Summary
ここでは、ヒトの辺縁ニッチ細胞を単離して同定するためのプロトコルを紹介します。
Abstract
ここでは、辺縁ニッチ細胞(LNC)の単離と同定のための標準的な手順を報告します。アイバンクから得られた辺縁部組織をLNCの単離に使用しました。組織を無菌条件下で12個に分割し、コラゲナーゼAを使用して細胞培養インキュベーターで37°Cで18時間消化し、LNCおよび辺縁上皮前駆細胞を含む細胞クラスターを得ました。細胞クラスターを0.25%トリプシン-EDTAを用いて37°Cで15分間消化し、単一細胞を得た後、5%マトリゲルでコーティングされたプラスチック表面上の改変胚性幹細胞培地(MESCM)で培養しました。細胞は70%のコンフルエンスで継代し、免疫蛍光法、リアルタイム定量PCR(qPCR)、およびフローサイトメトリーを用いてLNCを同定しました。一次LNCを単離し、12回以上継代した。P4からP6にかけてのLNCの増殖活性が最も高かった。LNCは、BMMSC(SCF、Nestin、Rex1、SSEA4、CD73、CD90、MSX1、P75NTR、およびPDGFRβ)よりも高い幹細胞マーカーを発現していました。さらに、P4 LNCはVIM、CD90、CD105、PDGFRβを均一に発現するが、LNCの同定マーカーとして使用できるPan-CKは発現しないことが示された。 フローサイトメトリー解析では、LNCの約95%、97%、92%、および11%がそれぞれCD73、CD90、CD105、およびSCFを発現し、BMMSCでは68%、99%、20%、および3%であることが示されました。LNCの単離と同定のための標準的なプロセスは、LNCを広く使用するための信頼できる実験室基盤を提供する可能性があります。
Introduction
角膜上皮幹細胞欠損症(LSCD)1、角膜上皮再生症(CES)の発生率は、角膜感染症や外傷によりますます緊急性を増しています。適切に治療しないと、CESDは角膜移植を必要とする失明につながる可能性があります。その結果、CESの再生はより重要になってきています。辺縁ニッチ細胞(LNC)と呼ばれる支持細胞のグループがあり、CES機能に不可欠なサポートを提供します。辺縁間質幹細胞は、Polisettyらによって最初に単離され2、Xieら3によって、辺縁の下皮および辺縁の間質に局在するLNCとして同定されました。LNCは角膜縁を支える幹細胞であり、骨髄由来MSC(BMMSC)の機能を持ち、角膜上皮細胞や角膜間質細胞などに成長を誘導する可能性があります3,4,5,6,7。これまでの研究で、LNCの幹細胞の質は、すでに臨床で広く使用されているBMMSC8よりも原始的であることが示されました。LNCは、特にCESDの治療において、MSCに次ぐ実行可能な選択肢になる可能性さえあります。CESの重要な支持細胞であるLNCは、辺縁部の「ニッチ」構造に由来する幹細胞でもあります。LNCは、成熟角膜上皮細胞(MCEC)のCES9への脱分化に重要な役割を果たす可能性があります。しかし、LNCに関する研究はまだ比較的不十分であり、LNCの用語、単離、精製、同定、および特性に関するコンセンサスはありません。一部の研究者は、LNCを辺縁生検由来間質幹細胞10、辺縁間葉系幹細胞11、辺縁線維芽細胞12、および辺縁間葉系間質細胞13と名付けました。LNCの増殖特性は詳細に記述されておらず、科学的および臨床的応用が有望であり、将来的に最も重要な臨床ツールの1つとなる可能性があるため、LNCの単離、精製、同定、および特性を要約する必要があります。
以前の研究14によると、LNCは主に辺縁の下皮と辺縁の間質に存在します。このプロトコルには、コラゲナーゼAを使用して辺縁組織を処理し、LEPCとLNCからなるクラスターを取得し、0.25%トリプシンEDTA(TE)で単一細胞に消化することが含まれます。次いで、LNCを改変胚性幹細胞培地(MESCM)で選択的に培養し、精製した。この論文で報告されているプロトコルは単純で、ヒトLNCを大量に入手するのに高い効率を持っています。
LNCの単離、培養、同定の詳細な手順は、LNC研究に関心のある科学者のためにビデオに記録されており、必要に応じて便利に繰り返すことができます。
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Protocol
50歳から60歳までのドナーからの辺縁部組織は、赤十字眼科銀行、同済病院(中国、武漢)から入手しました。この議定書は同済倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。
