Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e identificar as células do nicho limbal humano.
Abstract
Relatamos aqui um procedimento padrão para o isolamento e identificação de células de nicho limbal (LNCs). Tecido do limbo obtido de um banco de olhos foi utilizado para o isolamento dos NCN. O tecido foi dividido em 12 pedaços sob condições assépticas e digerido por 18 h a 37 °C em incubadora de cultura celular usando colagenase A para obter aglomerados celulares com CNLS e células progenitoras epiteliais límbicas. Os aglomerados celulares foram posteriormente digeridos por 15 min a 37 °C usando tripsina-EDTA a 0,25% para obtenção de células únicas e, em seguida, cultivados em meio de células-tronco embrionárias modificado (MESCM) em uma superfície plástica revestida com Matrigel a 5%. As células foram passadas em confluência de 70%, e os LNCs foram identificados por imunofluorescência, PCR quantitativo em tempo real (qPCR) e citometria de fluxo. Os NCL primários foram isolados e passados mais de 12 vezes. A atividade proliferativa de LNCs de P4 a P6 foi a mais alta. Os LNCs expressaram marcadores de células-tronco mais elevados do que os BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR e PDGFRβ). Além disso, os resultados mostraram que os LNCs P4 expressaram uniformemente VIM, CD90, CD105 e PDGFRβ, mas não Pan-CK, o que poderia ser usado como um marcador para a identificação de LNCs. A análise por citometria de fluxo mostrou que aproximadamente 95%, 97%, 92% e 11% dos LNCs expressaram CD73, CD90, CD105 e SCF, respectivamente, enquanto foram 68%, 99%, 20% e 3% nos BMMSCs. O processo padrão para isolamento e identificação de LNC poderia fornecer uma base laboratorial confiável para o uso generalizado de LNCs.
Introduction
A incidência de deficiência de células-tronco epiteliais corneanas (CESD), também chamada de deficiência de células-tronco do limbo (LSCD)1, e regeneração epitelial corneana (ECC) estão se tornando cada vez mais urgentes devido à infecção e lesão corneana. Se não tratada adequadamente, a CESD pode levar à cegueira que requer transplante de córnea. Como resultado, a regeneração da CES está se tornando mais significativa. Existe um grupo de células de suporte chamadas células de nicho limbal (LNCs) que fornecem suporte essencial para a função da CES. As células-tronco estromais do limbo foram primeiramente isoladas por Polisetty et al.2 e identificadas por Xie et al.3 como CNLs que estão localizadas no epitélio limbal subjacente e estroma do limbo. Os NCLs são as principais células-tronco de suporte da borda corneana e, com a função de CTMs derivadas da medula óssea (BMMSCs), e podem ser induzidos a se desenvolver em células epiteliais da córnea e células estromais da córnea, etc.3,4,5,6,7. Estudos anteriores mostraram que as qualidades de células-tronco dos LNCs são mais primitivas do que as BMMSCs8, que já são amplamente utilizadas na clínica. Os LNCs podem até se tornar a próxima opção viável após as CTM, especialmente para o tratamento de CESD. Como importantes células de suporte para a CES, os LNCs também são células-tronco derivadas da estrutura de "nicho" do limbo. Os NCLs podem desempenhar um papel fundamental na desdiferenciação de células epiteliais maduras da córnea (MCEC) para a CES9. No entanto, os estudos sobre NCL ainda são relativamente insuficientes, e não há consenso sobre a terminologia, isolamento, purificação, identificação e características dos NCL. Alguns pesquisadores denominaram células-tronco estromais derivadas de biópsia limbal 10, células-tronco mesenquimais do limbo 11, células-tronco fibroblásticas do limbo12 e células estromais mesenquimais do limbo13. Como as características de crescimento dos NCN não foram descritas em detalhes, e devido às suas promissoras aplicações científicas e clínicas, e podem ser uma das ferramentas clínicas mais importantes no futuro, é necessário resumir o isolamento, purificação, identificação e características dos NCL.
De acordo com estudoprévio14, os NCL estão presentes principalmente no epitélio limbal subjacente e no estroma do limbo. Esse protocolo inclui o tratamento do tecido do limbo com colagenase A, a obtenção de um cluster composto por LEPC e LNCs e a digestão em células únicas com tripsina-EDTA (ET) a 0,25%. Os NCL foram então cultivados seletivamente em um meio de células-tronco embrionárias modificado (MESCM) para serem purificados. O protocolo relatado neste trabalho é simples e tem alta eficiência na obtenção de NCLs humanos em grandes quantidades.
