Summary
Здесь мы представляем протокол для выделения и идентификации клеток лимбальной ниши человека.
Abstract
Здесь мы сообщаем о стандартной процедуре выделения и идентификации клеток лимбальной ниши (LNCs). Ткань лимбуса, полученная из глазного банка, использовалась для выделения LNCs. Ткань делили на 12 частей в асептических условиях и переваривали в течение 18 ч при 37 °С в инкубаторе клеточных культур с использованием коллагеназы А для получения клеточных кластеров с LNC и клетками-предшественниками лимбального эпителия. Клеточные кластеры дополнительно расщепляли в течение 15 мин при 37 °C с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА для получения единичных клеток, а затем культивировали в модифицированной среде эмбриональных стволовых клеток (MESCM) на пластиковой поверхности, покрытой 5% Матригелем. Клетки пассажировали при слиянии 70%, а LNC идентифицировали с помощью иммунофлуоресценции, количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР) и проточной цитометрии. Первичные ЛНК были изолированы и пассированы более 12 раз. Пролиферационная активность ЛНК от Р4 до Р6 была самой высокой. LNC экспрессировали более высокие маркеры стволовых клеток, чем BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR и PDGFRβ). Кроме того, результаты показали, что P4 LNC равномерно экспрессируют VIM, CD90, CD105 и PDGFRβ, но не Pan-CK, который может быть использован в качестве маркера для идентификации LNC. Проточный цитометрический анализ показал, что примерно 95%, 97%, 92% и 11% LNC экспрессировали CD73, CD90, CD105 и SCF соответственно, в то время как в BMMSC они составляли 68%, 99%, 20% и 3%. Стандартный процесс выделения и идентификации LNC может обеспечить надежную лабораторную основу для широкого использования LNC.
Introduction
Заболеваемость дефицитом эпителиальных стволовых клеток роговицы (CESD), также называемая дефицитом лимбальных стволовых клеток (LSCD)1, и регенерация эпителия роговицы (CES) становятся все более и более актуальными из-за инфекции и травмы роговицы. При отсутствии надлежащего лечения CESD может привести к слепоте, которая требует пересадки роговицы. В результате, регенерация CES становится все более значимой. Существует группа поддерживающих клеток, называемых клетками лимбальной ниши (LNC), которые обеспечивают необходимую поддержку функции CES. Лимбальные стромальные стволовые клетки были впервые выделены Polisetty et al.2 и идентифицированы Xie et al.3 как LNC, которые локализуются в лимбальном эпителии и строме лимба. LNC являются ключевыми поддерживающими стволовыми клетками края роговицы и, выполняя функцию МСК костного мозга (BMMSC), могут развиваться в эпителиальные клетки роговицы и стромальные клетки роговицы и т. д.3,4,5,6,7. Предыдущие исследования показали, что свойства стволовых клеток LNC более примитивны, чем BMMSC8, которые уже широко используются в клинике. ЛНК могут даже стать следующим жизнеспособным вариантом после МСК, особенно для лечения КЭСР. Являясь важными опорными клетками для CES, LNC также являются стволовыми клетками, полученными из «нишевой» структуры лимба. LNC могут играть ключевую роль в дедифференцировке зрелых эпителиальных клеток роговицы (MCEC) до CES9. Тем не менее, исследования ЛНК все еще относительно недостаточны, и нет единого мнения о терминологии, изоляции, очистке, идентификации и характеристиках ЛНК. Некоторые исследователи называют LNC стромальными стволовыми клетками, полученными в результате лимбальной биопсии 10, лимбальными мезенхимальными стволовыми клетками 11, лимбальными стволовыми клетками фибробластов12 и лимбальными мезенхимальными стромальными клетками13. Поскольку характеристики роста LNC не были подробно описаны, а также из-за их многообещающего научного и клинического применения, и они могут стать одним из наиболее важных клинических инструментов в будущем, необходимо обобщить выделение, очистку, идентификацию и характеристики LNC.
Согласно предыдущему исследованию14, ЛНК в основном присутствуют в лимбальном эпителии и строме лимба. Этот протокол включает в себя обработку тканей лимба с помощью коллагеназы А, получение кластера, состоящего из LEPC и LNCs, и расщепление его на отдельные клетки с 0,25% трипсин-ЭДТА (ТЭ). Затем LNC селективно культивировали в модифицированной среде эмбриональных стволовых клеток (MESCM) для очистки. Протокол, описанный в этой статье, прост и обладает высокой эффективностью в получении человеческих LNC в больших количествах.
