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Isolement et identification des cellules de niche limbique

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

Summary

Nous présentons ici un protocole permettant d’isoler et d’identifier les cellules de niche limbique humaines.

Abstract

Nous rapportons ici une procédure standard pour l’isolement et l’identification des cellules de niche limbique (LNC). Le tissu limbique obtenu à partir d’une banque d’yeux a été utilisé pour l’isolement des LNC. Le tissu a été divisé en 12 morceaux dans des conditions aseptiques et digéré pendant 18 h à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire à l’aide de la collagénase A pour obtenir des amas cellulaires avec des LNC et des cellules progénitrices de l’épithélium limbique. Les amas de cellules ont ensuite été digérés pendant 15 minutes à 37 °C en utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA pour obtenir des cellules individuelles, puis cultivés dans un milieu de cellules souches embryonnaires modifiées (MESCM) sur une surface plastique recouverte de 5 % de Matrigel. Les cellules ont été transmises à 70 % de confluence, et les LNC ont été identifiés à l’aide de l’immunofluorescence, de la PCR quantitative en temps réel (qPCR) et de la cytométrie en flux. Les LNC primaires ont été isolés et sont passés plus de 12 fois. L’activité de prolifération des LNC de P4 à P6 a été la plus élevée. Les LNC ont exprimé des marqueurs de cellules souches plus élevés que les BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR et PDGFRβ). De plus, les résultats ont montré que les LNC P4 exprimaient uniformément VIM, CD90, CD105 et PDGFRβ, mais pas Pan-CK, qui pourrait être utilisé comme marqueur pour l’identification des LNC. L’analyse par cytométrie en flux a montré qu’environ 95 %, 97 %, 92 % et 11 % des LNC exprimaient respectivement CD73, CD90, CD105 et SCF, alors qu’ils étaient respectivement de 68 %, 99 %, 20 % et 3 % dans les BMMSC. Le procédé normalisé d’isolement et d’identification des LNC pourrait fournir une base de laboratoire fiable pour l’utilisation généralisée des LNC.

Introduction

L’incidence du déficit en cellules souches épithéliales cornéennes (CESD), également appelé déficit en cellules souches limbiques (LSCD)1, et de la régénération épithéliale cornéenne (CES) devient de plus en plus urgente en raison des infections et des lésions cornéennes. Si elle n’est pas correctement traitée, la CESD peut entraîner une cécité qui nécessite une greffe de cornée. En conséquence, la régénération du CES devient plus importante. Il existe un groupe de cellules de soutien appelées cellules de niche limbique (LNC) qui fournissent un soutien essentiel à la fonction CES. Les cellules souches stromales limbiques ont d’abord été isolées par Polisetty et al.2 et identifiées par Xie et al.3 comme des LNC qui sont localisées dans l’épithélium limbique sous-jacent et le stroma du limbe. Les LNC sont les principales cellules souches de soutien du bord cornéen et, avec la fonction des CSM dérivées de la moelle osseuse (BMMSC), et pourraient être induites à se développer en cellules épithéliales cornéennes et en cellules stromales cornéennes, etc.3,4,5,6,7. Des études antérieures ont montré que les qualités des cellules souches des LNC sont plus primitives que celles desBMMSCs 8, qui sont déjà largement utilisées en clinique. Les LNC pourraient même devenir la prochaine option viable après la CSM, en particulier pour le traitement du CESD. En tant que cellules de soutien importantes pour le CES, les LNC sont également des cellules souches dérivées de la structure de « niche » du limbe. Les LNC peuvent jouer un rôle clé dans la dédifférenciation des cellules épithéliales cornéennes matures (MCEC) en CES9. Cependant, les études sur les LNC sont encore relativement insuffisantes et il n’y a pas de consensus sur la terminologie, l’isolement, la purification, l’identification et les caractéristiques des LNC. Certains chercheurs ont nommé les cellules souches stromales dérivées de la biopsie limbique10, les cellules souches mésenchymateuses limbiques11, les cellules souches fibroblastiques limbiques 12 et les cellules stromales mésenchymateuses limbiques13. Étant donné que les caractéristiques de croissance des LNC n’ont pas été décrites en détail, et en raison de leurs applications scientifiques et cliniques prometteuses, et qu’elles pourraient être l’un des outils cliniques les plus importants à l’avenir, il est nécessaire de résumer l’isolement, la purification, l’identification et les caractéristiques des LNC.