1. アイソレーション
- 中期角膜保存培地から辺縁部組織を採取し、超クリーンな作業台で無菌条件下で操作します。
- 角膜の周りの虹彩と内皮を、滅菌した外科用丸い刃でこすり落とし、取り除きます。
- 角膜と強膜の両側に1mmを残した外科用ブレードで、辺縁組織を12の等しい大きさに切断します。
- 辺縁部組織を3.5cmの培養プレートに移し、1 mLのコラゲナーゼA(2 mg/mL、DF-12培地中)を加えて、すべての組織を浸して消化します。
- プレートを37°Cの細胞インキュベーターに入れ、辺縁組織を18時間消化します。
注意: フォローアップ手順は通常、2日目に実行されます。 - 5%基底膜マトリックス(マトリゲル)でコーティングされた6ウェル培養プレートを調製します。
- ウェルの底に5%基底膜マトリックス(MESCMに溶解[表1])をコーティングします。
- 200 μL と 1 mL チップ、15 mL 遠心チューブ 1 本、6 ウェルプレート 1 枚を滅菌バッグに入れて調製します。
- 滅菌したバッグ(チップと遠心チューブを含む)と新しい6ウェルプレートを-20°Cまたは-80°Cの環境で20分間置きます。基底膜マトリックスを冷蔵庫で4°Cで解凍します。
- -20°Cまたは-80°Cの環境から予冷したチップ、遠心チューブ、6ウェルプレートを取り出し、ウルトラクリーンワークベンチで以下の操作を行います。
- 200 μL チップを使用して 5% 基底膜マトリックス 50 μL を 1 mL MESCM に移し、穏やかかつ均一に混合します。
- 予冷した 1 mL チップを使用して、5% 基底膜マトリックス(MESCM に溶解)を 6 ウェル培養プレートの 1 つのウェルに移します。
- 6ウェルプレートを静かに水平に振とうし、6ウェル培養プレートを37°Cの細胞インキュベーターに約1時間入れてから、次のステップを実行します。
- 18時間消化後、コラゲナーゼA消化された辺縁組織を取り出すと、目に見える小さな塊と未消化の強膜組織のみが残ります。
注:高倍率顕微鏡では、多くの高密度に充填された細胞(LNCを含む)で構成されるクラスターが明らかになります。 - 200 μLのピペットチップを使用して、実体顕微鏡下で未消化の強膜組織からクラスターを剥離します。
- クラスターを3.5cmの培養プレートに移し、0.25%TEに浸漬してから、プレートを細胞インキュベーターに15分間入れます。
- 1 mL MESCM と 10% ノックアウト血清を添加して細胞消化を停止し、1 mL のピペットチップを使用してクラスターを個々の細胞に再懸濁するために、静かに上下にピペットで移動します。
- 細胞懸濁液を 15 mL 遠心チューブに移し、200 x g で 5 分間遠心分離します。
- 細胞沈殿を妨げずに上清を慎重に除去し、1 mL MESCM を添加して細胞を再懸濁します。
- 1 mLのピペットチップを使用して、下部の細胞沈殿物がMESCMに均一に懸濁するまで2〜3回ピペットを上下させ、20 μLの細胞懸濁液を採取して細胞をカウントします。
- 細胞懸濁液を 1 mL のピペットチップで 5% 基底膜マトリックスコーティング 6 ウェルプレートに移し、MESCM の容量を 2.5 mL に増やします。
- 6ウェルプレートを水平に静かに振とうし、細胞を均等に分散させます。
- 細胞を画像化して記録した後、培養インキュベーターに移します。細胞を毎日観察して写真に撮り、3〜4日ごとに培地を交換します。
2. LNCの識別
- 免疫蛍光染色
- 1 mL 0.25% TE を使用して 37°C のセルインキュベーターで 5 分間、プレートの底部から LNC を消化します。
- 1 mL MESCM(ノックアウト血清を含む)を添加して消化を終了し、細胞懸濁液を 200 x g で 5 分間遠心分離し、上清を注意深く吸引します。
- 1 mL の MESCM を加えて、細胞を懸濁液に再懸濁します。80 μLの細胞懸濁液(スライドあたり4×103 細胞)を4枚のスライド(20 μL/スライド)用に調製し、遠心分離システムを使用して、メーカーの指示に従って細胞を顕微鏡スライドに沈着させます。
- 4%パラホルムアルデヒドで細胞(ステップ3でスライドに接着)を約10分間固定した後、0.2% Triton X-100 in PBSで15分間スライド上の細胞を透過処理します。
