ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
يعد التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي أحد أكثر نماذج الفئران استخداما على نطاق واسع لمرض التصلب المتعدد. في البروتوكول الحالي ، يتم تحصين الفئران C57BL / 6J من كلا الجنسين بببتيد البروتين السكري قليل التغصن المايلين ، مما يؤدي بشكل رئيسي إلى شلل جزئي تصاعدي في الذيل والأطراف. نناقش هنا بروتوكول التعريف والتقييم EAE.
Abstract
التصلب المتعدد (MS) هو مرض التهابي مناعي ذاتي مزمن يؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS). يتميز بانتشار مختلف بين الجنسين ، مما يؤثر على النساء أكثر من الرجال ، ونتائج مختلفة ، تظهر أشكالا أكثر عدوانية لدى الرجال منها لدى النساء. علاوة على ذلك ، فإن مرض التصلب العصبي المتعدد غير متجانس للغاية من حيث الجوانب السريرية والسمات الإشعاعية والمرضية. وبالتالي ، من الضروري الاستفادة من النماذج الحيوانية التجريبية التي تسمح بالتحقيق في أكبر عدد ممكن من جوانب علم الأمراض. يمثل التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) أحد أكثر نماذج مرض التصلب العصبي المتعدد استخداما في الفئران ، حيث يقوم بنمذجة ميزات المرض المختلفة ، من تنشيط الجهاز المناعي إلى تلف الجهاز العصبي المركزي. هنا نصف بروتوكولا لتحريض EAE في كل من الفئران C57BL / 6J من الذكور والإناث باستخدام تحصين البروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 (MOG35-55) ، مما يؤدي إلى تطور شكل مزمن من المرض. نبلغ أيضا عن تقييم النتيجة السريرية اليومية والأداء الحركي لهذه الفئران لمدة 28 يوما بعد التحصين (28 نقطة في البوصة). أخيرا ، نوضح بعض التحليلات النسيجية الأساسية على مستوى الجهاز العصبي المركزي ، مع التركيز على الحبل الشوكي باعتباره الموقع الرئيسي للتلف الناجم عن المرض.
Introduction
التصلب المتعدد (MS) هو مرض التهابي مناعي ذاتي مزمن يؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS). يظهر وجود تسلل حول الأوعية الدموية للخلايا الالتهابية ، وإزالة الميالين ، وفقدان المحور العصبي ، والتسمم1. لا تزال مسبباته غير معروفة ، وتشير جوانبه السريرية والتصوير الشعاعي والسمات المرضية إلى عدم تجانس ملحوظ في المرض2.
نظرا لمسببات وتعقيده غير المعروفين ، في الوقت الحاضر ، لا يوجد نموذج حيواني يلخص جميع السمات السريرية والإشعاعية المعروضة في MS 3,4 البشري. ومع ذلك ، يتم استخدام نماذج حيوانية مختلفة لدراسة جوانب مختلفة من MS 3,4. في هذه النماذج ، عادة ما يكون بدء المرض مصطنعا للغاية ، ويختلف الإطار الزمني لظهور العلامات السريرية بين البشر والفئران. على سبيل المثال ، في البشر ، لا يتم اكتشاف العمليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة وراء المرض لسنوات قبل ظهور المظاهر السريرية. على العكس من ذلك ، يمكن للمجربين اكتشاف الأعراض في النماذج الحيوانية في غضون أسابيع أو حتى أيام بعد تحريض مرض التصلب العصبي المتعدد4.
تنتج ثلاثة نماذج حيوانية أساسية سمات إزالة الميالين التي تميز مرض التصلب العصبي المتعدد: تلك التي يسببها الفيروس (على سبيل المثال، فيروس التهاب الدماغ والنخاع الفأر في ثيلر)، وتلك التي تسببها العوامل السامة (على سبيل المثال، كوبريزون، ليسوليسيثين)، والمتغيرات المختلفة لالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE)5. يساعد كل نموذج في دراسة بعض الجوانب المحددة للمرض ولكن لا شيء يكرر جميع ميزات MS6. وبالتالي ، من الأهمية بمكان اختيار النموذج الصحيح مع مراعاة الاحتياجات التجريبية المحددة والأسئلة العلمية التي يجب معالجتها.
بفضل إجراءات التحصين ضد المستضدات المشتقة من المايلين ، يتم تحفيز EAE عن طريق تحفيز استجابة المناعة الذاتية لمكونات الجهاز العصبي المركزي في الفئران الحساسة. يؤدي التفاعل بين مجموعة واسعة من الآليات المناعية المرضية والعصبية المرضية إلى تطور السمات المرضية الرئيسية لمرض التصلب العصبي المتعدد (أي الالتهاب وإزالة الميالين وفقدان المحور العصبي والتسمم بالدم) في الفئران المحصنة 7,8. تبدأ الفئران في إظهار الأعراض السريرية في الأسبوع الثاني تقريبا بعد التحصين وتظهر عموما شللا تصاعديا من الذيل إلى الطرف والطرف الأمامي. يتم تقييم النتيجة السريرية (أي القياس الكمي لتراكم العجز المرتبط بالمرض) بشكل عام باستخدام مقياس مكون من 5 نقاط7.
يمكن استخدام التحصين النشط بالبروتين أو الببتيد أو النقل السلبي للخلايا التائية الدماغية المنشأ للحث على EAE في الفئران ذات الخلفيات الوراثية المختلفة (على سبيل المثال ، SJL / J ، C57BL / 6 ، والفئران غير المصابة بالسمنة والسكري (NOD). بروتين المايلين البروتيني (PLP) وبروتين الميالين الأساسي (MBP) والبروتين السكري قليل التغصن المياليني (MOG) هي أمثلة على بروتينات الجهاز العصبي المركزي الذاتي التي تنتج منها عادة مولدات المناعة. على وجه الخصوص ، تقوم الفئران SJL / J المحصنة بالخاتمة المناعية ل PLP (PLP139−151) بتطوير مسار مرض الانتكاس والتحويل (RR) ، بينما تظهر الفئران C57BL / 6J المحصنة بالببتيد MOG35-55 المناعي EAE ذو الطبيعةالمزمنة 1. على الرغم من بعض القيود ، مثل توفير القليل جدا من المعلومات حول تطور مرض التصلب العصبي المتعدد ، أو دور الخلايا البائية في المرض ، أو الآليات من الداخل إلى الخارج ، أو الصعوبات في دراسة إعادة الميالين ، فقد ساهمت نماذج EAE بشكل كبير في فهم عمليات المناعة الذاتية والالتهابات العصبية ، وزيادة المعرفة في مجال مرض التصلب العصبي المتعدد وبالتالي السماح بتطوير مناهج علاجية جديدة لهذا المرض4 ، 6.