O procedimento detalhado de isolamento, cultura e identificação do LNC foi gravado no vídeo para cientistas interessados no estudo do LNC, e pode ser convenientemente repetido quando necessário.
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Protocol
O tecido do limbo de doadores com idade entre 50 e 60 anos foi obtido do Banco de Olhos da Cruz Vermelha, Hospital Tongji (Wuhan, China). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Tongji e foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque.
1. Isolamento
- Obter tecido do limbo a partir de meio de armazenamento corneano de médio prazo intermediário e operar sob condições assépticas em uma bancada de trabalho ultralimpa.
- Raspar e remover a íris e o endotélio ao redor da córnea usando uma lâmina redonda cirúrgica estéril.
- Cortar o tecido do limbo em doze pedaços de tamanho igual com uma lâmina cirúrgica com 1 mm à esquerda em ambos os lados da córnea e esclera.
- Transfira os tecidos do limbo para uma placa de cultura de 3,5 cm, adicione 1 mL de colagenase A (2 mg/mL, em meio DF-12), para imergir todos os tecidos para digestão.
- Coloque a placa na incubadora de células a 37 °C, digerir os tecidos límbicos durante 18 horas.
NOTA: Os procedimentos de acompanhamento são geralmente realizados no segundo dia. - Preparar uma matriz de membrana basal (Matrigel) revestida com 5% de placa de cultura de 6 poços.
- Revestir 5% de matriz de membrana basal (dissolvida em MESCM [Tabela 1]) no fundo do poço.
- Preparar pontas de 200 μL e 1 mL, um tubo centrífugo de 15 mL e uma placa de 6 poços em uma bolsa esterilizada.
- Coloque o saco esterilizado (incluindo pontas e tubo centrífugo) e uma nova placa de 6 poços a ambientes de -20 °C ou -80 °C por 20 min. Descongelar a matriz da membrana basal no refrigerador a 4 °C.
- Retire as pontas pré-resfriadas, o tubo centrífugo e a placa de 6 poços do ambiente de -20 °C ou -80 °C e, em seguida, execute as seguintes operações na bancada de trabalho ultralimpa.
- Transfira 50 μL de matriz de membrana basal a 5% para 1 mL de MESCM usando uma ponta de 200 μL e misture-os suavemente e uniformemente.
- Transfira a matriz da membrana basal a 5% (dissolvida em MESCM) para um poço de uma placa de cultura de 6 poços usando a ponta pré-resfriada de 1 mL.
- Agite a placa de 6 poços suave e horizontalmente, coloque a placa de cultura de 6 poços na incubadora de células a 37 °C por aproximadamente 1 h e, em seguida, execute a próxima etapa.
- Após 18 horas de digestão, retire o tecido límbico digerido pela colagenase A, apenas alguns pequenos aglomerados visíveis e tecidos esclerais não digeridos permanecerão.
NOTA: A microscopia de alta magnificação revela um aglomerado composto por muitas células densamente compactadas (incluindo LNCs). - Use uma ponta de pipeta de 200 μL para separar os cachos dos tecidos esclerais não digeridos sob o estereomicroscópio.
- Transfira os cachos para a placa de cultura de 3,5 cm e mergulhe-os em TA 0,25% e, em seguida, coloque a placa na incubadora de células por 15 min.
- Adicione 1 mL de MESCM com 10% de soro nocaute para interromper a digestão celular e pipetar suavemente para cima e para baixo para ressuspender os aglomerados em células individuais usando uma ponta de pipeta de 1 mL.
- Transfira a suspensão celular para um tubo centrífugo de 15 mL e centrífuga a 200 x g por 5 min.
- Remova o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar a precipitação celular e, em seguida, adicione 1 mL de MESCM para ressuspender as células.
- Pipetar para cima e para baixo 2-3 vezes até que a precipitação da célula de fundo seja uniformemente suspensa no MESCM usando a ponta da pipeta de 1 mL e tomar a suspensão de 20 μL de células para contagem celular.
