Summary
在这里，我们提出了一种分离和鉴定人类角膜缘生态位细胞的方案。
Abstract
在这里，我们报告了分离和鉴定角膜缘生态位细胞（LNC）的标准程序。从眼库获得的角膜缘组织用于LNCs分离。在无菌条件下将组织分成12块，并在37°C下在细胞培养箱中消化18小时，使用胶原酶A获得具有LNC和角膜缘上皮祖细胞的细胞簇。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37°C下进一步消化细胞簇15分钟以获得单细胞，然后在涂有5%基质凝胶的塑料表面上在改良的胚胎干细胞培养基（MESCM）中培养。细胞在 70% 汇合时传代，并使用免疫荧光、实时定量 PCR （qPCR） 和流式细胞术鉴定 LNC。原代 LNC 被分离并传代超过 12 次。从P4到P6的LNCs增殖活性最高。LNCs表达的干细胞标志物高于BMMSC（SCF、Nestin、Rex1、SSEA4、CD73、CD90、MSX1、P75NTR和PDGFRβ）。结果显示，P4 LNCs均均匀表达VIM、CD90、CD105和PDGFRβ，但不均匀表达Pan-CK，可作为LNCs鉴定的标志物。 流式细胞分析显示，约95%、97%、92%和11%的LNCs分别表达CD73、CD90、CD105和SCF，而在BMMSCs中分别表达68%、99%、20%和3%。LNCs分离鉴定的标准工艺可为LNCs的广泛应用提供可靠的实验室依据。
Introduction
角膜上皮干细胞缺乏症（CESD），也称为角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）1，角膜上皮再生（CES）的发病率因角膜感染和损伤而变得越来越紧迫。如果治疗不当，CESD可能导致失明，需要角膜移植。因此，CES再生变得越来越重要。有一组称为角膜缘生态位细胞 （LNC） 的支持细胞为 CES 功能提供必要的支持。角膜缘基质干细胞首先由Polisetty等2分离，Xie等3鉴定为LNC，定位于角膜缘的角膜缘上皮和角膜缘的基质。LNCs是角膜边缘的关键支持干细胞，具有骨髓来源的MSCs（BMMSCs）的功能，可诱导发育成角膜上皮细胞和角膜基质细胞等3,4,5,6,7。先前的研究表明，LNCs的干细胞质量比BMMSCs8更原始，BMMSCs8已经在临床上被广泛使用。LNC甚至可能成为继MSC之后的下一个可行选择，特别是用于治疗CESD。作为CES的重要支持细胞，LNC也是源自角膜缘“生态位”结构的干细胞。LNC 可能在成熟角膜上皮细胞 （MCEC） 向 CES9 的去分化中发挥关键作用。然而，对LNCs的研究仍然相对不足，对LNCs的术语、分离、纯化、鉴定和特性尚未达成共识。一些研究人员将 LNC 命名为角膜缘活检来源的基质干细胞10、角膜缘间充质干细胞11、角膜缘成纤维细胞干细胞 12 和角膜缘间充质基质细胞13。由于LNCs的生长特性尚未详细描述，且由于其科学和临床应用前景广阔，并且可能是未来最重要的临床工具之一，因此有必要总结LNCs的分离、纯化、鉴定和特性。
根据先前的一项研究14，LNC主要存在于角膜缘上皮下和角膜缘的基质中。该方案包括使用胶原酶A处理角膜缘组织，获得由LEPC和LNC组成的簇，并将其消化成含有0.25%胰蛋白酶-EDTA（TE）的单细胞。然后将LNCs选择性地培养在改良的胚胎干细胞培养基（MESCM）中进行纯化。本文报道的方案简单，在大量获得人LNCs方面具有很高的效率。
视频中记录了LNC分离、培养和鉴定的详细过程，供对LNC研究感兴趣的科学家使用，必要时可以方便地重复。
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Protocol
年龄在50至60岁之间的供体的角膜缘组织来自同济医院（中国武汉）红十字眼库。该协议得到了同济伦理委员会的批准，并按照《赫尔辛基宣言》进行。
1. 隔离
- 从中期角膜储存培养基中获取角膜缘组织，并在超洁净工作台上在无菌条件下操作。
- 使用无菌手术圆刀片刮擦并去除角膜周围的虹膜和内皮。
- 用手术刀片将角膜缘组织切成十二个大小相等的碎片，角膜和巩膜两侧留有 1 毫米。
- 将角膜缘组织转移到 3.5 cm 培养板中，加入 1 mL 胶原酶 A（2 mg/mL，在 DF-12 培养基中），浸入所有组织进行消化。
- 将板放入37°C细胞培养箱中，消化角膜缘组织18小时。
注意：后续程序通常在第二天进行。 - 准备5%基底膜基质（基质胶）包被的6孔培养板。
