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Medicine

अलगाव और लिम्बल आला कोशिकाओं की पहचान

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

Summary

यहां, हम मानव लिम्बल आला कोशिकाओं को अलग करने और पहचानने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

यहां हम लिम्बल आला कोशिकाओं (एलएनसी) के अलगाव और पहचान के लिए एक मानक प्रक्रिया की रिपोर्ट करते हैं। एक नेत्र बैंक से प्राप्त लिम्बस ऊतक का उपयोग एलएनसी अलगाव के लिए किया गया था। ऊतक सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत 12 टुकड़ों में विभाजित किया गया था और एलएनसी और लिम्बल उपकला पूर्वज कोशिकाओं के साथ सेल समूहों को प्राप्त करने के लिए कोलेजनेज ए का उपयोग करके सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए पचाया गया था। सेल समूहों को आगे एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पचाया गया और फिर 5% मैट्रिगेल के साथ लेपित प्लास्टिक की सतह पर संशोधित भ्रूण स्टेम सेल माध्यम (एमईएससीएम) में सुसंस्कृत किया गया। कोशिकाओं को 70% संगम पर पारित किया गया था, और एलएनसी की पहचान इम्यूनोफ्लोरेसेंस, वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर), और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके की गई थी। प्राथमिक एलएनसी को अलग किया गया और 12 से अधिक बार पारित किया गया। P4 से P6 तक LNCs की प्रसार गतिविधि सबसे अधिक थी। LNCs ने BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR, और PDGFRβ) की तुलना में उच्च स्टेम सेल मार्कर व्यक्त किए। इसके अलावा, परिणामों से पता चला कि P4 LNCs ने समान रूप से VIM, CD90, CD105 और PDGFRβ व्यक्त किए, लेकिन पैन-सीके नहीं, जिसका उपयोग LNCs की पहचान के लिए मार्कर के रूप में किया जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण से पता चला है कि लगभग 95%, 97%, 92%, और 11% LNCs ने क्रमशः CD73, CD90, CD105 और SCF व्यक्त किए, जबकि वे BMMSCs में 68%, 99%, 20% और 3% थे। एलएनसी अलगाव और पहचान के लिए मानक प्रक्रिया एलएनसी के व्यापक उपयोग के लिए एक विश्वसनीय प्रयोगशाला आधार प्रदान कर सकती है।

Introduction

कॉर्नियल उपकला स्टेम सेल की कमी की घटना (CESD), भी अंग स्टेम सेल की कमी कहा जाता है (LSCD)1, और कॉर्नियल उपकला उत्थान (सीईएस) कॉर्नियल संक्रमण और चोट की वजह से अधिक से अधिक जरूरी होते जा रहे हैं. यदि ठीक से इलाज नहीं किया जाता है, तो सीईएसडी अंधापन का कारण बन सकता है जिसके लिए कॉर्नियल प्रत्यारोपण की आवश्यकता होती है। नतीजतन, सीईएस उत्थान अधिक महत्वपूर्ण होता जा रहा है। सहायक कोशिकाओं का एक समूह है जिसे लिम्बल आला कोशिकाएं (एलएनसी) कहा जाता है जो सीईएस फ़ंक्शन के लिए आवश्यक सहायता प्रदान करते हैं। लिम्बल स्ट्रोमल स्टेम कोशिकाओं को पहले पोलिसेट्टी एट अल.2 द्वारा अलग किया गया था और ज़ी एट अल.3 द्वारा एलएनसी के रूप में पहचाना गया था जो लिम्बल एपिथेलियम सबजेसेंट और लिम्बस के स्ट्रोमा में स्थानीयकृत होते हैं। एलएनसी कॉर्नियल रिम के प्रमुख सहायक स्टेम सेल हैं और, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एमएससी (बीएमएमएससी) के कार्य के साथ, और कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं और कॉर्नियल स्ट्रोमल कोशिकाओं आदि में विकसित होने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एलएनसी के स्टेम-सेल गुण बीएमएमएससी8 की तुलना में अधिक आदिम हैं, जो पहले से ही क्लिनिक में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। एमएससी के बाद एलएनसी भी अगला व्यवहार्य विकल्प बन सकता है, खासकर सीईएसडी के इलाज के लिए। सीईएस के लिए महत्वपूर्ण सहायक कोशिकाओं के रूप में, एलएनसी भी लिम्बस की "आला" संरचना से प्राप्त स्टेम सेल हैं। एलएनसी परिपक्व कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं (एमसीईसी) को सीईएस9 में विभेदित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। हालांकि, एलएनसी पर अध्ययन अभी भी अपेक्षाकृत अपर्याप्त हैं, और एलएनसी की शब्दावली, अलगाव, शुद्धिकरण, पहचान और विशेषताओं पर कोई सहमति नहीं है। कुछ शोधकर्ताओं ने एलएनसी लिम्बल बायोप्सी-व्युत्पन्न स्ट्रोमल स्टेम सेल10, लिम्बल मेसेनकाइमल स्टेम सेल 11, लिम्बल फाइब्रोब्लास्ट स्टेम सेल 12, और लिम्बल मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल13 का नाम दिया है। चूंकि एलएनसी की विकास विशेषताओं का विस्तार से वर्णन नहीं किया गया है, और उनके आशाजनक वैज्ञानिक और नैदानिक अनुप्रयोगों के कारण, और भविष्य में सबसे महत्वपूर्ण नैदानिक उपकरणों में से एक हो सकता है, एलएनसी के अलगाव, शुद्धिकरण, पहचान और विशेषताओं को संक्षेप में प्रस्तुत करना आवश्यक है।