Подробная процедура выделения, культивирования и идентификации LNC была записана в видео для ученых, заинтересованных в изучении LNC, и при необходимости ее можно удобно повторить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ткань лимбуса от доноров в возрасте от 50 до 60 лет была получена из Глазного банка Красного Креста, больница Тунцзи (Ухань, Китай). Протокол был одобрен Комитетом по этике Тунцзи и проводился в соответствии с Хельсинкской декларацией.
1. Изоляция
- Получение ткани лимба из среды хранения роговицы среднего срока и работа в асептических условиях на сверхчистом рабочем столе.
- Соскребите и удалите радужную оболочку и эндотелий вокруг роговицы с помощью стерильного хирургического круглого лезвия.
- Хирургическим лезвием разрезать ткань лимба на двенадцать одинаковых по размеру кусков с оставлением по 1 мм с обеих сторон роговицы и склеры.
- Переложите ткани лимба на культуральную планшет диаметром 3,5 см, добавьте 1 мл коллагеназы А (2 мг/мл, в среду DF-12), чтобы погрузить все ткани для пищеварения.
- Поместите планшет в клеточный инкубатор с температурой 37 °C, переваривайте лимбальные ткани в течение 18 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие процедуры обычно проводятся на второй день. - Подготовьте 6-луночный культуральный планшет с покрытием из 5%-ной базальной мембранной матрицы (Matrigel).
- Покрыть 5%-ной мембранной матрицей основания (растворенной в MESCM [табл. 1]) на дне скважины.
- Подготовьте наконечники объемом 200 мкл и 1 мл, одну центробежную пробирку объемом 15 мл и одну 6-луночную чашку в стерилизованном пакете.
- Поместите стерилизованный пакет (включая наконечники и центробежную трубку) и новую 6-луночную пластину в среду -20 °C или -80 °C на 20 минут. Разморозьте матрицу мембраны основания в холодильнике при температуре 4 °C.
- Выньте предварительно охлажденные наконечники, центробежную трубку и 6-луночную пластину из среды -20 °C или -80 °C, а затем выполните следующие операции на сверхчистом верстаке.
- Перенесите 50 мкл 5% матрицы базальной мембраны в 1 мл MESCM с помощью наконечника на 200 мкл и осторожно и равномерно перемешайте.
- Перенесите 5%-ную матрицу базальной мембраны (растворенную в MESCM) в одну лунку 6-луночного культурального планшета, используя предварительно охлажденный наконечник объемом 1 мл.
- Осторожно и горизонтально встряхните 6-луночный планшет, поместите 6-луночный культуральный планшет в клеточный инкубатор при температуре 37 °C примерно на 1 ч, а затем выполните следующий шаг.
- После 18-часового расщепления выньте коллагеназу А-переваренную лимбальную ткань, останутся только видимые мелкие скопления и непереваренные ткани склеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскопия с большим увеличением выявляет кластер, состоящий из множества плотно упакованных клеток (включая LNC). - Используйте наконечник пипетки на 200 мкл, чтобы отделить кластеры от непереваренных тканей склеры под стереомикроскопом.
- Переложите грозди на культуральную планшет диаметром 3,5 см и погрузите их в 0,25% TE, а затем поместите планшет в клеточный инкубатор на 15 мин.
- Добавьте 1 мл MESCM с 10% нокаутной сывороткой, чтобы остановить клеточное пищеварение, и осторожно проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать кластеры в отдельных клетках с помощью наконечника дозатора объемом 1 мл.
- Переложите клеточную суспензию в центробежную пробирку объемом 15 мл и центрифугу при 200 x g в течение 5 мин.
- Удалите надосадочную жидкость осторожно, не нарушая осаждение клеток, а затем добавьте 1 мл MESCM для ресуспендирования клеток.
- Пипетку вверх и вниз 2-3 раза до тех пор, пока осадок нижней клетки не будет равномерно взвешен в MESCM с помощью наконечника дозатора объемом 1 мл, и возьмите 20 мкл клеточной суспензии для подсчета клеток.
- Перенесите клеточную суспензию на 6-луночный планшет, покрытый матрицей 5% базальной мембраны, с наконечником пипетки объемом 1 мл и увеличьте объем MESCM до 2,5 мл.
