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Aislamiento e identificación de células de nicho limbal

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para aislar e identificar las células del nicho limbal humano.

Abstract

Aquí presentamos un procedimiento estándar para el aislamiento e identificación de células de nicho limbal (LNCs). Para el aislamiento de las LNC se utilizó tejido del limbo obtenido de un banco de ojos. El tejido se dividió en 12 piezas en condiciones asépticas y se digirió durante 18 h a 37 °C en la incubadora de cultivos celulares utilizando colagenasa A para obtener grupos celulares con LNCs y células progenitoras epiteliales limbales. Los grupos celulares se digierieron durante 15 minutos a 37 °C utilizando tripsina-EDTA al 0,25% para obtener células individuales y luego se cultivaron en medio de células madre embrionarias modificadas (MESCM) en una superficie plástica recubierta con Matrigel al 5%. Las células se hicieron pasar tras una confluencia del 70% y los LNC se identificaron mediante inmunofluorescencia, PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) y citometría de flujo. Los LNC primarios fueron aislados y pasados más de 12 veces. La actividad de proliferación de los LNC de P4 a P6 fue la más alta. Los LNC expresaron marcadores de células madre más altos que los BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR y PDGFRβ). Además, los resultados mostraron que los LNC P4 expresaron uniformemente VIM, CD90, CD105 y PDGFRβ, pero no Pan-CK, lo que podría usarse como marcador para la identificación de LNC. El análisis de citometría de flujo mostró que aproximadamente el 95%, 97%, 92% y 11% de los LNC expresaron CD73, CD90, CD105 y SCF respectivamente, mientras que en las BMMSC fueron del 68%, 99%, 20% y 3%. El proceso estándar para el aislamiento e identificación de LNC podría proporcionar una base de laboratorio confiable para el uso generalizado de LNC.

Introduction

La incidencia de la deficiencia de células madre epiteliales corneales (CESD, por sus siglas en inglés), también llamada deficiencia de células madre limbales (LSCD, por sus siglas en inglés)1, y la regeneración epitelial corneal (CES, por sus siglas en inglés) son cada vez más urgentes debido a la infección y lesión de la córnea. Si no se trata adecuadamente, el CESD puede provocar ceguera que requiere un trasplante de córnea. Como resultado, la regeneración de CES es cada vez más significativa. Existe un grupo de células de apoyo llamadas células de nicho limbal (LNC, por sus siglas en inglés) que proporcionan un apoyo esencial para la función de CES. Las células madre del estroma limbal fueron aisladas por primera vez por Polisetty et al.2 e identificadas por Xie et al.3 como LNC que se localizan en el epitelio limbal subyacente y el estroma del limbo. Las LNC son la célula madre de soporte clave del borde corneal y, con la función de las MSC derivadas de la médula ósea (BMMSC), podrían inducirse a desarrollarse en células epiteliales corneales y células estromales corneales, etc.3,4,5,6,7. Estudios previos demostraron que las cualidades de las células madre de las LNC son más primitivas que lasBMMSCs 8, que ya se utilizan ampliamente en la clínica. Los LNC pueden incluso convertirse en la próxima opción viable después de MSC, especialmente para el tratamiento de la CESD. Como células de soporte importantes para CES, las LNC también son células madre derivadas de la estructura de "nicho" del limbo. Las LNC pueden desempeñar un papel clave en la desdiferenciación de las células epiteliales corneales maduras (MCEC) a CES9. Sin embargo, los estudios sobre los LNC son todavía relativamente insuficientes y no hay consenso sobre la terminología, el aislamiento, la purificación, la identificación y las características de los LNC. Algunos investigadores han nombrado a las LNC células madre estromales derivadas de biopsias limbales 10, células madre mesenquimales limbales 11, células madre de fibroblastos limbales12 y células estromales mesenquimales limbales13. Dado que las características de crecimiento de los LNC no se han descrito en detalle, y debido a sus prometedoras aplicaciones científicas y clínicas, y pueden ser una de las herramientas clínicas más importantes en el futuro, es necesario resumir el aislamiento, la purificación, la identificación y las características de los LNC.