पिछले अध्ययन14 के अनुसार, एलएनसी मुख्य रूप से लिम्बल एपिथेलियम सबजेसेंट और लिम्बस के स्ट्रोमा में मौजूद होते हैं। इस प्रोटोकॉल में कोलेजनेज ए का उपयोग करके लिम्बस ऊतक का इलाज करना, एलईपीसी और एलएनसी से युक्त क्लस्टर प्राप्त करना और इसे 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए (टीई) के साथ एकल कोशिकाओं में पचाना शामिल है। एलएनसी को तब शुद्ध करने के लिए एक संशोधित भ्रूण स्टेम सेल माध्यम (एमईएससीएम) में चुनिंदा रूप से सुसंस्कृत किया गया था। इस पत्र में रिपोर्ट प्रोटोकॉल सरल है और बड़ी मात्रा में मानव एलएनसी प्राप्त करने में उच्च दक्षता है.

एलएनसी अलगाव, संस्कृति और पहचान की विस्तृत प्रक्रिया एलएनसी अध्ययन में रुचि रखने वाले वैज्ञानिकों के लिए वीडियो में दर्ज की गई थी, और जरूरत पड़ने पर इसे आसानी से दोहराया जा सकता है।

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Protocol

50 से 60 वर्ष की आयु के दाताओं से लिम्बस ऊतक रेड क्रॉस आई बैंक, टोंगजी अस्पताल (वुहान, चीन) से प्राप्त किया गया था। प्रोटोकॉल को टोंगजी एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था और हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार आयोजित किया गया था।

1. अलगाव

  1. मध्यवर्ती अवधि कॉर्नियल भंडारण माध्यम से लिंबस ऊतक प्राप्त करें और अल्ट्रा-क्लीन वर्कबेंच पर सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में काम करें।
  2. परिमार्जन और एक बाँझ शल्य गोल ब्लेड का उपयोग करके कॉर्निया के चारों ओर परितारिका और एंडोथेलियम को हटा दें।
  3. कॉर्निया और श्वेतपटल के दोनों किनारों पर छोड़े गए 1 मिमी के साथ एक सर्जिकल ब्लेड के साथ बारह समान आकार के टुकड़ों में लिम्बस ऊतक को काटें।
  4. एक 3.5 सेमी संस्कृति प्लेट के लिए लिंबस ऊतकों हस्तांतरण, कोलेजन ए (2 मिलीग्राम / एमएल, DF-12 माध्यम में) के 1 एमएल जोड़ें, पाचन के लिए ऊतकों के सभी विसर्जित करने के लिए.
  5. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस सेल इनक्यूबेटर में डालें, 18 घंटे के लिए लिम्बल ऊतकों को पचाएं।
    नोट: अनुवर्ती प्रक्रियाएं आमतौर पर दूसरे दिन की जाती हैं।
  6. एक 5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (Matrigel) लेपित 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट लेपित तैयार करें.
    1. कोट 5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (MESCM [तालिका 1] में भंग) अच्छी तरह से के तल पर.
    2. एक निष्फल बैग में 200 माइक्रोन और 1 एमएल युक्तियाँ, एक 15-एमएल केन्द्रापसारक ट्यूब, और एक 6-अच्छी प्लेट तैयार करें।
    3. निष्फल बैग (सुझावों और केन्द्रापसारक ट्यूब सहित) और 20 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस वातावरण में एक नई 6 अच्छी तरह से थाली रखो. 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पिघलना.
    4. -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस वातावरण से प्री-कूल्ड टिप्स, केन्द्रापसारक ट्यूब और 6-वेल प्लेट को बाहर निकालें, और फिर अल्ट्रा-क्लीन वर्कबेंच पर निम्नलिखित ऑपरेशन करें।
    5. 200 माइक्रोन टिप का उपयोग करके 50 माइक्रोन 5% बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को 1 एमएल एमईएससीएम में स्थानांतरित करें, और उन्हें धीरे और समान रूप से मिलाएं।
    6. पूर्व-ठंडा 1 एमएल टिप का उपयोग करके 6-अच्छी संस्कृति प्लेट के एक कुएं में 5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (एमईएससीएम में भंग) को स्थानांतरित करें।
    7. 6 अच्छी तरह से थाली धीरे और क्षैतिज हिला, लगभग 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस सेल इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट डाल दिया, और फिर अगले कदम प्रदर्शन.
  7. 18-एच पाचन के बाद, कोलेजनेज ए-पचाने वाले लिम्बल ऊतक को बाहर निकालें, केवल कुछ दिखाई देने वाले छोटे क्लस्टर और अपचित स्क्लेरल ऊतक रहेंगे।
    नोट: उच्च आवर्धन माइक्रोस्कोपी कई घनी पैक कोशिकाओं (एलएनसी सहित) से बना एक क्लस्टर का पता चलता है।
  8. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत अपचित स्क्लरल ऊतकों से समूहों को अलग करने के लिए 200 माइक्रोन पिपेट टिप का उपयोग करें।
  9. क्लस्टर को 3.5 सेमी संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें और उन्हें 0.25% ते में विसर्जित करें, और फिर प्लेट को 15 मिनट के लिए सेल इनक्यूबेटर में रखें।
  10. सेल पाचन को रोकने के लिए 10% नॉकआउट सीरम के साथ 1 एमएल एमईएससीएम जोड़ें और 1-एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके अलग-अलग कोशिकाओं में क्लस्टर को फिर से निलंबित करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  11. सेल निलंबन को 15-एमएल केन्द्रापसारक ट्यूब और 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें।
  12. सेल वर्षा को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला सावधानी से निकालें, और फिर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए 1 एमएल एमईएससीएम जोड़ें।
  13. पिपेट ऊपर और नीचे 2-3 बार जब तक नीचे सेल वर्षा समान रूप से 1 एमएल विंदुक टिप का उपयोग कर MESCM में निलंबित कर दिया है, और सेल गिनती के लिए 20 माइक्रोन सेल निलंबन ले.
  14. सेल निलंबन को 1-एमएल पिपेट टिप के साथ 5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 6-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें और एमईएससीएम की मात्रा को 2.5 एमएल तक बढ़ाएं।
  15. धीरे 6 अच्छी तरह से थाली क्षैतिज हिला समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए.
  16. imaged और दर्ज किया जा रहा है के बाद संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए कोशिकाओं स्थानांतरण. दैनिक कोशिकाओं का निरीक्षण और फोटोग्राफ करें, और हर 3-4 दिनों में माध्यम बदलें।