- 2%ウシ血清アルブミン(BSA)で細胞を1時間ブロックしてから、一次抗体(Pan-CK [1:1000]、Vim [1:100]、CD90 [1:100]、CD105 [1:200]、SCF [1:100]、PDGFRβ [1:100])と4°Cで一晩インキュベートします。 インキュベーション後、スライドをPBST(PBS + 0.1% Tween 20)で洗浄(5分/回、3回)して、結合していない一次抗体を除去します。
- 対応する二次抗体(ロバ抗マウスIgG二次抗体TRITC [1:1000]、ロバ抗ウサギIgG FITC [1:500]、ロバ抗マウスIgG 488 [1:300]、ロバ抗ウサギIgG 594 [1:400])を適切なIgG非特異的IgG抗体と1時間インキュベートします。PBST(5分/洗浄、3回)を使用して、結合していない二次抗体を除去します。
- 核を 5 μg/mL DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)で対比染色し、スライドを密封します。
- 蛍光顕微鏡(倍率400倍;ばく露時間: 50 ms)。
- 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)
- RNA Isolation Kit を使用して、製造元の指示に従って全 RNA を抽出します。
- 大容量cDNA転写キットを使用して、1〜2μgのトータルRNAをcDNAに逆転写します。
- cDNA(100 ng)、TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL)、ユニバーサル PCR マスターミックス (10 μL)、ddH 2 O (20 μL まで) を含む 20 μL 溶液中で、逆転写 (42 °C、2分、50 °C、85 分) および qPCR (95 °C、5 分、95 °C、10 秒、40 サイクル) を実行します。
- 比較CT法(ΔΔCT)4,9を用いて、相対的な遺伝子発現を調べます。
3. LNCの特性評価
- 細胞カウント(血球計算盤)
- プレートの底部から0.25%TEを用いて、37°Cの細胞インキュベーターで5分間LNCを消化します。
- 1 mL MESCM(ノックアウト血清を含む)を添加して消化を終了し、細胞懸濁液を 200 x g で 5 分間遠心分離し、上清を注意深く吸引します。
- 1 mL の MESCM を加えて細胞を再懸濁し、0.5 mL の遠心チューブで 10 μL の細胞懸濁液を採取します。等量の0.4%トリパンブルー染色溶液を加えます。
- 染色した細胞懸濁液10 μLを血球計算盤の計数領域に置き、計数用のカバースリップで覆います。
注:中央の5つの正方形の領域のセル数は「A」として定義されます。1 mLの細胞数は、5A × 104 × 2として計算されます。
- フローサイトメトリーによるLNCおよびBMMSCマーカーの検査15
- フローサイトメトリー15(2-4 × 106イベント/サンプル、各サンプルから2,000個の細胞が得られ、同時にゲーティングされた合計550,000個の細胞)を使用して、LNCおよびBMMSCにおけるSCF、CD73、CD90、およびCD105の発現を検出します。
- キットの説明書に従って、ブロッキングバッファー(3% BSAおよび0.05% Tween-20 in PBS)中で細胞を採取し、染色します。
- フローサイトメーターを用いた蛍光活性化セルソーティング(FACS)解析を実施します。本研究では、FACS DivaソフトウェアとFlowJoソフトウェアを使用した。サンプルごとに 10,000 個のイベントを記録し、生細胞をゲートして解析します。
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Representative Results
LNCの成長