De acuerdo con un estudio previo14, las LNC están presentes principalmente en el epitelio limbal subyacente y en el estroma del limbo. Este protocolo incluye el tratamiento del tejido del limbo con colagenasa A, la obtención de un grupo formado por LEPC y LNCs, y su digestión en células individuales con tripsina-EDTA (TE) al 0,25%. A continuación, los LNC se cultivaron selectivamente en un medio de células madre embrionarias modificadas (MESCM) para su purificación. El protocolo reportado en este trabajo es simple y tiene una alta eficiencia en la obtención de LNCs humanos en grandes cantidades.

El procedimiento detallado de aislamiento, cultivo e identificación de LNC se grabó en el video para los científicos que están interesados en el estudio de LNC, y se puede repetir convenientemente cuando sea necesario.

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Protocol

El tejido del limbo de donantes de entre 50 y 60 años se obtuvo del Banco de Ojos de la Cruz Roja del Hospital Tongji (Wuhan, China). El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de Tongji y se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki.

1. Aislamiento

  1. Obtenga tejido del limbo a partir de un medio de almacenamiento corneal a mediano plazo y opere en condiciones asépticas en un banco de trabajo ultralimpio.
  2. Raspe y extraiga el iris y el endotelio alrededor de la córnea con una cuchilla redonda quirúrgica estéril.
  3. Corte el tejido del limbo en doce trozos del mismo tamaño con una cuchilla quirúrgica con 1 mm a ambos lados de la córnea y la esclerótica.
  4. Transfiera los tejidos del limbo a una placa de cultivo de 3,5 cm, agregue 1 mL de colagenasa A (2 mg/mL, en medio DF-12), para sumergir todos los tejidos para la digestión.
  5. Coloque la placa en la incubadora celular a 37 °C, digiera los tejidos limbales durante 18 h.
    NOTA: Los procedimientos de seguimiento generalmente se realizan al segundo día.
  6. Prepare una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal (Matrigel) al 5%.
    1. Cubrir al 5% la matriz de membrana basal (disuelta en MESCM [Tabla 1]) en el fondo del pozo.
    2. Prepare puntas de 200 μL y 1 mL, un tubo centrífugo de 15 mL y una placa de 6 pocillos en una bolsa esterilizada.
    3. Coloque la bolsa esterilizada (incluidas las puntas y el tubo centrífugo) y una nueva placa de 6 pocillos a un ambiente de -20 °C o -80 °C durante 20 min. Descongelar la matriz de la membrana basal en el refrigerador a 4 °C.
    4. Saque las puntas preenfriadas, el tubo centrífugo y la placa de 6 pocillos del entorno de -20 °C u -80 °C y, a continuación, realice las siguientes operaciones en el banco de trabajo ultralimpio.
    5. Transfiera 50 μL de matriz de membrana basal al 5% a 1 mL de MESCM con una punta de 200 μL y mézclelos suave y uniformemente.
    6. Transfiera la matriz de membrana basal al 5% (disuelta en MESCM) a un pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos utilizando la punta preenfriada de 1 mL.
    7. Agite la placa de 6 pocillos suave y horizontalmente, coloque la placa de cultivo de 6 pocillos en la incubadora celular a 37 °C durante aproximadamente 1 h y luego realice el siguiente paso.
  7. Después de 18 h de digestión, saque el tejido limbal digerido por la colagenasa A, solo quedarán algunos pequeños grupos visibles y tejidos esclerales no digeridos.
    NOTA: La microscopía de gran aumento revela un grupo compuesto por muchas células densamente empaquetadas (incluidas las LNC).
  8. Utilice una punta de pipeta de 200 μL para separar los grupos de los tejidos esclerales no digeridos bajo el microscopio estereoscópico.
  9. Transfiera los racimos a la placa de cultivo de 3,5 cm y sumérjalos en TE al 0,25%, y luego coloque la placa en la incubadora celular durante 15 minutos.
  10. Agregue 1 ml de MESCM con suero knockout al 10 % para detener la digestión celular y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender los grupos en células individuales con una punta de pipeta de 1 ml.
  11. Transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 ml y centrifugue a 200 x g durante 5 min.
  12. Retire el sobrenadante con cuidado sin perturbar la precipitación celular y luego agregue 1 ml de MESCM para resuspender las células.
  13. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces hasta que la precipitación de la célula inferior se suspenda uniformemente en el MESCM utilizando la punta de pipeta de 1 ml y tomar 20 μl de suspensión celular para el recuento de células.
  14. Transfiera la suspensión celular a la placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal al 5 % con una punta de pipeta de 1 ml y aumente el volumen de MESCM a 2,5 ml.
  15. Agite suavemente la placa de 6 pocillos horizontalmente para distribuir uniformemente las células.
  16. Transfiera las células a la incubadora de cultivo después de haber sido fotografiadas y registradas. Observe y fotografíe las células diariamente y cambie el medio cada 3-4 días.

