Summary
Hier presenteren we een protocol om de menselijke limbale nichecellen te isoleren en te identificeren.
Abstract
Hier rapporteren we een standaardprocedure voor de isolatie en identificatie van limbale nichecellen (LNC's). Limbusweefsel verkregen uit een oogbank werd gebruikt voor de isolatie van LNC's. Het weefsel werd onder aseptische omstandigheden in 12 stukken verdeeld en gedurende 18 uur bij 37 °C verteerd in de celkweekincubator met behulp van collagenase A om celclusters met LNC's en limbale epitheliale voorlopercellen te verkrijgen. De celclusters werden verder verteerd gedurende 15 minuten bij 37 °C met 0,25% trypsine-EDTA om afzonderlijke cellen te verkrijgen en vervolgens gekweekt in gemodificeerd embryonaal stamcelmedium (MESCM) op een plastic oppervlak bedekt met 5% Matrigel. Cellen werden gepasseerd bij 70% samenvloeiing en LNC's werden geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie, real-time kwantitatieve PCR (qPCR) en flowcytometrie. Primaire LNC's werden geïsoleerd en meer dan 12 keer gepasseerd. De proliferatieactiviteit van LNC's van P4 naar P6 was het hoogst. LNC's brachten hogere stamcelmarkers tot expressie dan BMMSC's (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR en PDGFRβ). Bovendien toonden de resultaten aan dat P4-LNC's VIM, CD90, CD105 en PDGFRβ uniform tot expressie brachten, maar niet Pan-CK, dat kon worden gebruikt als marker voor de identificatie van LNC's. Flowcytometrische analyse toonde aan dat ongeveer 95%, 97%, 92% en 11% van de LNC's respectievelijk CD73, CD90, CD105 en SCF tot expressie brachten, terwijl ze 68%, 99%, 20% en 3% waren in BMMSC's. Het standaardproces voor LNC-isolatie en -identificatie zou een betrouwbare laboratoriumbasis kunnen bieden voor het wijdverbreide gebruik van LNC's.
Introduction
De incidentie van cornea-epitheliale stamceldeficiëntie (CESD), ook wel limbale stamceldeficiëntie (LSCD)1 genoemd, en cornea-epitheliale regeneratie (CES) wordt steeds urgenter vanwege hoornvliesinfectie en -letsel. Als CESD niet goed wordt behandeld, kan het leiden tot blindheid waarvoor een hoornvliestransplantatie nodig is. Als gevolg hiervan wordt CES-regeneratie steeds belangrijker. Er is een groep ondersteunende cellen, limbale nichecellen (LNC's) genaamd, die essentiële ondersteuning bieden voor de CES-functie. Limbale stromale stamcellen werden voor het eerst geïsoleerd door Polisetty et al.2 en geïdentificeerd door Xie et al.3 als LNC's die gelokaliseerd zijn in het limbale epitheel subjacent en stroma van de limbus. LNC's zijn de belangrijkste ondersteunende stamcel van de hoornvliesrand en, met de functie van beenmerg-afgeleide MSC (BMMSC's), en kunnen worden geïnduceerd om zich te ontwikkelen tot hoornvliesepitheelcellen en hoornvliesstromale cellen, enz.3,4,5,6,7. Eerdere studies toonden aan dat de stamcelkwaliteiten van LNC's primitiever zijn dan BMMSC's8, die al veel in de kliniek worden gebruikt. LNC's kunnen zelfs de volgende haalbare optie worden na MSC, vooral voor de behandeling van CESD. Als belangrijke ondersteunende cellen voor CES zijn LNC's ook stamcellen die zijn afgeleid van de "niche"-structuur van de limbus. LNC's kunnen een sleutelrol spelen bij de dedifferentiatie van rijpe cornea-epitheelcellen (MCEC) naar CES9. Studies over LNC's zijn echter nog steeds relatief ontoereikend en er is geen consensus over de terminologie, isolatie, zuivering, identificatie en kenmerken van LNC's. Sommige onderzoekers hebben LNC's limbale biopsie-afgeleide stromale stamcellen10, limbale mesenchymale stamcellen 11, limbale fibroblaststamcellen 12 en limbale mesenchymale stromale cellen13 genoemd. Aangezien de groeikenmerken van LNC's niet in detail zijn beschreven, en vanwege hun veelbelovende wetenschappelijke en klinische toepassingen, en in de toekomst een van de belangrijkste klinische hulpmiddelen kunnen zijn, is het noodzakelijk om de isolatie, zuivering, identificatie en kenmerken van LNC's samen te vatten.