- Transfira a suspensão celular para a placa de 6 poços revestida com matriz de membrana basal a 5% com ponta de pipeta de 1 mL e aumente o volume de MESCM para 2,5 mL.
- Agite suavemente a placa de 6 poços horizontalmente para distribuir uniformemente as células.
- Transferir as células para a incubadora de cultura após serem fotografadas e registradas. Observe e fotografe as células diariamente, e troque o meio a cada 3-4 dias.
2. Identificação do LNC
- Coloração por imunofluorescência
- Digerir os LNCs do fundo da placa usando 1 mL de TE 0,25% por 5 min na incubadora de células a 37°C.
- Terminar a digestão adicionando 1 mL de MESCM (contendo soro nocaute), centrifugar a suspensão celular a 200 x g por 5 min e aspirar o sobrenadante cuidadosamente.
- Adicionar 1 ml de MESCM para ressuspender as células em suspensão. Preparar a suspensão celular de 80 μL (4 × 103 células por lâmina) para 4 lâminas (20 μL/lâmina) e usar o sistema de centrífuga para depositar as células nas lâminas do microscópio de acordo com as instruções do fabricante.
- Fixar as células (aderidas às lâminas na etapa 3) usando paraformaldeído a 4% por cerca de 10 min e, em seguida, permeabilizar as células nas lâminas com Triton X-100 a 0,2% em PBS por 15 min.
- Bloquear as células por 1 h com albumina de soro bovino (BSA) a 2% antes de incubá-las com anticorpos primários (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) em um agitador durante a noite a 4 °C. Após a incubação, remover os anticorpos primários não ligados lavando (5 min/lavagem, 3x) as lâminas com PBST (PBS + 0,1% Tween 20).
- Incubar os anticorpos secundários correspondentes (anticorpo secundário IgG de burro anti-rato TRITC [1:1000], burro anti-coelho IgG FITC [1:500], burro anti-rato IgG 488 [1:300], burro anti-coelho IgG 594 [1:400]) durante 1 h com anticorpos IgG inespecíficos IgG adequados. Remova o anticorpo secundário não ligado usando PBST (5 min/lavagem, 3x).
- Contracolorir os núcleos com 5 μg/mL de DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol ) e selar as lâminas.
- Realizar imagens de fluorescência usando um microscópio de fluorescência (Ampliação: 400x; Tempo de exposição: 50 ms).
- Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR)
- Tome o Kit de Isolamento de RNA para extrair o RNA total de acordo com as instruções do fabricante.
- Use um Kit de Transcrição de cDNA de alta capacidade para transcrever reversamente 1-2 μg de RNA total para cDNA.
- Realizar a transcrição reversa (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) e qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 ciclos) em uma solução de 20 μL contendo cDNA (100 ng), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), PCR universal Master Mix (10 μL) e ddH2O (até 20 μL).
- Utilizar a técnica de TC comparativa (ΔΔCT)4,9 para examinar a expressão gênica relativa.
3. Caracterização do LNC
- Contagem celular (hemocitômetro)
- Digerir os LNCs do fundo da placa usando TE 0,25% por 5 min na incubadora de células a 37 °C.
- Terminar a digestão adicionando 1 mL de MESCM (contendo soro nocaute), centrifugar a suspensão celular a 200 x g por 5 min e aspirar o sobrenadante cuidadosamente.
- Adicionar 1 ml de MESCM para ressuspender as células e, em seguida, tomar 10 μL de suspensão celular num tubo de centrífuga de 0,5 ml. Adicione um volume igual de solução corante de azul de Trypan a 0,4%.
- Colocar a suspensão celular corada de 10 μL na área de contagem do hemocitômetro e cobri-la com uma lamínula para contagem.
Observação : o número de células nas cinco áreas quadradas do meio é definido como "A"; o número de células em 1 mL é calculado como 5A × 10,4 × 2.
- Exame dos marcadores LNC e BMMSC por citometria de fluxo15
- Detectar a expressão de SCF, CD73, CD90 e CD105 nos LNCs e BMMSCs utilizando citometria de fluxo15 (2-4 ×10 6 eventos/amostra, 2.000 células foram obtidas de cada uma das amostras, totalizando 550.000 células que foram fechadas simultaneamente).
- Coletar e corar as células a 20-30 °C por 15 min em um tampão de bloqueio (3% BSA e 0,05% Tween-20 em PBS) usando anticorpos pré-marcados (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] e CD105 [1:50]) de acordo com as instruções do kit.