- 在孔的底部涂覆5%基底膜基质（溶解在MESCM [表1]中）。
- 在灭菌袋中准备 200 μL 和 1 mL 吸头、一个 15 mL 离心管和一个 6 孔板。
- 将灭菌袋（包括吸头和离心管）和新的6孔板置于-20°C或-80°C环境中20分钟。在4°C的冰箱中解冻基底膜基质。
- 从-20°C或-80°C环境中取出预冷的吸头、离心管和6孔板，然后在超净工作台上进行以下操作。
- 使用 200 μL 吸头将 50 μL 5% 基底膜基质转移到 1 mL MESCM 中，并轻轻均匀地混合。
- 使用预冷的 1 mL 吸头将 5% 基底膜基质（溶解在 MESCM 中）转移到 6 孔培养板的一个孔中。
- 轻轻水平摇动6孔板，将6孔培养板置于37°C细胞培养箱中约1小时，然后进行下一步。
- 消化18小时后，取出胶原酶A消化的角膜缘组织，只剩下一些可见的小簇和未消化的巩膜组织。
注：高倍率显微镜揭示了一个由许多密集堆积的细胞（包括LNC）组成的簇。 - 使用200μL移液器吸头在立体显微镜下从未消化的巩膜组织中分离簇。
- 将簇转移到3.5cm培养板中，并将它们浸入0.25%TE中，然后将板置于细胞培养箱中15分钟。
- 加入 1 mL MESCM 和 10% 敲除血清以停止细胞消化，并使用 1 mL 移液器吸头轻轻上下移液以将簇重悬到单个细胞中。
- 将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中，并以 200 x g 离心 5 分钟。
- 小心地除去上清液，不要干扰细胞沉淀，然后加入 1 mL MESCM 以重悬细胞。
- 上下移液2-3次，直至底部细胞沉淀均匀悬浮于MESCM中，使用1mL移液器吸头，取20μL细胞悬液进行细胞计数。
- 用 1 mL 移液器吸头将细胞悬液转移到 5% 基底膜基质包被的 6 孔板中，并将 MESCM 的体积增加到 2.5 mL。
- 水平轻轻摇动 6 孔板以均匀分布细胞。
- 成像和记录后将细胞转移到培养箱中。每天观察和拍摄细胞，每3-4天更换一次培养基。
2. LNC的鉴定
- 免疫荧光染色
- 在 37°C 细胞培养箱中使用 1 mL 0.25% TE 消化板底部的 LNC 5 分钟。
- 通过加入 1 mL MESCM（含有敲除血清）终止消化，将细胞悬液以 200 x g 离心 5 分钟，并小心吸出上清液。
- 加入 1 mL MESCM 以重悬悬于悬浮液中的细胞。为 4 张载玻片（20 μL/载玻片）制备 80 μL 细胞悬液（每张载玻片 4 ×10 个 3 个 细胞），并按照制造商的说明使用离心机系统将细胞沉积到显微镜载玻片上。
- 使用4%多聚甲醛固定细胞（在步骤3中粘附在载玻片上）约10分钟，然后用0.2%Triton X-100在PBS中透化载玻片上的细胞15分钟。
- 用2%牛血清白蛋白（BSA）封闭细胞1小时，然后将它们与一抗（Pan-CK [1：1000]，Vim [1：100]，CD90 [1：100]，CD105 [1：200]，SCF [1：100]，PDGFRβ [1：100]）在振荡器上在4°C下孵育过夜。 孵育后，通过用PBST（PBS + 0.1%吐温20）洗涤（5分钟/洗涤，3x）载玻片除去未结合的一抗。
- 将相应的二抗（驴抗小鼠 IgG 二抗 TRITC [1：1000]、驴抗兔 IgG FITC [1：500]、驴抗小鼠 IgG 488 [1：300]、驴抗兔 IgG 594 [1：400]）与合适的 IgG 非特异性 IgG 抗体孵育 1 小时。使用PBST（5分钟/洗涤，3x）除去未结合的二抗。
- 用 5 μg/mL DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）对细胞核进行复染并密封载玻片。
- 使用荧光显微镜（放大倍率：400倍;曝光时间：50 毫秒）。
- 实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）
- 按照制造商的说明，使用RNA分离试剂盒提取总RNA。
- 使用高容量 cDNA 转录试剂盒将 1-2 μg 总 RNA 逆转录为 cDNA。
- 在含有cDNA（100ng），TaqMan基因表达检测试剂盒（1μL），通用PCR预混液（10μL）和ddH 2O（至20μL）的20μL溶液中进行逆转录（42°C，2分钟;50°C，85分钟）和qPCR（95°C，5分钟;95°C，10秒，40个循环）。