LNCは、上記のように、角膜強膜縁組織のコラゲナーゼA(2 mg/mL)消化の消化法に従って正常に単離されました(図1)。以前に報告された研究3と同様に、コラゲナーゼA消化後、イモムシのようなクラスターが顕微鏡下で可視化されました(図2)。紡錘体細胞の割合は、細胞の継代とともに徐々に増加しました。紡錘形の細胞は、コーティングされた基底膜マトリックス3のないプラスチックで培養された対応する細胞とは異なり、コーティングされた5%基底膜マトリックスプレートで増殖する可能性があります。P1からP12までの細胞は均一な増殖速度を示し、細胞倍加時間は2〜7日でした(表2)。本研究では、LNCを13継代、34倍に培養しました(図3)3。LNCは初代細胞(LNC P0)から培養しました。LNC P0 はゆっくりと成長し、約 12 日かかりました。P1-P8ではLNCの継代に約3日しかかからず、P9以降のLNCの増殖速度は有意に低下しました(表2)。細胞形態に関しては、LNCは紡錘形をしており、P0では丸い。P3以降、LNCは同じ形態サイズの紡錘形になりました(図2)。総膨張の程度は、次の式を使用して、P0からP13に倍増する母集団の数として測定されました:細胞倍増数(NCD)= log10(y / x)/ log102、ここで、yは細胞の最終密度であり、xは細胞3の初期播種密度です。NCDはLNCの成長率を表します(図3A)。NCD曲線と累積NCD曲線(図3B)から、LNCは指数関数的に増加するのに最も時間がかかり、P3-P5(図3)から最も速く成長しました。P5以降、細胞増殖速度は著しく低下し、P13ではNCDは1.32に戻り、増殖はほぼ停止しました。
LNCの識別
LNCの単離と培養に続いて、もう一つの重要な課題は同定でした。LNCに関する現在の関連研究によると、LNCはVim、CD90、CD105、SCF、およびPDGFRβで発現するが、Pan-CKでは発現しない(図4)9。LNC P4の二重免疫染色により、これらの細胞は一貫してPan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+であることが明らかになりました(図4)。qPCRでは、P2ではPan-CK発現が減少し、P3ではVim、CD90、CD105、SCF、およびPDGFR転写産物が増加していることも明らかになりました。Vim、CD90、CD105、SCF、およびPDGFRの転写レベルは、P1と比較してP4で劇的に増加しました(p < 0.01)(図4)9。
LNCの特徴
さらなる解析により、LNCは胚性幹細胞(ESC)マーカー(Nestin、Rex1、SSEA4)、間葉系幹細胞(MSC)マーカー(CD73、CD90、CD105)、ニッチ細胞(NC)マーカー(MSX1、P75NTR、PDGFRβ)をより多く発現していることが示されました(図5)15。フローサイトメトリーでは、CD73、CD90、CD105などのMSCの表面抗原特性が、LNCとBMMSCの両方で発現していることが示された15。CD73、CD90、CD105、およびSCFを発現するLNCの割合は、それぞれ約95%、97%、92%、および11%であったのに対し、BMMSCのLNCは、それぞれ68%、99%、20%、および3%であった。このことは、LNCがBMMSCと比較して、MSC陽性マーカーであるCD73、CD105、サイトカインSCF(p < 0.01)と同程度のCD90(p > 0.05)を有意に多く発現していることを示しています(図6)15。
図1:LNCの単離プロセス 。 (A)角膜強膜縁組織。(B)コラゲナーゼAを37°Cで18時間消化した後のクラスター。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:MESCMで5%基底膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレートで培養したP0〜P13 LNC( Bar = 50 μm)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:P0-P13からのLNCの成長パターン 。 (A)P0-P13からのLNCのNCD。(B)P0-P13からのLNCの累積NCD。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:免疫蛍光法とqPCR。 免疫蛍光法とqPCRにより、LNCはVim、CD90、CD105、SCF、およびPDGFRβを均一に発現するが、Pan-CKは発現しないことが明らかになりました。この図は、Zhu et al.9の許可を得て転載しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:LNCはBMMSCよりも多くのESC、MSC、NCマーカーを発現します。P4 LNCおよびP4 BMMSCをqPCRにかけ、ESCマーカー(A)、MSCおよび神経堤マーカー(B)の転写発現を行った(それぞれn = 3、*P < 0.05、#P < 0.05、および**p < 0.01)。