- Аккуратно встряхните 6-луночную пластину горизонтально, чтобы равномерно распределить ячейки.
- Перенесите клетки в культуральный инкубатор после того, как они будут сфотографированы и записаны. Наблюдайте и фотографируйте клетки ежедневно, а среду меняйте каждые 3-4 дня.
2. Идентификация LNC
- Иммунофлуоресцентное окрашивание
- Расщепляют LNC со дна планшета, используя 1 мл 0,25% TE в течение 5 минут в клеточном инкубаторе при температуре 37°C.
- Прекратите пищеварение, добавив 1 мл MESCM (содержащего нокаутную сыворотку), центрифугируйте клеточную суспензию при 200 x g в течение 5 мин и осторожно аспирируйте надосадочную жидкость.
- Добавьте 1 мл MESCM для ресуспендирования клеток во взвешенном состоянии. Приготовьте суспензию клеток объемом 80 мкл (4 × 103 клеток на предметное стекло) для 4 предметных стекол (20 мкл/предметное стекло) и используйте центрифужную систему для нанесения клеток на предметные стекла микроскопа в соответствии с инструкциями производителя.
- Зафиксируйте клетки (прилипшие к предметным стеклам на шаге 3) с помощью 4% параформальдегида в течение примерно 10 мин, а затем пермеабилизируйте клетки на предметных стеклах 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин.
- Блокируют клетки в течение 1 ч 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) перед инкубацией с первичными антителами (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) на шейкере в течение ночи при 4 °C. После инкубации удаляют несвязанные первичные антитела, промывая (5 мин/промывка, 3 раза) предметные стекла PBST (PBS + 0,1% Tween 20).
- Инкубируют соответствующие вторичные антитела (вторичные антитела IgG к ослам у мышей TRITC [1:1000], антикроличьи IgG FITC [1:500], ослиные антимышиные IgG 488 [1:300], ослиные антикроличьи IgG 594 [1:400]) в течение 1 ч с подходящими неспецифическими антителами IgG IgG. Удалите несвязанное вторичное антитело с помощью PBST (5 мин/промывка, 3 раза).
- Окрасьте ядра 5 мкг/мл DAPI (4',6-Диамидино-2-Фенилиндол) и запечатайте предметные стекла.
- Выполните флуоресцентную визуализацию с помощью флуоресцентного микроскопа (увеличение: 400x; Время экспозиции: 50 мс).
- Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (кПЦР)
- Возьмите набор для выделения РНК, чтобы извлечь общую РНК в соответствии с инструкциями производителя.
- Используйте набор для транскрипции кДНК большой емкости для обратной транскрибации 1-2 мкг общей РНК в кДНК.
- Проводят обратную транскрипцию (42 °C, 2 мин; 50 °C, 85 мин) и кПЦР (95 °C, 5 мин; 95 °C, 10 с, 40 циклов) в 20-мкловом растворе, содержащем кДНК (100 нг), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 мкл), универсальную ПЦР Master Mix (10 мкл) и ddH2O (до 20 мкл).
- Используйте метод сравнительной КТ (ΔΔCT)4,9 для изучения относительной экспрессии генов.
3. Характеристика LNC
- Подсчет клеток (гемоцитометр)
- Расщепляют LNC со дна чашки, используя 0,25% TE, в течение 5 минут в клеточном инкубаторе при температуре 37 °C.
- Прекратите пищеварение, добавив 1 мл MESCM (содержащего нокаутную сыворотку), центрифугируйте клеточную суспензию при 200 x g в течение 5 мин и осторожно аспирируйте надосадочную жидкость.
- Добавьте 1 мл MESCM для ресуспендирования клеток, затем возьмите 10 мкл клеточной суспензии в центрифужную пробирку объемом 0,5 мл. Добавьте равный объем 0,4% раствора окрашивания трипанового синего.
- Поместите 10 мкл окрашенной клеточной суспензии на счетную зону гемоцитометра и накройте ее покровным стеклом для подсчета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек в пяти средних квадратных областях определяется как «А»; количество клеток в 1 мл рассчитывается как 5А × 104 × 2.
- Исследование маркеров LNC и BMMSC методом проточной цитометрии15
- Определение экспрессии SCF, CD73, CD90 и CD105 в LNC и BMMSC с помощью проточной цитометрии 15 (2-4 ×10 6 событий на образец, из каждого образца было получено 2 000 клеток, всего 550 000 клеток, которые были построены одновременно).