- Realizar análise de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) usando um citômetro de fluxo. Neste estudo, foram utilizados os softwares FACS Diva e FlowJo. Para cada amostra, registre 10.000 eventos e analise células vivas.
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Representative Results
Crescimento do LNC
Os NCL foram isolados com sucesso de acordo com o método de digestão da colagenase A (2 mg/mL) do tecido da borda corneoescleral, conforme descrito acima (Figura 1). Consistente com um estudo relatado anteriormente3, após a digestão da colagenase A, aglomerados semelhantes a lagartas foram visualizados ao microscópio (Figura 2). A proporção de células fusiformes aumentou gradualmente com a passagem celular. As células fusiformes poderiam crescer em placas de matriz de membrana basal revestidas a 5%, ao contrário de suas contrapartes cultivadas em plástico sem matriz de membrana basal revestida3. As células de P1 a P12 apresentaram taxa proliferativa uniforme, com tempo de duplicação celular entre 2 e 7 dias (Tabela 2). Neste estudo, os NCL foram cultivados para as 13 passagens e 34 duplicações (Figura 3)3. Os NCL foram cultivados a partir de células primárias (LNC P0); O LNC P0 cresceu lentamente e levou aproximadamente 12 dias. Os RNC necessitaram apenas de cerca de 3 dias para passar em P1-P8, e a taxa de crescimento dos CNN após P9 diminuiu significativamente (Tabela 2). Em termos de morfologia celular, os CNLs eram fusiformes e redondos em P0. Após o P3, os NCL foram fusiformes com o mesmo tamanho morfológico (Figura 2). A extensão da expansão total foi medida como o número de população duplicando de P0 para P13 usando a seguinte fórmula: número de duplicação celular (NCD) = log10 (y/x) / log102, onde y é a densidade final das células e x é a densidade inicial de semeadura das células3. As DCNT representam a taxa de crescimento dos RNA (Figura 3A). A partir das curvas DCNT e DCNT acumulativa (Figura 3B), as NCN levaram menos tempo para aumentar exponencialmente e cresceram mais rapidamente a partir do P3-P5 (Figura 3). Após o P5, a taxa de crescimento celular diminuiu significativamente, a DCNT retornou para 1,32 em P13, e o crescimento quase parou.
Identificação do LNC
Após o isolamento e cultura dos NCNs, outra tarefa importante foi a identificação. NCLs expressos para Vim, CD90, CD105, SCF e PDGFRβ, mas não Pan-CK, de acordo com estudos relevantes atuais sobre NCLs (Figura 4)9. A dupla imunomarcação LNC P4 revelou que essas células eram consistentemente Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+ (Figura 4). A qPCR também revelou diminuição da expressão de Pan-CK no P2 e aumento dos transcritos Vim, CD90, CD105, SCF e PDGFR no P3. Os níveis de transcrição de Vim, CD90, CD105, SCF e PDGFR aumentaram dramaticamente no P4 em comparação com o P1 (p < 0,01) (Figura 4)9.
Características do LNC
Uma análise mais aprofundada mostrou que os LNCs expressaram mais marcadores de células-tronco embrionárias (CTE) (Nestina, Rex1 e SSEA4), marcadores de células-tronco mesenquimais (CTM) (CD73, CD90 e CD105) e marcadores de células de nicho (NC) (MSX1, P75NTR e PDGFRβ) (Figura 5)15. A citometria de fluxo indicou que as características antigênicas de superfície das CTMs, incluindo CD73, CD90 e CD105, foram expressas tanto em LNCs quanto em BMMSCs15. As porcentagens de CNL que expressaram CD73, CD90, CD105 e SCF foram de aproximadamente 95%, 97%, 92% e 11%, respectivamente, enquanto as de CMMS foram de 68%, 99%, 20% e 3%, respectivamente. Isso mostra que os NCLs expressam níveis significativamente mais elevados dos marcadores CD73, CD105 e da citocina SCF (p < 0,01) e um nível semelhante de CD90 (p > 0,05) em comparação com os BMMSCs (Figura 6)15.