Selon une étude antérieure14, les LNC sont principalement présents au niveau de l’épithélium limbique sous-jacent et du stroma du limbe. Ce protocole comprend le traitement du tissu limbique à l’aide de la collagénase A, l’obtention d’un cluster composé de LEPC et de LNC, et sa digestion en cellules uniques avec 0,25 % de trypsine-EDTA (TE). Les LNC ont ensuite été sélectivement cultivés dans un milieu de cellules souches embryonnaires modifiées (MESCM) pour être purifiés. Le protocole décrit dans cet article est simple et très efficace pour obtenir des LNC humains en grande quantité.

La procédure détaillée d’isolement, de culture et d’identification du LNC a été enregistrée dans la vidéo pour les scientifiques intéressés par l’étude du LNC, et elle peut être facilement répétée en cas de besoin.

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Protocol

Les tissus Limbus provenant de donneurs âgés de 50 à 60 ans ont été obtenus auprès de la banque d’yeux de la Croix-Rouge de l’hôpital de Tongji (Wuhan, Chine). Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique de Tongji et a été mené conformément à la Déclaration d’Helsinki.

1. Isolement

  1. Obtenir du tissu limbique à partir d’un milieu de stockage cornéen à moyen terme et opérer dans des conditions aseptiques sur un établi ultra-propre.
  2. Grattez et retirez l’iris et l’endothélium autour de la cornée à l’aide d’une lame ronde chirurgicale stérile.
  3. Coupez le tissu limbique en douze morceaux de taille égale à l’aide d’une lame chirurgicale laissant 1 mm de part et d’autre de la cornée et de la sclérotique.
  4. Transférez les tissus du limbe dans une plaque de culture de 3,5 cm, ajoutez 1 mL de collagénase A (2 mg/mL, en milieu DF-12), pour immerger tous les tissus pour la digestion.
  5. Mettez la plaque dans l’incubateur cellulaire à 37 °C, digérez les tissus limbiques pendant 18 h.
    REMARQUE : Les procédures de suivi sont généralement effectuées le deuxième jour.
  6. Préparez une plaque de culture à 6 puits revêtue d’une matrice membranaire basale à 5 % (Matrigel).
    1. Enduire une matrice membranaire basale à 5 % (dissoute dans le MESCM [Tableau 1]) au fond du puits.
    2. Préparez des embouts de 200 μL et de 1 mL, un tube centrifuge de 15 mL et une plaque à 6 puits dans un sac stérilisé.
    3. Placez le sac stérilisé (y compris les embouts et le tube centrifuge) et une nouvelle plaque à 6 puits dans un environnement de -20 °C ou -80 °C pendant 20 minutes. Décongeler la matrice de la membrane basale au réfrigérateur à 4 °C.
    4. Retirez les pointes pré-refroidies, le tube centrifuge et la plaque à 6 puits de l’environnement à -20 °C ou -80 °C, puis effectuez les opérations suivantes sur l’établi ultra-propre.
    5. Transférez 50 μL de matrice de membrane basale à 5 % dans 1 mL de MESCM à l’aide d’un embout de 200 μL et mélangez-les doucement et uniformément.
    6. Transférer la matrice de la membrane basale à 5 % (dissoute dans MESCM) dans un puits d’une plaque de culture à 6 puits à l’aide de l’embout prérefroidi de 1 mL.
    7. Agitez doucement et horizontalement la plaque de culture à 6 puits, placez la plaque de culture à 6 puits dans l’incubateur cellulaire à 37 °C pendant environ 1 h, puis effectuez l’étape suivante.
  7. Après 18 heures de digestion, retirez le tissu limbique digéré par la collagénase A, il ne restera que quelques petits amas visibles et des tissus scléraux non digérés.
    REMARQUE : La microscopie à fort grossissement révèle un amas composé de nombreuses cellules densément emballées (y compris les LNC).
  8. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, détacher les amas des tissus scléraux non digérés sous le stéréomicroscope.
  9. Transférez les grappes dans la plaque de culture de 3,5 cm et plongez-les dans 0,25 % d’ET, puis placez la plaque dans l’incubateur cellulaire pendant 15 min.
  10. Ajouter 1 mL de MESCM avec 10 % de sérum knock-out pour arrêter la digestion cellulaire et pipeter doucement de haut en bas pour remettre les amas en suspension dans les cellules individuelles à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL.
  11. Transférez la suspension cellulaire dans un tube centrifuge de 15 ml et centrifugez à 200 x g pendant 5 min.
  12. Retirez le surnageant avec précaution sans perturber la précipitation des cellules, puis ajoutez 1 mL de MESCM pour remettre les cellules en suspension.
  13. Pipeter de haut en bas 2 à 3 fois jusqu’à ce que la précipitation de la cellule inférieure soit uniformément suspendue dans le MESCM à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL, et prendre une suspension de cellules de 20 μL pour le comptage des cellules.
  14. Transférez la suspension cellulaire sur la plaque à 6 puits revêtue d’une matrice de membrane basale à 5 % à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL et augmentez le volume de MESCM à 2,5 mL.
  15. Secouez doucement la plaque à 6 puits horizontalement pour répartir uniformément les cellules.
  16. Transférez les cellules dans l’incubateur de culture après avoir été imagées et enregistrées. Observez et photographiez les cellules tous les jours, et changez de support tous les 3-4 jours.