2. Identificación de LNC

  1. Tinción por inmunofluorescencia
    1. Digiera los LNC del fondo de la placa con 1 ml de TE al 0,25% durante 5 min en la incubadora de células a 37 °C.
    2. Finalice la digestión añadiendo 1 ml de MESCM (que contiene suero knockout), centrifugue la suspensión celular a 200 x g durante 5 min y aspire el sobrenadante con cuidado.
    3. Agregue 1 ml de MESCM para resuspender las células en suspensión. Prepare una suspensión celular de 80 μL (4 × 103 celdas por portaobjetos) para 4 portaobjetos (20 μL/portaobjetos) y utilice el sistema de centrífuga para depositar las células en los portaobjetos del microscopio según las instrucciones del fabricante.
    4. Fije las células (adheridas a los portaobjetos en el paso 3) con paraformaldehído al 4% durante unos 10 minutos y, a continuación, permeabilice las células de los portaobjetos con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 15 minutos.
    5. Bloquear las células durante 1 h con albúmina sérica bovina (BSA) al 2% antes de incubarlas con anticuerpos primarios (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) en un agitador durante la noche a 4 °C. Después de la incubación, eliminar los anticuerpos primarios no unidos lavando (5 min/lavado, 3 veces) los portaobjetos con PBST (PBS + 0,1% Tween 20).
    6. Incubar los anticuerpos secundarios correspondientes (anticuerpo secundario IgG de burro anti-ratón TRITC [1:1000], IgG anti-conejo burro FITC [1:500], burro anti-ratón IgG 488 [1:300], anti-conejo burro IgG 594 [1:400]) durante 1 h con anticuerpos IgG inespecíficos IgG adecuados. Retire el anticuerpo secundario no unido con PBST (5 min/lavado, 3 veces).
    7. Contratiñir los núcleos con 5 μg/mL de DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol) y sellar los portaobjetos.
    8. Realice imágenes de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia (aumento: 400x; Tiempo de exposición: 50 ms).
  2. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR)
    1. Tome el kit de aislamiento de ARN para extraer el ARN total según las instrucciones del fabricante.
    2. Utilice un kit de transcripción de ADNc de alta capacidad para realizar la transcripción inversa de 1-2 μg de ARN total a ADNc.
    3. Realice la transcripción inversa (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) y qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 ciclos) en una solución de 20 μL que contenga ADNc (100 ng), mezcla de ensayo de expresión génica TaqMan (1 μL), mezcla maestra de PCR universal (10 μL) y ddH2O (hasta 20 μL).
    4. Utilizar la técnica de TC comparativa (ΔΔCT)4,9 para examinar la expresión génica relativa.