Volgens een eerdere studie14 zijn LNC's voornamelijk aanwezig in het limbale epitheel subjacent en stroma van de limbus. Dit protocol omvat het behandelen van limbusweefsel met collagenase A, het verkrijgen van een cluster bestaande uit LEPC en LNC's en het verteren ervan in afzonderlijke cellen met 0,25% trypsine-EDTA (TE). LNC's werden vervolgens selectief gekweekt in een gemodificeerd embryonaal stamcelmedium (MESCM) om te worden gezuiverd. Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, is eenvoudig en heeft een hoge efficiëntie bij het verkrijgen van menselijke LNC's in grote hoeveelheden.
De gedetailleerde procedure van LNC-isolatie, kweek en identificatie is opgenomen in de video voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in LNC-onderzoek, en kan indien nodig gemakkelijk worden herhaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Limbusweefsel van donoren tussen 50 en 60 jaar werd verkregen van de Rode Kruis Eye Bank, Tongji Hospital (Wuhan, China). Het protocol werd goedgekeurd door de Tongji Ethics Committee en werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.
1. Isolatie
- Verkrijg limbusweefsel uit het tussenliggende opslagmedium van het hoornvlies en werk onder aseptische omstandigheden op een ultraschone werkbank.
- Schraap en verwijder de iris en het endotheel rond het hoornvlies met behulp van een steriel chirurgisch rond mesje.
- Snijd limbusweefsel in twaalf stukken van gelijke grootte met een chirurgisch mes met 1 mm links aan beide zijden van het hoornvlies en de sclera.
- Breng limbusweefsels over naar een kweekplaat van 3,5 cm, voeg 1 ml collagenase A (2 mg/ml, in DF-12-medium) toe om alle weefsels onder te dompelen voor de spijsvertering.
- Plaats de plaat in de celincubator van 37 °C, verteer de limbale weefsels gedurende 18 uur.
OPMERKING: Vervolgprocedures worden meestal op de tweede dag uitgevoerd. - Bereid een 5% basaalmembraanmatrix (Matrigel) gecoate kweekplaat met 6 putjes voor.
- Smeer 5% basaalmembraanmatrix (opgelost in MESCM [Tabel 1]) op de bodem van de put.
- Bereid tips van 200 μl en 1 ml, een centrifugaalbuis van 15 ml en een plaat met 6 putjes voor in een gesteriliseerde zak.
- Zet de gesteriliseerde zak (inclusief tips en centrifugaalbuis) en een nieuwe plaat met 6 putjes gedurende 20 minuten in een omgeving van -20 °C of -80 °C. Ontdooi de basaalmembraanmatrix in de koelkast bij 4 °C.
- Haal de voorgekoelde tips, de centrifugaalbuis en de plaat met 6 putjes uit de omgeving van -20 °C of -80 °C en voer vervolgens de volgende handelingen uit op de ultraschone werkbank.
- Breng 50 μL 5% basaalmembraanmatrix over naar 1 ml MESCM met behulp van een tip van 200 μL en meng ze voorzichtig en gelijkmatig.
- Breng 5% basaalmembraanmatrix (opgelost in MESCM) over naar een putje van een kweekplaat met 6 putjes met behulp van de voorgekoelde tip van 1 ml.
- Schud de 6-wellsplaat voorzichtig en horizontaal, plaats de 6-wells kweekplaat ongeveer 1 uur in de 37 °C-celincubator en voer dan de volgende stap uit.
- Verwijder na 18 uur vertering collagenase A-verteerd limbaal weefsel, er blijven alleen enkele zichtbare kleine clusters en onverteerd scleraweefsel over.
