Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Identifizierung der menschlichen Limbus-Nischenzellen vor.
Abstract
Hier berichten wir über ein Standardverfahren zur Isolierung und Identifizierung von limbalen Nischenzellen (LNCs). Limbusgewebe aus einer Augenbank wurde für die Isolierung von LNCs verwendet. Das Gewebe wurde unter aseptischen Bedingungen in 12 Stücke geteilt und 18 h bei 37 °C im Zellkultur-Inkubator unter Verwendung von Kollagenase A aufgeschlossen, um Zellcluster mit LNCs und limbalen Epithel-Vorläuferzellen zu erhalten. Die Zellcluster wurden 15 Minuten lang bei 37 °C unter Verwendung von 0,25 % Trypsin-EDTA verdaut, um Einzelzellen zu erhalten, und dann in modifiziertem embryonalem Stammzellmedium (MESCM) auf einer mit 5 % Matrigel beschichteten Kunststoffoberfläche kultiviert. Die Zellen wurden bei 70%iger Konfluenz durchgelassen und LNCs wurden mittels Immunfluoreszenz, quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) und Durchflusszytometrie identifiziert. Primäre LNCs wurden isoliert und mehr als 12 Mal durchquert. Die Proliferationsaktivität von LNCs von P4 bis P6 war am höchsten. LNCs exprimierten höhere Stammzellmarker als BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR und PDGFRβ). Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass P4-LNCs einheitlich VIM, CD90, CD105 und PDGFRβ exprimierten, jedoch nicht Pan-CK, was als Marker für die Identifizierung von LNCs verwendet werden könnte. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass etwa 95 %, 97 %, 92 % und 11 % der LNCs CD73, CD90, CD105 bzw. SCF exprimierten, während sie bei BMMSCs 68 %, 99 %, 20 % und 3 % exprimierten. Das Standardverfahren zur LNC-Isolierung und -Identifizierung könnte eine zuverlässige Laborgrundlage für den weit verbreiteten Einsatz von LNCs bieten.
Introduction
Die Inzidenz von Hornhautepithelzellmangel (CESD), auch Limbusstammzellmangel (LSCD)1 genannt, und Hornhautepithelregeneration (CES) wird aufgrund von Hornhautinfektionen und -verletzungen immer dringlicher. Wenn CESD nicht richtig behandelt wird, kann sie zur Erblindung führen, die eine Hornhauttransplantation erfordert. Dadurch gewinnt die CES-Regeneration an Bedeutung. Es gibt eine Gruppe von unterstützenden Zellen, die als limbale Nischenzellen (LNCs) bezeichnet werden und eine wesentliche Unterstützung für die CES-Funktion bieten. Limba-Stroma-Stammzellen wurden zuerst von Polisetty et al.2 isoliert und von Xie et al.3 als LNCs identifiziert, die im Limbusepithel und Stroma des Limbus lokalisiert sind. LNCs sind die wichtigsten unterstützenden Stammzellen des Hornhautrandes und könnten mit der Funktion von MSC aus dem Knochenmark (BMMSCs) dazu gebracht werden, sich zu Hornhautepithelzellen und Hornhautstromazellen usw. zu entwickeln.3,4,5,6,7. Frühere Studien zeigten, dass die Stammzellqualitäten von LNCs primitiver sind als die von BMMSCs8, die in der Klinik bereits weit verbreitet sind. LNCs könnten sogar die nächste praktikable Option nach MSC werden, insbesondere für die Behandlung von CESD. Als wichtige Stützzellen für CES sind LNCs auch Stammzellen, die aus der "Nischen"-Struktur des Limbus stammen. LNCs könnten eine Schlüsselrolle bei der Dedifferenzierung reifer Hornhautepithelzellen (MCEC) zu CES9 spielen. Die Studien zu LNCs sind jedoch noch relativ unzureichend, und es gibt keinen Konsens über die Terminologie, die Isolierung, die Reinigung, die Identifizierung und die Eigenschaften von LNCs. Einige Forscher haben LNCs aus der Limbusbiopsie gewonnene stromale Stammzellen10, limbale mesenchymale Stammzellen 11, limbale Fibroblasten-Stammzellen 12 und limbale mesenchymale Stromazellen13 genannt. Da die Wachstumseigenschaften von LNCs noch nicht im Detail beschrieben wurden und aufgrund ihrer vielversprechenden wissenschaftlichen und klinischen Anwendungen in Zukunft eines der wichtigsten klinischen Werkzeuge sein könnten, ist es notwendig, die Isolierung, Aufreinigung, Identifizierung und Eigenschaften von LNCs zusammenzufassen.