3. Caracterización de la LNC

  1. Recuento de células (hemocitómetro)
    1. Digiera los LNC desde el fondo de la placa con TE al 0,25% durante 5 min en la incubadora de células a 37 °C.
    2. Finalice la digestión añadiendo 1 ml de MESCM (que contiene suero knockout), centrifugue la suspensión celular a 200 x g durante 5 min y aspire el sobrenadante con cuidado.
    3. Agregue 1 ml de MESCM para resuspender las células, luego tome 10 μl de suspensión celular en un tubo de centrífuga de 0,5 ml. Agregue un volumen igual de solución de tinción de azul de tripano al 0,4%.
    4. Coloque 10 μL de suspensión celular teñida en el área de recuento del hemocitómetro y cúbrala con un cubreobjetos para contar.
      NOTA: El número de celdas en las cinco áreas cuadradas centrales se define como "A"; el número de células en 1 ml se calcula como 5A × 104 × 2.
  2. Examen de marcadores LNC y BMMSC con citometría de flujo15
    1. Detectar la expresión de SCF, CD73, CD90 y CD105 en las LNCs y BMMSCs mediante citometría de flujo 15 (2-4 ×10 6 eventos/muestra, se obtuvieron 2.000 células de cada una de las muestras, totalizando 550.000 células que fueron activadas simultáneamente).
    2. Recoja y tiña las células a 20-30 °C durante 15 min en un tampón de bloqueo (3% de BSA y 0,05% de Tween-20 en PBS) utilizando anticuerpos premarcados (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] y CD105 [1:50]) según las instrucciones del kit.
    3. Realice análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un citómetro de flujo. En este estudio se utilizaron el software FACS Diva y el software FlowJo. Para cada muestra, registre 10.000 eventos y compuerta y analice células vivas.

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Representative Results

Crecimiento de LNC
Los LNC se aislaron con éxito de acuerdo con el método de digestión de la colagenasa A (2 mg/mL) del tejido del borde corneoescleral, como se describió anteriormente (Figura 1). De acuerdo con un estudio previamente reportado3, después de la digestión de la colagenasa A, se visualizaron grupos similares a orugas bajo el microscopio (Figura 2). La proporción de células fusiformes aumentó gradualmente con el paso de la célula. Las células fusiformes podrían crecer en placas de matriz de membrana basal recubiertas al 5%, a diferencia de sus contrapartes cultivadas en plástico sin matriz de membrana basal recubierta3. Las células de P1 a P12 exhibieron una tasa proliferativa uniforme, con un tiempo de duplicación celular entre 2 y 7 días (Tabla 2). En este estudio, los LNC se cultivaron en los 13 pasajes y 34 duplicaciones (Figura 3)3. Los LNC se cultivaron a partir de células primarias (LNC P0); El LNC P0 creció lentamente y tardó aproximadamente 12 días. Los LNC solo necesitaron alrededor de 3 días para pasar en P1-P8, y la tasa de crecimiento de los LNC después de P9 disminuyó significativamente (Tabla 2). En cuanto a la morfología celular, los LNC tenían forma de huso y eran redondos en P0. Después de P3, los LNC tenían forma de huso con el mismo tamaño morfológico (Figura 2). El grado de expansión total se midió como el número de poblaciones que se duplican de P0 a P13 utilizando la siguiente fórmula: número de duplicación de células (NCD) = log10 (y/x) / log102, donde y es la densidad final de células y x es la densidad inicial de siembra de células3. Las enfermedades no transmisibles representan la tasa de crecimiento de los LNC (Figura 3A). A partir de las curvas NCD y NCD acumulativa (Figura 3B), los LNC tardaron menos tiempo en aumentar exponencialmente y crecieron más rápido que los P3-P5 (Figura 3). Después de la P5, la tasa de crecimiento celular disminuyó significativamente, la NCD volvió a 1,32 en la P13 y el crecimiento casi se detuvo.

Identificación de LNC
Después del aislamiento y la cultura de los LNC, otra tarea importante fue la identificación. Las LNC expresadas para Vim, CD90, CD105, SCF y PDGFRβ, pero no para Pan-CK, según los estudios actuales relevantes sobre LNC (Figura 4)9. La doble inmunotinción de LNC P4 reveló que estas células eran consistentemente Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+ (Figura 4). La qPCR también reveló una disminución de la expresión de Pan-CK en el P2 y un aumento de las transcripciones de Vim, CD90, CD105, SCF y PDGFR en el P3. Los niveles de transcripción de Vim, CD90, CD105, SCF y PDGFR aumentaron drásticamente en el P4 en comparación con el P1 (p < 0,01) (Figura 4)9.