في العمل الحالي ، ركزنا على شكل معين من EAE النشط ، وهو ببتيد البروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 (MOG35-55) - الشكلالناجم عن 9،10،11،12. نماذج EAE المستحثةMOG 35-55 شكل مزمن من مرض التصلب العصبي المتعدد. بعد التحصين ، تخضع الفئران لمرحلة بدون أعراض خلال الأسبوع الأول بعد التحصين ، ثم يظهر المرض عادة خلال الأسبوع الثاني بعد التحصين ، بينما بين الأسبوعين الثالث والرابع بعد التحصين ، يصبح المرض مزمنا ، مع عدم وجود إمكانية للشفاء التام من العجز المتراكم7،8،13. ومن المثير للاهتمام ، أنه لم يتم ملاحظة أي فروق بين الذكور والإناث في الإصابة أو بداية المرض أو مساره أو تقدمه في معظم الدراسات الموجودة في الأدبيات14 ، حتى لو كانت الدراسات أقل تقارن المرض بين الذكور والإناث.
في المقابل ، في البشر ، من المعروف أن هذه المعلمات تكون ثنائية الشكل جنسيابقوة 2. يؤثر مرض التصلب العصبي المتعدد على النساء أكثر من الرجال. ومع ذلك ، فإن الرجال عموما يصابون بشكل أكثر عدوانية من المرض2. وقد اقترح هذا الدليل دورا أساسيا ومعقدا لهرمونات الغدد التناسلية15. ومع ذلك ، فإن دور وآلية عمل الهرمونات الجنسية في علم الأمراض لا يزال غير واضح. علاوة على ذلك ، تدعم البيانات من النماذج الحيوانية فكرة أن كلا من هرمون الاستروجين والأندروجينات يمارسان تأثيرات إيجابية على مساحات مختلفة من علم الأمراض بطريقة خاصة بالجنس16,17.
تشير بعض الدراسات أيضا إلى تأثيرات البروجسترون الواقية للأعصاب والبروميالين والمضادة للالتهابات18 ، وعلى الرغم من ندرة الأدلة في مرضى التصلب العصبيالمتعدد 18 ، فإن الستيرويدات العصبية النشطة (أي المنشطات المركبة من قبل الجهاز العصبي ، مثل بريجنينولوني ، رباعي هيدروبروجستيرون ، وثنائي هيدروبروجستيرون) قد تؤثر أيضا على الدورة المرضية19. بشكل جماعي ، تدعم هذه البيانات فكرة أن الهرمونات الجنسية المنتجة محيطيا وداخل الجهاز العصبي المركزي لها دور مهم وخاص بالجنس في ظهور المرض وتطوره. لذلك ، في العمل الحالي ، نحث على جمع بيانات منفصلة من كل من الذكور والإناث.
من وجهة نظر التشريح المرضي ، تعمل المادة البيضاء للحبل الشوكي كموقع رئيسي لإصابة الجهاز العصبي المركزي في هذا النموذج ، والذي يتميز بمناطق متعددة البؤر ومتقاربة من التسلل الالتهابي أحادي النواة وإزالة الميالين8. وبالتالي ، عند وصف هذا البروتوكول لتحريض EAE الناجم عن MOG35-55 في الفئران C57BL / 6J ، سنأخذ في الاعتبار نتائج المرض في الجنسين ونقدم بعض الأفكار النسيجية المرضية فيما يتعلق بالحبل الشوكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ رعاية والتعامل معها في العمل الحالي وفقا لتوجيه مجلس الاتحاد الأوروبي المؤرخ 22سبتمبر 2010 (2010/63 / UE) ؛ تمت الموافقة على جميع الإجراءات المبلغ عنها في هذه الدراسة من قبل وزارة الصحة الإيطالية (407/2018-PR) ولجنة الأخلاقيات بجامعة تورينو (المشروع رقم 360384). نقترح التوافق مع التصميم التجريبي لإرشادات REACH التي نشرها في الأصل Kilkenny et al. في 201020. قبل البدء ، تأكد من توفر المواد اللازمة (انظر جدول المواد). تعقيم جميع الأواني الزجاجية والأواني المستخدمة لإعداد مستحلب MOG35-55 في الأوتوكلاف. يتم تمثيل ملخص الإجراءات التجريبية في الشكل 1.
1. إعداد مستحلب MOG35-55
ملاحظة: لتحضير المستحلب ، يلزم وجود MOG35-55 ، ومساعد فرويد غير المكتمل (IFA) ، وسلالة المتفطرة السلية H37Ra (MT) ، والمحلول الفسيولوجي (انظر جدول المواد).
تنبيه: يمكن أن يحفز MT المقتول بالحرارة الاستجابة المناعية الفطرية. تجنب الاستنشاق والابتلاع والتلامس مع الجلد والعينين باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة ووزن MT في ميزان دقيق مغطى أسفل الغطاء.
| حل | تكوين | تلاحظ |
| 2 ملغ / مل MOG35-55 محلول الببتيد | الببتيد MOG35-55 المجفف بالتجميد المخفف في محلول فسيولوجي بتركيز 2 مجم / مل | الحفاظ على الحل المخفف بالفعل عند -80 درجة مئوية. |
| محلول PT 5 ميكروغرام / مل | PT المجفف بالتجميد المخفف في محلول فسيولوجي بتركيز 5 ميكروغرام / مل. | الحفاظ على الحل المخفف بالفعل عند -80 درجة مئوية. |
| مستحلب | الحجم الإجمالي للمستحلب اللازم لكل فأر ليتم تحصينه هو 300 ميكرولتر مقسمة على النحو التالي: | لتجنب البدائل أو التلوث ، قم بإعداد المستحلب في يوم التحصين. |
| 200 ميكروغرام / فأر من MOG35-55 ، أي 100 ميكرولتر من محلول MOG35-55 2 مجم / مل. | ||
| 50 ميكرولتر من المحلول الفسيولوجي | ||
| 150 ميكرولتر من IFA | ||
| 4 ملغم/مل طن متري، أي 1.2 ملغم/فأر | ||
| الحل الفسيولوجي | كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ مخفف في الماء المقطر. |
الجدول 1: تكوين الحلول المستخدمة لإجراء التحصين.
- تحضير الحل في دورق زجاجي ، إضافة المكون السائل أولا وأخيرا MT.
ملاحظة: الحجم الإجمالي للمستحلب اللازم لتحصين كل فأر هو 300 ميكرولتر ، مقسوما كما هو موضح في الجدول 1. المستحلب لزج وسميك للغاية ، لذلك أثناء إجراء التحضير والحقن ، قد يكون هناك بعض الخسارة ، خاصة عند تحضير المحلول لعدد قليل من الفئران. نقترح حساب الحجم النهائي للمستحلب المطلوب عن طريق المبالغة في تقدير عدد الفئران المراد تحصينها بما لا يقل عن 1.5-2 ضعف. - ضع الدورق في الثلج واستخدم المحقنة الزجاجية بإبرة 18 جم لبدء استحلاب المحلول.