OPMERKING: Sterk vergrote microscopie onthult een cluster dat bestaat uit veel dicht opeengepakte cellen (inclusief LNC's). - Gebruik een pipetpunt van 200 μl om de clusters onder de stereomicroscoop los te maken van onverteerde scleraweefsels.
- Breng de clusters over naar de kweekplaat van 3,5 cm en dompel ze onder in 0,25% TE, en plaats de plaat vervolgens gedurende 15 minuten in de celincubator.
- Voeg 1 ml MESCM met 10% knock-out serum toe om de celvertering te stoppen en pipetteer voorzichtig op en neer om de clusters in individuele cellen te resuspenderen met behulp van een pipetpunt van 1 ml.
- Breng de celsuspensie over in een centrifugaalbuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g .
- Verwijder het supernatans voorzichtig zonder de celprecipitatie te verstoren en voeg vervolgens 1 ml MESCM toe om de cellen te resuspenderen.
- Pipetteer 2-3 keer op en neer totdat de neerslag van de onderste cel gelijkmatig in de MESCM is gesuspendeerd met behulp van een pipetpunt van 1 ml, en neem een celsuspensie van 20 μl voor het tellen van de cellen.
- Breng de celsuspensie over naar de 5% basaalmembraan matrixgecoate 6-wells plaat met een pipetpunt van 1 ml en verhoog het volume MESCM tot 2,5 ml.
- Schud de plaat met 6 putjes voorzichtig horizontaal om de cellen gelijkmatig te verdelen.
- Breng de cellen over naar de kweekincubator nadat ze zijn afgebeeld en geregistreerd. Observeer en fotografeer de cellen dagelijks en verander het medium elke 3-4 dagen.
2. Identificatie van LNC
- Immunofluorescentie kleuring
- Verteer de LNC's van de bodem van de plaat met 1 ml 0,25% TE gedurende 5 minuten in de 37°C celincubator.
- Beëindig de digestie door 1 ml MESCM (met knock-out serum) toe te voegen, centrifugeer de celsuspensie op 200 x g gedurende 5 minuten en zuig het supernatans voorzichtig op.
- Voeg 1 ml MESCM toe om de cellen in suspensie te resuspenderen. Bereid een celsuspensie van 80 μl (4 × 103 cellen per objectglaasje) voor 4 objectglaasjes (20 μl/objectglaasje) en gebruik het centrifugesysteem om cellen op microscoopglaasjes te deponeren volgens de instructies van de fabrikant.
- Fixeer de cellen (geplakt op de objectglaasjes in stap 3) met 4% paraformaldehyde gedurende ongeveer 10 minuten en permeabiliseer vervolgens de cellen op de objectglaasjes met 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten.
- Blokkeer de cellen gedurende 1 uur met 2% runderserumalbumine (BSA) voordat u ze incubeert met primaire antilichamen (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) op een shaker 's nachts bij 4 °C. Verwijder na de incubatie ongebonden primaire antilichamen door de objectglaasjes te wassen (5 min/wasbeurt, 3x) met PBST (PBS + 0,1% Tween 20).
- Incubeer de overeenkomstige secundaire antilichamen (ezel anti-muis IgG secundair antilichaam TRITC [1:1000], ezel anti-konijn IgG FITC [1:500], ezel anti-muis IgG 488 [1:300], ezel anti-konijn IgG 594 [1:400]) gedurende 1 uur met geschikte IgG niet-specifieke IgG-antilichamen. Verwijder het ongebonden secundaire antilichaam met PBST (5 min/wasbeurt, 3x).
- Kleuring van de kernen met 5 μg/ml DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole) en sluit de glaasjes af.
- Voer fluorescentiebeeldvorming uit met behulp van een fluorescentiemicroscoop (vergroting: 400x; Belichtingstijd: 50 ms).
- Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR)
- Neem RNA Isolation Kit om het totale RNA te extraheren volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik een cDNA-transcriptiekit met hoge capaciteit om 1-2 μg totaal RNA om te keren naar cDNA.
- Voer de omgekeerde transcriptie (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) en qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 cycli) uit in een oplossing van 20 μL met cDNA (100 ng), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), universele PCR Master Mix (10 μL) en ddH2O (tot 20 μL).