2. Identification de LNC

  1. Coloration par immunofluorescence
    1. Digérer les LNC du fond de l’assiette à l’aide de 1 mL 0,25 % TE pendant 5 min dans l’incubateur cellulaire à 37 °C.
    2. Terminez la digestion en ajoutant 1 mL de MESCM (contenant du sérum knock-out), centrifugez la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min et aspirez soigneusement le surnageant.
    3. Ajouter 1 mL de MESCM pour remettre les cellules en suspension. Préparez une suspension cellulaire de 80 μL (4 × 103 cellules par lame) pour 4 lames (20 μL/lame) et utilisez un système de centrifugation pour déposer les cellules sur des lames de microscope selon les instructions du fabricant.
    4. Fixez les cellules (collées aux lames à l’étape 3) en utilisant du paraformaldéhyde à 4 % pendant environ 10 min, puis perméabilisez les cellules sur les lames avec 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 min.
    5. Bloquer les cellules pendant 1 h avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 2 % avant de les incuber avec des anticorps primaires (Pan-CK [1 :1000], Vim [1 :100], CD90 [1 :100], CD105 [1 :200], SCF [1 :100], PDGFRβ [1 :100]) sur un agitateur pendant une nuit à 4 °C. Après l’incubation, éliminer les anticorps primaires non liés en lavant (5 min/lavage, 3x) les lames avec du PBST (PBS + 0,1 % Tween 20).
    6. Incuber les anticorps secondaires correspondants (anticorps IgG anti-souris de l’âne TRITC [1 :1000], IgG anti-lapin de l’âne FITC [1 :500], IgG 488 anti-souris de l’âne [1 :300], IgG 594 anti-lapin de l’âne [1 :400]) pendant 1 h avec des anticorps IgG non spécifiques appropriés. Retirez l’anticorps secondaire non lié à l’aide de PBST (5 min/lavage, 3x).
    7. Contre-colorer les noyaux avec 5 μg/mL de DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole) et sceller les lames.
    8. Effectuer une imagerie par fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence (grossissement : 400x ; Temps d’exposition : 50 ms).
  2. Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR)
    1. Prenez le kit d’isolement de l’ARN pour extraire l’ARN total selon les instructions du fabricant.
    2. Utilisez un kit de transcription d’ADNc de grande capacité pour transcrire 1 à 2 μg d’ARN total en ADNc.
    3. Effectuez la transcription inverse (42 °C, 2 min ; 50 °C, 85 min) et la qPCR (95 °C, 5 min ; 95 °C, 10 s, 40 cycles) dans une solution de 20 μL contenant de l’ADNc (100 ng), du TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), du Master Mix PCR universel (10 μL) et du ddH2O (jusqu’à 20 μL).
    4. Utiliser la technique de tomodensitométrie comparative (ΔΔCT)4,9 pour examiner l’expression relative des gènes.