Características de LNC
Un análisis posterior mostró que los LNC expresaban más marcadores de células madre embrionarias (ESC) (Nestin, Rex1 y SSEA4), marcadores de células madre mesenquimales (MSC) (CD73, CD90 y CD105) y marcadores de células de nicho (NC) (MSX1, P75NTR y PDGFRβ) (Figura 5)15. La citometría de flujo indicó que las características del antígeno de superficie de las MSC, incluyendo CD73, CD90 y CD105, se expresaron tanto en las LNC como en lasBMMSCs 15. Los porcentajes de LNC que expresaron CD73, CD90, CD105 y SCF fueron de aproximadamente 95%, 97%, 92% y 11%, respectivamente, mientras que los de BMMSC fueron de 68%, 99%, 20% y 3%, respectivamente. Esto muestra que los LNC expresan niveles significativamente más altos de los marcadores positivos para MSC CD73, CD105 y la citocina SCF (p < 0,01) y un nivel similar de CD90 (p > 0,05) en comparación con las BMMSC (Figura 6)15.

Figure 1
Figura 1: Proceso de aislamiento de las LNCs . (A) Tejido del reborde corneoescleral. (B) Racimos después de la digestión de la colagenasa A a 37 °C durante 18 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: LNCs P0 a P13 cultivados en una placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal al 5% en MESCM (Bar = 50 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Patrón de crecimiento de las LNC de P0 a P13. (A) La NCD de las LNC de P0 a P13; (B) La NCD acumulada de los LNC de P0 a P13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Inmunofluorescencia y qPCR. La inmunofluorescencia y la qPCR revelaron que los LNC expresaron uniformemente Vim, CD90, CD105, SCF y PDGFRβ, pero no Pan-CK. Esta figura ha sido reproducida con permiso de Zhu et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Los LNC expresan más marcadores ESC, MSC y NC que los BMMSC. Las LNC P4 y las BMMSC P4 se sometieron a qPCR para la expresión de transcripción de marcadores ESC (A), MSC y marcadores de cresta neural (B) (n = 3, *P < 0,05, #P < 0,05 y **p < 0,01 respectivamente). Inmunotinción de marcadores ESC (C) y marcadores MSC, NC (D), con contratinción nuclear por Hoechst 33342. Barras de escala = 25 μm. Esta figura ha sido reproducida con permiso de Li et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Clasificación celular activada por fluorescencia de LNC P4 y BMMSC (A-F). Análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de marcadores MSC, incluidos CD73, CD90 y CD105 (n = 3). Esta figura ha sido reproducida con permiso de Li et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Reactivo Concentración de la solución madre Volumen Concentración final Entorno de almacenamiento
DME/F-12 1:1(1×) Medio básico 180 ml 90% 4 °C
KnockOutTMSR - 20 mL 10% -20 °C
Reemplazo de suero para ESCs/iPSCs
Factor inhibidor de la leucemia humana (Lif) 50 μg/mL 40 μL 10 ng/mL -80 °C
FGF humano recombinante-básico 100 μg/mL 8 μL 4 ng/mL -80 °C
ITS (insulina, transferrina, selenito de sodio) 500 μg/mL de insulina 2 ml 5 μg/mL de insulina -20 °C
500 μg/mL de transferrina 5 μg/mL de transferrina
500 ng/Ml de selenito de sodio 5 ng/ml de selenito de sodio
Gentamicina 25 μg/mL 2 ml 50 μg/mL 4 °C
Anfotericina B 2500 μg/mL 100 μL 1,25 μg/ml 4 °C

Tabla 1: Formulación del MESCM.