ملاحظة: يمكن أيضا تحضير المستحلب باستخدام استراتيجيات أخرى ، على سبيل المثال ، عن طريق توصيل المحقنتين الزجاجيتين المجانيتين بالهواء بمحبس ثلاثي الاتجاهات وخلط المحلول عن طريق دفع الغطاسين ذهابا وإيابا21,22. - استحلاب المحلول لمدة 15 دقيقة على الأقل ؛ بشكل عام ، 30 دقيقة من الاستحلاب كافية. للتحقق من جودة المستحلب ، أضف قطرة من المستحلب في وعاء شفاف مملوء بالماء: إذا حافظت القطرة على هيكلها وبقيت سليمة ، فإن المستحلب جاهز.
- ضع المستحلب مباشرة داخل المحاقن سعة 1 مل التي سيتم استخدامها للتحصين وقم بتخزينها في درجة حرارة +4 درجة مئوية حتى الاستخدام للحفاظ على سمك المستحلب وتجنب التعديلات أو التلوث.
2. اختيار والتحصين
- اختيار
- حدد الفئران البالغة C57BL / 6J من كلا الجنسين في عمر 8-10 أسابيع مع وزن الجسم الأمثل ~ 20 جم. تأكد من اختيار الفئران المتطابقة مع العمر والجنس لمجموعات تجريبية مختلفة لأن القابلية للإصابة بالمرض يمكن أن تختلف باختلاف العمر والجنس.
ملاحظة: يجب أن يكون وزن جسم الفئران مشابها في يوم التحصين لأن الإجراء الحالي محسن لنطاق معين من وزن الجسم (17-25 جم). - إيواء من نفس الجنس في مجموعات (ن = 4-5 / قفص) لتجنب العزلة الاجتماعية في الظروف القياسية في أقفاص فأر البولي بروبلين 45 سم × 25 سم × 15 سم عند 22 ± 2 درجة مئوية ، تحت 12:12 دورة الضوء / الظلام (تضاء الأنوار في الساعة 08:00 صباحا). توفير الغذاء والماء حسب الطلب.
ملاحظة: في نهاية المطاف ، للحد من التباين المحتمل لمسار المرض في المحصنة ، نقترح أيضا تشكيل مجموعات تجريبية عديدة بما فيه الكفاية. هناك أيضا دراسات 8,23 تصف توقيت التحصين كشرط يحدد التباين في نتائج EAE. وبالتالي ، نقترح إجراء التحصين في نفس الساعة تقريبا في جميع ، ويفضل أن يكون ذلك خلال الساعات الضوئية لدورة الضوء / الظلام اليومية23. للحد من الإجهاد ، من الأفضل التلاعب بالحيوانات قبل يوم التحصين ووضع علامة عليها للتعرف عليها بسهولة للتقييم اليومي ، على سبيل المثال ، قص الأذن أو العلامة.
- حدد الفئران البالغة C57BL / 6J من كلا الجنسين في عمر 8-10 أسابيع مع وزن الجسم الأمثل ~ 20 جم. تأكد من اختيار الفئران المتطابقة مع العمر والجنس لمجموعات تجريبية مختلفة لأن القابلية للإصابة بالمرض يمكن أن تختلف باختلاف العمر والجنس.
- إجراء التحصين
ملاحظة: تأكد من تنفيذ الإجراء من قبل محقق متمرس لتقليل الضغط على وتحسين التحصين. قبل البدء في التحصين ، حدد طريقة التخدير وفقا لإرشادات اللجنة المؤسسية لرعاية والأخلاقية. يستخدم مختبرنا تخديرا قصيرا مع الأيزوفلوران.- تخدير الماوس: 4٪ إيزوفلوران لتحريض التخدير و 1.5-2٪ إيزوفلوران لصيانة التخدير. انتظر حتى يكون التخدير فعالا واستخدم قرصة إصبع القدم الخلفية والأمامية لتقييم مستوى التخدير. لمنع جفاف العينين أثناء تخدير الفأر ، استخدم مرهما للعين معتمدا من الطبيب البيطري.
- حقن PT في الوريد في الوريد الذيلي الجانبي: قم بتوصيل ذيل الفأر برفق بمحلول الإيثانول ، الذي يعمل كموسع للأوعية ، لعرض الأوردة. ركز على أحد الأوردة الجانبية للذيل ، وباستخدام حقنة 0.5 مل مزودة بإبرة 30 جم ، قم بحقن 500 نانوغرام من PT (أي 100 ميكرولتر من PT المخفف في محلول فسيولوجي بتركيز 5 ميكروغرام / مل).
- الحقن تحت الجلد من مستحلب MOG35-55 : باستخدام حقنة 1 مل بإبرة 26 جم ، قم بإجراء ثلاث حقن تحت الجلد من المستحلب المعد مسبقا: اثنان تحت الجزء المنقاري من الأجنحة وواحد في قاعدة الذيل. حجم المستحلب المحقون في كل موقع هو 100 ميكرولتر ، لحجم إجمالي قدره 300 ميكرولتر من المستحلب المحقون في كل فأر.
ملاحظة: يسجل يوم التمنيع على أنه اليوم 0 بعد التمنيع (dpi)؛ بعد 48 ساعة (أي عند 2 نقطة في البوصة) ، من الضروري إجراء حقن وريدي آخر من PT يساوي الحقن الذي تم إجراؤه مسبقا. من الممكن إجراء الحقن بدون تخدير ، باستخدام مقيد الماوس. يهدف الإجراء الموصوف هنا إلى تحفيز والحفاظ على تخدير الفئران أثناء إجراء التحصين لتجنب الانزعاج المحتمل وحركات أو المخاطر لكل من الفئران والمحققين. وبالتالي ، لا توجد عمليات جراحية. ومع ذلك ، لتحسين العمليات التجريبية ، من المهم الحفاظ على ظروف معقمة مناسبة خلال هذه الخطوات ومراقبة حالة الماوس بعد هذه الإجراءات. - للتحقق من تعافي الفأر من الحقن ، ضعه في قفص نظيف بعد الإجراءات وانتظر حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. بعد أن يتعافى الماوس تماما ، أعده إلى قفص المنزل مع الأخرى.
3. متابعة EAE
- وزن الجسم وتناول الطعام
- راقب يوميا وزن الجسم (BW) للحيوانات ، باستخدام ميزان الدقة الإلكترونية ، لأن الانخفاض في الأسلحة البيولوجية هو مؤشر على تطور المرض.