Laut einer früheren Studie14 sind LNCs hauptsächlich am Limbusepithel und Stroma des Limbus vorhanden. Dieses Protokoll umfasst die Behandlung von Limbusgewebe mit Kollagenase A, die Gewinnung eines Clusters aus LEPC und LNCs und die Verdauung in einzelne Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA (TE). LNCs wurden dann selektiv in einem modifizierten embryonalen Stammzellmedium (MESCM) kultiviert, um gereinigt zu werden. Das Protokoll, über das in diesem Artikel berichtet wird, ist einfach und hat eine hohe Effizienz bei der Gewinnung menschlicher LNCs in großen Mengen.
Das detaillierte Verfahren der LNC-Isolierung, -Kultur und -Identifizierung wurde in dem Video für Wissenschaftler aufgezeichnet, die an einer LNC-Studie interessiert sind, und kann bei Bedarf bequem wiederholt werden.
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Protocol
Limbusgewebe von Spendern im Alter zwischen 50 und 60 Jahren wurde von der Augenbank des Roten Kreuzes im Tongji-Krankenhaus (Wuhan, China) gewonnen. Das Protokoll wurde von der Ethikkommission der Tongji genehmigt und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt.
1. Isolierung
- Gewinnen Sie Limbusgewebe aus einem mittelfristigen Hornhautspeichermedium und arbeiten Sie unter aseptischen Bedingungen auf einer ultrareinen Werkbank.
- Kratzen Sie die Iris und das Endothel um die Hornhaut herum mit einer sterilen chirurgischen Rundklinge ab und entfernen Sie sie.
- Schneiden Sie Limbusgewebe in zwölf gleich große Stücke mit einer chirurgischen Klinge, die auf beiden Seiten der Hornhaut und der Sklera noch 1 mm beträgt.
- Limbusgewebe auf eine 3,5 cm große Kulturplatte übertragen, 1 ml Kollagenase A (2 mg/ml, in DF-12-Medium) hinzufügen, um das gesamte Gewebe für die Verdauung einzutauchen.
- Die Platte in den 37 °C warmen Zellinkubator geben, das Limbusgewebe 18 h lang verdauen.
HINWEIS: Nachsorgeuntersuchungen werden in der Regel am zweiten Tag durchgeführt. - Bereiten Sie eine 5%ige Basalmembranmatrix (Matrigel) beschichtete 6-Well-Kulturplatte vor.
- Schicht 5% Basalmembranmatrix (gelöst in MESCM [Tabelle 1]) am Boden der Bohrung.
- Bereiten Sie 200-μl- und 1-ml-Spitzen, ein 15-ml-Zentrifugalröhrchen und eine 6-Well-Platte in einem sterilisierten Beutel vor.
- Stellen Sie den sterilisierten Beutel (einschließlich Spitzen und Zentrifugalröhrchen) und eine neue 6-Well-Platte für 20 Minuten in eine Umgebung von -20 °C oder -80 °C. Die Kellermembranmatrix im Kühlschrank bei 4 °C auftauen.
- Nehmen Sie die vorgekühlten Spitzen, das Zentrifugalröhrchen und die 6-Well-Platte aus der Umgebung von -20 °C oder -80 °C heraus und führen Sie dann die folgenden Vorgänge auf der ultrareinen Werkbank durch.
- 50 μl 5%ige Basalmembranmatrix mit einer 200-μl-Spitze auf 1 mL MESCM übertragen und vorsichtig und gleichmäßig mischen.
- 5%ige Basalmembranmatrix (gelöst in MESCM) mit der vorgekühlten 1-ml-Spitze in eine Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte übertragen.
- Schütteln Sie die 6-Well-Platte vorsichtig und horizontal, legen Sie die 6-Well-Kulturplatte für ca. 1 h in den 37 °C-Zellinkubator und führen Sie dann den nächsten Schritt durch.
- Nach 18-stündiger Verdauung Kollagenase A-verdautes Limbusgewebe entfernen, es bleiben nur einige sichtbare kleine Cluster und unverdautes Skleralgewebe zurück.