2. एलएनसी की पहचान

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना
    1. 37 डिग्री सेल्सियस सेल इनक्यूबेटर में 5 मिन के लिए 1 एमएल 0.25% टीई का उपयोग करके प्लेट के नीचे से एलएनसी को डाइजेस्ट करें।
    2. 1 एमएल एमईएससीएम (नॉकआउट सीरम युक्त) जोड़कर पाचन को समाप्त करें, 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरनेवाला सावधानी से महाप्राण करें।
    3. निलंबन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए 1 एमएल एमईएससीएम जोड़ें। 4 स्लाइड (20 माइक्रोन / स्लाइड) के लिए 80 माइक्रोन सेल निलंबन (4 × 103 सेल प्रति स्लाइड) तैयार करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कोशिकाओं को जमा करने के लिए अपकेंद्रित्र प्रणाली का उपयोग करें।
    4. लगभग 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करके कोशिकाओं (चरण 3 में स्लाइड का पालन किया गया) को ठीक करें, और फिर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.2% ट्राइटन एक्स-100 के साथ स्लाइड पर कोशिकाओं को पारगम्य करें।
    5. प्राथमिक एंटीबॉडी (पैन-सीके [1:1000], विम [1:100], सीडी90 [1:100], सीडी105 [1:200], एससीएफ [1:100], पीडीजीएफआरβ [1:100]) के साथ उन्हें इनक्यूबेट करने से पहले 2% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को ब्लॉक करें। इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएसटी (पीबीएस + 0.1% ट्वीन 20) के साथ स्लाइड (5 मिनट/धोने, 3x) धोने से अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा दें।
    6. संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी (गधा विरोधी माउस IgG माध्यमिक एंटीबॉडी TRITC [1:1000], गधा विरोधी खरगोश IgG FITC [1:500], गधा विरोधी माउस IgG 488 [1:300], गधा विरोधी खरगोश IgG 594 [1:400]) उपयुक्त IgG निरर्थक IgG एंटीबॉडी के साथ 1 घंटे के लिए. पीबीएसटी (5 मिनट/धोने, 3x) का उपयोग कर अनबाउंड माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें.
    7. 5 μg/mL DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole) के साथ नाभिक counterstain और स्लाइड सील.
    8. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (बढ़ाई: 400x) का उपयोग कर प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदर्शन एक्सपोजर समय: 50 एमएस)।
  2. मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR)
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार कुल आरएनए निकालने के लिए आरएनए आइसोलेशन किट लें।
    2. सीडीएनए के लिए कुल आरएनए के 1-2 माइक्रोग्राम रिवर्स ट्रांसक्राइब करने के लिए एक उच्च क्षमता सीडीएनए प्रतिलेखन किट का उपयोग करें.
    3. सीडीएनए (100 एनजी), ताकमैन जीन अभिव्यक्ति परख मिक्स (1 माइक्रोन), सार्वभौमिक पीसीआर मास्टर मिक्स (10 माइक्रोन) और डीडीएच 2 ओ (20 माइक्रोन) युक्त 20-माइक्रोन समाधान में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (42 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट; 50 डिग्री सेल्सियस, 85 मिनट) और क्यूपीसीआर(95 डिग्री सेल्सियस, 5 डिग्री, 10 एस, 40 चक्र) करें।
    4. तुलनात्मक सीटी तकनीक (ΔΔCT)4,9 रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए प्रयोग करें.