- 使用比较 CT 技术 （ΔΔCT）4,9 检查相对基因表达。
3. LNC的表征
- 细胞计数（血细胞计数器）
- 在37°C细胞培养箱中使用0.25%TE从板底部消化LNC5分钟。
- 通过加入 1 mL MESCM（含有敲除血清）终止消化，将细胞悬液以 200 x g 离心 5 分钟，并小心吸出上清液。
- 加入 1 mL MESCM 以重悬细胞，然后在 0.5 mL 离心管中取 10 μL 细胞悬液。加入等体积的0.4%台盼蓝染色液。
- 将 10 μL 染色的细胞悬液放在血细胞计数器的计数区域，并用盖玻片盖住进行计数。
注意：五个中间正方形区域中的单元格数定义为“A”;1mL中的细胞数计算为5A×10,4×2。
- 使用流式细胞术检查 LNC 和 BMMSC 标志物15
- 使用流式细胞术15 检测 LNC 和 BMMSC 中 SCF、CD73、CD90 和 CD105 的表达（2-4 ×10 6 个事件/样品，从每个样品中获得 2,000 个细胞，总共 550,000 个同时设门的细胞）。
- 根据试剂盒说明，使用预标记抗体（SCF [1：50]、CD70 [1：50]、CD90 [1：50]和CD105 [1：50]）在封闭缓冲液（3%BSA和0.05%吐温-20的PBS）中收集和染色细胞15分钟。
- 使用流式细胞仪进行荧光激活细胞分选 （FACS） 分析。在这项研究中，使用了 FACS Diva 软件和 FlowJo 软件。对于每个样品，记录 10,000 个事件并设门并分析活细胞。
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Representative Results
LNC的成长
如上所述，根据胶原酶A（2mg / mL）消化角膜巩膜边缘组织的酶切方法成功分离LNC（图1）。与先前报道的研究3一致，在胶原酶A消化后，在显微镜下观察到毛毛虫样簇（图2）。纺锤体细胞的比例随着细胞传代而逐渐增加。纺锤形细胞可以在包被的 5% 基底膜基质板上生长，这与在没有包被基底膜基质3 的塑料上培养的对应细胞不同。从 P1 到 P12 的细胞表现出均匀的增殖速率，细胞倍增时间在 2 到 7 天之间（表 2）。在这项研究中，LNCs被培养到13个传代，34个倍增（图3）3。LNCs从原代细胞（LNC P0）中培养;LNC P0 生长缓慢，大约需要 12 天。LNCs在P1-P8中仅需3 d左右通过，P9后LNCs的生长速率显著下降（表2）。在细胞形态上，LNCs呈纺锤形，P0为圆形。在P3之后，LNC呈纺锤形，具有相同的形态大小（图2）。使用以下公式测量总扩增程度为从 P0 到 P13 的种群数量倍增：细胞倍增数 （NCD） = log10 （y/x） / log102，其中 y 是细胞的最终密度，x 是细胞3 的初始接种密度。NCD代表LNC的生长速率（图3A）。从NCD和累积NCD曲线（图3B）来看，LNCs呈指数增长所需的时间最短，与P3-P5相比增长最快（图3）。P5后，细胞生长速率明显下降，P13时NCD恢复到1.32，生长几乎停止。
LNC的鉴定
在LNCs的分离和培养之后，另一项重要任务是鉴定。根据目前对 LNC 的相关研究，LNC 表达 Vim、CD90、CD105、SCF 和 PDGFRβ，但不表达 Pan-CK（图 4）9。LNC P4 双重免疫染色显示，这些细胞始终是 Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+（图 4）。qPCR 还显示 P2 中 Pan-CK 表达降低，P3 中 Vim、CD90、CD105、SCF 和 PDGFR 转录本增加。与 P1 相比，P4 中 Vim、CD90、CD105、SCF 和 PDGFR 的转录水平显着增加 （p < 0.01）（图 4）9。
LNC的特点
进一步的分析表明，LNCs表达更多的胚胎干细胞（ESC）标志物（Nestin、Rex1和SSEA4）、间充质干细胞（MSC）标志物（CD73、CD90和CD105）和生态位细胞（NC）标志物（MSX1、P75NTR和PDGFRβ）（图5）15。流式细胞术表明，MSCs（包括CD73、CD90和CD105）的表面抗原特征在LNCs和BMMSCs中均有表达15。表达CD73、CD90、CD105和SCF的LNCs百分比分别约为95%、97%、92%和11%，而BMMSCs的表达百分比分别为68%、99%、20%和3%。这表明，与 BMMSC 相比，LNC 表达的 MSC 阳性标志物 CD73、CD105 和细胞因子 SCF （p < 0.01） 和类似水平的 CD90 （p > 0.05） 水平显着更高（图 6）15。