HINWEIS: Die Mikroskopie mit hoher Vergrößerung zeigt einen Cluster, der aus vielen dicht gepackten Zellen (einschließlich LNCs) besteht. - Verwenden Sie eine 200-μl-Pipettenspitze, um die Cluster unter dem Stereomikroskop von unverdautem Skleralgewebe zu lösen.
- Übertragen Sie die Cluster auf die 3,5-cm-Kulturplatte und tauchen Sie sie in 0,25 % TE, und legen Sie die Platte dann für 15 Minuten in den Zellinkubator.
- Fügen Sie 1 ml MESCM mit 10 % Knockout-Serum hinzu, um die Zellverdauung zu stoppen, und pipettieren Sie vorsichtig nach oben und unten, um die Cluster mit einer 1-ml-Pipettenspitze in einzelne Zellen zu resuspendieren.
- Die Zellsuspension wird in ein 15-ml-Zentrifugalröhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne die Zellausfällung zu stören, und fügen Sie dann 1 ml MESCM hinzu, um die Zellen zu resuspendieren.
- Pipettieren Sie 2-3 Mal auf und ab, bis der Niederschlag der unteren Zelle gleichmäßig im MESCM mit einer 1-ml-Pipettenspitze suspendiert ist, und nehmen Sie 20 μl Zellsuspension zur Zellzählung.
- Übertragen Sie die Zellsuspension mit einer 1-ml-Pipettenspitze auf die mit einer Basalmembranmatrix beschichtete 6-Well-Platte und erhöhen Sie das MESCM-Volumen auf 2,5 ml.
- Schütteln Sie die 6-Well-Platte vorsichtig horizontal, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
- Übertragen Sie die Zellen in den Kulturinkubator, nachdem sie abgebildet und aufgezeichnet wurden. Beobachten und fotografieren Sie die Zellen täglich und wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage.
2. Identifizierung von LNC
- Immunfluoreszenz-Färbung
- Die LNCs vom Boden der Platte werden mit 1 ml 0,25 % TE für 5 Minuten im 37 °C C-Zellinkubator aufgeschlossen.
- Beenden Sie den Aufschluss durch Zugabe von 1 ml MESCM (enthält Knockout-Serum), zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 200 x g und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab.
- Fügen Sie 1 mL MESCM hinzu, um die Zellen in Suspension zu resuspendieren. Bereiten Sie 80 μl Zellsuspension (4 × 103 Zellen pro Objektträger) für 4 Objektträger (20 μl/Objektträger) vor und verwenden Sie ein Zentrifugensystem, um Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers auf Objektträger abzuscheiden.
- Fixieren Sie die Zellen (die in Schritt 3 auf Objektträgern geklebt wurden) mit 4 % Paraformaldehyd für etwa 10 Minuten und permeabilisieren Sie dann die Zellen auf den Objektträgern mit 0,2 % Triton X-100 in PBS für 15 Minuten.
- Blockieren Sie die Zellen für 1 h mit 2% Rinderserumalbumin (BSA), bevor Sie sie mit primären Antikörpern (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) über Nacht bei 4 °C in einem Shaker inkubieren. Nach der Inkubation werden die ungebundenen Primärantikörper durch Waschen (5 min/Waschen, 3x) der Objektträger mit PBST (PBS + 0,1 % Tween 20) entfernt.
- Die entsprechenden Sekundärantikörper (Esels-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper TRITC [1:1000], Esel-Anti-Kaninchen-IgG-FITC [1:500], Esel-Anti-Maus-IgG 488 [1:300], Esel-Anti-Kaninchen-IgG 594 [1:400]) für 1 h mit geeigneten unspezifischen IgG-Antikörpern inkubieren. Entfernen Sie den ungebundenen Sekundärantikörper mit PBST (5 min/Waschen, 3x).
- Die Zellkerne werden mit 5 μg/ml DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol) gegengefärbt und die Objektträger versiegelt.
- Fluoreszenzbildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop durchführen (Vergrößerung: 400x; Belichtungszeit: 50 ms).
- Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)
- Nehmen Sie das RNA-Isolations-Kit ein, um die Gesamt-RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren.
- Verwenden Sie ein cDNA-Transkriptionskit mit hoher Kapazität, um 1-2 μg Gesamt-RNA in cDNA umzuschreiben.