ملاحظة: يجب ألا يتجاوز هذا الانخفاض نسبة معينة ، وفقا لإرشادات اللجنة المؤسسية والأخلاقية لرعاية. عادة ، إذا فقد أكثر من 20٪ من وزن الجسم الأولي (أي الوزن المسجل عند 0 نقطة في البوصة) ، فيجب التضحية به كتطبيق لنقطة النهاية الإنسانية. تتضمن طرق القتل الرحيم تخديرا عميقا لا رجعة فيه للاستنشاق (على سبيل المثال ، 5٪ إيزوفلوران) يليه قطع الرأس. - راقب كمية الطعام (FI) - الطعام الذي يأكله في يوم واحد (g∙day-1∙animal-1) ، ووزن كمية الطعام في الحاوية المحددة مرة واحدة على الأقل في الأسبوع ، وقسمة كمية الطعام المأكول للأيام التي مرت بين قياسين متتاليين وعدد الموجودة في القفص.
ملاحظة: يسمح هذا القياس بتقدير متوسط تناول الطعام. بسبب ظهور وتراكم علامات المرض السريري ، والتي تنطوي على شلل الأطراف ، نقترح وضع بعض الطعام المائي على أرضية القفص عندما تكون غير قادرة على الوقوف بثبات على أطرافها الخلفية والوصول إلى حاوية الطعام أو زجاجة الماء. لتقييم تناول الطعام خلال فترة المتابعة بأكبر قدر ممكن من الدقة ، قمنا أيضا بقياس الوزن الجاف لهذا الطعام قبل ترطيبه للفئران.
- راقب يوميا وزن الجسم (BW) للحيوانات ، باستخدام ميزان الدقة الإلكترونية ، لأن الانخفاض في الأسلحة البيولوجية هو مؤشر على تطور المرض.
- تقييم الدورة الشهوانية خلال EAE
- تحقق من الدورة الشحمية لدورتين على الأقل ، وتقييم مسحات الخلايا المهبلية كما وصفها McLean et al.24. صنف مرحلة الدورة الشحمية بناء على وجود ثلاثة أنواع من الخلايا الأولية - الخلايا الظهارية ذات النواة ، والخلايا الظهارية الحرشفية المتقرنة ، والكريات البيض - في عينات اللطاخة المهبلية ، على النحو التالي:
- تصنف على أنها نثر بناء على وجود حصري تقريبا لمجموعات من الخلايا الظهارية المستديرة جيدة التكوين.
- تصنف على أنها شبق بناء على الوجود السائد لمجموعات كثيفة من الخلايا الظهارية الحرشفية المتقرنة.
- تصنف على أنها metestrus على أساس الوجود السائد للكريات البيض الصغيرة الملطخة بالظلام والوجود الطفيف للخلايا الظهارية الحرشفية المتقرنة.
- تصنف على أنها ديسترو بناء على الوجود السائد للغاية للكريات البيض الصغيرة الملطخة بالظلام والخلايا الظهارية الحرشفية النادرة جنبا إلى جنب مع المظهر المحتمل للخلايا الظهارية النواة.
ملاحظة: عند تقييم المرض في كلا الجنسين ، من المهم التحقق من التباين في الإناث بسبب الدورة الشبقية. نقترح التركيز على تقييم الدورة الشهوانية ، خاصة بين الأسبوع الأول والثاني بعد التمنيع (أي خلال المرحلة الحادة من EAE). لقد ثبت سابقا أن إجراء التحصين يسبب التغييرات الأكثر وضوحا في الدورة الشحمية ضمن هذه المرحلة25. علاوة على ذلك ، من المهم مراعاة أن إجراء اللطاخة عندما يصل إلى درجة سريرية عالية (خاصة >3) أمر صعب بسبب شلل جزئي خلفي ونقص النغمة في الأطراف الخلفية.
- تحقق من الدورة الشحمية لدورتين على الأقل ، وتقييم مسحات الخلايا المهبلية كما وصفها McLean et al.24. صنف مرحلة الدورة الشحمية بناء على وجود ثلاثة أنواع من الخلايا الأولية - الخلايا الظهارية ذات النواة ، والخلايا الظهارية الحرشفية المتقرنة ، والكريات البيض - في عينات اللطاخة المهبلية ، على النحو التالي:
- النتيجة السريرية
- اطلب من محقق أعمى تقييم النتيجة السريرية للحيوانات يوميا. خصص لكل درجة مصنفة من 0 إلى 5 (انظر الجدول 2) لتقييم مسار المرض26 كما هو موضح في Racke7.
ملاحظة: على غرار انخفاض وزن الجسم ، فإن نقطة النهاية الإنسانية ضرورية أيضا لزيادة الدرجات السريرية ، وفقا لإرشادات اللجنة المؤسسية والأخلاقية لرعاية. بشكل عام ، إذا لم يعد قادرا على إطعام نفسه بشكل مستقل (يحدث هذا عادة عندما يصل إلى درجة 4 على الأقل ، وفقا للمقياس الذي نستخدمه) ، فيجب التضحية به كتطبيق لنقطة النهاية الإنسانية.
- اطلب من محقق أعمى تقييم النتيجة السريرية للحيوانات يوميا. خصص لكل درجة مصنفة من 0 إلى 5 (انظر الجدول 2) لتقييم مسار المرض26 كما هو موضح في Racke7.
- تقييم الأداء الحركي عن طريق اختبار الروتارود
ملاحظة: عادة ما يتم إجراء تقييم تقدم EAE عن طريق تعيين النتيجة السريرية يوميا ، والتي يتم إجراؤها بواسطة محقق أعمى مدرب تدريبا كاملا. ومع ذلك ، قد يكون من المفيد إحاطته بتقييم كمي وموضوعي أكثر لتطور المرض. في دراسة سابقة26 ، تم استخدام اختبار الروتارود لقياس الأداء الحركي للحيوانات المحصنة. كما وصفه van den Berg et al.27 ، للحصول على تقييم سريري أكثر كمية ودقة لمسار المرض ، يمكن أن يدعم تقييم الأداء الحركي بواسطة اختبار الروتارود تقييم النتيجة السريرية. وللاطلاع على وصف مفصل، انظر van den Berg et al.27.- دع الفئران تخضع لجلسات دوارة يوميا ، بدءا من 1 نقطة في البوصة حتى التضحية (أي 28 نقطة في البوصة). تتكون كل جلسة من جلسة واحدة مدتها 300 ثانية يجب خلالها زيادة سرعة القضيب خطيا من 4 إلى 40 دورة في الدقيقة.
