مل 90% 4 درجة مئوية
خروج المغلوبTMSR - 20 مل 10% -20 درجة مئوية
استبدال المصل ل ESCs / iPSCs
العامل المثبط لسرطان الدم البشري الموصى به (Lif) 50 ميكروغرام / مل 40 ميكرولتر 10 نانوغرام / مل -80 درجة مئوية
FGF البشري المؤتلف الأساسي 100 ميكروغرام / مل 8 ميكرولتر 4 نانوغرام / مل -80 درجة مئوية
ITS (الأنسولين ، الترانسفيرين ، سيلينيت الصوديوم) 500 ميكروغرام / مل من الأنسولين 2 مل 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين -20 درجة مئوية
500 ميكروغرام / مل ترانسفيرين 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين
500 نانوغرام / مل سيلينيت الصوديوم 5 نانوغرام/مل سيلينيت الصوديوم
الجنتاميسين 25 ميكروغرام / مل 2 مل 50 ميكروغرام / مل 4 درجة مئوية
الأمفوتريسين ب 2500 ميكروغرام / مل 100 ميكرولتر 1.25 ميكروغرام / مل 4 درجة مئوية

الجدول 1: صياغة MESCM.

مرور كثافة البذر (× 105 خلايا / سم2) الكثافة النهائية (× 105خلايا / سم2) وقت الثقافة (أيام) عدد مضاعفة الخلايا (NCD) الأمراض غير المعدية التراكمية
ف 0 0.22 0.385714 12 0.810029 0.810029
ص 1 0.08 0.365714 4 2.192645 3.002674
ص2 0.051429 0.357143 3 2.795859 5.798533
ص3 0.037143 0.337143 2 3.182203 8.980737
ص 4 0.028571 0.311429 6 3.446256 12.42699
ص 5 0.04 0.385714 3 3.269461 15.69645
ص 6 0.054286 0.48 4 3.14439 18.84084
ص 7 0.057143 0.351429 3 2.620586 21.46143
ص 8 0.08 0.394286 3 2.30117 23.7626
ص 9 0.06 0.345714 6 2.526546 26.28915
ص 10 0.022857 0.122857 7 2.426265 28.71541
ص 11 0.025714 0.122857 5 2.25634 30.97175
ص 12 0.028571 0.114286 5 2 32.97175
ص 13 0.045714 0.114286 10 1.321928 34.29368