- Die reverse Transkription (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) und qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 Zyklen) wird in einer 20-μl-Lösung durchgeführt, die cDNA (100 ng), TaqMan Genexpression Assay Mix (1 μl), universellen PCR Master Mix (10 μl) und ddH2O (bis 20 μl) enthält.
- Verwenden Sie die vergleichende CT-Technik (ΔΔCT)4,9, um die relative Genexpression zu untersuchen.
3. Charakterisierung von LNC
- Zellzählung (Hämozytometer)
- Die LNCs werden vom Boden der Platte mit 0,25 % TE für 5 Minuten im 37 °C heißen Zellinkubator aufgeschlossen.
- Beenden Sie den Aufschluss durch Zugabe von 1 ml MESCM (enthält Knockout-Serum), zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 200 x g und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab.
- Fügen Sie 1 ml MESCM hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und nehmen Sie dann 10 μl Zellsuspension in ein 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 0,4 % Trypanblau-Färbelösung hinzu.
- Geben Sie 10 μl gefärbte Zellsuspension auf den Zählbereich des Hämozytometers und decken Sie ihn zum Zählen mit einem Deckglas ab.
HINWEIS: Die Anzahl der Zellen in den fünf mittleren quadratischen Bereichen ist als "A" definiert. Die Zellzahl in 1 ml wird als 5A × 104 × 2 berechnet.
- Untersuchung von LNC- und BMMSC-Markern mit Durchflusszytometrie15
- Nachweis der Expression von SCF, CD73, CD90 und CD105 in den LNCs und BMMSCs mit Durchflusszytometrie 15 (2-4 ×10 6 Ereignisse/Probe, 2.000 Zellen wurden aus jeder der Proben gewonnen, insgesamt 550.000 Zellen, die gleichzeitig angesteuert wurden).
- Die Zellen werden bei 20-30 °C für 15 Minuten in einem Blockierungspuffer (3 % BSA und 0,05 % Tween-20 in PBS) mit vormarkierten Antikörpern (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] und CD105 [1:50]) gemäß den Anweisungen des Kits gesammelt und gefärbt.
- Führen Sie eine Analyse der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) mit einem Durchflusszytometer durch. In dieser Studie wurden die Software FACS Diva und die Software FlowJo verwendet. Zeichnen Sie für jede Probe 10.000 Ereignisse auf und analysieren Sie lebende Zellen.
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Representative Results
Wachstum von LNC
Die LNCs wurden erfolgreich gemäß der Methode des Verdaus von Kollagenase A (2 mg/ml) des korneoskleralen Randgewebes, wie oben beschrieben (Abbildung 1), isoliert. In Übereinstimmung mit einer zuvor berichteten Studie3 wurden nach dem Verdau von Kollagenase A raupenartige Cluster unter dem Mikroskop sichtbar gemacht (Abbildung 2). Der Anteil der Spindelzellen nahm mit der Zellpassage allmählich zu. Spindelförmige Zellen konnten auf beschichteten 5%-Basalmembran-Matrixplatten wachsen, im Gegensatz zu ihren Gegenstücken, die auf Kunststoff ohne beschichtete Basalmembranmatrix kultiviert wurden3. Zellen von P1 bis P12 zeigten eine einheitliche Proliferationsrate mit einer Zellverdopplungszeit zwischen 2 und 7 Tagen (Tabelle 2). In dieser Studie wurden LNCs auf die 13 Passagen und 34 Verdopplungen kultiviert (Abbildung 3)3. LNCs wurden aus Primärzellen (LNC P0) kultiviert; LNC P0 wuchs langsam und dauerte etwa 12 Tage. LNCs benötigten nur etwa 3 Tage für die Passage in P1-P8, und die Wachstumsrate der LNCs nach P9 nahm signifikant ab (Tabelle 2). In Bezug auf die Zellmorphologie waren LNCs spindelförmig und in P0 rund. Nach P3 waren die LNCs spindelförmig mit der gleichen morphologischen Größe (Abbildung 2). Das Ausmaß der Gesamtexpansion wurde als Anzahl der Populationsverdopplungen von P0 auf P13 mit der folgenden Formel gemessen: Anzahl der Zellverdopplungen (NCD) = log10 (y/x) / log102, wobei y die endgültige Dichte der Zellen und x die anfängliche Aussaatdichte der Zellen3 ist. NCD stellt die Wachstumsrate der LNCs dar (Abbildung 3A). Ausgehend von den NCD- und akkumulativen NCD-Kurven (Abbildung 3B) brauchten die LNCs am wenigsten Zeit, um exponentiell anzusteigen, und wuchsen am schnellsten gegenüber den P3-P5 (Abbildung 3). Nach dem P5 nahm die Zellwachstumsrate signifikant ab, NCD kehrte auf 1,32 in P13 zurück und das Wachstum kam fast zum Stillstand.