Pasaje Densidad de siembra (× 105 células/cm2) Densidad final (× 105células/cm2) Tiempo de cultivo (días) Número de duplicaciones celulares (NCD) Enfermedades no transmisibles acumulativas
P0 0.22 0.385714 12 0.810029 0.810029
P1 0.08 0.365714 4 2.192645 3.002674
P2 0.051429 0.357143 3 2.795859 5.798533
P3 0.037143 0.337143 2 3.182203 8.980737
P4 0.028571 0.311429 6 3.446256 12.42699
P5 0.04 0.385714 3 3.269461 15.69645
P6 0.054286 0.48 4 3.14439 18.84084
P7 0.057143 0.351429 3 2.620586 21.46143
P8 0.08 0.394286 3 2.30117 23.7626
P9 0.06 0.345714 6 2.526546 26.28915
P10 0.022857 0.122857 7 2.426265 28.71541
Pág. 11 0.025714 0.122857 5 2.25634 30.97175
Pág. 12 0.028571 0.114286 5 2 32.97175
Pág. 13 0.045714 0.114286 10 1.321928 34.29368

Tabla 2: Pasajes seriados del LNC en plástico.

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Discussion

La transparencia de la córnea se mantiene típicamente mediante la disposición y distribución regular de pequeñas fibras (25-30 nm de diámetro) en el estroma corneal, que es crucial para la agudeza visual normal16. Hay 253 millones de personas con discapacidad visual en todo el mundo, de las cuales 36 millonesson ciegas. La Organización Mundial de la Salud (OMS) considera que la ceguera corneal es uno de los peligros más graves para la vista humana, representando el 5,1% de toda la ceguera en todo el mundo16. El defecto del epitelio corneal con CES normal puede sanar rápidamente sin dejar cicatriz18. Se estima que más de 12,7 millones de pacientes en todo el mundo requieren trasplantes de córnea debido a la pérdida de visión de moderada a severa19; El 30% del fracaso del trasplante de córnea fue causado por CESD20. Sin embargo, debido a la escasez de donación de córnea en la mayoría de los países del mundo, solo uno de cada setenta pacientes ciegos de córnea podría recibir un trasplante de córnea21. Actualmente, el trasplante de células madre epiteliales de la córnea (CEST, por sus siglas en inglés) se puede utilizar para tratar el CESD22. Los pacientes con CESD monocular pueden obtener CES de ojos sanos para CEST. Sin embargo, en el caso de los pacientes con CESD bilateral, solo se puede obtener CES alogénico para el tratamiento. El rechazo inmunitario sigue siendo la principal razón del fracaso de la CEST alogénica. Un método prometedor para reducir el tratamiento terapéutico para el CESD es encontrar una célula que pueda reemplazar eficazmente al CES autógeno o fomentar la diferenciación de otras células autógenas de otros lugares para convertirse en CES. La diferenciación in vitro de células autólogas en CES también se está volviendo popular, incluyendo BMMSC23, células epiteliales de la mucosa oral (OMEC)24, células madre de pulpa dental (DPSC)19, células madre pluripotentes inducidas derivadas de fibroblastos humanos (iPSC)25 y células madre adiposas (ASC)26. Rohaina et al.23encontraron que las BMMSCs cultivadas en membranas amnióticas durante 10 días podían diferenciarse en células epiteliales corneales y que la expresión de CK3 y p63 aumentaba significativamente después de la inducción de la diferenciación. En 2020, O'Callaghan et al.24indujeron la diferenciación de células epiteliales de la mucosa oral en células epiteliales corneales utilizando un nuevo sistema de cultivo, y lo utilizaron con éxito para el tratamiento de la CESD utilizando una estructura tisular 3D (RAFT) como soporte para el cultivo de células epiteliales de la mucosa oral con fibroblastos de la mucosa oral humana como trofoblastos. Además, DPSC se diferencia con éxito en células estromales y epiteliales corneales. Al aumentar la expresión de K3, K12 y CD90, la DPSC puede prevenir la invasión conjuntival corneal. En otro estudio se utilizaron DPSC como láminas de células amnióticas colocadas en la superficie de la córnea en un modelo CESD de conejo. Los resultados mostraron que el grupo DPSC tenía córneas más limpias y menos angiogénesis que el grupo control27. Hayashi et al.28lograron la diferenciación utilizando iPSC derivada de fibroblastos que pudo ser inducida en células epiteliales corneales PAX6(+) y K12(+) después de 12 semanas. La iPSC se convierte eficazmente en células epiteliales de la córnea, activa la K12 y suprime el NANOG25. Zeppieri et al.26 descubrieron que las ASC podían diferenciarse en células epiteliales corneales para curar la CESD de ratón y mejorar la cicatrización de heridas epiteliales corneales en un modelo animal inducido por láser.