- Gebruik de vergelijkende CT-techniek (ΔΔCT)4,9 om de relatieve genexpressie te onderzoeken.
3. Karakterisering van LNC
- Cellen tellen (hemocytometer)
- Vergist de LNC's van de bodem van de plaat met 0,25% TE gedurende 5 minuten in de 37 °C-celincubator.
- Beëindig de digestie door 1 ml MESCM (met knock-out serum) toe te voegen, centrifugeer de celsuspensie op 200 x g gedurende 5 minuten en zuig het supernatans voorzichtig op.
- Voeg 1 ml MESCM toe om de cellen te resuspenderen en neem vervolgens 10 μl celsuspensie in een centrifugebuisje van 0,5 ml. Voeg een gelijk volume van 0,4% Trypan blauwe kleuroplossing toe.
- Plaats 10 μL gekleurde celsuspensie op het telgebied van de hemocytometer en dek het af met een dekglaasje om te tellen.
OPMERKING: Het aantal cellen in de vijf middelste vierkante gebieden wordt gedefinieerd als "A"; het celgetal in 1 ml wordt berekend als 5A × 104 × 2.
- Onderzoek van LNC- en BMMSC-markers met flowcytometrie15
- Detecteer de expressie van SCF, CD73, CD90 en CD105 in de LNC's en BMMSC's met behulp van flowcytometrie 15 (2-4 ×10 6 gebeurtenissen/monster, 2.000 cellen werden verkregen uit elk van de monsters, in totaal 550.000 cellen die tegelijkertijd werden afgeschermd).
- Verzamel en kleur de cellen bij 20-30 °C gedurende 15 minuten in een blokkerende buffer (3% BSA en 0,05% Tween-20 in PBS) met behulp van vooraf gelabelde antilichamen (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] en CD105 [1:50]) volgens de instructies van de kit.
- Voer een FACS-analyse (fluorescentie-geactiveerde celsortering) uit met behulp van een flowcytometer. In dit onderzoek is gebruik gemaakt van FACS Diva software en FlowJo software. Noteer voor elk monster 10.000 gebeurtenissen en poort- en analyseer levende cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Groei van LNC
De LNC's werden met succes geïsoleerd volgens de verteringsmethode van collagenase A (2 mg/ml) vertering van corneosclerale randweefsel, zoals hierboven beschreven (figuur 1). In overeenstemming met een eerder gerapporteerde studie3 werden na de vertering van collagenase A rupsachtige clusters onder de microscoop gevisualiseerd (Figuur 2). Het aandeel spoelcellen nam geleidelijk toe met de celpassage. Spoelvormige cellen zouden kunnen groeien op gecoate 5% basaalmembraanmatrixplaten, in tegenstelling tot hun tegenhangers die op plastic worden gekweekt zonder gecoate basaalmembraanmatrix3. Cellen van P1 tot P12 vertoonden een uniforme proliferatieve snelheid, met een celverdubbelingstijd tussen 2 en 7 dagen (tabel 2). In deze studie werden LNC's gekweekt tot de 13 passages en 34 verdubbelingen (Figuur 3)3. LNC's werden gekweekt uit primaire cellen (LNC P0); LNC P0 groeide langzaam en duurde ongeveer 12 dagen. LNC's hadden slechts ongeveer 3 dagen nodig om in P1-P8 te passeren, en de groeisnelheid van LNC's na P9 nam aanzienlijk af (tabel 2). In termen van celmorfologie waren LNC's spoelvormig en rond in P0. Na P3 waren LNC's spoelvormig met dezelfde morfologische grootte (Figuur 2). De mate van totale expansie werd gemeten als het aantal populatieverdubbelingen van P0 naar P13 met behulp van de volgende formule: aantal celverdubbelingen (NCD) = log10 (y/x) / log102, waarbij y de uiteindelijke dichtheid van cellen is en x de initiële zaaidichtheid van cellen3. NCD vertegenwoordigt het groeipercentage van de LNC's (figuur 3A). Van de NCD- en accumulatieve-NCD-curven (Figuur 3B) hadden LNC's de minste tijd nodig om exponentieel te stijgen en groeiden ze het snelst vanaf de P3-P5 (Figuur 3). Na de P5 nam de celgroeisnelheid aanzienlijk af, NCD keerde terug naar 1,32 in P13 en de groei stopte bijna.