Identifizierung von LNC
Nach der Isolierung und Kultur der LNCs war eine weitere wichtige Aufgabe die Identifizierung. LNCs, die für Vim, CD90, CD105, SCF und PDGFRβ exprimiert werden, jedoch nicht für Pan-CK, gemäß aktuellen relevanten Studien zu LNCs (Abbildung 4)9. Die doppelte Immunfärbung von LNC P4 zeigte, dass diese Zellen konsistent Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+ waren (Abbildung 4). Die qPCR zeigte auch eine verminderte Pan-CK-Expression im P2 und erhöhte Vim-, CD90-, CD105-, SCF- und PDGFR-Transkripte im P3. Die Transkriptionsniveaus von Vim, CD90, CD105, SCF und PDGFR stiegen im P4 im Vergleich zum P1 dramatisch an (p < 0,01) (Abbildung 4)9.
Eigenschaften von LNC
Weitere Analysen zeigten, dass LNCs mehr embryonale Stammzellmarker (ESC) (Nestin, Rex1 und SSEA4), mesenchymale Stammzellmarker (MSC) (CD73, CD90 und CD105) und Nischenzellmarker (NC) (MSX1, P75NTR und PDGFRβ) exprimierten (Abbildung 5)15. Die Durchflusszytometrie zeigte, dass Oberflächenantigeneigenschaften von MSCs, einschließlich CD73, CD90 und CD105, sowohl in LNCs als auch in BMMSCs exprimiert wurden15. Die Prozentsätze der LNCs, die CD73, CD90, CD105 und SCF exprimierten, betrugen etwa 95 %, 97 %, 92 % bzw. 11 %, während die der BMMSCs 68 %, 99 %, 20 % bzw. 3 % betrugen. Dies zeigt, dass LNCs signifikant höhere Konzentrationen der MSC-positiven Marker CD73, CD105 und des Zytokins SCF (p < 0,01) und ein ähnliches Niveau von CD90 (p > 0,05) im Vergleich zu BMMSCs exprimieren (Abbildung 6)15.
Abbildung 1: Der Prozess der Isolierung von LNCs . (A) Korneosklerales Randgewebe. (B) Cluster nach Kollagenase A-Verdauung bei 37 °C für 18 h. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: P0- bis P13-LNCs, kultiviert auf einer 5%igen Basalmembranmatrix-beschichteten 6-Well-Platte in MESCM (Bar = 50 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Das Wachstumsmuster der LNCs von P0-P13. (A) die NCD der LNCs von P0-P13; (B) Die kumulative NCD der LNCs von P0 bis P13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Immunfluoreszenz und qPCR. Immunfluoreszenz und qPCR zeigten, dass LNCs Vim, CD90, CD105, SCF und PDGFRβ einheitlich exprimierten, nicht aber Pan-CK. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Zhu et al.9 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: LNCs exprimieren mehr ESC-, MSC- und NC-Marker als BMMSCs. P4 LNCs und P4 BMMSCs wurden einer qPCR zur Transkriptionsexpression von ESC-Markern (A), MSC und Neuralleistenmarkern (B) unterzogen (n = 3, *P < 0,05, #P < 0,05 bzw. **p < 0,01). Immunfärbung von ESC-Markern (C) und MSC, NC-Markern (D) mit nuklearer Gegenfärbung nach Hoechst 33342. Maßstabsbalken = 25 μm. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Li et al.15 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung von P4-LNCs und BMMSCs (A-F). Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Analyse von MSC-Markern wie CD73, CD90 und CD105 (n=3). Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Li et al.15 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reagenz | Konzentration der Stammlösung | Volumen | Endkonzentration | Speicherumgebung |
| DME/F-12 1:1(1×) | Basis-Medium | 180 ml | 90% | 4 °C |
| KnockOutTMSR | - | 20 ml | 10% | -20 °C |
| Serumersatz für ESCs/iPSCs | ||||
| Recominanter humaner Leukämie-Hemmfaktor (LIF) | 50 μg/ml | 40 μl | 10 ng/ml | -80 °C |
| Rekombinantes humanes FGF-basic | 100 μg/ml | 8 μl | 4 ng/ml | -80 °C |
| ITS (Insulin, Transferrin, Natriumselenit) | 500 μg/ml Insulin | 2 ml | 5 μg/ml Insulin | -20 °C |
| 500 μg/ml Transferrin | 5 μg/ml Transferrin | |||
| 500 ng/ml Natriumselenit | 5 ng/ml Natriumselenit | |||
| Gentamicin | 25 μg/ml | 2 ml | 50 μg/ml | 4 °C |
| Amphotericin B | 2500 μg/ml | 100 μl | 1,25 μg/ml | 4 °C |
Tabelle 1: MESCM-Formulierung.