الجدول 2: الممرات التسلسلية ل LNC على البلاستيك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عادة ما يتم الحفاظ على شفافية القرنية من خلال الترتيب والتوزيع المنتظم للألياف الصغيرة (قطرها 25-30 نانومتر) في سدى القرنية ، وهو أمر بالغ الأهمية لحدة الرؤية الطبيعية16. هناك 253 مليون شخص يعانون من ضعف البصر في جميع أنحاء العالم ، 36 مليون منهم مكفوفون17. تعتبر منظمة الصحة العالمية (WHO) عمى القرنية أحد أخطر المخاطر على البصر البشري ، حيث تمثل 5.1٪ من جميع حالات العمى في جميع أنحاء العالم16. عيب ظهارة القرنية مع CES الطبيعي يمكن أن تلتئم بسرعة دون ترك ندبة18. تشير التقديرات إلى أن أكثر من 12.7 مليون مريض في جميع أنحاء العالم يحتاجون إلى عمليات زرع القرنية بسبب فقدان البصر المعتدل إلى الشديد19 ؛ 30٪ من فشل زرع القرنية كان سببه CESD20. ومع ذلك ، بسبب نقص التبرع بالقرنية في معظم البلدان في جميع أنحاء العالم ، يمكن لواحد فقط من كل سبعين مريضا مصابا بعمى القرنية أن يتلقى في النهاية عملية زرع القرنية21. حاليا ، يمكن استخدام زرع الخلايا الجذعية الظهارية القرنية (CEST) لعلاج CESD22. يمكن للمرضى الذين يعانون من CESD أحادي العين الحصول على CES من عيون صحية ل CEST. ومع ذلك ، بالنسبة للمرضى الذين يعانون من CESD الثنائي ، يمكن الحصول على CES الخيفي فقط للعلاج. يبقى الرفض المناعي هو السبب الرئيسي لفشل CEST الخيفي. طريقة واعدة للحد من العلاج العلاجي ل CESD هي العثور على خلية يمكن أن تحل محل CES ذاتية المنشأ بشكل فعال أو تشجيع تمايز الخلايا الذاتية الأخرى من أماكن أخرى لتصبح CES. أصبح التمايز في المختبر للخلايا الذاتية في CES شائعا أيضا ، بما في ذلك BMMSC23 ، والخلايا الظهارية المخاطية الفموية (OMEC) 24 ، والخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSC) 19 ، والخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الليفية البشرية (iPSC) 25 ، والخلايا الجذعية الدهنية (ASC) 26. وجد Rohaina et al.23أن BMMSCs المزروعة على الأغشية الأمنيوسية لمدة 10 أيام يمكن أن تتمايز إلى خلايا ظهارية القرنية وأن تعبير CK3 و p63 زاد بشكل ملحوظ بعد تحريض التمايز. في عام 2020 ، حث O'Callaghan et al.24على تمايز الخلايا الظهارية المخاطية الفموية إلى خلايا ظهارية القرنية باستخدام نظام زراعة جديد ، واستخدمها بنجاح لعلاج CESD باستخدام بنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد (RAFT) كدعم لثقافة الخلايا الظهارية المخاطية الفموية مع الخلايا الليفية المخاطية الفموية البشرية كأرومة جوفية. بالإضافة إلى ذلك ، يتمايز DPSC بنجاح إلى خلايا انسجة القرنية والخلايا الظهارية. من خلال تنظيم التعبير عن K3 و K12 و CD90 ، يمكن ل DPSC منع غزو القرنية الملتحمة. استخدمت دراسة أخرى DPSC كصفائح الخلايا الأمنيوسية على سطح القرنية في نموذج CESD للأرانب. أظهرت النتائج أن مجموعة DPSC لديها قرنيات أنظف وتولد أوعية أقل من المجموعةالضابطة 27. حقق Hayashi et al.28التمايز باستخدام iPSC المشتق من الخلايا الليفية والذي يمكن تحفيزه في الخلايا الظهارية القرنية PAX6 (+) و K12 (+) بعد 12 أسبوعا. يتطور iPSC بشكل فعال إلى خلايا ظهارية القرنية ، وينشط K12 ، ويقمع NANOG25. اكتشف Zeppieri et al.26 أن ASCs يمكن أن تتمايز إلى خلايا ظهارية القرنية لعلاج CESD للفأر وتعزيز التئام الجروح الظهارية للقرنية في نموذج حيواني ناتج عن الليزر.

تتمركز LNCs في مكانة القزحية ، حيث يتم حماية ودعم CES ، ولها العديد من الخصائص المشابهة ل MSCs. تم عزل LNCs لأول مرة بواسطة Polisetty et al.2 وتم تسميتها لأول مرة بواسطة Xie et al.3. وفقا للدراسات الحديثة ، فإن LNCs هي خلايا جذعية أساسية أكثر من MSCs ويمكن أن تتمايز بسهولة إلى الخلايا الشحمية والخلايا الغضروفية والخلايا العظمية 4,29. بالمقارنة مع BMMSCs شائعة الاستخدام ، تظهر LNCs خصائص أكبر للخلايا الجذعية (تعبير أعلى عن CD73 ، CD105 ، PDGFR ، SCF ، إلخ.) (الشكل 5) 30. يمكن ل LNCs علاج الأرانب بنجاح باستخدام CESD الناجم عن حروق القرنية القلوية من خلال تعزيز إصلاح ظهارة القرنية وسدى15. يشير انخفاض التعبير عن الفبرونيكتين (FN) وعامل نمو النسيج الضام (CTGF) والبروتين الحمضي والغني بالسيستين (SPARC) في الخلايا الليفية القرنية إلى أن إفراز LNCs يعزز التئام الجروح ويقلل من التليف7.