3. Caractérisation du LNC

  1. Comptage cellulaire (hémocytomètre)
    1. Digérer les LNC du fond de la plaque en utilisant 0,25 % de TE pendant 5 min dans l’incubateur cellulaire à 37 °C.
    2. Terminez la digestion en ajoutant 1 mL de MESCM (contenant du sérum knock-out), centrifugez la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min et aspirez soigneusement le surnageant.
    3. Ajouter 1 mL de MESCM pour remettre les cellules en suspension, puis prélever 10 μL de suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 0,5 mL. Ajouter un volume égal de 0,4 % de solution colorante au bleu de trypan.
    4. Placez 10 μL de suspension de cellules colorées sur la zone de comptage de l’hémocytomètre et couvrez-la d’une lamelle pour le comptage.
      REMARQUE : Le nombre de cellules dans les cinq zones carrées du milieu est défini par « A » ; le nombre de cellules dans 1 mL est calculé comme suit : 5A × 10,4 × 2.
  2. Examen des marqueurs LNC et BMMSC par cytométrie en flux15
    1. Détecter l’expression de SCF, CD73, CD90 et CD105 dans les LNC et les BMMSCs à l’aide de la cytométrie en flux 15 (2-4 ×10 6 événements/échantillon, 2 000 cellules ont été obtenues à partir de chacun des échantillons, soit un total de 550 000 cellules qui ont été fermées simultanément).
    2. Prélever et colorer les cellules à 20-30 °C pendant 15 min dans un tampon bloquant (3 % de BSA et 0,05 % de Tween-20 dans le PBS) à l’aide d’anticorps prémarqués (SCF [1 :50], CD70 [1 :50], CD90 [1 :50] et CD105 [1 :50]) conformément aux instructions de la trousse.
    3. Effectuez une analyse de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) à l’aide d’un cytomètre en flux. Dans cette étude, les logiciels FACS Diva et FlowJo ont été utilisés. Pour chaque échantillon, enregistrez 10 000 événements et analysez les cellules vivantes.

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Representative Results

Croissance de LNC
Les LNC ont été isolés avec succès selon la méthode de digestion de la collagénase A (2 mg/mL) du tissu cornéo-scléral, telle que décrite ci-dessus (Figure 1). Conformément à une étude précédemment rapportée3, après la digestion de la collagénase A, des amas ressemblant à des chenilles ont été visualisés au microscope (Figure 2). La proportion de cellules fusiformes augmentait progressivement avec le passage des cellules. Les cellules en forme de fuseau pourraient se développer sur des plaques de matrice de membrane basale revêtues à 5 %, contrairement à leurs homologues cultivées sur du plastique sans matrice de membrane basalerevêtue 3. Les cellules de P1 à P12 présentaient un taux de prolifération uniforme, avec un temps de doublement des cellules compris entre 2 et 7 jours (tableau 2). Dans cette étude, les LNC ont été cultivés jusqu’aux 13 passages et aux 34 doublages (figure 3)3. Les LNC ont été cultivés à partir de cellules primaires (LNC P0) ; LNC P0 s’est développé lentement et a pris environ 12 jours. Les LNC n’ont eu besoin que d’environ 3 jours pour passer en P1-P8, et le taux de croissance des LNC après P9 a diminué de manière significative (tableau 2). En termes de morphologie cellulaire, les LNC étaient fusiformes et rondes en P0. Après P3, les LNC étaient en forme de fuseau avec la même taille morphologique (Figure 2). L’étendue de l’expansion totale a été mesurée par le nombre de populations doublant de P0 à P13 à l’aide de la formule suivante : nombre de cellules doublant (NCD) = log10 (y/x) / log102, où y est la densité finale des cellules et x est la densité initiale d’ensemencement des cellules3. Les MNT représentent le taux de croissance des MNT (figure 3A). D’après les courbes des MNT et des MNT cumulées (figure 3B), les MNT ont mis le moins de temps à augmenter de façon exponentielle et ont connu la croissance la plus rapide à partir des P3-P5 (figure 3). Après le P5, le taux de croissance cellulaire a diminué de manière significative, la MNT est revenue à 1,32 en P13 et la croissance s’est presque arrêtée.