3. एलएनसी की विशेषता

  1. सेल गिनती (हेमोसाइटोमीटर)
    1. 37 डिग्री सेल्सियस सेल इनक्यूबेटर में 5 मिन के लिए 0.25% ते का उपयोग करके प्लेट के नीचे से एलएनसी को डाइजेस्ट करें।
    2. 1 एमएल एमईएससीएम (नॉकआउट सीरम युक्त) जोड़कर पाचन को समाप्त करें, 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरनेवाला सावधानी से महाप्राण करें।
    3. कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए 1 एमएल एमईएससीएम जोड़ें, फिर 0.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 10 माइक्रोन सेल निलंबन लें। 0.4% Trypan नीले धुंधला समाधान के बराबर मात्रा जोड़ें.
    4. हेमोसाइटोमीटर के गिनती क्षेत्र पर 10 माइक्रोन सना हुआ सेल निलंबन रखें और इसे गिनती के लिए कवरस्लिप के साथ कवर करें।
      नोट: पांच मध्य वर्ग क्षेत्रों में कोशिकाओं की संख्या "ए" के रूप में परिभाषित की गई है; 1 एमएल में सेल नंबर की गणना 5 ए × 104 × 2 के रूप में की जाती है।
  2. प्रवाह साइटोमेट्री के साथ एलएनसी और बीएमएमएससी मार्करों की परीक्षा15
    1. फ्लो साइटोमेट्री 15 (2-4 ×10 6 घटनाओं/नमूना, 2,000 कोशिकाओं को प्रत्येक नमूने से प्राप्त किया गया था, कुल 550,000 कोशिकाओं को एक साथ गेटेड किए गए थे) का उपयोग करके LNCs और BMMCCs में SCF, CD73, CD90, और CD105 की अभिव्यक्ति का पता लगाएं।
    2. इकट्ठा करें और एक अवरुद्ध बफर (3% बीएसए और पीबीएस में 0.05% ट्वीन-20) में 15 मिनट के लिए 20-30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को दाग प्रीलेबल्ड एंटीबॉडी (एससीएफ [1:50], सीडी 70 [1:50], सीडी 90 [1:50], और सीडी 105 [1:50]) किट निर्देशों के अनुसार।
    3. फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) विश्लेषण करें। इस अध्ययन में, FACS दिवा सॉफ्टवेयर और FlowJo सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था। प्रत्येक नमूने के लिए, 10,000 घटनाओं और गेट रिकॉर्ड और जीवित कोशिकाओं का विश्लेषण.

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Representative Results

एलएनसी का विकास
एलएनसी को कॉर्नियोस्क्लेरल रिम ऊतक के कोलेजन ए (2 मिलीग्राम/एमएल) पाचन की विधि के अनुसार सफलतापूर्वक अलग किया गया था, जैसा कि ऊपर वर्णित है(चित्र 1)। पहले से रिपोर्ट किए गए अध्ययन3 के अनुरूप, कोलेजनेज ए पाचन के बाद, माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) के तहत कैटरपिलर जैसे समूहों की कल्पना की गई थी। कोशिका मार्ग के साथ धुरी कोशिकाओं का अनुपात धीरे-धीरे बढ़ता गया। धुरी के आकार की कोशिकाएं लेपित 5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्लेटों पर विकसित हो सकती हैं, लेपित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स3 के बिना प्लास्टिक पर खेती की गई उनके समकक्षों के विपरीत। पी 1 से पी 12 तक की कोशिकाओं ने 2 और 7 दिनों (तालिका 2) के बीच सेल दोहरीकरण समय के साथ एक समान प्रोलिफेरेटिव दर का प्रदर्शन किया। इस अध्ययन में, एलएनसी को 13 मार्गों, और 34 दोहरीकरण (चित्रा 3)3 के लिए सुसंस्कृत किया गया था। एलएनसी को प्राथमिक कोशिकाओं (एलएनसी पी 0) से सुसंस्कृत किया गया था; LNC P0 धीरे-धीरे बढ़ा और इसमें लगभग 12 दिन लगे। एलएनसी को पी 1-पी 8 में पारित होने के लिए केवल 3 दिनों की आवश्यकता थी, और पी 9 के बाद एलएनसी की वृद्धि दर में काफी कमी आई (तालिका 2)। कोशिका आकृति विज्ञान के संदर्भ में, LNCs धुरी के आकार के थे, और P0 में गोल थे। पी 3 के बाद, एलएनसी एक ही रूपात्मक आकार (चित्रा 2) के साथ धुरी के आकार के थे। कुल विस्तार की सीमा को निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके P0 से P13 तक दोगुनी जनसंख्या की संख्या के रूप में मापा गया था: सेल दोहरीकरण की संख्या (NCD) = log10 (y/x) / log102, जहां y कोशिकाओं का अंतिम घनत्व है और x कोशिकाओं का प्रारंभिक बीजारोपण घनत्वहै 3. एनसीडी एलएनसी की वृद्धि दर का प्रतिनिधित्व करता है (चित्र 3क)। एनसीडी और संचयी-एनसीडी घटता (चित्रा 3बी) से, एलएनसी ने तेजी से बढ़ने के लिए कम से कम समय लिया और पी 3-पी 5 (चित्रा 3) से सबसे तेजी से बढ़ा। P5 के बाद, कोशिका वृद्धि दर में काफी कमी आई, NCD P13 में 1.32 पर लौट आया, और विकास लगभग बंद हो गया।

एलएनसी की पहचान
एलएनसी के अलगाव और संस्कृति के बाद, एक और महत्वपूर्ण कार्य पहचान था। एलएनसी (चित्रा 4)9पर वर्तमान प्रासंगिक अध्ययनों के अनुसार, विम, सीडी 90, सीडी 105, एससीएफ और पीडीजीएफआरβ के लिए व्यक्त किए गए एलएनसी, लेकिन पैन-सीके नहीं। डबल इम्यूनोस्टेनिंग एलएनसी पी 4 से पता चला कि ये कोशिकाएं लगातार पैन-सीके-/विम +/सीडी90+/सीडी105+/एससीएफ+/पीडीजीएफआर+ (चित्र 4)थीं। qPCR ने P2 में पैन-सीके अभिव्यक्ति में कमी का भी खुलासा किया और P3 में विम, CD90, CD105, SCF और PDGFR प्रतिलेखों में वृद्धि की। विम, सीडी 90, सीडी 105, एससीएफ और पीडीजीएफआर के प्रतिलेखन स्तर पी 1 (पी < 0.01) (चित्रा 4)9की तुलना में पी 4 में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई।