Identificatie van LNC
Na het isolement en de cultuur van LNC's was identificatie een andere belangrijke taak. LNC's uitgedrukt voor Vim, CD90, CD105, SCF en PDGFRβ, maar niet voor Pan-CK, volgens de huidige relevante studies over LNC's (figuur 4)9. Dubbele immunokleuring LNC P4 onthulde dat deze cellen consistent Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+ waren (Figuur 4). qPCR onthulde ook een verminderde Pan-CK-expressie in de P2 en verhoogde Vim-, CD90-, CD105-, SCF- en PDGFR-transcripten in de P3. Transcriptieniveaus van Vim, CD90, CD105, SCF en PDGFR namen dramatisch toe in de P4 in vergelijking met de P1 (p < 0,01) (Figuur 4)9.
Kenmerken van LNC
Verdere analyse toonde aan dat LNC's meer embryonale stamcelmarkers (ESC) (Nestin, Rex1 en SSEA4), mesenchymale stamcelmarkers (MSC) (CD73, CD90 en CD105) en nichecelmarkers (NC) (MSX1, P75NTR en PDGFRβ) tot expressie brachten (Figuur 5)15. Flowcytometrie gaf aan dat oppervlakte-antigeenkenmerken van MSC's, waaronder CD73, CD90 en CD105, tot expressie kwamen in zowel LNC's als BMMSC's15. De percentages LNC's die CD73, CD90, CD105 en SCF uitdrukten, waren respectievelijk ongeveer 95%, 97%, 92% en 11%, terwijl die van BMMSC's respectievelijk 68%, 99%, 20% en 3% waren. Dit toont aan dat LNC's significant hogere niveaus van MSC-positieve markers CD73, CD105 en het cytokine SCF (p < 0,01) en een vergelijkbaar niveau van CD90 (p > 0,05) tot expressie brengen in vergelijking met BMMSC's (Figuur 6)15.
Figuur 1: Het isolatieproces van LNC's . (A) Corneoscleraal randweefsel. (B) Clusters na collagenase A-vergisting bij 37 °C gedurende 18 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: P0 tot P13 LNC's gekweekt op 5% basaalmembraanmatrix gecoate 6-well plaat in MESCM. (Bar = 50 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het groeipatroon van LNC's van P0-P13. (A) De NCD van LNC's van P0-P13; (B) De cumulatieve NCD van LNC's van P0-P13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunofluorescentie en qPCR. Immunofluorescentie en qPCR toonden aan dat LNC's Vim, CD90, CD105, SCF en PDGFRβ uniform tot expressie brachten, maar niet Pan-CK. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Zhu et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: LNC's brengen meer ESC-, MSC- en NC-markers tot expressie dan BMMSC's. P4 LNC's en P4 BMMSC's werden onderworpen aan qPCR voor transcriptie-expressie van ESC-markers (A), MSC en neurale topmarkers (B) (respectievelijk n = 3, *P < 0,05, #P < 0,05 en **p < 0,01). Immunokleuring van ESC-markers (C) en MSC, NC-markers (D), met nucleaire tegenkleuring door Hoechst 33342. Schaalbalken = 25 μm. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Li et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Fluorescentie-geactiveerde celsortering van P4 LNC's en BMMSC's (A-F). Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) analyse van MSC-markers, waaronder CD73, CD90 en CD105 (n=3). Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Li et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagens | Concentratie van de voorraadoplossing | Volume | Definitieve concentratie | Opslag Omgeving |
| DME/F-12 1:1 (1×) | Basis medium | 180 ml | 90% | 4 °C |
| Knock-outTMSR | - | 20 ml | 10% | -20 °C |
| Serumvervanging voor ESC's/iPSC's | ||||
| Aanbevelende humane leukemieremmende factor (Lif) | 50 μg/ml | 40 μL | 10 ng/ml | -80 °C |
| Recombinant humaan FGF-basisch | 100 μg/ml | 8 μL | 4 ng/ml | -80 °C |
| ITS (insuline, transferrine, natriumseleniet) | 500 μg/ml insuline | 2 ml | 5 μg/ml insuline | -20 °C |
| 500 μg/ml transferrine | 5 μg/ml transferrine | |||
| 500 ng/ml natriumseleniet | 5 ng/ml natriumseleniet | |||
| Gentamicine | 25 μg/ml | 2 ml | 50 μg/ml | 4 °C |
| Amfotericine B | 2500 μg/ml | 100 μL | 1,25 μg/ml | 4 °C |
Tabel 1: MESCM-formulering.