Identification de LNC
Après l’isolement et la culture des LNC, une autre tâche importante a été l’identification. Les LNC sont exprimés pour Vim, CD90, CD105, SCF et PDGFRβ, mais pas pour Pan-CK, selon les études pertinentes actuelles sur les LNC (Figure 4)9. Le double immunomarquage LNC P4 a révélé que ces cellules étaient systématiquement Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+ (Figure 4). La qPCR a également révélé une diminution de l’expression de Pan-CK dans la P2 et une augmentation des transcrits Vim, CD90, CD105, SCF et PDGFR dans la P3. Les niveaux de transcription de Vim, CD90, CD105, SCF et PDGFR ont augmenté de façon spectaculaire dans le P4 par rapport au P1 (p < 0,01) (Figure 4)9.

Caractéristiques du LNC
Une analyse plus poussée a montré que les LNC exprimaient plus de marqueurs de cellules souches embryonnaires (ESC) (Nestin, Rex1 et SSEA4), de marqueurs de cellules souches mésenchymateuses (CSM) (CD73, CD90 et CD105) et de marqueurs de cellules de niche (NC) (MSX1, P75NTR et PDGFRβ) (Figure 5)15. La cytométrie en flux a indiqué que les caractéristiques de l’antigène de surface des CSM, y compris CD73, CD90 et CD105, étaient exprimées à la fois dans les LNC et lesBMMSC15. Les pourcentages de LNC qui exprimaient CD73, CD90, CD105 et SCF étaient d’environ 95 %, 97 %, 92 % et 11 %, respectivement, tandis que ceux des BMMS étaient respectivement de 68 %, 99 %, 20 % et 3 %. Cela montre que les LNC expriment des niveaux significativement plus élevés de marqueurs MSC positifs CD73, CD105 et la cytokine SCF (p < 0,01) et un niveau similaire de CD90 (p > 0,05) par rapport aux BMMSCs (Figure 6)15.

Figure 1
Figure 1 : Processus d’isolement des LNC. (A) Tissu cornéo-scléral. (B) Grappes après la digestion de la collagénase A à 37 °C pendant 18 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : LNC P0 à P13 cultivés sur une plaque à 6 puits revêtue d’une membranaire basale à 5 % dans un MESCM (Bar = 50 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Schéma de croissance des LNC de P0 à P13. (A) Les MNT des LNC de P0 à P13 ; (B) Les MNT cumulées des LNC de P0 à P13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Immunofluorescence et qPCR. L’immunofluorescence et la qPCR ont révélé que les LNC exprimaient uniformément Vim, CD90, CD105, SCF et PDGFRβ, mais pas Pan-CK. Cette figure a été reproduite avec la permission de Zhu et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Les LNC expriment plus de marqueurs ESC, MSC et NC que les BMMSCs. Les LNC P4 et les BMMSCs P4 ont été soumis à la qPCR pour l’expression de la transcription des marqueurs ESC (A), MSC et des marqueurs de la crête neurale (B) (n = 3, *P < 0,05, #P < 0,05 et **p < 0,01 respectivement). Immunomarquage des marqueurs ESC (C) et MSC, NC (D), avec contre-coloration nucléaire par Hoechst 33342. Barres d’échelle = 25 μm. Cette figure a été reproduite avec l’autorisation de Li et al.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Tri cellulaire activé par fluorescence des LNC P4 et des BMMSC (A-F). Analyse par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) des marqueurs MSC, y compris CD73, CD90 et CD105 (n = 3). Cette figure a été reproduite avec l’autorisation de Li et al.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Réactif Concentration de la solution mère Volume Concentration finale Environnement de stockage
DME/F-12 1 :1(1×) Médium de base 180 ml 90% 4 °C
KnockOutTMSR (en anglais seulement) - 20 ml 10% -20 °C
Remplacement du sérum pour les ESC/iPSC
Facteur inhibiteur de la leucémie humaine (LIF) 50 μg/mL 40 μL 10 ng/mL -80 °C
FGF-basique humain recombinant 100 μg/mL 8 μL 4 ng/mL -80 °C
ITS (insuline, transferrine, sélénite de sodium) 500 μg/mL d’insuline 2 mL 5 μg/mL d’insuline -20 °C
500 μg/mL de transferrine 5 μg/mL de transferrine
500 ng/ml de sélénite de sodium 5 ng/mL de sélénite de sodium
Gentamicine 25 μg/mL 2 mL 50 μg/mL 4 °C
Amphotéricine B 2500 μg/mL 100 μL 1,25 μg/mL 4 °C

Tableau 1 : Formulation de MESCM.