एलएनसी के लक्षण
आगे के विश्लेषण से पता चला है कि LNCs ने अधिक भ्रूण स्टेम सेल (ESC) मार्कर (नेस्टिन, Rex1, और SSEA4), मेसेनकाइमल स्टेम सेल (MSC) मार्कर (CD73, CD90, और CD105), और आला सेल (NC) मार्कर (MSX1, P75NTR, और PDGFRβ) (चित्रा 5)15व्यक्त किए। फ्लो साइटोमेट्री ने संकेत दिया कि सीडी 73, सीडी 90 और सीडी 105 सहित एमएससी की सतह प्रतिजन विशेषताओं को एलएनसी और बीएमएमएससी15 दोनों में व्यक्त किया गया था। CD73, CD90, CD105 और SCF व्यक्त करने वाले LNCs का प्रतिशत क्रमशः लगभग 95%, 97%, 92% और 11% था, जबकि BMMSCs के क्रमशः 68%, 99%, 20% और 3% थे। इससे पता चलता है कि एलएनसी बीएमएमएससी (चित्रा 6)15की तुलना में एमएससी-पॉजिटिव मार्करों सीडी 73, सीडी 105, और साइटोकिन एससीएफ (पी < 0.01) और सीडी 90 (पी > 0.05) के समान स्तर के काफी उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एलएनसी अलगाव प्रक्रिया । (ए) कॉर्नियोस्क्लेरल रिम ऊतक। (बी) कोलेजेनेज के बाद क्लस्टर 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पाचन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पी 0 से पी 13 एलएनसी 5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर सुसंस्कृत एमईएससीएम में 6-अच्छी तरह से प्लेट लेपित ( बार = 50 माइक्रोन)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पी 0-पी 13 से एलएनसी का विकास पैटर्न। (ए) पी 0-पी 13 से एलएनसी का एनसीडी; (B) P0-P13 से LNCs का संचयी NCD। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: इम्यूनोफ्लोरेसेंस और क्यूपीसीआर। इम्यूनोफ्लोरेसेंस और क्यूपीसीआर से पता चला कि एलएनसी ने समान रूप से विम, सीडी 90, सीडी 105, एससीएफ और पीडीजीएफआर को व्यक्त किया, लेकिन पैन-सीके नहीं। यह आंकड़ा झू एट अल से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: LNCs BMMSCs की तुलना में अधिक ESC, MSC और NC मार्कर व्यक्त करते हैं। P4 LNCs और P4 BMMSCs को ESC मार्करों (A), MSC और तंत्रिका शिखा मार्करों (B) (n = 3, *P < 0.05, #P < 0.05, और **p < 0.01 क्रमशः) के प्रतिलेखन अभिव्यक्ति के लिए qPCR के अधीन किया गया था। ईएससी मार्करों (सी) और एमएससी, एनसी मार्करों (डी) की इम्यूनोस्टेनिंग, होचस्ट 33342 द्वारा परमाणु काउंटरस्टेन के साथ। स्केल बार = 25 माइक्रोन। यह आंकड़ा ली एट अल 15 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: पी 4 एलएनसी और बीएमएमएससी (एएफ) की प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई। प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) CD73, CD90, और CD105 (एन = 3) सहित MSC मार्करों का विश्लेषण. यह आंकड़ा ली एट अल 15 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक समाधान की एकाग्रता आयतन अंतिम एकाग्रता भंडारण पर्यावरण
एफ-12 1:1(1×) मूल माध्यम 180 एमएल 90% 4 डिग्री सेल्सियस
नॉकआउटटीएमएसआर - 20 एमएल 10% -20 डिग्री सेल्सियस
ESCs/IPSC के लिए सीरम प्रतिस्थापन
पुनः प्राप्त मानव ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (Lif) 50 μg/mL 40 माइक्रोन 10 एनजी/एमएल -80 डिग्री सेल्सियस
पुनः संयोजक मानव एफजीएफ-बेसिक 100 μg/mL 8 माइक्रोन 4 एनजी/एमएल -80 डिग्री सेल्सियस
आईटीएस (इंसुलिन, ट्रांसफरिन, सोडियम सेलेनाइट) 500 μg/mL इंसुलिन 2 एमएल 5 μg/mL इंसुलिन -20 डिग्री सेल्सियस
500 μg/mL ट्रांसफरिन 5 μg/mL ट्रांसफरिन
500 एनजी/एमएल सोडियम सेलेनाइट 5 एनजी/एमएल सोडियम सेलेनाइट
जेंटामाइसिन 25 μg/mL 2 एमएल 50 μg/mL 4 डिग्री सेल्सियस
एम्फोटेरिसिन बी 2500 μg/mL 100 माइक्रोन 1.25 μg/mL 4 डिग्री सेल्सियस