Las LNC se localizan en el nicho limbal, donde los CES están protegidos y apoyados, y tienen muchas características similares a las MSC. Las LNC fueron aisladas por primera vez por Polisetty et al.2 y nombradas por primera vez por Xie et al.3. Según estudios recientes, las LNC son células madre más fundamentales que las MSC y pueden diferenciarse fácilmente en adipocitos, condrocitos y osteocitos 4,29. En comparación con las BMMSC de uso común, las LNC muestran mayores características de las células madre (mayor expresión de CD73, CD105, PDGFR, SCF, etc.) (Figura 5) 30. Los LNC pueden tratar con éxito a los conejos con CESD causada por quemaduras por álcali corneal al promover la reparación del epitelio corneal y el estroma15. La expresión reducida de fibronectina (FN), factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) y proteína secretada ácida y rica en cisteína (SPARC) en los fibroblastos corneales sugiere que la secreción de LNC mejora la cicatrización de heridas y reduce la fibrosis7.

En un microambiente 3D, lo interesante es que los LNC pueden reunirse con los MCEC, estimulando a estas últimas células para restaurar las propiedades de las células madre9. Los LNC aceleran eficazmente el crecimiento del CES31 y previenen la cicatrización de la córnea10. Sin embargo, la cantidad de LNC es limitada; Los estudios han indicado que representa solo aproximadamente el 3% del número total de células del estroma limbal en la córnea bovina32, con una expresión significativa de sulfato de queratán, queratocán y ALDH3A133. Pueden ser inferiores al 1% en las córneas humanas33.

En este protocolo, se repitieron los métodos previos de aislamiento, purificación e identificación de LNC 3,14,34. Después de 18 h de tratamiento del tejido del limbo humano con colagenasa A (2 mg/mL), se aislaron los LNC. Las LNC P0 se desarrollaron lentamente y exhibieron varias morfologías celulares, incluidas las LNC en forma de huso, otras poligonales y MCEC esféricas visibles (Figura 2, P0). Estudios previos han demostrado que las LNC son células fusiformes que se adhieren al fondo de la superficie de cultivo con una morfología homogénea14. Al mismo tiempo, los MCEC son redondos29, lo que es consistente con la morfología de las células cultivadas en este protocolo. Además, los LNC P0 crecieron lentamente hasta que las células crecieron aproximadamente entre el 70% y el 80% de la densidad celular en aproximadamente 12 días. El LNC P1-P12 proliferó sustancialmente más rápido y, en 3-6 días, cubrió prácticamente toda la placa de cultivo. Después de P1, las células anexiales de las LNC en forma de huso superaron significativamente en número a las células MCEC redondas y poligonales.

De los valores de NCD de la Tabla 2 y de la Figura 3 se desprende claramente que los LNC P0 tuvieron la NCD más baja (0,810) y que el paso celular se produjo a lo largo de 12 días. Sin embargo, después de la P1, el crecimiento de las LNC se aceleró drásticamente y la tasa de crecimiento alcanzó un máximo de 3,44 en la P4. Después de la P6, la tasa de crecimiento de los LNC se redujo sustancialmente (Figura 3). La tasa de crecimiento y la actividad de los LNC de P4 fueron sustancialmente las más altas en términos del patrón de crecimiento de los LNC, lo que es consistente con los hallazgos anteriores que indican que la actividad de crecimiento de los LNC P4-P6 es la mejor9. Sin embargo, este método tiene ciertas limitaciones, el número de LNC P0 varía mucho según la edad del donante y el momento de la muerte. Por lo tanto, cuando el tejido donante es más joven y fresco, se puede aislar más LNC P0. El factor más importante para imitar el microambiente del CES in vitro es la necesidad de factores de nicho universales, como una matriz extracelular rica en laminaminas35.