- تسجيل درجة. عندما يكون الماوس غير قادر على الحفاظ على توازنه ويسقط من الجهاز ، فإنه يسقط على الأرض ويشغل جهاز استشعار ، ويتم تسجيل الوقت (الأوقات). وبالتالي ، يتم تسجيل الأداء على أنه زمن انتقال إلى السقوط (السقوط).
| درجة | علامة سريرية | وصف | |||
| 0 | صحي | لا توجد علامة سريرية ملحوظة. يظهر نغمة طبيعية وحركة الذيل. يمشي دون تعثر. | |||
| 0.5 | بوابة ضعيفة | رحلات أثناء المشي على الشواية. | |||
| 1 | ذيل يعرج | عندما يتم التقاط على أساس الذيل ، يتدلى الذيل (الذيل المترهل). | |||
| 1.5 | ذيل عرج وبوابة ضعيفة | يظهر ذيلا مترهلا ، ويسافر أثناء المشي على الشواية. | |||
| 2 | رنح | يظهر صعوبات في الوقوف بمجرد قلبه على ظهره. | |||
| 2.5 | ترنح وشلل جزئي في الأطراف الخلفية | لا يمكن لعروض الوقوف بمجرد قلبها على ظهرها ، وتفقد نغمة أحد أطرافها الخلفية. | |||
| 3 | شلل الأطراف الخلفية | يفقد لهجة كل من الأطراف الخلفية. | |||
| 3.5 | شلل الأطراف الخلفية و / أو شلل جزئي في الطرف الأمامي | يفقد لهجة كل من الأطراف الخلفية وجزئيا من الأطراف الأمامية. في الواقع ، يظهر فقدان القوة في قبضة الأطراف الأمامية. | |||
| 4 | شلل جزئي تترا | يفقد تماما لهجة أطرافه. | |||
| 4.5 | شلل جزئي تترا وانخفاض درجة حرارة الجسم | يفقد تماما نغمة أطرافه ، ويظهر انخفاضا في درجة حرارة الجسم (إنه بارد). | |||
| 5 | الموت أو الموت | يموت (لا يستجيب لأي حافز) أو ميت. | |||
الجدول 2: نظام التسجيل السريري المستخدم لتقييم تقدم EAE.
4. تقييم العلامات النسيجية المرضية التي يسببها EAE على مستوى الحبل الشوكي
ملاحظة: هنا ، نبلغ بإيجاز عن إجراء التضحية بالحيوانات وجمع الحبال الشوكية لإجراء التحليل النسيجي المرضي. للحصول على وصف مفصل ، راجع هذه المراجع10،26،28،29.
- التثبيت وأخذ عينات الأنسجة
ملاحظة: للحصول على وصف تفصيلي ، راجع هذه المراجع10،26.- التضحية بالحيوانات في 28 نقطة في البوصة خلال المرحلة المزمنة من المرض.
- تخدير الفئران عن طريق التخدير العميق الذي لا رجعة فيه (الحقن داخل الصفاق من زولازيبام وتيليتامين 80 مجم / كجم / زيلازين 10 مجم / كجم).
- تتسرب الفئران عبر القلب بمحلول ملحي متبوعا بمحلول بارافورمالدهيد 4٪ (PFA).
ملاحظة: انتبه أثناء استخدام PFA: نظرا لأنه سام ، تجنب الاستنشاق والابتلاع والتلامس مع الجلد والعينين باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة. وزن المسحوق ، وإعداد الحل ، وإجراء التروية تحت غطاء محرك السيارة.
- إزالة الحبل الشوكي من العمود الفقري30.
- قم بتخزين الحبل الشوكي في محلول PFA بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة.
- قم بإجراء عدة غسلات في محلول فوسفات ملحي 0.01 متر (PBS).
- تضمين الحبل الشوكي في كتل البارافين30.
- التضحية بالحيوانات في 28 نقطة في البوصة خلال المرحلة المزمنة من المرض.
- الإجراءات النسيجية
ملاحظة: للاطلاع على وصف مفصل، انظر Montarolo et al.10.- استخدم ميكروتوم لقطع أقسام الحبل الشوكي المستعرضة بسمك 10 ميكرومتر وجمعها على شرائح مغلفة بالجيلاتين. قم بتوجيه مستوى التقسيم لمطابقة الرسومات المقابلة للمقاطع المستعرضة لأطلس الحبل الشوكي للفأر31.
- إجراء إزالة البارافين من الأقسام32.
- وصمة عار القسم مع الهيماتوكسيلين و Eosin32.
- تجفيف الأقسام32.
- قم بتغطية الأقسام بوسط تثبيت واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء كيميائي.
ملاحظة: يسمح تلطيخ الهيماتوكسيلين-إيوسين بالكشف عن وجود ارتشاح التهابي حول الأوعية الدموية (PvIIs)26 ، والذي يتم تقييمه كعلامة على المرض28.
- التحليل الكمي لأقسام الحبل الشوكي
- احصل على صور للأقسام الملطخة باستخدام مجهر بصري متصل بكاميرا رقمية بهدف 20x29.
- قم بتحليل الصورة المكتسبة للحصول على عدد PvIIs ، معبرا عنه بعدد حالات التسلل لكل مم2.
ملاحظة: لتحليل الصور التي تم الحصول عليها ، من المفيد الاستفادة من برنامج تحليل الصور. يتم قياس النتائج المرضية العصبية المقدمة في هذا العمل في 10 مقاطع عرضية كاملة للحبل الشوكي لكل فأر (ن = 8 / مجموعة) تمثل مستويات الحبل الشوكي بأكملها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
متابعة EAE بعد التحصين
وقد تم تقييم ذلك على النحو المبين أدناه.
وزن الجسم وتناول الطعام
يظهر تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) (الجنس والوقت كمتغيرات مستقلة) انخفاضا في وزن الجسم لحيوانات EAE من كلا الجنسين ، خاصة خلال الأسبوع الثاني بعد الحث (F (1,57) = 4.952 ، p < 0.001 ؛ الشكل 2 أ). ومع ذلك ، يتم الحفاظ دائما على إزدواج الشكل الجنسي في الأسلحة البيولوجية (الشكل 2 أ). من حيث النسبة المئوية ل BW (F (1,57) = 23.935 ، p < 0.001 ؛ الشكل 2 ب) ، يظهر كل من الذكور والإناث خسارة فادحة بين 12 نقطة في البوصة إلى 17 نقطة في البوصة (p < 0.001) مقارنة بالأسلحة البيولوجية الأولية ولكنها لا تتجاوز أبدا خسارة إجمالية قدرها 20٪ (الشكل 2B). وهكذا ، على الرغم من أن فقدان الأسلحة البيولوجية يبدأ قبل ظهور المرض ، إلا أنه يصل إلى الحد الأقصى خلال المرحلة الحادة من EAE (الشكل 2A ، B). لا توجد فروق بين الجنسين من حيث فقدان الأسلحة البيولوجية. ومع ذلك ، تميل الإناث إلى فقدان المزيد من الوزن في وقت مبكر والتعافي بشكل أقل خلال المرحلة المزمنة (الأسبوع الثالث والرابع بعد التحريض) (الشكل 2 ب).
علاوة على ذلك ، يظهر ANOVA ثنائي الاتجاه (الجنس والوقت كمتغيرات مستقلة) أيضا انخفاضا كبيرا في FI (F (9 ، 39) = 6.682 ، p < 0.001 ؛ الشكل 2 ج) في كلا الجنسين ، لا سيما خلال الأسبوع الثاني بعد التحصين ، نتيجة لزيادة شدة EAE ، مما جعل من الصعب على الوصول إلى الطعام الموجود في الحاوية العلوية في القفص. كما اقترحنا ، تم وضع الطعام لاحقا على أرضية القفص لتقليل الضغط على. سمح هذا للمؤسسة المالية بالعودة إلى المستويات الأولية (الشكل 2C) ، واستعادة BW جزئيا (الشكل 2A ، B).