| Durchgang | Aussaatdichte (× 105 Zellen/cm2) | Enddichte (× 105Zellen/cm2) | Kulturzeit (Tage) | Anzahl der Zellverdopplungen (NCD) | Kukumulative nichtübertragbare Krankheiten |
| P0 | 0.22 | 0.385714 | 12 | 0.810029 | 0.810029 |
| Platz 1 | 0.08 | 0.365714 | 4 | 2.192645 | 3.002674 |
| Platz 2 | 0.051429 | 0.357143 | 3 | 2.795859 | 5.798533 |
| Platz 3 | 0.037143 | 0.337143 | 2 | 3.182203 | 8.980737 |
| Platz 4 | 0.028571 | 0.311429 | 6 | 3.446256 | 12.42699 |
| Platz 5 | 0.04 | 0.385714 | 3 | 3.269461 | 15.69645 |
| Platz 6 | 0.054286 | 0.48 | 4 | 3.14439 | 18.84084 |
| Platz 7 | 0.057143 | 0.351429 | 3 | 2.620586 | 21.46143 |
| Platz 8 | 0.08 | 0.394286 | 3 | 2.30117 | 23.7626 |
| Platz 9 | 0.06 | 0.345714 | 6 | 2.526546 | 26.28915 |
| Platz 10 | 0.022857 | 0.122857 | 7 | 2.426265 | 28.71541 |
| Platz 11 | 0.025714 | 0.122857 | 5 | 2.25634 | 30.97175 |
| Platz 12 | 0.028571 | 0.114286 | 5 | 2 | 32.97175 |
| Seite 13 | 0.045714 | 0.114286 | 10 | 1.321928 | 34.29368 |
Tabelle 2: Serielle Durchgänge des LNC auf Kunststoff.
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Discussion
Die Transparenz der Hornhaut wird in der Regel durch die regelmäßige Anordnung und Verteilung kleiner Fasern (25-30 nm Durchmesser) im Hornhautstroma aufrechterhalten, was für die normale Sehschärfe entscheidend ist16. Weltweit gibt es 253 Millionen sehbehinderte Menschen, von denen 36 Millionen blind sind17. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) betrachtet Hornhautblindheit als eine der schwerwiegendsten Gefahren für das menschliche Sehvermögen und macht 5,1 % aller Erblindungen weltweit aus16. Ein Hornhautepitheldefekt mit normalem CES kann schnell heilen, ohne eine Narbe zu hinterlassen18. Es wird geschätzt, dass weltweit mehr als 12,7 Millionen Patienten aufgrund eines mittelschweren bis schweren Sehverlusts eine Hornhauttransplantation benötigen19; 30 % der Fehlschläge bei Hornhauttransplantationen wurden durch CESD20 verursacht. Aufgrund des Mangels an Hornhautspenden in den meisten Ländern der Welt konnte jedoch nur einer von siebzig hornhautblinden Patienten letztendlich eine Hornhauttransplantation erhalten21. Derzeit kann die Hornhautepithel-Stammzelltransplantation (CEST) zur Behandlung von CESD22 eingesetzt werden. Patienten mit monokularer CESD können CES von gesunden Augen für CEST erhalten. Bei Patienten mit bilateraler CESD kann jedoch nur ein allogenes CES zur Behandlung erhalten werden. Die Immunabstoßung ist nach wie vor der Hauptgrund für das Versagen der allogenen CEST. Eine vielversprechende Methode, um die therapeutische Behandlung von CESD zu reduzieren, besteht darin, eine Zelle zu finden, die das autogene CES effektiv ersetzen oder die Differenzierung anderer autogener Zellen von anderen Stellen zu CES fördern kann. Die In-vitro-Differenzierung autologer Zellen zu CES wird ebenfalls immer beliebter, darunter BMMSC 23, orale Schleimhautepithelzellen (OMEC)24, Stammzellen der Zahnpulpa (DPSC)19, humane Fibroblasten-induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)25 und Fettstammzellen (ASC)26. Rohaina et al.23fanden heraus, dass BMMSCs, die 10 Tage lang auf