En conclusión, las LNC desempeñan un papel crucial en el apoyo a las células madre epiteliales de la córnea y en el mantenimiento de la madre de CES, incluida la autorrenovación y la diferenciación en células epiteliales de la córnea maduras. Se puede esperar que la LNC sea una herramienta celular innovadora para el tratamiento de pacientes con CESD 9,15.

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Disclosures

Ninguno de los autores tiene información financiera relevante.

Acknowledgments

Gracias a Wei Wang, Lingjuan Xu y Rong Liu por la orientación en este trabajo, a Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You y Li Guigang por proporcionar parte del material, a Guanyu Su por escribir el manuscrito, a Xiao Zhou, Yihong Xiong y Huatao Xie por corregir el manuscrito, y a Guigang Li por su orientación completa. Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82070936, 81470606, 81570819), el proyecto de investigación científica de salud y planificación familiar de la provincia de Hubei (No. WJ2017M073), Los diez mejores proyectos de investigación médica traslacional del Hospital Tongji (No.2016ZHYX20), Proyecto de capacitación de jóvenes pioneros médicos en la ciudad de Wuhan (No.2015whzqnyxggrc10), Programa de reclutamiento de talentos globales (G2022154028L), Proyecto de la Comisión Nacional de Salud de la provincia de Hubei en 2022 (WJ2021ZH0005) y Fundación de Construcción de Sujetos del Departamento de Finanzas de Hubei en 2022 (42000022815T000000102)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole ThermoFisher D1306 5μg/mL
Amphotericin B Sigma V900919 1.25 μg/mL
Anti-CD73 Abcam ab202122 1:50
Bovine Serum Albumin MERCK A1933 -
CD105 Proteintech 67075-1-Ig 1:200
CD105 Abcam ab114052 1:50
CD90 Proteintech 66766-1-Ig 1:100
CD90 Abcam ab307736 1:50
Cell Incubator Shanghai Lishen K1119K4644 HF90(HT)
Centrifuge system StatSpin  StatSpin CytoFuge 12 -
Collagenase A Roche 10103578001 2 mg/mL
Confocal microscope Zeiss  LSM700 -
Culture plate virya 3500356 35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)  cytiva SH30023.01 90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher A16016 1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher 31568 1:1000
FACS Diva sofware BD Biosciences Tree Star -
Flow Cytometer BD Biosciences Becton Dickinson LSRII -
Fluorescence microscope olympus cx31 
Gentamicin Sigma G1914 50 μg/mL
Hemocytometer MERCK Z359629 Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit ThermoFisher 4374966
Inverted phase-contrast microscope  UOP DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) Sigma I3146 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs gibco 10828-028 10%
Matrigel BioCoat 356234 -
Pan-CK Abcam ab7753 1:1000
Paraformaldehyde NoninBio NBS0135 4.00%
Paraformaldehyde MKBio MM-1505 4%
PDGFRβ Abclonal A1444 1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument Applied Biosystems Step One Plus -
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B 4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) Peprotech 300-05 10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit Qiagen 74104 -
SCF Bioss bs-0545R 1:100
SCF Abcam ab52603 1:50
Stereomicroscope ZEISS SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade Careforde 29500 size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix Applied Biosystems 4448489
Triton X-100 MERCK X100 0.20%
Trypan blue ThermoFisher 15250061 0.40%
Trypsin-EDTA Genview GP3108 0.25%
Tween 20 MERCK P9416 -
Ultra Clean Bench LaiTe LT20200705 SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
Vim  Abcam ab92547 1:100

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References

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Células de Nicho Limbal Aislamiento Identificación Tejido del Limbo Grupos de Células Medio de Células Madre Embrionarias Matrigel Inmunofluorescencia PCR Cuantitativa en Tiempo Real Citometría de Flujo Marcadores de Células Madre VIM CD90 CD105 PDGFRβ Pan-CK CD73 SCF BMMSCs
Aislamiento e identificación de células de nicho limbal
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