تقييم الدورة الاستروإخوانية عند الإناث
تم إجراء المقارنة بين الوقت المستغرق في المراحل المختلفة من الشبق باستخدام اختبار t للطالب. يظهر التحليل اختلافات في الوقت المستغرق في مراحل استرال (أي الشبق والشبق) مقارنة بالوقت المستغرق في المرحلة غير الإستريال (أي metestrus و diestrus) بين المرحلة عديمة الأعراض (قبل بداية EAE) والمرحلة العرضية (بعد بداية EAE) (p = 0.042; الشكل 2D) ، ويرجع ذلك أساسا إلى زيادة الوقت الذي يقضيه في diestrus خلال مراحل الأعراض (p = 0.017) والميل في تقليل الوقت الذي يقضيه في proestrus (p = 0.08).
لقد سبق وصفه بأن إجراء الحث يؤدي إلى تغيير في الدورة الشحمية عند الإناث ، مما يؤثر بشكل خاص على proestrus25. خلال هذه المرحلة ، من المعروف أن زيادة مستويات هرمون الاستروجين تمارس تأثيرات مضادة للالتهابات ووقائية للأعصاب16 ، وبالتالي ، ربما تكون مسؤولة عن الدور الوقائي لتلك الهرمونات خلال مرحلة ما قبل الأعراض. ومع ذلك ، عندما ينخفض مستوى هرمون الاستروجين ، كما نرى في مرحلة ما بعد البداية ، تنتهي آثارها الوقائية أيضا.
النتيجة السريرية وأداء الروتارود
يظهر ANOVA ثنائي الاتجاه (الجنس والوقت كمتغيرات مستقلة) زيادة كبيرة في الوقت في النتيجة السريرية (CS) لكل من الذكور والإناث (F (56-813) = 27.951 ، p < 0.001 ؛ الشكل 3 أ). على وجه الخصوص ، بدءا من 10 نقطة في البوصة ، يظهر كلا الجنسين زيادة كبيرة في CS (p < 0.001) ، والتي يتم الحفاظ عليها حتى نقطة النهاية (28 نقطة في البوصة) (الشكل 3A). تظهر الإناث ، حتى لو لم يكن بشكل ملحوظ (p = 0.156) ، CS أعلى من الذكور (الشكل 3 أ). من حيث بداية المرض ، فإنه يحدث بشكل عام حوالي 10 نقطة في البوصة ، مع ميل لبداية مبكرة في الإناث منه في الذكور (الشكل 3B). علاوة على ذلك ، تظهر الإناث CS تراكمي أعلى بشكل ملحوظ مقارنة بالذكور (p = 0.017; الشكل 3 ج).
تشبه دورة أداء الروتارود التقييمات السريرية (الشكل 2 د). بدءا من بداية المرض ، ينخفض ، ليصل إلى الحد الأدنى من الأداء خلال الأسبوع الثاني بعد التحصين ، في المرحلة الحادة من EAE. يظهر ANOVA ثنائي الاتجاه (الجنس والوقت كمتغيرات مستقلة) انخفاضا كبيرا في الوقت في أداء الروتارود لكل من الذكور والإناث (F (46-673) = 5.365 ، p < 0.001 ؛ الشكل 3D). على وجه الخصوص ، يظهر الذكور الحد الأدنى من الأداء عند 16 نقطة في البوصة (p = 0.022) بينما تعرض الإناث 17 نقطة في البوصة (p < 0.001). يميل الذكور إلى الأداء بشكل أفضل من الإناث ، خاصة خلال المرحلة المزمنة من المرض (21-28 نقطة في البوصة) ، ربما نتيجة لانخفاض CS (الشكل 3 أ ، د).
التقييم النسيجي المرضي للحبل الشوكي
يسلط ANOVA أحادي الاتجاه (الجنس كمتغير مستقل) ل PvIIs في أقسام الحبل الشوكي الضوء على اختلاف واضح بين الذكور والإناث (الشكل 4 أ). تظهر الإناث عددا أعلى بكثير من PvIIs من الذكور (F (1،14) = 63.107 ، p < 0.001 ؛ الشكل 4 ب). ربما تعكس هذه البيانات ارتفاع CS التراكمي ، وأسوأ أداء دوار ، والمرض الأكثر عدوانية الذي لوحظ في الإناث ، خاصة خلال المرحلة المزمنة من EAE.
تعكس هذه البيانات أيضا حقيقة أن إناث الفئران تظهر قابلية أعلى لتطوير EAE أكثر عدوانية مقارنة بالذكور14 ، وهو أحد الاختلافات الرئيسية بين نموذج المرض هذا ومرض التصلب العصبي المتعدد الذي يحدث في البشر. تظهر النساء بداية مبكرة للمرض ، ولديهن انتشار أقل بشكل معتدل للأشكال التقدمية الأولية ، ويظهرن تقدما أقل للإعاقة بشكل عام من الرجال2،33،34.