图 1：LNC 分离过程 。 （A）角膜巩膜边缘组织。（B）胶原酶A在37°C消化18小时后的簇。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：在 MESCM 中 5% 基底膜基质包被的 6 孔板上培养的 P0 至 P13 LNC。 （Bar = 50 μm）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：P0-P13中LNCs的生长模式。 （A） P0-P13中LNCs的NCD;（B） P0-P13 LNC 的累积 NCD。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：免疫荧光和qPCR。 免疫荧光和qPCR结果显示，LNCs均匀表达Vim、CD90、CD105、SCF和PDGFRβ，但不表达Pan-CK。此图经Zhu et al.9许可转载。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：LNC 表达的 ESC、MSC 和 NC 标志物比 BMMSC 多。对 P4 LNC 和 P4 BMMSC 进行 qPCR 检测 ESC 标志物 （A）、MSC 和神经嵴标志物 （B） 的转录表达（n = 3，*P < 0.05、#P < 0.05 和 **p < 0.01）。通过 Hoechst 33342 对 ESC 标志物 （C） 和 MSC、NC 标志物 （D） 进行免疫染色。比例尺 = 25 μm。该图经 Li 等人许可转载15。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：P4 LNC 和 BMMSC 的荧光激活细胞分选 （A-F）。对 MSC 标志物（包括 CD73、CD90 和 CD105）进行荧光激活细胞分选 （FACS） 分析 （n=3）。该图经 Li 等人许可转载15。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 试剂 | 储备液的浓度 | 卷 | 最终浓度 | 存储环境 |
| DME/F-12 1：1（1×） | 基本介质 | 180毫升 | 90% | 4°摄氏度 |
| 敲除TMSR | - | 20毫升 | 10% | -20°摄氏度 |
| ESC/iPSCs的血清替代物 | ||||
| 复发性人白血病抑制因子 （LIF） | 50微克/毫升 | 40微升 | 10纳克/毫升 | -80°摄氏度 |
| 重组人FGF-basic | 100微克/毫升 | 8 微升 | 4纳克/毫升 | -80°摄氏度 |
| ITS（胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠） | 500 μg/mL 胰岛素 | 2毫升 | 5 μg/mL 胰岛素 | -20°摄氏度 |
| 500 μg/mL 转铁蛋白 | 5 μg/mL 转铁蛋白 | |||
| 500 ng/ml亚硒酸钠 | 5 ng/mL 亚硒酸钠 | |||
| 庆大霉素 | 25微克/毫升 | 2毫升 | 50微克/毫升 | 4°摄氏度 |
| 两性霉素B | 2500微克/毫升 | 100 微升 | 1.25微克/毫升 | 4°摄氏度 |
表1：MESCM配方。
| 通道 | 接种密度 （× 105 个细胞/cm2） | 最终密度（× 105个细胞/cm2） | 培养时间（天） | 细胞倍增数 （NCD） | 累积非传染性疾病 |
| 第 0 页 | 0.22 | 0.385714 | 12 | 0.810029 | 0.810029 |
| 小一 | 0.08 | 0.365714 | 4 | 2.192645 | 3.002674 |
| 小二 | 0.051429 | 0.357143 | 3 | 2.795859 | 5.798533 |
| 小三 | 0.037143 | 0.337143 | 2 | 3.182203 | 8.980737 |
| 小四 | 0.028571 | 0.311429 | 6 | 3.446256 | 12.42699 |
| 小五 | 0.04 | 0.385714 | 3 | 3.269461 | 15.69645 |