| Passage | Zaaidichtheid (× 105 cellen/cm2) | Einddichtheid (× 105cellen/cm2) | Cultuurtijd (dagen) | Aantal celverdubbelingen (NCD) | Accumulatieve NCD |
| P0 | 0.22 | 0.385714 | 12 | 0.810029 | 0.810029 |
| Blz. 1 | 0.08 | 0.365714 | 4 | 2.192645 | 3.002674 |
| P2 | 0.051429 | 0.357143 | 3 | 2.795859 | 5.798533 |
| Blz.3 | 0.037143 | 0.337143 | 2 | 3.182203 | 8.980737 |
| Blz. 4 | 0.028571 | 0.311429 | 6 | 3.446256 | 12.42699 |
| Blz. 5 | 0.04 | 0.385714 | 3 | 3.269461 | 15.69645 |
| Blz. 6 | 0.054286 | 0.48 | 4 | 3.14439 | 18.84084 |
| Blz. 7 | 0.057143 | 0.351429 | 3 | 2.620586 | 21.46143 |
| Blz. 8 | 0.08 | 0.394286 | 3 | 2.30117 | 23.7626 |
| Blz. 9 | 0.06 | 0.345714 | 6 | 2.526546 | 26.28915 |
| Blz. 10 | 0.022857 | 0.122857 | 7 | 2.426265 | 28.71541 |
| Blz. 11 | 0.025714 | 0.122857 | 5 | 2.25634 | 30.97175 |
| Blz. 12 | 0.028571 | 0.114286 | 5 | 2 | 32.97175 |
| Blz. 13 | 0.045714 | 0.114286 | 10 | 1.321928 | 34.29368 |
Tabel 2: Seriële passages van de LNC op plastic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De transparantie van het hoornvlies wordt doorgaans gehandhaafd door regelmatige rangschikking en verdeling van kleine vezels (25-30 nm in diameter) in het hoornvliesstroma, wat cruciaal is voor een normale gezichtsscherpte16. Wereldwijd zijn er 253 miljoen mensen met een visuele beperking, van wie 36 miljoen blinden17. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) beschouwt hoornvliesblindheid als een van de ernstigste gevaren voor het menselijk gezichtsvermogen, goed voor 5,1% van alle blindheid wereldwijd16. Hoornvliesepitheeldefect met normale CES kan snel genezen zonder een litteken achter te laten18. Geschat wordt dat wereldwijd meer dan 12,7 miljoen patiënten een hoornvliestransplantatie nodig hebben vanwege matig tot ernstig verlies van het gezichtsvermogen19; 30% van de mislukte hoornvliestransplantatie werd veroorzaakt door CESD20. Vanwege het tekort aan hoornvliesdonatie in de meeste landen over de hele wereld, zou uiteindelijk slechts één op de zeventig hoornvliesblinde patiënten een hoornvliestransplantatie kunnen ondergaan21. Momenteel kan hoornvliesepitheliale stamceltransplantatie (CEST) worden gebruikt om CESD22 te behandelen. Patiënten met monoculaire CESD kunnen CES krijgen van gezonde ogen voor CEST. Voor patiënten met bilaterale CESD kan echter alleen allogene CES worden verkregen voor behandeling. Immuunafstoting blijft de belangrijkste reden voor het falen van allogene CEST. Een veelbelovende methode om de therapeutische behandeling voor CESD te verminderen, is het vinden van een cel die autogene CES effectief kan vervangen of de differentiatie van andere autogene cellen van andere plaatsen kan aanmoedigen om CES te worden. In vitro differentiatie van autologe cellen in CES wordt ook steeds populairder, waaronder BMMSC 23, orale mucosale epitheelcellen (OMEC)24, tandpulpstamcellen (DPSC)19, menselijke fibroblast-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)25 en vetstamcellen (ASC)26. Rohaina et al.23ontdekten dat BMMSC's die gedurende 10 dagen op