الشكل 1: التمثيل الزمني التخطيطي للإجراءات التجريبية. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. الاختصارات: i.v. = عن طريق الوريد. s.c. = تحت الجلد ؛ MOG35-55 = ببتيد البروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 ؛ = نقطة في البوصة = يوم بعد التحصين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تقييم تأثيرات EAE على وزن الجسم ، وتناول الطعام في ذكور وإناث الفئران ، والدورة الشهوانية في إناث الفئران. من يوم التحصين (0 نقطة في البوصة) حتى يوم الأضحية (28 نقطة في البوصة) ، تظهر الرسوم البيانية (أ) وزن الجسم اليومي ، (ب) النسبة المئوية لوزن الجسم ، و (ج) التقييم الأسبوعي للاستهلاك الغذائي في من كلا الجنسين (ن = 15 / مجموعة). (د) الوقت المستغرق (معبرا عنه كمتوسط النسبة المئوية للوقت) في المراحل المختلفة للدورة الشهوانية ، التي تم تقييمها بواسطة مسحات الخلايا المهبلية ، خلال المرحلة الخالية من الأعراض (ما قبل البداية ، العمود الأيسر من الرسم البياني) أو المرحلة العرضية (ما بعد البداية ، العمود الأيمن من الرسم البياني) في إناث الفئران. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. كشف التحليل الإحصائي عن تأثير معنوي ل p≤ 0.05 (# = الذكور مقابل الإناث ؛ * = مقارنة بين النقاط الزمنية المختلفة). الاختصارات: EAE = التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي. BW = وزن الجسم ؛ FI = تناول الطعام ؛ نقطة في البوصة = يوم بعد التحصين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم النتيجة السريرية وأداء الروتارود في ذكور وإناث الفئران المصابة ب EAE. (أ) تقييم النتيجة السريرية اليومية (من 0 إلى 28 نقطة في البوصة) في من كلا الجنسين (ن = 15 / مجموعة). (ب) يوم ظهور المرض (متوسط نقطة في البوصة) في الذكور المصابين ب EAE (العمود الأيسر) والإناث (العمود الأيمن). (ج) متوسط النتيجة السريرية التراكمية التي وصلت إليها الذكور المصابة ب EAE (العمود الأيسر) والإناث (العمود الأيمن). (د) تقييم أداء الروتارود اليومي (يقاس بزمن السقوط) من 6 إلى 28 نقطة في البوصة (يمثل 0 القيم الأساسية التي تم الحصول عليها خلال أول 5 أيام من الاختبار) في من كلا الجنسين. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. كشف التحليل الإحصائي عن تأثير معنوي ل p≤ 0.05 (# = الذكور مقابل الإناث ؛ * = مقارنة بين النقاط الزمنية المختلفة). الاختصارات: EAE = التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي. CS = النتيجة السريرية ؛ Cum CS = النتيجة السريرية التراكمية ؛ نقطة في البوصة = يوم بعد التحصين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل الالتهاب في الحبل الشوكي للفئران المصابة ب EAE من كلا الجنسين. (أ) تبرز الصور التمثيلية لمقاطع الحبل الشوكي المستعرضة الملطخة بالهيماتوكسيلين-يوسين وجود PvIIs (الأسهم) في ذكور الفئران (الصورة العلوية) والإناث (الصورة السفلية). (ب) قياس وجود PvIIs في الحبل الشوكي للفئران المصابة ب EAE من كلا الجنسين (n = 8 / مجموعة). يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM. كشف التحليل الإحصائي عن تأثير معنوي ل p ≤ 0.05 (# = الذكور مقابل الإناث). شريط المقياس = 200 ميكرومتر (تكبير 10x). الاختصارات: EAE = التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي. * = القناة المركزية ؛ PvIIs = تسلل التهابي حول الأوعية الدموية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أدى بروتوكول EAE الناجم عن MOG35-55 الذي وصفناه إلى تطوير شكل مزمن من مرض التصلب العصبي المتعدد في الفئران C57BL / 6J7،8،13. في هذه النتائج التمثيلية ، أبلغنا أن من كلا الجنسين التي خضعت لإجراء التحصين طورت شكلا مزمنا من المرض (أي أنها لا تتعافى تماما بعد بداية المرض ، وتتراكم العجز ، وتحافظ على CS على الأقل 1.5 في المرحلة المزمنة).
حتى لو لم تبلغ العديد من الدراسات عن أي اختلافات بين الذكور والإناث في هذا النموذج14 ، فإن عددا قليلا فقط من الدراسات يأخذ في الاعتبار كلا الجنسين. ومع ذلك ، نظرا لإزدواج الشكل الجنسي الكبير المعروض في MS2 ، يجب أن يكون من الأهمية بمكان دراسة نتائج المرض في الجنسين. بفضل الدراسات الحديثة التي تشمل كلا الجنسين ، تم أيضا وصف وجود بعض إزدواج الشكل الجنسي في MOG35-55 الناجم عن EAE35. لاحظنا بشكل أساسي أنه في الإناث ، يكون EAE الناجم عن MOG35-55 أكثر عدوانية بشكل عام (نظرا لقابلية الفئران الأنثوية العالية لهذا النموذج)36 ، حيث تميل إلى أن يكون لها بداية مبكرة ودرجات سريرية تراكمية أعلى ، مما يعكس زيادة الالتهاب على مستوى الحبل الشوكي مقارنة بما لوحظ في الذكور. أحد الاستنتاجات الرئيسية هو أن هذا البروتوكول يمكن أن يحفز EAE في كل من الفئران الذكور والإناث ، ولكن يجب على الباحثين أن يتذكروا أن بعض جوانب المرض يمكن أن تختلف بين الجنسين. وبالتالي ، من الأهمية بمكان النظر بشكل صحيح في السؤال التجريبي الرئيسي الذي يجب معالجته ، واختيار النموذج الحيواني الأكثر ملاءمة ، وتقييم ضرورة تضمين أحد الجنسين أو كلاهما.
الخطوات الهامة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها المحتملة
نظرا لأن النماذج المختلفة لمرض التصلب العصبي المتعدد تنتج بعض الجوانب المحددة للمرض ، ولكن ليس كل6 ، فإن الخطوة الأساسية الأولى هي اختيار النموذج الصحيح مع مراعاة الاحتياجات التجريبية المحددة والأسئلة العلمية التي يجب معالجتها. ثانيا ، يجب إجراء إجراء التحصين من قبل خبير للتأكد من أنه يتم بشكل صحيح وتجنب الأخطاء أو التباين بسبب الإجراءات غير الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون المحقق على دراية بلوائح رعاية التي اعتمدتها المؤسسة المضيفة.
ثالثا ، يجب توحيد المستحلب في التجربة. تجدر الإشارة إلى أن كل فأر يظهر قابلية نموذجية للتحريض ، وبالتالي ، يمكن لبعض أن تصاب بمرض أقل عدوانية أو لا تصاب به على الإطلاق. في هذه الحالة ، يمكن تحسين حدوث المرض وشدته عن طريق ضبط كمية MOG35-55 التي تدار للفئران. رابعا ، على الرغم من أن حقن PT يستخدم على نطاق واسع لتسهيل تحريض EAE في الفئران35,36 ، إلا أنه ليس ضروريا لكل بروتوكول37,38. في غياب PT ، عادة ما تطور الفئران شكلا أقل حدة وأكثر تنوعا من EAE39. علاوة على ذلك ، يمكن أن يحدث المزيد من التباين بسبب طرق مختلفة لإدارة PT (على سبيل المثال ، عن طريق الوريد مقابل داخل الصفاق) ولأن قوة PT قد وصفت بأنها تختلف بين الدفعات. للتغلب على هذه المشكلة ، من المهم ضبط مستوى الصوت وفقا لقوة كل دفعة مستخدمة وإعداد حل PT بشكل صحيح40,41. بالنظر إلى الأهداف التجريبية ، والمهارات التقنية للباحثين ، وتحسين البحوث الحيوانية ، من الضروري اختيار بروتوكول الحث الأنسب.
خامسا ، لجمع البيانات بطريقة أكثر موضوعية ، يوصى بشدة بالتسجيل الأعمى لأعراض المرض. علاوة على ذلك ، نقترح التسجيل السريري مع تقييم كمي وموضوعي أكثر لمسار المرض ، مثل تقييم أداء الروتارد. وأخيرا، فإن الاختيار الصحيح للعديد من المجموعات التجريبية بشكل كاف أمر أساسي للحصول على بيانات موثوقة وقابلة للمقارنة (انظر القسم 2 من البروتوكول). يجب إجراء حسابات حجم العينة للحصول على أحجام المجموعات اللازمة ، اعتمادا على حجم التأثير المتوقع.