في بيئة مجهرية ثلاثية الأبعاد ، الأمر المثير للاهتمام هو أن LNCs قد تتحد مع MCECs ، مما يحفز الخلايا الأخيرة لاستعادة خصائص الخلايا الجذعية9. تعمل LNCs على تسريع نمو CES31 بشكل فعال وتمنع تندب القرنية10. ومع ذلك ، فإن كمية LNCs محدودة. أشارت الدراسات إلى أنه يمثل حوالي 3٪ فقط من إجمالي عدد الخلايا اللحمية الحوفية في القرنيةالبقري 32 ، مع تعبير كبير عن كبريتات الكيراتان والكيراتوكان وALDH3A1 33. قد تكون أقل من 1٪ في القرنيات البشرية33.

في هذا البروتوكول ، تم تكرار الطرق السابقة لعزل وتنقية وتحديد LNCs3،14،34. بعد 18 ساعة من علاج أنسجة الأطراف البشرية بالكولاجيناز A (2 مجم / مل) ، تم عزل LNCs. تطورت P0 LNC ببطء وأظهرت مورفولوجيا خلوية مختلفة ، بما في ذلك LNCs على شكل مغزل ، وأخرى متعددة الأضلاع ، و MCEC كروية مرئية (الشكل 2 ، P0). أظهرت الدراسات السابقة أن LNCs هي خلايا على شكل مغزل ترتبط بالجزء السفلي من سطح الثقافة بمورفولوجيا متجانسة14. في الوقت نفسه ، تكون MCECs مستديرة29 ، وهو ما يتوافق مع مورفولوجيا الخلايا المزروعة في هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، نمت P0 LNCs ببطء إلى الخلايا التي تنمو بالكامل حوالي 70٪ -80٪ من كثافة الخلايا في حوالي 12 يوما. انتشر P1-P12 LNC بشكل أسرع بكثير ، وفي غضون 3-6 أيام ، غطى عمليا لوحة الثقافة بأكملها. بعد P1 ، فاق عدد الخلايا الملحقة LNCs على شكل مغزل عدد الخلايا المستديرة MCEC والخلايا متعددة الأضلاع.

يتضح من قيم الأمراض غير السارية في الجدول 2 والشكل 3 أن LNCs P0 لديها أدنى نسبة من الأمراض غير السارية (0.810) وأن مرور الخلية حدث على مدار 12 يوما. ومع ذلك ، بعد P1 ، تسارع نمو LNCs بشكل كبير ، وبلغ معدل النمو ذروته عند 3.44 في P4. بعد P6 ، انخفض معدل نمو الشركات غير التجارية المحلية بشكل كبير (الشكل 3). كان معدل نمو الشركات ذات القيمة المحلية ونشاط P4 هو الأعلى إلى حد كبير من حيث نمط نمو الشركات ذات القيمة المحلية المنخفضة ، بما يتفق مع النتائج السابقة التي تشير إلى أن نشاط نمو الشركات ذات الاقتصادات المحلية المحلية P4-P6 هو الأفضل9. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها قيود معينة ، يختلف عدد LNC P0 اختلافا كبيرا وفقا لعمر المتبرع ووقت الوفاة. لذلك ، عندما تكون أنسجة المتبرع أصغر سنا وأكثر نضارة ، يمكن عزل المزيد من P0 LNC. العامل الأكثر أهمية في محاكاة البيئة المكروية ل CES في المختبر هو الحاجة إلى عوامل متخصصة عالمية ، مثل مصفوفة خارج الخلية غنية بالصفيحات35.

في الختام ، تلعب LNCs دورا حاسما في دعم الخلايا الجذعية الظهارية للقرنية والحفاظ على جذع CES ، بما في ذلك التجديد الذاتي والتمايز إلى خلايا ظهارية القرنية الناضجة. من المتوقع أن يكون LNC أداة خلوية مبتكرة لعلاج المرضى الذين يعانون من CESD 9,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أي من المؤلفين أي إقرارات مالية ذات صلة.