| 小六 | 0.054286 | 0.48 | 4 | 3.14439 | 18.84084 |
| 小七 | 0.057143 | 0.351429 | 3 | 2.620586 | 21.46143 |
| 小八 | 0.08 | 0.394286 | 3 | 2.30117 | 23.7626 |
| 小九 | 0.06 | 0.345714 | 6 | 2.526546 | 26.28915 |
| P10系列 | 0.022857 | 0.122857 | 7 | 2.426265 | 28.71541 |
| 第11页 | 0.025714 | 0.122857 | 5 | 2.25634 | 30.97175 |
| 第12页 | 0.028571 | 0.114286 | 5 | 2 | 32.97175 |
| 第13页 | 0.045714 | 0.114286 | 10 | 1.321928 | 34.29368 |
表 2：LNC 在塑料上的串行通道。
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Discussion
角膜透明度通常通过角膜基质中小纤维（直径 25-30 nm）的规则排列和分布来维持，这对于正常视力至关重要16。全世界有 2.53 亿视障者，其中 3600 万人是盲人17.世界卫生组织 （WHO） 认为角膜盲是人类视力最严重的危害之一，占全球所有失明的 5.1%16。CES正常的角膜上皮缺损可以快速愈合而不会留下疤痕18。据估计，全球有超过 1270 万患者因中度至重度视力丧失而需要角膜移植19;30% 的角膜移植失败是由 CESD20 引起的。然而，由于世界上大多数国家都缺乏角膜捐献，七十分之一的角膜盲患者最终可以接受角膜移植21.目前，角膜上皮干细胞移植（CEST）可用于治疗CESD22。单眼 CESD 患者可以从健康眼睛获得 CES 进行 CEST。然而，对于双侧CESD患者，只能获得同种异体CES进行治疗。免疫排斥仍然是同种异体CEST失败的主要原因。减少CESD治疗的一个有前途的方法是找到一种可以有效替代自体CES的细胞，或者鼓励其他自体细胞从其他地方分化成为CES。自体细胞体外分化为CES也越来越流行，包括BMMSC 23、口腔粘膜上皮细胞（OMEC）24、牙髓干细胞（DPSC）19、人成纤维细胞衍生诱导的多能干细胞（iPSC）25和脂肪干细胞（ASC）26。Rohaina等[23]发现，在羊膜上培养10天的BMMSCs可以分化为角膜上皮细胞，并且在诱导分化后CK3和p63表达显著增加。2020 年，O'Callaghan 等 24使用一种新的培养系统诱导口腔粘膜上皮细胞分化为角膜上皮细胞，并成功将其用于使用 3D 组织结构 （RAFT） 治疗 CESD，作为以人口腔粘膜成纤维细胞为滋养层的口腔粘膜上皮细胞培养的支持。此外，DPSC 成功分化为角膜基质细胞和上皮细胞。通过上调 K3、K12 和 CD90 的表达，DPSC 可以预防角膜结膜浸润。另一项研究使用 DPSC 作为羊膜细胞片，在兔子 CESD 模型中搭载到角膜表面。结果显示，DPSC组的角膜比对照组更清洁，血管生成更少27。Hayashi 等人 28使用成纤维细胞衍生的 iPSC 实现了分化，该 iPSC 可在 12 周后在 PAX6（+） 和 K12（+） 角膜上皮细胞中诱导。iPSC可有效发育成角膜上皮细胞，激活K12，抑制NANOG25。Zeppieri等人[26]发现，在激光诱导的动物模型中，ASCs可以分化为角膜上皮细胞，以治愈小鼠CESD并增强角膜上皮伤口愈合。
LNCs位于角膜缘生态位，CES受到保护和支持，并具有许多与MSCs相似的特征。 LNCs首先由Polisetty等人分离出来2，并由Xie等人3首先命名。根据最近的研究，LNC 是比 MSC 更基本的干细胞，可以很容易地分化成脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞 4,29。与常用的BMMSCs相比，LNCs表现出更强的干细胞特性（CD73、CD105、PDGFR、SCF等的表达更高）（图5）30. LNCs通过促进角膜上皮和基质的修复，可以成功地治疗由角膜碱烧伤引起的CESD的兔子15.角膜成纤维细胞中纤连蛋白 （FN）、结缔组织生长因子 （CTGF） 和分泌的酸性和富含半胱氨酸的蛋白 （SPARC） 的表达降低表明 LNCs 分泌可促进伤口愈合并减少纤维化7.