Passage Densité de semis (× 105 cellules/cm2) Densité finale (× 105cellules/cm2) Temps de culture (jours) Nombre de doublages de cellules (NCD) Cumul des MNT
P0 0.22 0.385714 12 0.810029 0.810029
P1 (en anglais seulement) 0.08 0.365714 4 2.192645 3.002674
P2 (en anglais seulement) 0.051429 0.357143 3 2.795859 5.798533
P3 (en anglais seulement) 0.037143 0.337143 2 3.182203 8.980737
P4 (en anglais seulement) 0.028571 0.311429 6 3.446256 12.42699
P5 (en anglais seulement) 0.04 0.385714 3 3.269461 15.69645
P6 (en anglais seulement) 0.054286 0.48 4 3.14439 18.84084
P7 (en anglais seulement) 0.057143 0.351429 3 2.620586 21.46143
P8 (en anglais seulement) 0.08 0.394286 3 2.30117 23.7626
P9 (en anglais seulement) 0.06 0.345714 6 2.526546 26.28915
P10 (en anglais seulement) 0.022857 0.122857 7 2.426265 28.71541
P11 (en anglais seulement) 0.025714 0.122857 5 2.25634 30.97175
P12 (en anglais seulement) 0.028571 0.114286 5 2 32.97175
P13 (en anglais seulement) 0.045714 0.114286 10 1.321928 34.29368

Tableau 2 : Passages en série du LNC sur plastique.

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Discussion

La transparence cornéenne est généralement maintenue par la disposition et la distribution régulières de petites fibres (25 à 30 nm de diamètre) dans le stroma cornéen, ce qui est crucial pour l’acuité visuelle normale16. Il y a 253 millions de personnes malvoyantes dans le monde, dont 36 millions sont aveugles17. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) considère la cécité cornéenne comme l’un des risques les plus graves pour la vue humaine, représentant 5,1 % de toutes les cécités dans le monde16. L’anomalie de l’épithélium cornéen avec un CES normal peut guérir rapidement sans laisser de cicatrice18. On estime que plus de 12,7 millions de patients dans le monde ont besoin d’une greffe de cornée en raison d’une perte de vision modérée à sévère19 ; 30 % des échecs de greffe de cornée ont été causés par le CESD20. Cependant, en raison de la pénurie de dons de cornée dans la plupart des pays du monde, seul un patient aveugle sur soixante-dix pourrait éventuellement recevoir une greffe decornée21. À l’heure actuelle, la greffe de cellules souches épithéliales cornéennes (CEST) peut être utilisée pour traiter le CESD22. Les patients atteints de CESD monoculaire peuvent obtenir un CES à partir d’yeux sains pour CEST. Cependant, pour les patients atteints de CESD bilatérale, seul le CES allogénique peut être obtenu pour le traitement. Le rejet immunitaire reste la principale raison de l’échec de l’allogénique CEST. Une méthode prometteuse pour réduire le traitement thérapeutique de la CESD consiste à trouver une cellule capable de remplacer efficacement la CES autogène ou d’encourager la différenciation d’autres cellules autogènes d’autres endroits pour qu’elles deviennent des CES. La différenciation in vitro des cellules autologues en CES est également de plus en plus populaire, notamment en ce qui concerne le BMMSC23, les cellules épithéliales de la muqueuse buccale (OMEC)24, les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC)19, les cellules souches pluripotentes induites par des fibroblastes humains (iPSC)25 et les cellules souches adipeuses (ASC)26. Rohaina et al.23ont constaté que les BMMSCs cultivées sur des membranes amniotiques pendant 10 jours pouvaient se différencier en cellules épithéliales cornéennes et que l’expression de CK3 et p63 augmentait significativement après l’induction de la différenciation. En 2020, O’Callaghan et al.24ont induit la différenciation des cellules épithéliales de la muqueuse buccale en cellules épithéliales cornéennes à l’aide d’un nouveau système de culture, et l’ont utilisé avec succès pour traiter le CESD à l’aide d’une structure tissulaire 3D (RAFT) comme support pour la culture de cellules épithéliales de la muqueuse buccale buccale avec des fibroblastes de la muqueuse buccale humaine comme trophoblastes. De plus, le DPSC se différencie avec succès en cellules stromales et épithéliales cornéennes. En régulant à la hausse l’expression de K3, K12 et CD90, le DPSC peut prévenir l’invasion conjonctivale cornéenne. Une autre étude a utilisé le DPSC comme feuilles de cellules amniotiques greffées sur la surface cornéenne dans un modèle de CESD de lapin. Les résultats ont montré que le groupe DPSC avait des cornées plus propres et moins d’angiogenèse que le groupe témoin27. Hayashi et al.28ont obtenu une différenciation à l’aide d’iPSC dérivés de fibroblastes qui pourraient être induites dans les cellules épithéliales cornéennes PAX6 (+) et K12 (+) après 12 semaines. Les cellules iPSC se développent efficacement en cellules épithéliales cornéennes, activent K12 et suppriment NANOG25. Zeppieri et al.26 ont découvert que les ASC pouvaient se différencier en cellules épithéliales cornéennes pour guérir la CESD de souris et améliorer la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes dans un modèle animal induit par laser.