ESCマーカー(C)およびMSC、NCマーカー(D)の免疫染色、Hoechst 33342による核対比染色。スケールバー = 25 μm。この図はLi et al.15の許可を得て転載したものである。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:P4 LNCおよびBMMSCの蛍光活性化セルソーティング(A-F)。CD73、CD90、CD105(n=3)などのMSCマーカーの蛍光活性化セルソーティング(FACS)分析。この図はLi et al.15の許可を得て転載したものである。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 試薬 | 原液の濃度 | 容積 | 最終濃度 | ストレージ環境 |
| DME/F-12 1:1(1×) | ベーシックメディウム | 180 mLの | 90% | 4 °C |
| ノックアウトTMSR | - | 20 mLの | 10% | -20 °C |
| ESC/iPS細胞の血清置換 | ||||
| 推奨ヒト白血病抑制因子(Lif) | 50 μg/mL | 40 μL | 10 ng/mL | -80 °C |
| 組換えヒトFGF-塩基性 | 100 μg/mL | 8 μL | 4 ng/mL | -80 °C |
| ITS(インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム) | 500 μg/mL インスリン | 2 mLの | 5 μg/mL インスリン | -20 °C |
| 500 μg/mL トランスフェリン | 5 μg/mL トランスフェリン | |||
| 500 ng/ml亜セレン酸ナトリウム | 5 ng/mL 亜セレン酸ナトリウム | |||
| ゲンタマイシン | 25 μg/mL | 2 mLの | 50 μg/mL | 4 °C |
| アムホテリシンB | 2500 μg/mL | 100μL | 1.25 μg/mL | 4 °C |
表1:MESCMの定式化。
| 通路 | 播種密度(× 105 cells/cm2) | 最終密度(× 105cells/cm2) | 培養時間(日数) | 細胞倍増数(NCD) | 累積NCD |
| P0の | 0.22 | 0.385714 | 12 | 0.810029 | 0.810029 |
| P1の | 0.08 | 0.365714 | 4 | 2.192645 | 3.002674 |
| P2の | 0.051429 | 0.357143 | 3 | 2.795859 | 5.798533 |
| P3の | 0.037143 | 0.337143 | 2 | 3.182203 | 8.980737 |
| P4の | 0.028571 | 0.311429 | 6 | 3.446256 | 12.42699 |
| P5の | 0.04 | 0.385714 | 3 | 3.269461 | 15.69645 |
| P6の | 0.054286 | 0.48 | 4 | 3.14439 | 18.84084 |
| P7の | 0.057143 | 0.351429 | 3 | 2.620586 | 21.46143 |
| P8の | 0.08 | 0.394286 | 3 | 2.30117 | 23.7626 |
| P9の | 0.06 | 0.345714 | 6 | 2.526546 | 26.28915 |
| P10の | 0.022857 | 0.122857 | 7 | 2.426265 | 28.71541 |
| P11の | 0.025714 | 0.122857 | 5 | 2.25634 | 30.97175 |
| P12の | 0.028571 | 0.114286 | 5 | 2 | 32.97175 |
| P13の | 0.045714 | 0.114286 | 10 | 1.321928 | 34.29368 |
表2:プラスチック上のLNCの連続継代。
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Discussion