तालिका 1: एमईएससीएम सूत्रीकरण।

मार्ग सीडिंग डेंसिटी (× 105 सेल / सेमी2) अंतिम घनत्व (× 105सेल / सेमी2) संस्कृति समय (दिन) सेल डबलिंग की संख्या (एनसीडी) संचित एनसीडी
पी0 0.22 0.385714 12 0.810029 0.810029
पी1 0.08 0.365714 4 2.192645 3.002674
पी2 0.051429 0.357143 3 2.795859 5.798533
पी3 0.037143 0.337143 2 3.182203 8.980737
पी4 0.028571 0.311429 6 3.446256 12.42699
पी5 0.04 0.385714 3 3.269461 15.69645
पी6 0.054286 0.48 4 3.14439 18.84084
पी7 0.057143 0.351429 3 2.620586 21.46143
पी8 0.08 0.394286 3 2.30117 23.7626
पी9 0.06 0.345714 6 2.526546 26.28915
पी10 0.022857 0.122857 7 2.426265 28.71541
पी11 0.025714 0.122857 5 2.25634 30.97175
पी12 0.028571 0.114286 5 2 32.97175
पी13 0.045714 0.114286 10 1.321928 34.29368

तालिका 2: प्लास्टिक पर एलएनसी के सीरियल पैसेज।

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Discussion

कॉर्नियल पारदर्शिता आम तौर पर नियमित रूप से व्यवस्था और कॉर्नियल स्ट्रोमा में छोटे फाइबर (व्यास में 25-30 एनएम) के वितरण द्वारा बनाए रखा जाता है, जो सामान्य दृष्टि तीक्ष्णता16 के लिए महत्वपूर्ण है. दुनिया भर में 253 मिलियन दृष्टिहीन लोग हैं, जिनमें से 36 मिलियन अंधेहैं। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) कॉर्नियल अंधापन को मानव दृष्टि के लिए सबसे गंभीर खतरों में से एक मानता है, जो दुनिया भर में सभी अंधेपन का 5.1% है। सामान्य सीईएस के साथ कॉर्नियल उपकला दोष एक निशान18 छोड़ने के बिना जल्दी से ठीक कर सकते हैं. यह अनुमान है कि दुनिया भर में 12.7 मिलियन से अधिक रोगियों को मध्यम से गंभीरदृष्टि हानि के कारण कॉर्नियल प्रत्यारोपण की आवश्यकता होती है; कॉर्निया प्रत्यारोपण विफलता का 30% सीईएसडी20 के कारण हुआ था। हालांकि, दुनिया भर के अधिकांश देशों में कॉर्निया दान की कमी के कारण, सत्तर कॉर्निया-अंधे रोगियों में से केवल एक ही अंततः कॉर्नियल प्रत्यारोपण21 प्राप्त कर सकता है। वर्तमान में, कॉर्नियल एपिथेलियल स्टेम सेल प्रत्यारोपण (सीईएसटी) का उपयोग सीईएसडी22 के इलाज के लिए किया जा सकता है। मोनोकुलर सीईएसडी वाले मरीज सीईएसटी के लिए स्वस्थ आंखों से सीईएस प्राप्त कर सकते हैं। हालांकि, द्विपक्षीय सीईएसडी वाले रोगियों के लिए, उपचार के लिए केवल एलोजेनिक सीईएस प्राप्त किया जा सकता है। प्रतिरक्षा अस्वीकृति एलोजेनिक सीईएसटी की विफलता का मुख्य कारण बनी हुई है। सीईएसडी के लिए चिकित्सीय उपचार को कम करने के लिए एक आशाजनक तरीका एक सेल ढूंढना है जो प्रभावी रूप से ऑटोजेनस सीईएस को बदल सकता है या सीईएस बनने के लिए अन्य स्थानों से अन्य ऑटोजेनस कोशिकाओं के भेदभाव को प्रोत्साहित कर सकता है। सीईएस में ऑटोलॉगस कोशिकाओं के इन विट्रो भेदभाव भी बीएमएमएससी सहित लोकप्रिय हो रहा है 23, मौखिक श्लैश्मिक उपकला कोशिकाओं (ओएमईसी)24, दंत लुगदी स्टेम सेल (डीपीएससी)19, मानव फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी)25, और वसा स्टेम सेल (एएससी)26. रोहैना एट अल 23 ने पाया कि बीएमएमएससी 10 दिनों के लिए एमनियोटिक झिल्ली पर सुसंस्कृत कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं और भेदभाव के प्रेरण के बाद सीके 3 और पी 63अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई है। 2020 में, O'Callaghan et al.24ने एक नई संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं में मौखिक म्यूकोसल उपकला कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित किया, और ट्रोफोब्लास्ट के रूप में मानव मौखिक म्यूकोसल फाइब्रोब्लास्ट के साथ मौखिक म्यूकोसल उपकला सेल संस्कृति के समर्थन के रूप में 3D ऊतक संरचना (RAFT) का उपयोग करके CESD के इलाज के लिए सफलतापूर्वक इसका उपयोग किया। इसके अतिरिक्त, डीपीएससी कॉर्नियल स्ट्रोमल और उपकला कोशिकाओं में सफलतापूर्वक अंतर करता है। K3, K12 और CD90 की अभिव्यक्ति को अपग्रेड करके, DPSC कॉर्नियल कंजंक्टिवल आक्रमण को रोक सकता है। एक अन्य अध्ययन ने डीपीएससी को खरगोश सीईएसडी मॉडल में कॉर्नियल सतह पर एमनियोटिक सेल शीट पिग्गीबैक के रूप में इस्तेमाल किया। परिणामों से पता चला कि डीपीएससी समूह में नियंत्रण समूह27 की तुलना में क्लीनर कॉर्निया और कम एंजियोजेनेसिस था। हयाशी एट अल.28ने फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न आईपीएससी का उपयोग करके भेदभाव हासिल किया जिसे 12 सप्ताह के बाद PAX6(+) और K12(+) कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं में प्रेरित किया जा सकता है। IPSC प्रभावी ढंग से कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं में विकसित, K12 को सक्रिय करता है, और NANOG को दबा देता है25. Zeppieri et al.26 ने पाया कि ASCs माउस CESD को ठीक करने और लेजर-प्रेरित पशु मॉडल में कॉर्नियल उपकला घाव भरने को बढ़ाने के लिए कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं।