Figura 1: Processo de isolamento dos LNCs . (A) Tecido da borda corneescleral. (B) Cachos após digestão da colagenase A a 37 °C por 18 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: NCLs P0 a P13 cultivados em placa de 6 poços revestida com matriz de membrana basal a 5% em MESCM (Bar = 50 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O padrão de crescimento dos LNCs de P0-P13. (A) As DCNT dos NCN de P0-P13; (B) As DCNT cumulativas de LNCs de P0-P13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imunofluorescência e qPCR. A imunofluorescência e a qPCR revelaram que os LNCs expressaram uniformemente Vim, CD90, CD105, SCF e PDGFRβ, mas não Pan-CK. Esse valor foi reproduzido com permissão de Zhu et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Os LNCs expressam mais marcadores ESC, MSC e NC do que os BMMSCs. Os LNCs P4 e os BMMSCs P4 foram submetidos à qPCR para expressão transcricional dos marcadores ESC (A), CTM e marcadores da crista neural (B) (n = 3, *P < 0,05, #P < 0,05 e **p < 0,01 respectivamente). Imunomarcação de marcadores ESC (C) e MSC, marcadores NC (D), com contracoloração nuclear por Hoechst 33342. Barras de escala = 25 μm. Esse valor foi reproduzido com permissão de Li et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Classificação celular ativada por fluorescência de LNCs P4 e BMMSCs (A-F). Análise de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) de marcadores de CTM, incluindo CD73, CD90 e CD105 (n=3). Esse valor foi reproduzido com permissão de Li et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Concentração da solução-mãe | Volume | Concentração final | Ambiente de armazenamento |
| DME/F-12 1:1(1×) | Meio básico | 180 mL | 90% | 4 °C |
| NocauteTMSR | - | 20 mL | 10% | -20 °C |
| Reposição sérica para CTEs/iPSCs | ||||
| Fator Inibitório da Leucemia Humana Recominante (Lif) | 50 μg/mL | 40 μL | 10 ng/mL | -80 °C |
| FGF-básico humano recombinante | 100 μg/mL | 8 μL | 4 ng/mL | -80 °C |
| ITS (insulina, transferrina, selenito de sódio) | 500 μg/mL de insulina | 2 mL | 5 μg/mL de insulina | -20 °C |
| 500 μg/mL transferrina | 5 μg/mL de transferrina | |||
| 500 ng/ml selenito de sódio | 5 ng/mL selenito de sódio | |||
| Gentamicina | 25 μg/mL | 2 mL | 50 μg/mL | 4 °C |
| Anfotericina B | 2500 μg/mL | 100 μL | 1,25 μg/mL | 4 °C |
Tabela 1: Formulação do MESCM.
| Passagem | Densidade de semeadura (× 105 células/cm2) | Densidade final (× 105células/cm2) | Tempo de cultura (dias) | Número de duplicações celulares (NCD) | DCNT acumulada |
| P0 | 0.22 | 0.385714 | 12 | 0.810029 | 0.810029 |
| P1 | 0.08 | 0.365714 | 4 | 2.192645 | 3.002674 |
| P2 | 0.051429 | 0.357143 | 3 | 2.795859 | 5.798533 |
| P3 | 0.037143 | 0.337143 | 2 | 3.182203 | 8.980737 |
| P4 | 0.028571 | 0.311429 | 6 | 3.446256 | 12.42699 |
| Pág. 5 | 0.04 | 0.385714 | 3 | 3.269461 | 15.69645 |
| Pág. 6 | 0.054286 | 0.48 | 4 | 3.14439 | 18.84084 |
| Pág. 7 | 0.057143 | 0.351429 | 3 | 2.620586 | 21.46143 |
| Pág. 8 | 0.08 | 0.394286 | 3 | 2.30117 | 23.7626 |
| Pág. 9 | 0.06 | 0.345714 | 6 | 2.526546 | 26.28915 |
| P10 | 0.022857 | 0.122857 | 7 | 2.426265 | 28.71541 |
| Pág. 11 | 0.025714 | 0.122857 | 5 | 2.25634 | 30.97175 |
| Pág. 12 | 0.028571 | 0.114286 | 5 | 2 | 32.97175 |
| Pág. 13 | 0.045714 | 0.114286 | 10 | 1.321928 | 34.29368 |
Tabela 2: Passagens seriadas do LNC sobre plástico.