vruchtwatermembranen werden gekweekt, konden differentiëren in hoornvliesepitheelcellen en dat de expressie van CK3 en p63 significant toenam na de inductie van differentiatie. In 2020 induceerden O'Callaghan et al.24de differentiatie van orale mucosale epitheelcellen in hoornvliesepitheelcellen met behulp van een nieuw kweeksysteem, en gebruikten het met succes voor de behandeling van CESD met behulp van een 3D-weefselstructuur (RAFT) als ondersteuning voor orale mucosale epitheelcelkweek met menselijke orale mucosale fibroblasten als trofoblasten. Bovendien differentieert DPSC met succes in stromale en epitheelcellen van het hoornvlies. Door de expressie van K3, K12 en CD90 te verhogen, kan DPSC conjunctivale invasie van het hoornvlies voorkomen. Een andere studie gebruikte DPSC als vruchtwatercelvellen die meeliftten op het hoornvliesoppervlak in een CESD-model van een konijn. De resultaten toonden aan dat de DPSC-groep schonere hoornvliezen en minder angiogenese had dan de controlegroep27. Hayashi et al.28bereikten differentiatie met behulp van van fibroblasten afgeleide iPSC die na 12 weken kon worden geïnduceerd in PAX6(+) en K12(+) hoornvliesepitheelcellen. iPSC ontwikkelt zich effectief tot hoornvliesepitheelcellen, activeert K12 en onderdrukt NANOG25. Zeppieri et al.26 ontdekten dat ASC's konden differentiëren in hoornvliesepitheelcellen om CESD van muizen te genezen en de genezing van hoornvliesepitheliale wonden te verbeteren in een lasergeïnduceerd diermodel.
LNC's lokaliseren zich in de limbale niche, waar CES worden beschermd en ondersteund, en hebben veel kenmerken die vergelijkbaar zijn met MSC's. LNC's werden voor het eerst geïsoleerd door Polisetty et al.2 en voor het eerst benoemd door Xie et al.3. Volgens recente studies zijn LNC's fundamentelere stamcellen dan MSC's en kunnen ze gemakkelijk differentiëren in adipocyten, chondrocyten en osteocyten 4,29. In vergelijking met de veelgebruikte BMMSC's vertonen LNC's grotere stamcelkenmerken (hogere expressie van CD73, CD105, PDGFR, SCF, enz.) (Figuur 5) 30. LNC's kunnen konijnen met CESD veroorzaakt door alkalische brandwonden van het hoornvlies met succes behandelen door het herstel van het hoornvliesepitheel en stromate bevorderen 15. De verminderde expressie van fibronectine (FN), bindweefselgroeifactor (CTGF) en uitgescheiden eiwit zuur en cysteïnerijk (SPARC) in hoornvliesfibroblasten suggereren dat de secretie van LNC's de wondgenezing verbetert en fibrose vermindert7.
In een 3D-micro-omgeving is het interessant dat LNC's zich kunnen herenigen met MCEC's, waardoor de laatste cellen worden gestimuleerd om stamceleigenschappen te herstellen9. LNC's versnellen effectief de groei van CES31 en voorkomen littekens op het hoornvlies10. Het aantal LNC's is echter beperkt; Studies hebben aangetoond dat het slechts ongeveer 3% van het totale aantal limbale stromale cellen in het runderhoornvliesvertegenwoordigt 32, met een significante expressie van keratansulfaat, keratocan en ALDH3A133. Ze kunnen minder dan 1% zijn in menselijke hoornvliezen33.