Les LNC se localisent dans la niche limbique, où les CES sont protégés et soutenus, et présentent de nombreuses caractéristiques similaires aux CSM. Les LNC ont été isolés pour la première fois par Polisetty et al.2 et nommés pour la première fois par Xie et al.3. Selon des études récentes, les LNC sont des cellules souches plus fondamentales que les CSM et peuvent facilement se différencier en adipocytes, chondrocytes et ostéocytes 4,29. Par rapport aux BMMSCs couramment utilisés, les LNC présentent de plus grandes caractéristiques de cellules souches (expression plus élevée de CD73, CD105, PDGFR, SCF, etc.) (Graphique 5) 30. Les LNC peuvent traiter avec succès les lapins atteints de CESD causée par des brûlures alcalines cornéennes en favorisant la réparation de l’épithélium cornéen et du stroma15. La réduction de l’expression de la fibronectine (FN), du facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF) et de la protéine acide et riche en cystéine (SPARC) sécrétée dans les fibroblastes cornéens suggère que la sécrétion de LNC améliore la cicatrisation des plaies et réduit la fibrose7.

Dans un microenvironnement 3D, ce qui est intéressant, c’est que les LNC peuvent se réunir avec les MCEC, stimulant ces dernières cellules pour restaurer les propriétés des cellules souches9. Les LNC accélèrent efficacement la croissance du CES31 et préviennent la cicatrisation cornéenne10. Cependant, la quantité de LNC est limitée ; Des études ont indiqué qu’il ne représente qu’environ 3 % du nombre total de cellules stromales limbiques dans la cornée bovine32, avec une expression significative de sulfate de kératane, de kératocan et de ALDH3A133. Ils peuvent être inférieurs à 1 % dans les cornées humaines33.

Dans ce protocole, les méthodes précédentes d’isolement, de purification et d’identification des LNC ont été répétées 3,14,34. Après 18 h de traitement du tissu du limbe humain avec de la collagénase A (2 mg/mL), les LNC ont été isolées. Le LNC P0 s’est développé lentement et a présenté diverses morphologies cellulaires, y compris des LNC fusiformes, d’autres polygonales et des MCEC sphériques visibles (Figure 2, P0). Des études antérieures ont montré que les LNC sont des cellules fusiformes qui se fixent au fond de la surface de culture avec une morphologie homogène14. Dans le même temps, les MCEC sont ronds29, ce qui est cohérent avec la morphologie des cellules cultivées dans ce protocole. De plus, les LNC P0 se sont développés lentement jusqu’à ce que les cellules atteignent environ 70 % à 80 % de la densité cellulaire en environ 12 jours. Le LNC P1-P12 a proliféré beaucoup plus rapidement et, en 3 à 6 jours, a pratiquement recouvert toute la plaque de culture. Après P1, les cellules annexes LNC en forme de fuseau étaient significativement plus nombreuses que les cellules MCEC rondes et polygonales.