角膜の透明性は、通常、角膜間質における小さな線維(直径25〜30 nm)の規則的な配置と分布によって維持され、これは正常な視力に不可欠です16。世界には2億5,300万人の視覚障害者がおり、そのうち3,600万人が17歳の視覚障害者です。世界保健機関(WHO)は、角膜失明を人間の視力に対する最も深刻な危険の1つと見なしており、世界の全失明の5.1%を占めています16。正常なCESの角膜上皮欠損症は、瘢痕を残さずに迅速に治癒することができます18。世界中で1,270万人以上の患者が、中等度から重度の視力低下のために角膜移植を必要としていると推定されています19。角膜移植失敗の30%はCESD20によって引き起こされました。しかし、世界のほとんどの国で角膜提供が不足しているため、最終的に角膜移植を受けることができたのは、角膜失明患者の70人に1人だけでした21。現在、角膜上皮幹細胞移植(CEST)はCESD22の治療に使用できます。単眼CESDの患者は、CESTの健康な眼からCESを得ることができます。ただし、両側性CESDの患者の場合、治療のために取得できるのは同種CESのみです。免疫拒絶反応は、同種CESTの失敗の主な理由のままです。CESDの治療治療を減らすための有望な方法は、自家CESを効果的に置き換えることができる細胞を見つけること、または他の場所からの他の自家細胞の分化を促進してCESになることです。BMMSC 23、口腔粘膜上皮細胞(OMEC)24、歯髄幹細胞(DPSC)19、ヒト線維芽細胞由来多能性幹細胞(iPSC)25、脂肪幹細胞(ASC)26など、自家細胞のCESへのin vitro分化も一般的になりつつあります。Rohainaら23は、羊膜上で10日間培養したBMMSCが角膜上皮細胞に分化すること、および分化誘導後にCK3およびp63の発現が有意に増加することを発見しました。2020年、O'Callaghanら24は、新しい培養系を用いて口腔粘膜上皮細胞から角膜上皮細胞への分化を誘導し、ヒト口腔粘膜線維芽細胞を栄養膜とする口腔粘膜上皮細胞培養の支持体として3次元組織構造(RAFT)を用いたCESDの治療に用いることに成功しました。さらに、DPSCは角膜間質細胞と上皮細胞にうまく分化します。K3、K12、およびCD90の発現をアップレギュレーションすることにより、DPSCは角膜結膜浸潤を防ぐことができます。別の研究では、ウサギCESDモデルで角膜表面にピギーバックされた羊膜細胞シートとしてDPSCを使用しました。その結果、DPSC群は対照群よりも角膜がきれいで、血管新生が少なかったことが示された27。Hayashiら28は、12週間後にPAX6(+)およびK12(+)角膜上皮細胞に誘導できる線維芽細胞由来iPS細胞を用いて分化を達成しました。iPS細胞は角膜上皮細胞に効果的に成長し、K12を活性化し、NANOG25を抑制します。Zeppieri et al.26は、レーザー誘導動物モデルにおいて、ASCが角膜上皮細胞に分化してマウスCESDを治癒し、角膜上皮創傷治癒を促進できることを発見しました。
LNCは、CESが保護され支持されている辺縁部ニッチに局在し、MSCと類似した多くの特性を持っています。最近の研究によると、LNCはMSCよりも基本的な幹細胞であり、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞に容易に分化することができます4,29。一般的に使用されるBMMSCと比較して、LNCはより高い幹細胞特性を示します(CD73、CD105、PDGFR、SCFなどの発現が高い)。(図5)30.LNCは、角膜上皮と間質の修復を促進することにより、角膜アルカリ熱傷によって引き起こされるCESDのウサギをうまく治療できます15。角膜線維芽細胞におけるフィブロネクチン(FN)、結合組織成長因子(CTGF)、および分泌タンパク質酸性およびシステインリッチ(SPARC)の発現の減少は、LNCの分泌が創傷治癒を促進し、線維症を減少させることを示唆している7。
3D微小環境では、LNCがMCECと再結合し、MCECの細胞を刺激して幹細胞の特性を回復させることが興味深い9。LNCはCESの成長を効果的に加速し31 、角膜の瘢痕化を防ぎます10。ただし、LNCの数量には限りがあります。研究によると、ウシ角膜の辺縁間質細胞の総数の約3%しか占めておらず32、硫酸ケラタン、ケラトカン、ALDH3A133が有意に発現しています。それらは人間の角膜では1%未満である可能性があります33。