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Discussion
A transparência corneana é tipicamente mantida pelo arranjo e distribuição regulares de pequenas fibras (25-30 nm de diâmetro) no estroma corneano, o que é crucial para a acuidade visual normal16. Existem 253 milhões de deficientes visuais em todo o mundo, dos quais 36 milhões são cegos17. A Organização Mundial da Saúde (OMS) considera a cegueira corneana um dos mais sérios agravos à visão humana, sendo responsável por 5,1% de toda a cegueira no mundo16. O defeito do epitélio corneano com SCE normal pode cicatrizar rapidamente sem deixar cicatriz18. Estima-se que mais de 12,7 milhões de pacientes no mundo necessitem de transplante de córnea devido à perda de visão moderada a grave19; 30% das falhas no transplante de córnea foram causadas pela CESD20. No entanto, devido à escassez de doação de córneas na maioria dos países do mundo, apenas um em cada setenta pacientes córneo-cegos poderia eventualmente receber transplante de córnea21. Atualmente, o transplante de células-tronco epiteliais corneanas (CEST) pode ser utilizado no tratamento da CESD22. Pacientes com CESD monocular podem obter CES de olhos saudáveis para CEST. No entanto, para pacientes com CESD bilateral, apenas a CES alogênica pode ser obtida para tratamento. A rejeição imunológica continua sendo a principal razão para o fracasso do CEST alogênico. Um método promissor para reduzir o tratamento terapêutico para CESD é encontrar uma célula que possa efetivamente substituir a CES autógena ou incentivar a diferenciação de outras células autógenas de outros lugares para se tornar CES. A diferenciação in vitro de células autólogas em CES também está se popularizando, incluindo BMMSC23, células epiteliais da mucosa oral (OMEC)24, células-tronco da polpa dentária (DPSC)19, células-tronco pluripotentes induzidas por fibroblastos humanos (iPSC)25 e células-tronco adiposas (CTA)26. Rohaina et al.23verificaram que BMMSCs cultivadas em membranas amnióticas por 10 dias poderiam se diferenciar em células epiteliais da córnea e que a expressão de CK3 e p63 aumentou significativamente após a indução da diferenciação. Em 2020, O'Callaghan et al.24induziram a diferenciação de células epiteliais da mucosa oral em células epiteliais da córnea usando um novo sistema de cultura, e o utilizaram com sucesso para o tratamento de CESD usando uma estrutura tecidual 3D (RAFT) como suporte para cultura de células epiteliais da mucosa oral com fibroblastos da mucosa oral humana como trofoblastos. Além disso, a DPSC diferencia-se com sucesso em células epitelitais e estromais da córnea. Ao aumentar a expressão de K3, K12 e CD90, a DPSC pode prevenir a invasão conjuntival da córnea. Outro estudo utilizou DPSC como folhas de células amnióticas na superfície da córnea em um modelo CESD de coelho. Os resultados mostraram que o grupo CPPD apresentou córneas mais limpas e menos angiogênese que o grupo controle27. Hayashi et al.28obtiveram diferenciação usando iPSC derivadas de fibroblastos que poderiam ser induzidas em PAX6(+) e K12(+) células epiteliais da córnea após 12 semanas. A iPSC efetivamente se desenvolve em células epiteliais da córnea, ativa a K12 e suprime o NANOG25. Zeppieri et al.26 descobriram que as ASCs poderiam se diferenciar em células epiteliais da córnea para curar a CESD de camundongos e melhorar a cicatrização de feridas epiteliais corneanas em um modelo animal induzido por laser.
Os NCL localizam-se no nicho limbal, onde a ACD é protegida e suportada, e têm muitas características semelhantes às CTMs. Os NCL foram isolados pela primeira vez por Polisetty et al.2 e nomeados pela primeira vez por Xie et al.3. De acordo com estudos recentes, os RNCT são mais células-tronco fundamentais do que as CTMs e podem facilmente se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos 4,29. Em comparação com as BMMSCs comumente usadas, as LNCs apresentam maiores características de células-tronco (maior expressão de CD73, CD105, PDGFR, SCF, etc.) (Gráfico 5) 30. Os NCL podem tratar com sucesso coelhos com CESD causada por queimaduras alcalinas da córnea, promovendo o reparo do epitélio e estroma corneano15. A expressão reduzida de fibronectina (FN), fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) e proteína ácida e cisteína secretada (SPARC) em fibroblastos corneanos sugere que a secreção de NCL melhora a cicatrização de feridas e reduz a fibrose7.