- Собирают и окрашивают клетки при температуре 20-30 °C в течение 15 мин в блокирующем буфере (3% BSA и 0,05% Tween-20 в PBS) с использованием предварительно меченных антител (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] и CD105 [1:50]) в соответствии с инструкцией к набору.
- Выполните анализ флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) с помощью проточного цитометра. В данном исследовании использовалось программное обеспечение FACS Diva и программное обеспечение FlowJo. Для каждого образца запишите 10 000 событий, а также создайте и проанализируйте живые клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рост LNC
ЛНК были успешно выделены по методу расщепления коллагеназы А (2 мг/мл) ткани корнеосклерального ободка, описанному выше (рис. 1). В соответствии с ранее опубликованным исследованием3, после расщепления коллагеназы А под микроскопом визуализировали гусеничные кластеры (рис. 2). Доля веретенообразных клеток постепенно увеличивалась по мере пассажа клеток. Веретенообразные клетки могут расти на покрытых 5% пластинах матрицы базальной мембраны, в отличие от их аналогов, культивируемых на пластике без матрицы базальной мембраны3 с покрытием. Клетки от Р1 до Р12 демонстрировали равномерную скорость пролиферации, при этом время удвоения клеток составляло от 2 до 7 дней (табл. 2). В этом исследовании LNC культивировали до 13 пассажей и 34 удвоений (рис. 3)3. LNC культивировали из первичных клеток (LNC P0); LNC P0 рос медленно и занял около 12 дней. LNC потребовалось всего около 3 дней, чтобы пройти в P1-P8, а скорость роста LNC после P9 значительно снизилась (табл. 2). С точки зрения морфологии клеток, LNC были веретенообразными, а в P0 круглыми. После P3 LNC были веретенообразными с тем же морфологическим размером (рис. 2). Степень общего расширения измерялась как число популяций, удваивающихся от P0 до P13 по следующей формуле: число удвоения клеток (NCD) = log10 (y/x) / log102, где y — конечная плотность клеток, а x — начальная плотность посева клеток3. НИЗ представляет собой темп роста ННК (рисунок 3А). Судя по кривым НИЗ и кумулятивно-НИЗ (рис. 3B), ННК потребовалось наименьшее время для экспоненциального роста, и они росли быстрее всего по сравнению с кривыми P3-P5 (рис. 3). После Р5 скорость роста клеток значительно снизилась, НИЗ вернулся к 1,32 в Р13, и рост почти прекратился.
Идентификация LNC
После изоляции и культуры LNC еще одной важной задачей стала идентификация. LNCs, экспрессируемые для Vim, CD90, CD105, SCF и PDGFRβ, но не для Pan-CK, согласно текущим соответствующим исследованиям LNC (рис. 4)9. Двойное иммуноокрашивание LNC P4 показало, что эти клетки были последовательно Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+ (рис. 4). кПЦР также выявила снижение экспрессии Pan-CK в P2 и увеличение транскриптов Vim, CD90, CD105, SCF и PDGFR в P3. Уровни транскрипции Vim, CD90, CD105, SCF и PDGFR резко возросли в P4 по сравнению с P1 (p < 0,01) (рис. 4)9.
Характеристики LNC
Дальнейший анализ показал, что LNC экспрессируют больше маркеров эмбриональных стволовых клеток (ESC) (Nestin, Rex1 и SSEA4), маркеров мезенхимальных стволовых клеток (MSC) (CD73, CD90 и CD105) и маркеров нишевых клеток (NC) (MSX1, P75NTR и PDGFRβ) (рис. 5)15. Проточная цитометрия показала, что характеристики поверхностного антигена МСК, включая CD73, CD90 и CD105, экспрессируются как в LNC, так и вBMMSC15. Процентное соотношение ДНК, экспрессирующих CD73, CD90, CD105 и SCF, составляло примерно 95%, 97%, 92% и 11% соответственно, в то время как БКМСК составляло 68%, 99%, 20% и 3% соответственно. Это показывает, что LNC экспрессируют значительно более высокие уровни МСК-положительных маркеров CD73, CD105 и цитокина SCF (p < 0,01) и аналогичный уровень CD90 (p > 0,05) по сравнению с BMMSC (рис. 6)15.