Amnionmembranen kultiviert wurden, sich in Hornhautepithelzellen differenzieren konnten und dass die CK3- und p63-Expression nach der Induktion der Differenzierung signifikant zunahm. Im Jahr 2020 induzierten O'Callaghan et al.24die Differenzierung von oralen Schleimhautepithelzellen zu Hornhautepithelzellen mit einem neuen Kultursystem und setzten es erfolgreich zur Behandlung von CESD unter Verwendung einer 3D-Gewebestruktur (RAFT) als Träger für die orale Schleimhautepithelzellkultur mit menschlichen oralen Schleimhautfibroblasten als Trophoblasten ein. Darüber hinaus differenziert sich DPSC erfolgreich in korneale Stroma- und Epithelzellen. Durch die Hochregulierung der Expression von K3, K12 und CD90 kann die DPSC die Invasion der Hornhautkonjunktiva verhindern. In einer anderen Studie wurden DPSC als Amnionzellblätter huckepack auf der Hornhautoberfläche in einem CESD-Modell für Kaninchen verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass die DPSC-Gruppe sauberere Hornhäute und weniger Angiogenese aufwies als die Kontrollgruppe27. Hayashi et al.28erreichten eine Differenzierung mit Hilfe von Fibroblasten-abgeleitetem iPSC, das nach 12 Wochen in PAX6(+)- und K12(+)-Hornhautepithelzellen induziert werden konnte. iPSC entwickelt sich effektiv zu Hornhautepithelzellen, aktiviert K12 und unterdrückt NANOG25. Zeppieri et al.26 entdeckten, dass ASCs in einem laserinduzierten Tiermodell in Hornhautepithelzellen differenzieren können, um CESD bei Mäusen zu heilen und die Wundheilung des Hornhautepithels zu verbessern.
LNCs lokalisieren sich in der limbalen Nische, wo CES geschützt und unterstützt werden, und weisen viele ähnliche Eigenschaften wie MSCs auf. LNCs wurden zuerst von Polisetty et al.2 isoliert und erstmals von Xie et al.3 benannt. Jüngsten Studien zufolge sind LNCs grundlegendere Stammzellen als MSCs und können sich leicht in Adipozyten, Chondrozyten und Osteozyten differenzieren 4,29. Im Vergleich zu den häufig verwendeten BMMSCs weisen LNCs größere Stammzelleigenschaften auf (höhere Expression von CD73, CD105, PDGFR, SCF, etc.) (Abbildung 5) 30. LNCs können Kaninchen mit CESD, die durch Hornhautalkaliverbrennungen verursacht werden, erfolgreich behandeln, indem sie die Reparatur des Hornhautepithels und des Stromas fördern15. Die reduzierte Expression von Fibronektin (FN), Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF) und sezerniertem saurem und cysteinreichem Protein (SPARC) in Hornhautfibroblasten deutet darauf hin, dass die Sekretion von LNCs die Wundheilung verbessert und die Fibrose reduziert7.
Interessant ist, dass sich LNCs in einer 3D-Mikroumgebung wieder mit MCECs vereinen können, wodurch letztere Zellen dazu angeregt werden, die Stammzelleigenschaften wiederherzustellen9. LNCs beschleunigen effektiv das CES-Wachstum31 und verhindern Hornhautvernarbungen10. Die Anzahl der LNCs ist jedoch begrenzt; Studien haben gezeigt, dass es nur etwa 3 % der Gesamtzahl der limbalen Stromazellen in der Rinderhornhaut ausmacht32, mit einer signifikanten Expression von Keratansulfat, Keratocan und ALDH3A133. Sie können in der menschlichen Hornhaut weniger als 1 % betragen33.