Il ressort clairement des valeurs de MNT du tableau 2 et de la figure 3 que les LNC P0 présentaient la MNT la plus faible (0,810) et que le passage des cellules s’est produit sur une période de 12 jours. Cependant, après le P1, la croissance des LNC s’est considérablement accélérée, et le taux de croissance a culminé à 3,44 dans le P4. Après le P6, le taux de croissance des LNC a été considérablement réduit (figure 3). Le taux de croissance et l’activité des LNC du P4 étaient sensiblement les plus élevés en termes de modèle de croissance des LNC, ce qui est conforme aux résultats antérieurs indiquant que l’activité de croissance des LNC P4-P6 est la meilleure9. Cependant, cette méthode présente certaines limites, le nombre de LNC P0 varie fortement en fonction de l’âge du donneur et de l’heure du décès. Par conséquent, lorsque le tissu du donneur est plus jeune et plus frais, une plus grande quantité de P0 LNC peut être isolée. Le facteur le plus important dans l’imitation du microenvironnement du CES in vitro est le besoin de facteurs de niche universels, tels qu’une matrice extracellulaire riche en laminamine35.

En conclusion, les LNC jouent un rôle crucial dans le soutien des cellules souches épithéliales cornéennes et le maintien de la souche du CES, y compris l’auto-renouvellement et la différenciation en cellules épithéliales cornéennes matures. On pourrait s’attendre à ce que le LNC soit un outil cellulaire innovant pour le traitement des patients atteints de CESD 9,15.

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Disclosures

Aucun des auteurs n’a fourni d’informations financières pertinentes.

Acknowledgments

Merci à Wei Wang, Lingjuan Xu et Rong Liu pour les conseils sur ce travail, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You et Li Guigang pour avoir fourni une partie du matériel, Guanyu Su pour l’écriture du manuscrit, Xiao Zhou, Yihong Xiong et Huatao Xie pour la correction du manuscrit, et Guigang Li pour ses conseils complets. Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82070936, 81470606, 81570819), projet de recherche scientifique sur la santé et la planification familiale de la province du Hubei (n° 133). WJ2017M073), les dix principaux projets de recherche médicale translationnelle de l’hôpital de Tongji (n° 2016ZHYX20), le projet de formation des jeunes pionniers de la médecine dans la ville de Wuhan (n° 2015whzqnyxggrc10), le programme de recrutement de talents mondiaux (G2022154028L), le projet de la Commission nationale de la santé de la province du Hubei en 2022 (WJ2021ZH0005) et la fondation de construction du département des finances du Hubei en 2022 (42000022815T000000102)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole ThermoFisher D1306 5μg/mL
Amphotericin B Sigma V900919 1.25 μg/mL
Anti-CD73 Abcam ab202122 1:50
Bovine Serum Albumin MERCK A1933 -
CD105 Proteintech 67075-1-Ig 1:200
CD105 Abcam ab114052 1:50
CD90 Proteintech 66766-1-Ig 1:100
CD90 Abcam ab307736 1:50
Cell Incubator Shanghai Lishen K1119K4644 HF90(HT)
Centrifuge system StatSpin  StatSpin CytoFuge 12 -
Collagenase A Roche 10103578001 2 mg/mL
Confocal microscope Zeiss  LSM700 -
Culture plate virya 3500356 35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)  cytiva SH30023.01 90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher A16016 1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher 31568 1:1000
FACS Diva sofware BD Biosciences Tree Star -
Flow Cytometer BD Biosciences Becton Dickinson LSRII -
Fluorescence microscope olympus cx31 
Gentamicin Sigma G1914 50 μg/mL
Hemocytometer MERCK Z359629 Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit ThermoFisher 4374966
Inverted phase-contrast microscope  UOP DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) Sigma I3146 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs gibco 10828-028 10%
Matrigel BioCoat 356234 -
Pan-CK Abcam ab7753 1:1000
Paraformaldehyde NoninBio NBS0135 4.00%
Paraformaldehyde MKBio MM-1505 4%
PDGFRβ Abclonal A1444 1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument Applied Biosystems Step One Plus -
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B 4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) Peprotech 300-05 10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit Qiagen 74104 -
SCF Bioss bs-0545R 1:100
SCF Abcam ab52603 1:50
Stereomicroscope ZEISS SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade Careforde 29500 size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix Applied Biosystems 4448489
Triton X-100 MERCK X100 0.20%
Trypan blue ThermoFisher 15250061 0.40%
Trypsin-EDTA Genview GP3108 0.25%
Tween 20 MERCK P9416 -
Ultra Clean Bench LaiTe LT20200705 SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
Vim  Abcam ab92547 1:100

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References

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