Em um microambiente 3D, o interessante é que os LNCs podem se reunir com MCECs, estimulando estas últimas células a restaurar as propriedades das células-tronco9. Os LNCs efetivamente aceleram o crescimento da SCE31 e previnem cicatrizes corneanas10. No entanto, a quantidade de LNCs é limitada; Estudos indicam que representa apenas aproximadamente 3% do número total de células do estroma límbico na córneabovina32, com expressão significativa de sulfato de querata, queratocano e ALDH3A133. Podem ser inferiores a 1% nas córneas humanas33.
Nesse protocolo, métodos prévios de isolamento, purificação e identificação de NCEN foram repetidos 3,14,34. Após 18 h de tratamento do tecido do limbo humano com colagenase A (2 mg/mL), os NCL foram isolados. O CNL P0 desenvolveu-se lentamente e exibiu várias morfologias celulares, incluindo NCLs fusiformes, outros poligonais e MCEC esférico visível (Figura 2, P0). Estudos prévios mostraram que os NCL são células fusiformes que se fixam ao fundo da superfície de cultura com morfologia homogênea14. Ao mesmo tempo, os MCECs são em torno de29, o que é consistente com a morfologia das células cultivadas neste protocolo. Além disso, P0 LNCs cresceu lentamente para as células crescendo completamente aproximadamente 70%-80% da densidade celular em aproximadamente 12 dias. O P1-P12 LNC proliferou substancialmente mais rápido e, em 3-6 dias, cobriu praticamente toda a placa de cultura. Após P1, as células anexiais de CNLs fusiformes superaram significativamente o número de células redondas MCEC e poligonais.
Percebe-se, pelos valores das DCNT da Tabela 2 e Figura 3, que as NCN P0 apresentaram as menores DCNT (0,810) e que a passagem celular ocorreu em 12 dias. No entanto, após o P1, o crescimento dos LNCs acelerou dramaticamente, e a taxa de crescimento atingiu o pico de 3,44 no P4. Após o P6, a taxa de crescimento dos NCN foi substancialmente reduzida (Figura 3). A taxa de crescimento e a atividade do PNC do P4 foram substancialmente as mais altas em termos do padrão de crescimento do NCN, consistente com achados anteriores indicando que a atividade de crescimento do PNC P4-P6 é a melhor9. No entanto, este método tem certas limitações, o número de NCL P0 varia muito de acordo com a idade do doador e o momento do óbito. Portanto, quando o tecido doador é mais jovem e fresco, mais P0 LNC pode ser isolado. O fator mais importante na mimetização do microambiente da SCE in vitro é a necessidade de fatores universais de nicho, como uma matriz extracelular rica em laminamina35.
Em conclusão, os LNCs desempenham um papel crucial no suporte de células-tronco epiteliais da córnea e na manutenção da tronco da CES, incluindo a auto-renovação e diferenciação em células epiteliais maduras da córnea. Pode-se esperar que o LNC seja uma ferramenta celular inovadora para o tratamento de pacientes com CESD 9,15.
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Disclosures
Nenhum dos autores tem qualquer divulgação financeira relevante.
Acknowledgments
Obrigado a Wei Wang, Lingjuan Xu e Rong Liu pela orientação sobre este trabalho, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You e Li Guigang por fornecerem parte do material, Guanyu Su por escrever o manuscrito, Xiao Zhou, Yihong Xiong e Huatao Xie por corrigirem o manuscrito e Guigang Li por sua orientação completa. Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 82070936, 81470606, 81570819), projeto de pesquisa científica de saúde e planejamento familiar da província de Hubei (No. WJ2017M073), Top Ten Projetos de Pesquisa Médica Translacional do Hospital Tongji (No.2016ZHYX20), Projeto de Treinamento de Jovens Pioneiros Médicos na Cidade de Wuhan (No.2015whzqnyxggrc10), Programa Global de Recrutamento de Talentos (G2022154028L), Projeto da Comissão Nacional de Saúde da Província de Hubei em 2022(WJ2021ZH0005) e Fundação de Construção de Assunto do Departamento de Finanças de Hubei em 2022(42000022815T000000102)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | - |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | - |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | - |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | - |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | - |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | - |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | - |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | - |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
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