Рисунок 1: Процесс выделения ЛНК. (А) Ткань корнеосклерального ободка. (B) Кластеры после расщепления коллагеназы А при 37 °C в течение 18 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: ЖНК от P0 до P13, культивируемые на 5%-ной матрице базальной мембраны, покрытой 6-луночным планшетом в MESCM. (Бар = 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характер роста LNC от P0 до P13. (A) НИЗ LNC от P0-P13; (B) Кумулятивные НИЗ ЛНК от P0 до P13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Иммунофлуоресценция и кПЦР. Иммунофлуоресценция и кПЦР показали, что LNC равномерно экспрессируют Vim, CD90, CD105, SCF и PDGFRβ, но не Pan-CK. Этот рисунок воспроизведен с разрешения Zhu et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: LNC экспрессируют больше маркеров ESC, MSC и NC, чем BMMSC. P4 LNC и P4 BMMSCs подвергали кПЦР для транскрипционной экспрессии маркеров ESC (A), MSC и маркеров нервного гребня (B) (n = 3, *P < 0,05, #P < 0,05 и **p < 0,01 соответственно). Иммуноокрашивание маркеров ESC (C) и маркеров MSC, NC (D) ядерным контрокрашиванием по Hoechst 33342. Масштабные линейки = 25 мкм. Эта цифра воспроизведена с разрешения Li et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Флуоресцентно-активированная сортировка клеток P4 LNC и BMMSC (A-F). Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) для маркеров МСК, включая CD73, CD90 и CD105 (n=3). Эта цифра воспроизведена с разрешения Li et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Реагент | Концентрация исходного раствора | Том | Конечная концентрация | Среда хранения |
| ДМЭ/Ф-12 1:1(1×) | Базовый средний | 180 мл | 90% | 4 °С |
| НокаутTMSR | - | 20 мл | 10% | -20 °С |
| Сывороточная замена ЭСК/ИПСК | ||||
| Рекомендуемый ингибиторный фактор лейкемии человека (Lif) | 50 мкг/мл | 40 мкл | 10 нг/мл | -80 °С |
| Рекомбинантный человеческий FGF-basic | 100 мкг/мл | 8 мкл | 4 нг/мл | -80 °С |
| ИТС (инсулин, трансферрин, селенит натрия) | Инсулин 500 мкг/мл | 2 мл | 5 мкг/мл инсулина | -20 °С |
| 500 мкг/мл трансферрин | 5 мкг/мл трансферрина | |||
| 500 нг/мл селенита натрия | 5 нг/мл селенита натрия | |||
| Гентамицин | 25 мкг/мл | 2 мл | 50 мкг/мл | 4 °С |
| Амфотерицин В | 2500 мкг/мл | 100 мкл | 1,25 мкг/мл | 4 °С |
Таблица 1: Рецептура MESCM.
| Проход | Плотность высева семян (× 105 клеток/см2) | Конечная плотность (× 105клеток/см2) | Время культивирования (дней) | Число удвоений клеток (NCD) | Кумулятивные НИЗ |
| П0 | 0.22 | 0.385714 | 12 | 0.810029 | 0.810029 |
| П1 | 0.08 | 0.365714 | 4 | 2.192645 | 3.002674 |
| П2 | 0.051429 | 0.357143 | 3 | 2.795859 | 5.798533 |
| П3 | 0.037143 | 0.337143 | 2 | 3.182203 | 8.980737 |
| П4 | 0.028571 | 0.311429 | 6 | 3.446256 | 12.42699 |
| П5 | 0.04 | 0.385714 | 3 | 3.269461 | 15.69645 |
| П6 | 0.054286 | 0.48 | 4 | 3.14439 | 18.84084 |
| П7 | 0.057143 | 0.351429 | 3 | 2.620586 | 21.46143 |
| П8 | 0.08 | 0.394286 | 3 | 2.30117 | 23.7626 |
| П9 | 0.06 | 0.345714 | 6 | 2.526546 | 26.28915 |
| П10 | 0.022857 | 0.122857 | 7 | 2.426265 | 28.71541 |
| П11 | 0.025714 | 0.122857 | 5 | 2.25634 | 30.97175 |
| П12 | 0.028571 | 0.114286 | 5 | 2 | 32.97175 |
| П13 | 0.045714 | 0.114286 | 10 | 1.321928 | 34.29368 |
Таблица 2: Серийные проходы ЛНК на пластике.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Прозрачность роговицы обычно поддерживается за счет регулярного расположения и распределения мелких волокон (25-30 нм в диаметре) в строме роговицы, что имеет решающее значение для нормальной остроты зрения16. В мире насчитывается 253 миллиона людей с нарушениями зрения, 36 миллионов из которых слепые. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) считает слепоту роговицы одной из самых серьезных опасностей для зрения человека, на которую приходится 5,1% всех случаев слепоты во всеммире16. Дефект эпителия роговицы при нормальном КЭС может быстро заживать, не оставляя рубца18. По оценкам, более 12,7 миллиона пациентов во всем мире нуждаются в пересадке роговицы из-за умеренной и тяжелой потери зрения19; 30% неудачных попыток трансплантации роговицы были вызваны CESD20. Однако из-за нехватки доноров роговицы в большинстве стран мира только один из семидесяти слепых пациентов смог в конечном итоге получитьтрансплантацию роговицы. В настоящее время трансплантация эпителиальных стволовых клеток роговицы (CEST) может быть использована для лечения CESD22. Пациенты с монокулярной КЭСД могут получить КЭВ из здоровых глаз при КЕСТ. Однако для лечения пациентов с двусторонним КЭСД может быть получен только аллогенный КЭС. Иммунное отторжение остается основной причиной неудачи аллогенной CEST. Многообещающим методом сокращения терапевтического лечения КЭСД является поиск клетки, которая может эффективно заменить аутогенную КЭС или стимулировать дифференцировку других аутогенных клеток из других мест для превращения в КЭС. Также набирает популярность дифференцировка in vitro аутологичных клеток в CES, включая BMMSC 23, эпителиальные клетки слизистой оболочки полости рта (OMEC)24, стволовые клетки пульпы зуба (DPSC)19, индуцированные фибробластами человека плюрипотентные стволовые клетки (iPSC)25 и жировые стволовые клетки (ASC)26. Rohaina et al.23обнаружили, что BMMSC, культивируемые на амниотических мембранах в течение 10 дней, могут дифференцироваться в эпителиальные клетки роговицы и что экспрессия CK3 и p63 значительно увеличивается после индукции дифференцировки. В 2020 г. O'Callaghan et al.24индуцировали дифференцировку эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта в эпителиальные клетки роговицы с помощью новой системы культивирования и успешно использовали ее для лечения КЭСД с использованием 3D-структуры ткани (RAFT) в качестве носителя для культуры эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта с фибробластами слизистой оболочки полости рта человека в качестве трофобластов. Кроме того, DPSC успешно дифференцируется в стромальные и эпителиальные клетки роговицы. Повышая экспрессию K3, K12 и CD90, DPSC может предотвратить инвазию конъюнктивы роговицы. В другом исследовании DPSC использовался в качестве листов амниотических клеток, прикрепленных к поверхности роговицы в модели CESD кролика. Результаты показали, что в группе DPSC роговица была чище, а ангиогенез был меньше, чем в контрольной группе27. Hayashi et al.28добились дифференцировки с помощью ИПСК, полученной из фибробластов, которая может быть индуцирована в эпителиальных клетках роговицы PAX6(+) и K12(+) через 12 недель. ИПСК эффективно развивается в эпителиальные клетки роговицы, активирует K12 и подавляет NANOG25. Zeppieri et al.26 обнаружили, что ASC могут дифференцироваться в эпителиальные клетки роговицы для лечения CESD мышей и улучшения заживления эпителиальных ран роговицы в лазерно-индуцированной животной модели.
LNC локализуются в лимбальной нише, где CES защищены и поддерживаются, и имеют много характеристик, схожих с MSC. LNC были впервые выделены Polisetty et al.2 и впервые названы Xie et al.3. Согласно недавним исследованиям, LNC являются более фундаментальными стволовыми клетками, чем МСК, и могут легко дифференцироваться в адипоциты, хондроциты и остеоциты 4,29. По сравнению с широко используемыми BMMSC, LNC обладают более высокими характеристиками стволовых клеток (более высокая экспрессия CD73, CD105, PDGFR, SCF и т.д.). (Рисунок 5) 30. LNC могут успешно лечить кроликов с CESD, вызванным ожогами роговицы щелочью, способствуя восстановлению эпителия роговицы и стромы15. Снижение экспрессии фибронектина (FN), фактора роста соединительной ткани (CTGF) и секретируемого белка, богатого кислотой и цистеином (SPARC) в фибробластах роговицы позволяет предположить, что секреция LNCs ускоряет заживление ран и уменьшает фиброз7.