In dit protocol werden eerdere methoden voor het isoleren, zuiveren en identificeren van LNC's herhaald 3,14,34. Na 18 uur behandeling van menselijk limbusweefsel met collagenase A (2 mg/ml) werden LNC's geïsoleerd. P0 LNC ontwikkelde zich langzaam en vertoonde verschillende celmorfologieën, waaronder spoelvormige LNC's, veelhoekige andere en zichtbare bolvormige MCEC (Figuur 2, P0). Eerdere studies hebben aangetoond dat LNC's spoelvormige cellen zijn die zich met homogene morfologie aan de onderkant van het kweekoppervlak hechten14. Tegelijkertijd zijn MCEC's rond29, wat consistent is met de morfologie van de cellen die in dit protocol worden gekweekt. Bovendien groeiden P0 LNC's langzaam tot de cellen die in ongeveer 12 dagen ongeveer 70%-80% van de celdichtheid bereikten. P1-P12 LNC verspreidde zich aanzienlijk sneller en bedekte in 3-6 dagen praktisch de hele kweekplaat. Na P1 waren de spoelvormige LNC's adnexale cellen significant groter dan ronde MCEC en veelhoekige cellen.
Uit de NCD-waarden in Tabel 2 en Figuur 3 blijkt duidelijk dat de LNC's P0 de laagste NCD hadden (0,810) en dat de celpassage gedurende 12 dagen plaatsvond. Na de P1 versnelde de groei van LNC's echter dramatisch en piekte het groeipercentage op 3,44 in de P4. Na de P6 was het groeitempo van de LNC's aanzienlijk verminderd (figuur 3). Het groeipercentage van de LNC's en de activiteit van de P4 waren substantieel het hoogst in termen van het groeipatroon van de LNC's, in overeenstemming met eerdere bevindingen die erop wijzen dat de groeiactiviteit van de P4-P6 LNC's de beste9 is. Deze methode heeft echter bepaalde beperkingen, het aantal LNC P0 varieert sterk afhankelijk van de leeftijd van de donor en het tijdstip van overlijden. Daarom, wanneer het donorweefsel jonger en verser is, kan meer P0 LNC worden geïsoleerd. De belangrijkste factor bij het nabootsen van de micro-omgeving van CES in vitro is de behoefte aan universele nichefactoren, zoals een laminaminerijke extracellulaire matrix35.
Concluderend spelen LNC's een cruciale rol bij het ondersteunen van cornea-epitheelstamcellen en het handhaven van de stamheid van CES, inclusief zelfvernieuwing en differentiatie in volwassen cornea-epitheelcellen. Verwacht kan worden dat LNC een innovatief celhulpmiddel is voor de behandeling van patiënten met CESD 9,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft relevante financiële openbaarmakingen.
Acknowledgments
Met dank aan Wei Wang, Lingjuan Xu en Rong Liu voor de begeleiding bij dit werk, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You en Li Guigang voor het verstrekken van een deel van het materiaal, Guanyu Su voor het schrijven van het manuscript, Xiao Zhou, Yihong Xiong en Huatao Xie voor het corrigeren van het manuscript en Guigang Li voor zijn volledige begeleiding. Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 82070936, 81470606, 81570819), het wetenschappelijke onderzoeksproject voor gezondheid en gezinsplanning in de provincie Hubei (nr. WJ2017M073), Top tien translationele medische onderzoeksprojecten van het Tongji-ziekenhuis (nr. 2016ZHYX20), trainingsproject van jonge medische pioniers in de stad Wuhan (nr. 2015whzqnyxggrc10), Global Talents Recruitment Program (G2022154028L), project van de Nationale Gezondheidscommissie van de provincie Hubei in 2022 (WJ2021ZH0005), en onderwerp Bouw van de oprichting van de financiële afdeling van Hubei in 2022 (42000022815T000000102)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | - |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | - |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | - |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | - |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | - |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | - |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | - |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | - |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
References
- Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
- Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
- Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
- Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
- Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
- Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
- Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16 (2020).
- Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1 (2022).
- Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172 (2014).
- Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
- Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
- Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471 (2022).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
- Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566 (2018).
- Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Pineda, R. World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , Springer, Cham. 299-305 (2020).
- Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441 (2022).
- Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562 (2022).
- Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
- Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
- O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265 (2020).
- Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
- Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115 (2017).
- Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
- Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
- Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
- Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
- González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
- Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
- Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).