In diesem Protokoll wurden frühere Methoden zur Isolierung, Reinigung und Identifizierung von LNCs wiederholt 3,14,34. Nach 18-stündiger Behandlung von menschlichem Limbusgewebe mit Kollagenase A (2 mg/ml) wurden LNCs isoliert. P0 LNC entwickelte sich langsam und wies verschiedene Zellmorphologien auf, darunter spindelförmige LNCs, polygonale LNCs und sichtbare sphärische MCEC (Abbildung 2, P0). Frühere Studien haben gezeigt, dass LNCs spindelförmige Zellen sind, die sich mit homogener Morphologie an den Boden der Kulturoberfläche anheften14. Gleichzeitig sind die MCECs rund29, was mit der Morphologie der in diesem Protokoll kultivierten Zellen übereinstimmt. Darüber hinaus wuchsen die P0-LNCs langsam zu den Zellen, die in etwa 12 Tagen mit etwa 70%-80% der Zelldichte wuchsen. P1-P12 LNC vermehrte sich wesentlich schneller und bedeckte in 3-6 Tagen praktisch die gesamte Kulturplatte. Nach P1 waren die spindelförmigen LNCs den Adnexzellen der runden MCEC- und polygonalen Zellen signifikant überlegen.
Aus den NCD-Werten in Tabelle 2 und Abbildung 3 geht hervor, dass die LNCs P0 die niedrigste NCD (0,810) aufwiesen und dass die Zellpassage über 12 Tage erfolgte. Nach dem P1 beschleunigte sich das Wachstum der LNCs jedoch dramatisch, und die Wachstumsrate erreichte mit 3,44 im P4 ihren Höhepunkt. Nach dem P6 war die Wachstumsrate der LNCs erheblich reduziert (Abbildung 3). Die Wachstumsrate und die Aktivität der P4 waren im Hinblick auf das Wachstumsmuster der LNCs im Wesentlichen am höchsten, was mit früheren Ergebnissen übereinstimmt, die darauf hindeuteten, dass die Wachstumsaktivität der P4-P6 LNCs die beste ist9. Diese Methode hat jedoch gewisse Einschränkungen, die Anzahl der LNC P0 variiert stark je nach Alter des Spenders und dem Zeitpunkt des Todes. Wenn das Spendergewebe jünger und frischer ist, kann daher mehr P0-LNC isoliert werden. Der wichtigste Faktor bei der Nachahmung der Mikroumgebung von CES in vitro ist der Bedarf an universellen Nischenfaktoren, wie z. B. einer laminaminreichen extrazellulären Matrix35.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass LNCs eine entscheidende Rolle bei der Unterstützung von Hornhautepithel-Stammzellen und der Aufrechterhaltung der Stammzellbildung von CES spielen, einschließlich der Selbsterneuerung und Differenzierung zu reifen Hornhautepithelzellen. Es ist zu erwarten, dass LNC ein innovatives Zellwerkzeug für die Behandlung von Patienten mit CESD 9,15 ist.
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Disclosures
Keiner der Autoren verfügt über relevante finanzielle Angaben.
Acknowledgments
Vielen Dank an Wei Wang, Lingjuan Xu und Rong Liu für die Anleitung zu dieser Arbeit, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You und Li Guigang für die Bereitstellung eines Teils des Materials, Guanyu Su für das Schreiben des Manuskripts, Xiao Zhou, Yihong Xiong und Huatao Xie für die Korrektur des Manuskripts und Guigang Li für seine vollständige Anleitung. Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82070936, 81470606, 81570819), dem wissenschaftlichen Forschungsprojekt für Gesundheit und Familienplanung der Provinz Hubei (Nr. WJ2017M073), Top Ten translationale medizinische Forschungsprojekte des Tongji-Krankenhauses (Nr. 2016ZHYX20), Ausbildungsprojekt junger medizinischer Pioniere in der Stadt Wuhan (Nr. 2015whzqnyxggrc10), Global Talents Recruitment Program (G2022154028L), Projekt der Nationalen Gesundheitskommission der Provinz Hubei im Jahr 2022 (WJ2021ZH0005) und Subject Construction Foundation of Finance Department of Hubei im Jahr 2022 (4200002815T000000102)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | - |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | - |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | - |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | - |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | - |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | - |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | - |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | - |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
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