LNCs लिम्बल आला में स्थानीयकृत होते हैं, जहां CES संरक्षित और समर्थित होते हैं, और MSCs के समान कई विशेषताएं होती हैं। LNCs को पहले Polisetty et al.2 द्वारा अलग किया गया था और पहले Xie et al.3 द्वारा नामित किया गया था। हाल के अध्ययनों के अनुसार, एलएनसी एमएससी की तुलना में अधिक मौलिक स्टेम सेल हैं और आसानी से एडिपोसाइट्स, चोंड्रोसाइट्स और ओस्टियोसाइट्स 4,29में अंतर कर सकते हैं। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले बीएमएमएससी की तुलना में, एलएनसी अधिक स्टेम सेल विशेषताओं (सीडी 73, सीडी 105, पीडीजीएफआर, एससीएफ, आदि की उच्च अभिव्यक्ति) दिखाते हैं। (चित्र 5) 30. एलएनसी कॉर्नियल एपिथेलियम और स्ट्रोमा की मरम्मत को बढ़ावा देकर कॉर्नियल क्षार जलने के कारण सीईएसडी के साथ खरगोशों का सफलतापूर्वक इलाज कर सकते हैं15. कॉर्नियल फाइब्रोब्लास्ट में फाइब्रोनेक्टिन (एफएन), संयोजी ऊतक वृद्धि कारक (सीटीजीएफ), और स्रावित प्रोटीन अम्लीय और सिस्टीन समृद्ध (एसपीएआरसी) की कम अभिव्यक्ति से पता चलता है कि एलएनसी स्राव घाव भरने को बढ़ाता है और फाइब्रोसिसको कम करता है।

एक 3 डी microenvironment में, क्या दिलचस्प है कि LNCs एमसीईसी के साथ पुनर्मिलन कर सकते हैं, स्टेमसेल गुणों 9 को बहाल करने के लिए बाद की कोशिकाओं उत्तेजक. एलएनसी प्रभावी रूप से सीईएस विकास31 में तेजी लाते हैं और कॉर्नियल स्कारिंग10 को रोकते हैं। हालांकि, एलएनसी की मात्रा सीमित है; अध्ययनों से संकेत मिलता है कि यह गोजातीय कॉर्निया32 में लिम्बल स्ट्रोमल कोशिकाओं की कुल संख्या का केवल 3% का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें केराटन सल्फेट, केराटोकन औरALDH3A1 33 की महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति है। वे मानव कॉर्निया में 1% से कम हो सकते हैं33.

इस प्रोटोकॉल में, एलएनसी को अलग करने, शुद्ध करने और पहचानने के पिछले तरीकों को 3,14,34 दोहराया गया था। कोलेजनेस ए (2 मिलीग्राम / एमएल) के साथ मानव लिंबस ऊतक के उपचार के 18 घंटे के बाद, एलएनसी को अलग किया गया था। पी 0 एलएनसी धीरे-धीरे विकसित हुआ और स्पिंडल के आकार के एलएनसी, बहुभुज अन्य, और दृश्यमान गोलाकार एमसीईसी (चित्रा 2, पी 0) सहित विभिन्न सेल आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एलएनसी धुरी के आकार की कोशिकाएं हैं जो सजातीय आकृति विज्ञान14 के साथ संस्कृति की सतह के नीचे से जुड़ी होती हैं। इसी समय, एमसीईसी29 के आसपास हैं, जो इस प्रोटोकॉल में सुसंस्कृत कोशिकाओं की आकृति विज्ञान के अनुरूप है। इसके अलावा, P0 LNCs लगभग 12 दिनों में सेल घनत्व के लगभग 70% -80% पूर्ण बढ़ने वाली कोशिकाओं में धीरे-धीरे बढ़े। पी 1-पी 12 एलएनसी काफी तेजी से फैल गया और 3-6 दिनों में, व्यावहारिक रूप से पूरे संस्कृति प्लेट को कवर किया। पी 1 के बाद, धुरी के आकार के एलएनसी एडनेक्सल कोशिकाओं ने एमसीईसी और बहुभुज कोशिकाओं को काफी हद तक पछाड़ दिया।

तालिका 2 और चित्र 3 में एनसीडी मूल्यों से यह स्पष्ट है कि एलएनसी पी 0 में सबसे कम एनसीडी (0.810) था और सेल मार्ग 12 दिनों में हुआ था। हालांकि, P1 के बाद, LNCs की वृद्धि में नाटकीय रूप से तेजी आई, और विकास दर P4 में 3.44 पर पहुंच गई। P6 के बाद, LNCs की वृद्धि दर काफी कम हो गई (चित्र 3)। एलएनसी की वृद्धि दर और पी4 की गतिविधि एलएनसी विकास पैटर्न के संदर्भ में काफी हद तक उच्चतम थी, जो पहले के निष्कर्षों के अनुरूप थी जो दर्शाती है कि पी4-पी6 एलएनसी विकासगतिविधि सबसे अच्छी 9 है। हालांकि, इस पद्धति की कुछ सीमाएं हैं, एलएनसी पी 0 की संख्या दाता की उम्र और मृत्यु के समय के अनुसार बहुत भिन्न होती है। इसलिए, जब दाता ऊतक छोटा और ताजा होता है, तो अधिक P0 LNC को अलग किया जा सकता है। इन विट्रो में सीईएस के microenvironment नकल करने में सबसे महत्वपूर्ण कारक सार्वभौमिक आला कारकों के लिए की जरूरत है, इस तरह के एक टुकड़े टुकड़े अमीर बाह्य मैट्रिक्स35 के रूप में.