القيود الرئيسية
أولا ، يمكن أن يؤدي بروتوكول الحث هذا إلى نتائج متغيرة للغاية في المحصنة ، خاصة إذا لم تكن أحجام المجموعة كبيرة بما يكفي أو إذا لم يتم تنفيذ الإجراء بشكل صحيح. بعد ذلك ، فإن EAE الناجم عن MOG35-55 ، مثل أي نموذج آخر متاح من مرض التصلب العصبي المتعدد ، لديه بعض القيود (أي أنه يوفر القليل جدا من المعلومات حول تطور مرض التصلب العصبي المتعدد ، أو دور الخلايا البائية في المرض ، أو الآليات من الداخل إلى الخارج ، أو الصعوبات في دراسة إعادة الميالين)4,6. ومن ثم ، مرة أخرى ، من الضروري اختيار نموذج MS اللازم لمعالجة السؤال العلمي المحدد بشكل صحيح. أخيرا ، يتم تمثيل الموقع الأساسي للضرر بواسطة الحبل الشوكي ، ويؤدي علم الأمراض إلى ظهور علامات نسيجية مرضية بطريقة ذيلية في الجمجمة (أي بدءا من الحبل الشوكي وصعودا إلى الدماغ). هذا هو عكس ما يحدث في البشر وقد يمثل قيدا كبيرا على النموذج. ومع ذلك ، من الممكن أيضا تقدير بعض التعديلات في الدماغ ، مع الأخذ في الاعتبار أهدافا محددة.
مزايا
أولا ، يمكن أن يساهم هذا النموذج بشكل كبير في فهم الآليات المناعية المحيطية وتقييم العمليات الالتهابية العصبية ، وجزئيا ، إزالة الميالين في الجهاز العصبي المركزي. بعد ذلك ، يمكن تطبيق هذا النموذج في بعض سلالات الفئران المعدلة وراثيا المحددة لدراسة نتائج مرض التصلب العصبي المتعدد المتعلقة بتغيرات جينية محددة.
ميزة أخرى هي إجراء تقييم سريري يعتمد على طريقتين: تقييم النتيجة السريرية واختبار الروتارد. وهذا يؤدي إلى تقييم سريري أكثر كمية وأقل ذاتية وأكثر دقة لمسار المرض. علاوة على ذلك ، كما أشار فان دن بيرج وآخرون ، يرتبط التقييم القائم على الروتارود ارتباطا وثيقا بمساحة سطح الآفات الالتهابية في الأنظمة الحركية للحبل الشوكي27.
كما ناقشنا سابقا ، على الرغم من أن هذا النموذج لا يعيد إنتاج إزدواج الشكل الجنسي لمرض التصلب العصبي المتعدد بالكامل ، إلا أننا نعتقد أن هذا ميزة. يمكن أن يساعد الجمع بين الحث وعوامل الخطر المحتملة الأخرى ، وخاصة البيئية منها ، في فهم الآثار المحددة لهذه العوامل وتحديد دورها المحدد في حدوث بعض الجوانب الجنسية ثنائية الشكل لمرض التصلب العصبي المتعدد. أخيرا ، تم استخدام هذا النموذج على نطاق واسع لتطوير واختبار مجموعة واسعة من الأدوية العلاجية ، وبالتالي ، لديه القدرة على المساعدة في تطوير مناهج علاجية جديدة لهذا المرض 4,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أي من المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه فيما يتعلق بالبحث والتأليف و / أو نشر هذه المقالة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الخارجية ، وجامعة وجامعة ريسيركا - مشروع MIUR Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 و 2023-2027 إلى قسم علم الأعصاب ريتا ليفي مونتالتشيني. مؤسسة كافالييري أوتولينغي، أورباسانو، إيطاليا. كان BB زميلا في INFRA-P ، منطقة بيدمونت (n.378-35) (2022-2023) و PRIN 2020 - 20203AMKTW. نشكر مؤسسة البحوث الحيوية أونلوس (FORB) على الدعم. تم دعم رسوم النشر من خلال التبرع الكريم من Distretto Rotaract 2031 ، وعلى وجه الخصوص ، Rotaract Club Torino Nord-Est. نشكر إيلين ميلر على التدقيق اللغوي لمخطوطتنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
| Digital camera connected to the optical microscope | NIKON DS-U1 digital camera | ||
| Electronic precision balance | Merck | Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
| Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml | Sacco System | L003465 | |
| Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
| Hematoxylin (Mayer’s) | Sigma-Aldrich | MHS32 | Filter before using it. |
| Image analysis Software | Fiji | ||
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C. |
| Isoflurane | Wellona Pharma | This drug is used as inhalational anaesthetic. | |
| Male and female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory, Envigo | Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. | |
| Microtome | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
| Mounting Medium | Merck | 107961 | |
| Mouse Rotarod | Ugo Basile | #47600 | |
| Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra | Difco Laboratories Inc. | 231141 | Store at +4 °C. |
| Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) | Espikem | EPK1 | Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. |
| Optical microscope | NIKON eclipse 90i | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. |
| Pertussis toxin (PT) | Duotech | PT.181 | Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution |
| Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) | B. Eurospital | A 032182038 | Store at +4 °C once opened. |
| Saline phosphate buffer (PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | |
| Software for image acquisition | NIS-Element AR 2.10 | ||
| Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
| Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
| Vet ointment for eyes | Lacrilube, Lacrigel Europhta | ||
| Xylazine | Rompun | This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. | |
| Zolazepam and Tiletamine | Zoletil 100 | This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic |
References
- Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O.
- Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
- Smith, P.
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G.
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), Zurich, Switzerland. 123-137 (2017).
- Racke, M. K.
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
- Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
- Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
- Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
- Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
- McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It's complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
- Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
- Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
- Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
- Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
- Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E.
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
- Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
- vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
- Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida--a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Chapter 16 - Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. , Academic Press. 308-379 (2009).
- Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
- Bergamaschi, R.
- Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
- Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
- Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
- Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
- Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
- Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
- Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
- Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).
Tags
علم الأعصاب ، العدد 200 ، التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي الناجم عن MOG35-55 ، مرض التهاب المناعة الذاتية المزمن ، الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، الانتشار بين الجنسين ، الأشكال العدوانية ، الجوانب السريرية ، السمات الإشعاعية ، السمات المرضية ، النماذج الحيوانية التجريبية ، التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) ، ذكور وإناث C57BL / 6J الفئران ، المايلين أوليغوديندروسيت بروتين سكري الببتيد 35-55 (MOG35-55) التحصين ، الشكل المزمن للمرض ، النتيجة السريرية اليومية ، المحرك الأداء ، التحليل النسيجي ، الحبل الشوكيErratum
Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2024.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.