在 3D 微环境中，有趣的是 LNC 可能与 MCEC 重聚，刺激后者细胞恢复干细胞特性9。LNC 可有效加速 CES 生长31 并防止角膜瘢痕形成10。然而，LNC的数量是有限的;研究表明，它仅占牛角膜角膜缘基质细胞总数的约 3% 32，硫酸角质、角蛋白酶和ALDH3A133 有显着表达。它们在人类角膜中的含量可能低于 1%33。
在该协议中，重复了先前分离，纯化和鉴定LNC的方法3,14,34。用胶原酶A（2mg / mL）处理人角膜缘组织18小时后，分离LNCs。P0 LNC发育缓慢，表现出各种细胞形态，包括纺锤形LNC、多边形其他LNC和可见的球形MCEC（图2，P0）。先前的研究表明，LNC是纺锤形细胞，以均匀的形态附着在培养表面的底部14。同时，MCEC为第29轮，这与该方案中培养的细胞的形态一致。此外，P0 LNCs在大约12天内缓慢生长到细胞密度的70%-80%。P1-P12 LNC 增殖速度快得多，在 3-6 天内几乎覆盖了整个培养板。在 P1 之后，纺锤形 LNC 附件细胞的数量显着超过圆形 MCEC 和多边形细胞。
从 表 2 和 图 3 中的 NCD 值可以清楚地看出，LNC P0 的 NCD 最低 （0.810），并且细胞传代发生在 12 天内。然而，在P1之后，LNCs的增长急剧加速，增长率在P4达到峰值3.44。P6之后，LNCs的生长速率大幅降低（图3）。就LNCs生长模式而言，P4的LNCs生长速率和活性基本上是最高的，这与早期的研究结果一致，即P4-P6 LNCs的生长活性是最好的9。然而，这种方法有一定的局限性，LNC P0的数量根据供体的年龄和死亡时间而有很大差异。因此，当供体组织更年轻、更新鲜时，可以分离出更多的P0 LNC。 在体 外模拟CES微环境的最重要因素是需要通用的生态位因子，例如富含层胺的细胞外基质35。
总之，LNCs在支持角膜上皮干细胞和维持CES的干性方面起着至关重要的作用，包括自我更新和分化为成熟的角膜上皮细胞。LNC 有望成为治疗 CESD 9,15 患者的创新细胞工具。
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Disclosures
所有作者均未披露任何相关的财务信息。
Acknowledgments
感谢王伟、徐玲娟、刘荣对这项工作的指导，感谢谭永瑶、金碧辉、尤春秀和李贵刚提供部分材料，感谢苏冠宇撰写手稿，感谢周小、熊一红、谢华涛对稿件的校正，感谢李贵刚的全力指导。本研究得到了国家自然科学基金（82070936、81470606、81570819）、湖北省卫生与计划生育科研项目（No.WJ2017M073）、同济医院转化医学研究十大项目（No.2016ZHYX20）、武汉市医学青年先锋培养项目（No.2015whzqnyxggrc10）、全球人才招聘计划（G2022154028L）、湖北省国家卫健委2022年度项目（WJ2021ZH0005）、湖北省财政部学科建设基金（42000022815T000000102）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | - |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | - |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | - |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | - |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | - |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | - |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | - |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | - |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
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