अंत में, एलएनसी कॉर्नियल एपिथेलियल स्टेम कोशिकाओं का समर्थन करने और सीईएस की स्टेम को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जिसमें परिपक्व कॉर्निया उपकला कोशिकाओं में आत्म-नवीकरण और भेदभाव शामिल है। एलएनसी सीईएसडी 9,15 के साथ रोगियों के इलाज के लिए एक अभिनव सेल उपकरण होने की उम्मीद की जा सकती है।

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Disclosures

किसी भी लेखक के पास कोई प्रासंगिक वित्तीय खुलासा नहीं है।

Acknowledgments

इस काम पर मार्गदर्शन के लिए वेई वांग, लिंगजुआन जू और रोंग लियू के लिए धन्यवाद, योंग्याओ टैन, बिहुई जिन, चुनक्सिउ यू, और ली गुइगांग को कुछ सामग्री प्रदान करने के लिए, पांडुलिपि लिखने के लिए गुआन्यू सु, जिओ झोउ, यिहोंग जिओन, और हुताओ झी पांडुलिपि को सही करने के लिए, और गुइगांग ली उनके पूर्ण मार्गदर्शन के लिए। इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 82070936, 81470606, 81570819), हुबेई प्रांत स्वास्थ्य और परिवार नियोजन वैज्ञानिक अनुसंधान परियोजना (सं। WJ2017M073), टोंगजी अस्पताल से शीर्ष दस अनुवादक चिकित्सा अनुसंधान परियोजनाएं (नंबर 2016ZHYX20), वुहान शहर में युवा चिकित्सा अग्रदूतों की प्रशिक्षण परियोजना (संख्या 2015whzqnyxggrc10), वैश्विक प्रतिभा भर्ती कार्यक्रम (G2022154028L), 2022 में हुबेई प्रांत परियोजना का राष्ट्रीय स्वास्थ्य आयोग (WJ2021ZH0005), और 2022 में हुबेई के वित्त विभाग का विषय निर्माण फाउंडेशन (42000022815T000000102)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole ThermoFisher D1306 5μg/mL
Amphotericin B Sigma V900919 1.25 μg/mL
Anti-CD73 Abcam ab202122 1:50
Bovine Serum Albumin MERCK A1933 -
CD105 Proteintech 67075-1-Ig 1:200
CD105 Abcam ab114052 1:50
CD90 Proteintech 66766-1-Ig 1:100
CD90 Abcam ab307736 1:50
Cell Incubator Shanghai Lishen K1119K4644 HF90(HT)
Centrifuge system StatSpin  StatSpin CytoFuge 12 -
Collagenase A Roche 10103578001 2 mg/mL
Confocal microscope Zeiss  LSM700 -
Culture plate virya 3500356 35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)  cytiva SH30023.01 90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher A16016 1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher 31568 1:1000
FACS Diva sofware BD Biosciences Tree Star -
Flow Cytometer BD Biosciences Becton Dickinson LSRII -
Fluorescence microscope olympus cx31 
Gentamicin Sigma G1914 50 μg/mL
Hemocytometer MERCK Z359629 Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit ThermoFisher 4374966
Inverted phase-contrast microscope  UOP DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) Sigma I3146 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs gibco 10828-028 10%
Matrigel BioCoat 356234 -
Pan-CK Abcam ab7753 1:1000
Paraformaldehyde NoninBio NBS0135 4.00%
Paraformaldehyde MKBio MM-1505 4%
PDGFRβ Abclonal A1444 1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument Applied Biosystems Step One Plus -
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B 4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) Peprotech 300-05 10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit Qiagen 74104 -
SCF Bioss bs-0545R 1:100
SCF Abcam ab52603 1:50
Stereomicroscope ZEISS SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade Careforde 29500 size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix Applied Biosystems 4448489
Triton X-100 MERCK X100 0.20%
Trypan blue ThermoFisher 15250061 0.40%
Trypsin-EDTA Genview GP3108 0.25%
Tween 20 MERCK P9416 -
Ultra Clean Bench LaiTe LT20200705 SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
Vim  Abcam ab92547 1:100

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References

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लिम्बल आला कोशिकाएं अलगाव पहचान लिम्बस ऊतक सेल क्लस्टर भ्रूण स्टेम सेल मध्यम मैट्रिगेल इम्यूनोफ्लोरेसेंस रीयल-टाइम मात्रात्मक पीसीआर फ्लो साइटोमेट्री स्टेम सेल मार्कर वीआईएम सीडी 90 सीडी 105 पीडीजीएफआर पैन-सीके सीडी 73 एससीएफ बीएमएमएससी
अलगाव और लिम्बल आला कोशिकाओं की पहचान
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