Acknowledgments

شكرا ل Wei Wang و Lingjuan Xu و Rong Liu على التوجيه بشأن هذا العمل ، و Yongyao Tan و Bihui Jin و Chunxiu You و Li Guigang لتوفير بعض المواد ، و Guanyu Su لكتابة المخطوطة ، و Xiao Zhou و Yihong Xiong و Huatao Xie لتصحيح المخطوطة ، و Guigang Li لتوجيهاته الكاملة. ودعمت هذه الدراسة المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82070936، 81470606، 81570819)، ومشروع البحث العلمي للصحة وتنظيم الأسرة في مقاطعة هوبى (No. WJ2017M073) ، أفضل عشرة مشاريع بحثية طبية متعدية من مستشفى تونغجي (رقم 2016ZHYX20) ، مشروع تدريب الرواد الطبيين الشباب في مدينة ووهان (رقم 2015whzqnyxggrc10) ، برنامج توظيف المواهب العالمية (G2022154028L) ، مشروع اللجنة الوطنية للصحة في مقاطعة هوبي في عام 2022 (WJ2021ZH0005) ، ومؤسسة البناء الموضوعي لقسم المالية في هوبى في عام 2022 (42000022815T000000102)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole ThermoFisher D1306 5μg/mL
Amphotericin B Sigma V900919 1.25 μg/mL
Anti-CD73 Abcam ab202122 1:50
Bovine Serum Albumin MERCK A1933 -
CD105 Proteintech 67075-1-Ig 1:200
CD105 Abcam ab114052 1:50
CD90 Proteintech 66766-1-Ig 1:100
CD90 Abcam ab307736 1:50
Cell Incubator Shanghai Lishen K1119K4644 HF90(HT)
Centrifuge system StatSpin  StatSpin CytoFuge 12 -
Collagenase A Roche 10103578001 2 mg/mL
Confocal microscope Zeiss  LSM700 -
Culture plate virya 3500356 35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)  cytiva SH30023.01 90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher A16016 1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher 31568 1:1000
FACS Diva sofware BD Biosciences Tree Star -
Flow Cytometer BD Biosciences Becton Dickinson LSRII -
Fluorescence microscope olympus cx31 
Gentamicin Sigma G1914 50 μg/mL
Hemocytometer MERCK Z359629 Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit ThermoFisher 4374966
Inverted phase-contrast microscope  UOP DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) Sigma I3146 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs gibco 10828-028 10%
Matrigel BioCoat 356234 -
Pan-CK Abcam ab7753 1:1000
Paraformaldehyde NoninBio NBS0135 4.00%
Paraformaldehyde MKBio MM-1505 4%
PDGFRβ Abclonal A1444 1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument Applied Biosystems Step One Plus -
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B 4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) Peprotech 300-05 10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit Qiagen 74104 -
SCF Bioss bs-0545R 1:100
SCF Abcam ab52603 1:50
Stereomicroscope ZEISS SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade Careforde 29500 size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix Applied Biosystems 4448489
Triton X-100 MERCK X100 0.20%
Trypan blue ThermoFisher 15250061 0.40%
Trypsin-EDTA Genview GP3108 0.25%
Tween 20 MERCK P9416 -
Ultra Clean Bench LaiTe LT20200705 SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
Vim  Abcam ab92547 1:100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
  2. Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
  3. Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
  4. Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
  5. Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
  6. Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
  7. Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
  8. Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16 (2020).
  9. Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1 (2022).
  10. Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172 (2014).
  11. Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
  12. Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
  13. Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471 (2022).
  14. Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
  15. Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566 (2018).
  16. Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011 (2022).
  17. Pineda, R. World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , Springer, Cham. 299-305 (2020).
  18. Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  19. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  20. Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441 (2022).
  21. Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562 (2022).
  22. Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
  23. Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
  24. O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265 (2020).
  25. Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
  26. Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115 (2017).
  27. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
  28. Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
  29. Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
  30. Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
  31. González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
  32. Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
  33. Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. Stem cells in the limbal stroma. Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).
  34. Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
  35. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).

Tags

الخلايا المتخصصة في القزحية ، العزل ، تحديد الهوية ، أنسجة الأطراف ، مجموعات الخلايا ، وسط الخلايا الجذعية الجنينية ، Matrigel ، التألق المناعي ، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ، قياس التدفق الخلوي ، علامات الخلايا الجذعية ، VIM ، CD90 ، CD105 ، PDGFRβ ، Pan-CK ، CD73 ، SCF ، BMMSCs
عزل وتحديد الخلايا المتخصصة في الحوفي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Su, G., Wang, W., Xu, L., Liu, R.,… More

Su, G., Wang, W., Xu, L., Liu, R., Tan, Y., Jin, B., You, C., Zhou, X., Xiong, Y., Xie, H., Li, G. Isolation and Identification of Limbal Niche Cells. J. Vis. Exp. (200), e65618, doi:10.3791/65618 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter