Summary
Her presenterer vi en protokoll for å isolere og identifisere de menneskelige limbale nisjecellene.
Abstract
Her rapporterer vi en standard prosedyre for isolering og identifisering av limbale nisjeceller (LNC). Limbusvev hentet fra en øyebank ble brukt til LNCs isolasjon. Vevet ble delt inn i 12 stykker under aseptiske forhold og fordøyd i 18 timer ved 37 °C i cellekulturinkubatoren ved bruk av kollagenase A for å oppnå celleklynger med LNC og limbale epiteliale stamceller. Celleklyngene ble videre fordøyd i 15 minutter ved 37 °C ved bruk av 0,25 % trypsin-EDTA for å oppnå enkeltceller og deretter dyrket i modifisert embryonalt stamcellemedium (MESCM) på en plastoverflate belagt med 5 % Matrigel. Cellene ble passert ved 70% konfluens, og LNCs ble identifisert ved hjelp av immunfluorescens, sanntids kvantitativ PCR (qPCR) og flowcytometri. Primære LNCer ble isolert og passert mer enn 12 ganger. Spredningsaktiviteten av LNCs fra P4 til P6 var den høyeste. LNC uttrykte høyere stamcellemarkører enn BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR og PDGFRβ). Videre viste resultatene at P4 LNC uttrykte VIM, CD90, CD105 og PDGFRβ, men ikke Pan-CK, som kunne brukes som en markør for identifisering av LNC. Flowcytometrisk analyse viste at ca. 95 %, 97 %, 92 % og 11 % av LNC uttrykte henholdsvis CD73, CD90, CD105 og SCF, mens de var 68 %, 99 %, 20 % og 3 % i BMMSC. Standardprosessen for LNC-isolering og identifisering kan gi et pålitelig laboratoriegrunnlag for utstrakt bruk av LNC.
Introduction
Forekomsten av hornhinneepitelial stamcellemangel (CESD), også kalt limbal stamcellemangel (LSCD)1, og hornhinneepitelial regenerering (CES) blir mer og mer presserende på grunn av hornhinneinfeksjon og skade. Hvis ikke riktig behandlet, kan CESD føre til blindhet som krever hornhinnetransplantasjon. Som et resultat blir CES-regenerering stadig viktigere. Det er en gruppe støttende celler kalt limbale nisjeceller (LNC) som gir viktig støtte til CES-funksjonen. Limbale stromale stamceller ble først isolert av Polisetty et al.2 og identifisert av Xie et al.3 som LNCer som er lokalisert i limbalepitelet subjacent og stroma i limbus. LNC er den viktigste støttende stamcellen i hornhinnen, og med funksjonen av benmargsavledet MSC (BMMSC), og kan induseres til å utvikle seg til hornhinneepitelceller og hornhinnestromale celler, etc.3,4,5,6,7. Tidligere studier viste at stamcellekvalitetene til LNC er mer primitive enn BMMSC8, som allerede er mye brukt i klinikken. LNC kan til og med bli det neste levedyktige alternativet etter MSC, spesielt for behandling av CESD. Som viktige støtteceller for CES er LNC også stamceller avledet fra "nisje" -strukturen i limbus. LNC kan spille en nøkkelrolle i dedifferensiering av modne hornhinneepitelceller (MCEC) til CES9. Imidlertid er studier på LNC fortsatt relativt utilstrekkelige, og det er ingen konsensus om terminologi, isolasjon, rensing, identifikasjon og egenskaper ved LNC. Noen forskere har kalt LNCs limbale biopsi-avledede stromale stamceller 10, limbale mesenkymale stamceller 11, limbale fibroblast stamceller12 og limbale mesenkymale stromale celler13. Siden vekstegenskapene til LNC ikke er beskrevet i detalj, og på grunn av deres lovende vitenskapelige og kliniske anvendelser, og kan være et av de viktigste kliniske verktøyene i fremtiden, er det nødvendig å oppsummere isolasjon, rensing, identifikasjon og egenskaper av LNC.
Ifølge en tidligere studie14 er LNC hovedsakelig tilstede ved limbalepitelet subjacent og stroma i limbus. Denne protokollen inkluderer behandling av limbusvev ved bruk av kollagenase A, oppnå en klynge bestående av LEPC og LNC, og fordøye den i enkeltceller med 0,25% trypsin-EDTA (TE). LNC ble deretter selektivt dyrket i et modifisert embryonalt stamcellemedium (MESCM) for å bli renset. Protokollen rapportert i denne artikkelen er enkel og har høy effektivitet i å skaffe menneskelige LNCs i store mengder.
Den detaljerte prosedyren for LNC-isolasjon, kultur og identifikasjon ble registrert i videoen for forskere som er interessert i LNC-studien, og det kan enkelt gjentas når det er nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Limbusvev fra givere i alderen mellom 50 og 60 år ble hentet fra Røde Kors Eye Bank, Tongji Hospital (Wuhan, Kina). Protokollen ble godkjent av Tongjis etiske komité og ble gjennomført i samsvar med Helsinkideklarasjonen.
1. Isolasjon
- Hent limbusvev fra mellomliggende hornhinnelagringsmedium og bruk under aseptiske forhold på en ultraren arbeidsbenk.
- Skrap og fjern iris og endotel rundt hornhinnen ved hjelp av et sterilt kirurgisk rundt blad.
- Skjær limbusvev i tolv like store biter med et kirurgisk blad med 1 mm igjen på begge sider av hornhinnen og sclera.
- Overfør limbusvev til en 3,5 cm kulturplate, tilsett 1 ml kollagenase A (2 mg / ml, i DF-12 medium), for å fordype alle vevene for fordøyelsen.
- Sett platen inn i 37 °C celleinkubatoren, fordøy limbalvevet i 18 timer.
MERK: Oppfølgingsprosedyrer utføres vanligvis på den andre dagen. - Forbered en 5% kjellermembranmatrise (Matrigel) belagt 6-brønns kulturplate.
- Belegg 5% membranmatrise i kjeller (oppløst i MESCM [tabell 1]) i bunnen av brønnen.
- Forbered 200 μL og 1 ml tips, ett 15 ml sentrifugalrør og en 6-brønnsplate i en sterilisert pose.
- Sett den steriliserte posen (inkludert spisser og sentrifugalrør) og en ny 6-brønnsplate ved -20 °C eller -80 °C i 20 minutter. Tine membranmatrisen i kjelleren i kjøleskapet ved 4 °C.
- Ta ut de forkjølte spissene, sentrifugalrøret og 6-brønnsplaten fra -20 °C eller -80 °C, og utfør deretter følgende operasjoner på den ultrarene arbeidsbenken.
- Overfør 50 μL 5% kjellermembranmatrise til 1 ml MESCM ved hjelp av en 200 μL-spiss, og bland dem forsiktig og jevnt.
- Overfør 5% kjellermembranmatrise (oppløst i MESCM) til en brønn i en 6-brønns kulturplate ved bruk av den forkjølte 1 ml spissen.
- Rist 6-brønnsplaten forsiktig og horisontalt, sett 6-brønnskulturplaten i 37 ° C-celleinkubatoren i ca. 1 time, og utfør deretter neste trinn.
- Etter 18-timers fordøyelse, ta ut kollagenase A-fordøyd limbalvev, bare noen synlige små klynger og ufordøyd skleralt vev vil forbli.
MERK: Mikroskopi med høy forstørrelse avslører en klynge sammensatt av mange tettpakkede celler (inkludert LNC). - Bruk en 200 μL pipettespiss for å løsne klyngene fra ufordøyd skleralt vev under stereomikroskopet.
- Overfør klyngene til 3,5 cm kulturplaten og fordyp dem i 0,25% TE, og legg deretter platen i celleinkubatoren i 15 minutter.
- Tilsett 1 ml MESCM med 10 % knockoutserum for å stoppe cellefordøyelsen, og pipetter forsiktig opp og ned for å resuspendere klyngene i individuelle celler ved hjelp av en 1 ml pipettespiss.
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml sentrifugalrør og sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre celleutfellingen, og tilsett deretter 1 ml MESCM for å resuspendere cellene.
- Pipett opp og ned 2-3 ganger til bunncelleutfellingen er jevnt suspendert i MESCM ved hjelp av 1 ml pipettespiss, og ta 20 μL cellesuspensjon for celletelling.
- Overfør cellesuspensjonen til den 5% kjellermembranmatrisebelagte 6-brønnsplaten med en 1 ml pipettespiss og øk volumet av MESCM til 2,5 ml.
- Rist forsiktig 6-brønnsplaten horisontalt for å fordele cellene jevnt.
- Overfør cellene til kulturinkubatoren etter å ha blitt avbildet og registrert. Observer og fotografer cellene daglig, og bytt medium hver 3-4 dag.
2. Identifisering av LNC
- Farging av immunfluorescens
- Fordøy LNCene fra bunnen av platen ved å bruke 1 ml 0,25% TE i 5 minutter i 37 ° C celleinkubatoren.
- Avslutt fordøyelsen ved å tilsette 1 ml MESCM (inneholdende knockoutserum), sentrifuger cellesuspensjonen ved 200 x g i 5 minutter, og aspirer supernatanten forsiktig.
- Legg til 1 ml MESCM for å resuspendere cellene i suspensjon. Forbered 80 μL cellesuspensjon (4 × 103 celler per lysbilde) for 4 lysbilder (20 μL / lysbilde) og bruk sentrifugesystem for å sette celler på mikroskoplysbilder i henhold til produsentens instruksjoner.
- Fiks celler (festet til lysbilder i trinn 3) ved hjelp av 4 % paraformaldehyd i ca. 10 minutter, og permeabiliser deretter celler på lysbildene med 0,2 % Triton X-100 i PBS i 15 minutter.
- Blokker cellene i 1 time med 2% bovint serumalbumin (BSA) før du inkuberer dem med primære antistoffer (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) på en shaker over natten ved 4 °C. Etter inkubasjonen, fjern ubundne primære antistoffer ved å vaske (5 min / vask, 3x) lysbildene med PBST (PBS + 0,1% Tween 20).
- Inkuber de tilsvarende sekundære antistoffene (esel-anti-mus IgG sekundært antistoff TRITC [1:1000], esel-antikanin IgG FITC [1:500], esel-antimus IgG 488 [1:300], eselantikanin IgG 594 [1:400]) i 1 time med egnede IgG uspesifikke IgG-antistoffer. Fjern det ubundne sekundære antistoffet med PBST (5 min/vask, 3x).
- Motflekk kjernene med 5 μg / ml DAPI (4',6-Diamidino-2-fenylindol) og forsegle lysbildene.
- Utfør fluorescensavbildning ved hjelp av et fluorescensmikroskop (forstørrelse: 400x; Eksponeringstid: 50 ms).
- Kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon (qPCR)
- Ta RNA Isolation Kit for å trekke ut det totale RNA i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruk et cDNA-transkripsjonssett med høy kapasitet for å reversere transkribering av 1-2 μg totalt RNA til cDNA.
- Utfør revers transkripsjon (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) og qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 sykluser) i en 20-μL oppløsning inneholdende cDNA (100 ng), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), universell PCR Master Mix (10 μL) og ddH2O (til 20 μL).
- Bruk komparativ CT-teknikk (ΔΔCT)4,9 for å undersøke det relative genuttrykket.
3. Karakterisering av LNC
- Celletelling (hemocytometer)
- Fordøy LNCene fra bunnen av platen med 0,25% TE i 5 minutter i 37 ° C celleinkubatoren.
- Avslutt fordøyelsen ved å tilsette 1 ml MESCM (inneholdende knockoutserum), sentrifuger cellesuspensjonen ved 200 x g i 5 minutter, og aspirer supernatanten forsiktig.
- Tilsett 1 ml MESCM for å resuspendere cellene, og ta deretter 10 μL cellesuspensjon i et 0,5 ml sentrifugerør. Tilsett et like stort volum på 0,4% Trypan blå fargeløsning.
- Plasser 10 μL farget cellesuspensjon på telleområdet til hemocytometeret og dekk det med en deksel for telling.
MERK: Antall celler i de fem midterste kvadratområdene er definert som "A"; celletallet i 1 ml beregnes som 5A × 104 × 2.
- Undersøkelse av LNC- og BMMSC-markører med flowcytometri15
- Pådag ekspresjonen av SCF, CD73, CD90 og CD105 i LNCs og BMMSCs ved hjelp av Flow cytometry 15 (2-4 ×10 6 hendelser / prøve, 2,000 celler ble oppnådd fra hver av prøvene, totalt 550,000 celler som ble gated samtidig).
- Samle og flekk cellene ved 20-30 °C i 15 minutter i en blokkeringsbuffer (3% BSA og 0,05% Tween-20 i PBS) ved hjelp av forhåndsmerkede antistoffer (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] og CD105 [1:50]) i henhold til instruksjonene for settet.
- Utfør fluorescensaktivert cellesortering (FACS) analyse ved hjelp av et flowcytometer. I denne studien ble FACS Diva-programvare og FlowJo-programvare brukt. For hver prøve registrerer du 10 000 hendelser og analyserer levende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vekst av LNC
LNCene ble vellykket isolert i henhold til metoden for fordøyelse av kollagenase A (2 mg/ml) fordøyelse av corneoscleralt rimvev, som beskrevet ovenfor (figur 1). I samsvar med en tidligere rapportert studie3, etter kollagenase A-fordøyelsen, ble larvelignende klynger visualisert under mikroskopet (figur 2). Andelen spindelceller økte gradvis med cellepassasjen. Spindelformede celler kan vokse på belagte 5% kjellermembranmatriseplater, i motsetning til deres kolleger dyrket på plast uten belagt kjellermembranmatrise3. Celler fra P1 til P12 viste en jevn proliferativ rate, med en celledoblingstid mellom 2 og 7 dager (tabell 2). I denne studien ble LNC dyrket til de 13 passasjene og 34 doblinger (figur 3)3. LNC ble dyrket fra primære celler (LNC P0); LNC P0 vokste sakte og tok omtrent 12 dager. LNC trengte bare ca. 3 dager på å passere i P1-P8, og vekstraten for LNC etter P9 sank signifikant (tabell 2). Når det gjelder cellemorfologi, var LNC spindelformet og rund i P0. Etter P3 var LNC spindelformet med samme morfologiske størrelse (figur 2). Graden av total ekspansjon ble målt som antall populasjonsdobling fra P0 til P13 ved hjelp av følgende formel: antall celledobling (NCD) = log10 (y / x) / log102, hvor y er den endelige tettheten av celler og x er den opprinnelige såtettheten av celler3. NCD representerer vekstraten til LNCs (figur 3A). Fra NCD- og akkumulative NCD-kurver (figur 3B) tok LNC minst tid å øke eksponentielt og vokste raskest fra P3-P5 (figur 3). Etter P5 reduserte celleveksthastigheten betydelig, NCD returnerte til 1,32 i P13, og veksten stoppet nesten.
Identifisering av LNC
Etter isolasjonen og kulturen til LNC var en annen viktig oppgave identifikasjon. LNC uttrykt for Vim, CD90, CD105, SCF og PDGFRβ, men ikke Pan-CK, i henhold til nåværende relevante studier på LNC (figur 4)9. Dobbel immunfarging LNC P4 viste at disse cellene var konsistente Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+ (figur 4). qPCR viste også redusert Pan-CK-uttrykk i P2 og økte Vim-, CD90-, CD105-, SCF- og PDGFR-transkripter i P3. Transkripsjonsnivåene av Vim, CD90, CD105, SCF og PDGFR økte dramatisk i P4 sammenlignet med P1 (p < 0,01) (figur 4) 9.
Kjennetegn ved LNC
Videre analyse viste at LNCs uttrykte flere embryonale stamcellemarkører (ESC) (Nestin, Rex1 og SSEA4), mesenkymale stamcellemarkører (MSC) (CD73, CD90 og CD105) og nisjecellemarkører (NC) (MSX1, P75NTR og PDGFRβ) (figur 5) 15. Flowcytometri indikerte at overflateantigenkarakteristika til MSC, inkludert CD73, CD90 og CD105, ble uttrykt i både LNC og BMMSC15. Prosentandelen av LNC som uttrykte CD73, CD90, CD105 og SCF var henholdsvis ca. 95 %, 97 %, 92 % og 11 %, mens BMMSC-ene var henholdsvis 68 %, 99 %, 20 % og 3 %. Dette viser at LNC uttrykker signifikant høyere nivåer av MSC-positive markører CD73, CD105 og cytokinet SCF (p < 0,01) og et tilsvarende nivå av CD90 (p > 0,05) sammenlignet med BMMSC (figur 6)15.
Figur 1: LNCs isolasjonsprosess . (A) Corneoscleral rim vev. (B) Klynger etter kollagenase A fordøyelse ved 37 °C i 18 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: P0 til P13 LNC dyrket på 5% kjellermembranmatrise belagt 6-brønnsplate i MESCM. (Bar = 50 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vekstmønsteret til LNC fra P0-P13. (A) NCD for LNC fra P0-P13; (B) Den kumulative NCD for LNC fra P0-P13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Immunfluorescens og qPCR. Immunfluorescens og qPCR viste at LNC uttrykte Vim, CD90, CD105, SCF og PDGFRβ, men ikke Pan-CK. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Zhu et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: LNC uttrykker flere ESC-, MSC- og NC-markører enn BMMSC-er. P4 LNC og P4 BMMSC ble utsatt for qPCR for transkripsjonsuttrykk av ESC-markører (A), MSC og nevrale kammarkører (B) (n = 3, *P < 0,05, #P < 0,05 og **p < 0,01). Immunfarging av ESC-markører (C) og MSC, NC-markører (D), med nukleær motflekk av Hoechst 33342. Skalastenger = 25 μm. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Li et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Fluorescensaktivert cellesortering av P4 LNC og BMMSC (A-F). Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) analyse av MSC-markører inkludert CD73, CD90 og CD105 (n = 3). Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Li et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | Konsentrasjon av stamløsning | Volum | Endelig konsentrasjon | Lagringsmiljø |
| DME/F-12 1:1(1×) | Grunnleggende medium | 180 ml | 90% | 4 °C |
| KnockOutTMSR | - | 20 ml | 10% | -20 °C |
| Serumerstatning for ESC-er/iPSC-er | ||||
| Recominant human leukemihemmende faktor (Lif) | 50 μg/ml | 40 μL | 10 ng/ml | -80 °C |
| Rekombinant human FGF-basisk | 100 μg/ml | 8 μL | 4 ng/ml | -80 °C |
| ITS (insulin, transferrin, natrium selenitt) | 500 μg/ml insulin | 2 ml | 5 mikrogram/ml insulin | -20 °C |
| 500 μg/ml transferrin | 5 mikrogram/ml transferrin | |||
| 500 ng/ml natrium selenitt | 5 ng/ml natrium selenitt | |||
| Gentamicin | 25 μg/ml | 2 ml | 50 μg/ml | 4 °C |
| Amfotericin B | 2500 μg/ml | 100 μL | 1,25 μg/ml | 4 °C |
Tabell 1: MESCM formulering.
| Passasje | Såtetthet (× 105 celler/cm2) | Endelig tetthet (× 105celler/cm2) | Kulturtid (dager) | Antall celledoblinger (NCD) | Akkumulerende NCD |
| P0 | 0.22 | 0.385714 | 12 | 0.810029 | 0.810029 |
| P1 | 0.08 | 0.365714 | 4 | 2.192645 | 3.002674 |
| P2 | 0.051429 | 0.357143 | 3 | 2.795859 | 5.798533 |
| P3 | 0.037143 | 0.337143 | 2 | 3.182203 | 8.980737 |
| P4 | 0.028571 | 0.311429 | 6 | 3.446256 | 12.42699 |
| P5 | 0.04 | 0.385714 | 3 | 3.269461 | 15.69645 |
| P6 | 0.054286 | 0.48 | 4 | 3.14439 | 18.84084 |
| P7 | 0.057143 | 0.351429 | 3 | 2.620586 | 21.46143 |
| P8 | 0.08 | 0.394286 | 3 | 2.30117 | 23.7626 |
| P9 | 0.06 | 0.345714 | 6 | 2.526546 | 26.28915 |
| P10 | 0.022857 | 0.122857 | 7 | 2.426265 | 28.71541 |
| P11 | 0.025714 | 0.122857 | 5 | 2.25634 | 30.97175 |
| P12 | 0.028571 | 0.114286 | 5 | 2 | 32.97175 |
| P13 | 0.045714 | 0.114286 | 10 | 1.321928 | 34.29368 |
Tabell 2: Serial Passages of the LNC on plastic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Korneal gjennomsiktighet opprettholdes vanligvis ved regelmessig arrangement og distribusjon av små fibre (25-30 nm i diameter) i hornhinnen stroma, noe som er avgjørende for normal synsstyrke16. Det er 253 millioner synshemmede over hele verden, hvorav 36 millioner er blinde17. Verdens helseorganisasjon (WHO) anser hornhindeblindhet som en av de alvorligste farene for menneskelig syn, og står for 5.1% av all blindhet over hele verden16. Defekt i hornhinneepitel med normal CES kan gro raskt uten å etterlate et arr18. Det er anslått at mer enn 12,7 millioner pasienter over hele verden krever hornhindetransplantasjoner på grunn av moderat til alvorlig synstap19; 30 % av hornhinnetransplantasjonssvikten skyldtes CESD20. På grunn av mangelen på hornhindedonasjon i de fleste land over hele verden, kunne imidlertid bare en av sytti hornhindeblinde pasienter til slutt få hornhindetransplantasjon21. For tiden kan hornhinneepitelial stamcelletransplantasjon (CEST) brukes til å behandle CESD22. Pasienter med monokulær CESD kan få CES fra friske øyne for CEST. For pasienter med bilateral CESD kan imidlertid kun allogen CES fås til behandling. Immunavstøtning er fortsatt hovedårsaken til svikt i allogen CEST. En lovende metode for å redusere terapeutisk behandling for CESD er å finne en celle som effektivt kan erstatte autogen CES eller oppmuntre til differensiering av andre autogene celler fra andre steder for å bli CES. In vitro differensiering av autologe celler til CES er også blitt populært, inkludert BMMSC 23, orale slimhinneepitelceller (OMEC)24, stamceller fra dentale pulp (DPSC)19, humane fibroblastavledede-induserte pluripotente stamceller (iPSC)25 og fettstamceller (ASC)26. Rohaina et al.23fant at BMMSCer dyrket på fostermembraner i 10 dager kunne differensiere til hornhinneepitelceller, og at CK3 og p63-ekspresjon økte signifikant etter induksjon av differensiering. I 2020 induserte O'Callaghan et al.24differensieringen av orale slimhinneepitelceller i hornhinneepitelceller ved hjelp av et nytt kultursystem, og brukte det med hell til behandling av CESD ved hjelp av en 3D-vevsstruktur (RAFT) som støtte for oral mukosal epitelcellekultur med humane orale slimhinnefibroblaster som trofoblaster. I tillegg skiller DPSC seg vellykket inn i hornhinnen stromale og epitelceller. Ved å oppregulere uttrykket av K3, K12 og CD90, kan DPSC forhindre hornhinnekonjunktival invasjon. En annen studie brukte DPSC som fostercelleark piggybacked på hornhinnens overflate i en kanin CESD-modell. Resultatene viste at DPSC-gruppen hadde renere hornhinner og mindre angiogenese enn kontrollgruppen27. Hayashi et al.28oppnådde differensiering ved hjelp av fibroblast-avledet iPSC som kunne induseres i PAX6 (+) og K12 (+) hornhinneepitelceller etter 12 uker. iPSC utvikler seg effektivt til hornhinneepitelceller, aktiverer K12 og undertrykker NANOG25. Zeppieri et al.26 oppdaget at ASC-er kunne differensiere til hornhinneepitelceller for å kurere CESD fra mus og forbedre sårheling av hornhinneepitel i en laserindusert dyremodell.
LNC-er lokaliseres i limbal nisje, hvor CES er beskyttet og støttet, og har mange egenskaper som ligner MSC. LNC ble først isolert av Polisetty et al.2 og først navngitt av Xie et al.3. Ifølge nyere studier er LNC mer grunnleggende stamceller enn MSC og kan lett differensiere til adipocytter, kondrocytter og osteocytter 4,29. Sammenlignet med de vanlige BMMSC-ene, viser LNC større stamcelleegenskaper (høyere uttrykk av CD73, CD105, PDGFR, SCF, etc.) (Figur 5) 30. LNC kan med hell behandle kaniner med CESD forårsaket av korneal alkaliforbrenninger ved å fremme reparasjon av hornhinneepitelet og stroma15. Det reduserte uttrykket av fibronektin (FN), bindevevsvekstfaktor (CTGF) og utskilt protein surt og cysteinrikt (SPARC) i hornhinnefibroblaster antyder at LNCs sekresjon forbedrer sårheling og reduserer fibrose7.
I et 3D-mikromiljø er det interessant at LNC-er kan gjenforenes med MCEC-er, og stimulere sistnevnte celler til å gjenopprette stamcelleegenskaper9. LNCs akselererer effektivt CES-vekst31 og forhindrer hornhinnearrdannelse10. Mengden LNC er imidlertid begrenset; Studier har indikert at det representerer bare ca. 3% av det totale antall limbale stromale celler i storfehornhinnen32, med signifikant uttrykk for keratansulfat, keratokan og ALDH3A133. De kan være mindre enn 1% i menneskelige hornhinner33.
I denne protokollen ble tidligere metoder for å isolere, rense og identifisere LNC gjentatt 3,14,34. Etter 18 timers behandling av humant limbusvev med kollagenase A (2 mg/ml) ble LNC isolert. P0 LNC utviklet seg langsomt og viste ulike cellemorfologier, inkludert spindelformede LNCer, polygonale andre og synlig sfærisk MCEC (figur 2, P0). Tidligere studier har vist at LNC er spindelformede celler som fester seg til bunnen av kulturoverflaten med homogen morfologi14. Samtidig er MCEC runde29, noe som stemmer overens med morfologien til cellene som er dyrket i denne protokollen. I tillegg vokste P0 LNCs sakte til cellene vokser full ca 70% -80% av celletettheten i ca 12 dager. P1-P12 LNC spredte seg betydelig raskere og dekket praktisk talt hele kulturplaten i løpet av 3-6 dager. Etter P1 var spindelformede LNC-er signifikant flere enn runde MCEC- og polygonale celler.
Det fremgår av NCD-verdiene i tabell 2 og figur 3 at LNCs P0 hadde lavest NCD (0,810) og at cellepassasjen foregikk over 12 dager. Men etter P1 akselererte veksten av LNCs dramatisk, og vekstraten toppet på 3,44 i P4. Etter P6 ble vekstraten for LNC betydelig redusert (figur 3). LNCs vekstrate og aktivitet på P4 var vesentlig den høyeste når det gjelder LNCs vekstmønster, i samsvar med tidligere funn som indikerer at P4-P6 LNCs vekstaktivitet er den beste9. Denne metoden har imidlertid visse begrensninger, antall LNC P0 varierer sterkt i henhold til donorens alder og dødstidspunktet. Derfor, når donorvevet er yngre og friskere, kan mer P0 LNC isoleres. Den viktigste faktoren for å etterligne mikromiljøet til CES in vitro er behovet for universelle nisjefaktorer, for eksempel en laminaminrik ekstracellulær matrise35.
Avslutningsvis spiller LNC en avgjørende rolle i å støtte hornhinneepitelstamceller og opprettholde stammen til CES, inkludert selvfornyelse og differensiering i modne hornhinneepitelceller. LNC kan forventes å være et innovativt celleverktøy for behandling av pasienter med CESD 9,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har noen relevante økonomiske avsløringer.
Acknowledgments
Takk til Wei Wang, Lingjuan Xu og Rong Liu for veiledningen i dette arbeidet, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You og Li Guigang for å gi noe av materialet, Guanyu Su for å skrive manuskriptet, Xiao Zhou, Yihong Xiong og Huatao Xie for å korrigere manuskriptet, og Guigang Li for hans fulle veiledning. Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr. 82070936, 81470606, 81570819), Hubei-provinsen helse og familieplanlegging vitenskapelig forskningsprosjekt (nr. WJ2017M073), Topp ti translasjonelle medisinske forskningsprosjekter fra Tongji Hospital (No.2016ZHYX20), Opplæringsprosjekt for unge medisinske pionerer i Wuhan City (No.2015whzqnyxggrc10), Global Talents Recruitment Program (G2022154028L), National Health Commission of Hubei Province-prosjektet i 2022(WJ2021ZH0005), og Subject Construction Foundation of Finance Department of Hubei In 2022(42000022815T000000102)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | - |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | - |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | - |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | - |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | - |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | - |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | - |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | - |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
References
- Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
- Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
- Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
- Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
- Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
- Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
- Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16 (2020).
- Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1 (2022).
- Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172 (2014).
- Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
- Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
- Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471 (2022).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
- Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566 (2018).
- Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Pineda, R. World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , Springer, Cham. 299-305 (2020).
- Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441 (2022).
- Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562 (2022).
- Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
- Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
- O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265 (2020).
- Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
- Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115 (2017).
- Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
- Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
- Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
- Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
- González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
- Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
- Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).