Интересно, что в 3D-микросреде LNC могут воссоединяться с MCEC, стимулируя последние клетки к восстановлению свойств стволовых клеток9. LNC эффективно ускоряют рост CES31 и предотвращают рубцевание роговицы10. Однако количество LNC ограничено; Исследования показали, что он составляет всего около 3% от общего числа лимбальных стромальных клеток в роговице крупного рогатого скота32, со значительной экспрессией кератансульфата, кератокана и ALDH3A133. Они могут составлять менее 1% в роговице человека33.
В этом протоколе были повторены предыдущие методы выделения, очистки и идентификации LNC 3,14,34. Через 18 ч обработки тканей лимба человека коллагеназой А (2 мг/мл) ЛНК выделяли. P0 LNC развивался медленно и демонстрировал различные морфологии клеток, включая веретенообразные LNC, полигональные и видимые сферические MCEC (рис. 2, P0). Предыдущие исследования показали, что LNC представляют собой веретенообразные клетки, которые прикрепляются к нижней части поверхности культуры с однородной морфологией14. При этом MCEC имеют29-й круг, что согласуется с морфологией клеток, культивируемых в этом протоколе. Кроме того, P0 LNC медленно росли, и клетки достигали примерно 70%-80% клеточной плотности примерно за 12 дней. P1-P12 LNC размножался значительно быстрее и за 3-6 дней практически покрывал всю культуральную пластину. После P1 веретенообразные ячейки придатков LNC значительно превзошли по численности круглые MCEC и полигональные ячейки.
Из значений НИЗ, приведенных в таблице 2 и на рисунке 3 , видно, что НЦ P0 имели самый низкий уровень НИЗ (0,810) и что пассаж клеток происходил в течение 12 дней. Однако после P1 рост LNC резко ускорился, и темп роста достиг пика в 3,44 в P4. После Р6 темпы роста ЛНК существенно снизились (рис. 3). Темпы роста LNC и активность P4 были существенно самыми высокими с точки зрения модели роста LNC, что согласуется с более ранними данными, указывающими на то, что активность роста LNC P4-P6 является наилучшей9. Однако этот метод имеет определенные ограничения, количество LNC P0 сильно варьируется в зависимости от возраста донора и времени смерти. Поэтому, когда донорская ткань моложе и свежее, можно выделить больше P0 LNC. Наиболее важным фактором в имитации микроокружения CES in vitro является потребность в универсальных нишевых факторах, таких как богатый ламинамином внеклеточный матрикс35.
В заключение, LNC играют решающую роль в поддержке эпителиальных стволовых клеток роговицы и поддержании стволовой способности CES, включая самообновление и дифференцировку в зрелые эпителиальные клетки роговицы. Можно ожидать, что LNC станет инновационным клеточным инструментом для лечения пациентов с CESD 9,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один из авторов не раскрывает соответствующую финансовую информацию.
Acknowledgments
Благодарим Вэй Вана, Линцзюань Сюя и Жун Лю за руководство этой работой, Юнъяо Тана, Бихуэй Цзиня, Чуньсю Ю и Ли Гуйгана за предоставление некоторых материалов, Гуаньюй Су за написание рукописи, Сяо Чжоу, Ихун Сюна и Хуатао Се за исправление рукописи, а также Гуйгана Ли за его полное руководство. Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (No 82070936, 81470606, 81570819), научно-исследовательским проектом по здравоохранению и планированию семьи провинции Хубэй (No . WJ2017M073), Десять лучших трансляционных медицинских исследовательских проектов больницы Тунцзи (No 2016ZHYX20), Проект по обучению молодых пионеров медицины в городе Ухань (No 2015whzqnyxggrc10), Глобальная программа набора талантов (G2022154028L), проект Национальной комиссии по здравоохранению провинции Хубэй в 2022 году (WJ2021ZH0005) и Фонд предметного строительства финансового департамента провинции Хубэй в 2022 году(42000022815T000000102)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | - |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | - |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | - |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | - |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | - |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | - |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | - |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | - |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
References
- Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
- Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
- Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
- Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
- Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
- Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
- Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16 (2020).
- Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1 (2022).
- Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172 (2014).
- Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
- Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
- Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471 (2022).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
- Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566 (2018).
- Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Pineda, R. World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , Springer, Cham. 299-305 (2020).
- Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441 (2022).
- Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562 (2022).
- Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
- Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
- O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265 (2020).
- Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
- Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115 (2017).
- Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
- Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
- Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
- Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
- González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
- Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
- Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).