このプロトコルでは、LNCを単離、精製、および同定する以前の方法が繰り返されました3,14,34。ヒト辺縁部組織をコラゲナーゼA(2 mg/mL)で18時間処理した後、LNCを単離した。P0 LNCはゆっくりと発生し、紡錘形のLNC、多角形のLNC、目に見える球状のMCECなど、さまざまな細胞形態を示しました(図2、P0)。これまでの研究で、LNCは培養表面の底部に均質な形態で付着する紡錘形の細胞であることが示されている14。同時に、MCECはラウンド29であり、これはこのプロトコルで培養された細胞の形態と一致しています。さらに、P0 LNCはゆっくりと増殖し、約12日間で細胞密度の約70%〜80%まで増殖しました。P1〜P12 LNCは大幅に速く増殖し、3〜6日で培養プレート全体を実質的に覆いました。P1に続いて、紡錘形のLNC付属器細胞は、丸いMCEC細胞や多角形細胞を有意に上回った。
表2および図3のNCD値から、LNCのP0はNCDが最も低く(0.810)、細胞継代が12日間にわたって発生したことが明らかである。しかし、P1以降、LNCの伸びは劇的に加速し、P4では3.44でピークに達しました。P6の後、LNCの増殖速度は大幅に低下しました(図3)。LNCの成長率とP4の活性は、LNCの成長パターンの点で実質的に最高であり、P4-P6 LNCの成長活性が最高であることを示す以前の調査結果と一致しています9。ただし、この方法には一定の制限があり、LNC P0の数はドナーの年齢と死亡時期によって大きく異なります。したがって、ドナー組織が若くて新鮮であれば、より多くのP0 LNCを単離することができる。in vitroでCESの微小環境を模倣する上で最も重要な要因は、ラミナミンに富む細胞外マトリックス35などの普遍的なニッチ因子の必要性である。
結論として、LNCは、角膜上皮幹細胞をサポートし、自己複製や成熟角膜上皮細胞への分化など、CESの幹細胞性を維持する上で重要な役割を果たします。LNCは、CESD9,15の患者を治療するための革新的な細胞ツールとして期待できます。
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Disclosures
どの著者も関連する財務情報開示を行っていません。
Acknowledgments
本書の指導をしてくれたWei Wang氏、Lingjuan Xu氏、Rong Liu氏、資料の一部を提供してくれたYongyao Tan氏、Bihui Jin氏、Chunxiu You氏、Li Guigang氏、原稿を書いてくれたGuanyu Su氏、原稿の添削をしてくれたXiao Zhou氏、Yihong Xiong氏、Huatao Xie氏、そして完全な指導をしてくれたGuigang Li氏に感謝します。本研究は、中国国家自然科学基金会(第82070936号、81470606年、81570819年)、湖北省保健家族計画科学研究プロジェクト(第1号)の支援を受けて行われました。WJ2017M073)、同済医院のトランスレーショナルメディカル研究プロジェクトトップ10(No.2016ZHYX20)、武漢市若手医療パイオニア育成プロジェクト(No.2015whzqnyxggrc10)、グローバル人材採用プログラム(G2022154028L)、2022年湖北省国家衛生健康委員会プロジェクト(WJ2021ZH0005)、2022年湖北省財政部主題建設財団(42000022815T000000102)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | - |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | - |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | - |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | - |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | - |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | - |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | - |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | - |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
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