Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מידול טרשת נפוצה בשני המינים: MOG35-induced ניסיוני אוטואימוני אנצפלומיאליטיס

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65778
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,4
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

ERRATUM NOTICE

Summary

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית היא אחד המודלים הנפוצים ביותר של טרשת נפוצה. בפרוטוקול הנוכחי, עכברי C57BL/6J משני המינים מחוסנים בפפטיד גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין, וכתוצאה מכך בעיקר פרזיס עולה של הזנב והגפיים. כאן אנו דנים בפרוטוקול של אינדוקציה והערכה של EAE.

Abstract

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה דלקתית אוטואימונית כרונית המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית (CNS). היא מאופיינת בשכיחות שונה בין המינים, המשפיעה על יותר נשים מגברים, ותוצאות שונות, המראות צורות אגרסיביות יותר אצל גברים מאשר אצל נשים. יתר על כן, טרשת נפוצה היא הטרוגנית מאוד במונחים של היבטים קליניים, רדיולוגיים ופתולוגיים. לכן, יש צורך לנצל מודלים בעלי חיים ניסיוניים המאפשרים חקירה של היבטים רבים ככל האפשר של הפתולוגיה. אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) מייצגת את אחד המודלים הנפוצים ביותר של טרשת נפוצה בעכברים, המדמה תכונות מחלה שונות, החל מהפעלת מערכת החיסון ועד נזק למערכת העצבים המרכזית. כאן אנו מתארים פרוטוקול להשראת EAE בעכברי C57BL/6J זכריים ונקביים כאחד באמצעות חיסון מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין פפטיד 35-55 (MOG35-55), מה שמוביל להתפתחות צורה כרונית של המחלה. אנו גם מדווחים על הערכת התוצאה הקלינית היומית והביצועים המוטוריים של עכברים אלה במשך 28 ימים לאחר החיסון (28 dpi). לבסוף, אנו מדגימים כמה ניתוחים היסטולוגיים בסיסיים ברמת מערכת העצבים המרכזית, תוך התמקדות בחוט השדרה כאתר העיקרי של נזק הנגרם על ידי מחלה.

Introduction

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה דלקתית אוטואימונית כרונית המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית (CNS). זה מראה את נוכחותם של חדירה perivascular של תאים דלקתיים, demyelination, אובדן אקסונלי, gliosis1. האטיולוגיה שלה נותרה לא ידועה, וההיבטים הקליניים שלה, המאפיינים הרדיוגרפיים והפתולוגיים מצביעים על הטרוגניות יוצאת דופן במחלה2.

בשל האטיולוגיה והמורכבות הלא ידועות שלה, נכון לעכשיו, אף מודל של בעלי חיים אינו משחזר את כל התכונות הקליניות והרדיולוגיות המוצגות בטרשת נפוצה 3,4 אנושית. עם זאת, מודלים שונים של בעלי חיים משמשים לחקר היבטים שונים של טרשת נפוצה 3,4. במודלים אלה, התחלת המחלה היא בדרך כלל מלאכותית ביותר, ומסגרת הזמן של הופעת סימנים קליניים שונה בין בני אדם לעכברים. לדוגמה, בבני אדם, התהליכים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס המחלה אינם מזוהים במשך שנים לפני הופעת הביטויים הקליניים. לעומת זאת, הנסיינים יכולים לזהות תסמינים במודלים של בעלי חיים בתוך שבועות או אפילו ימים לאחר השראת טרשת נפוצה4.

שלושה מודלים בסיסיים של בעלי חיים מייצרים את התכונות של דה-מיאלינציה האופייניות לטרשת נפוצה: אלה המושרות על ידי וירוסים (למשל, וירוס האנצפלומיאליטיס מורין של טיילר), אלה המושרים על ידי חומרים רעילים (למשל, cuprizone, lysolecithin), והגרסאות השונות של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE)5. כל מודל מסייע לחקור היבטים ספציפיים של המחלה, אך אף אחד מהם אינו משכפל את כל התכונות של MS6. לכן, קריטי לבחור את המודל הנכון בהתחשב בצרכים הניסיוניים הספציפיים ובשאלות המדעיות שיש להתייחס אליהן.

הודות להליכי חיסון נגד אנטיגנים שמקורם במיאלין, EAE נגרם על ידי הפעלת תגובה אוטואימונית לרכיבי CNS בעכברים רגישים. יחסי הגומלין בין מגוון רחב של מנגנונים אימונופתולוגיים ונוירופתולוגיים גורמים להתפתחות תכונות פתולוגיות עיקריות של טרשת נפוצה (כלומר, דלקת, דמיאלינציה, אובדן אקסונלי וגליוזיס) בעכברים המחוסנים 7,8. עכברים מתחילים להראות תסמינים קליניים סביב השבוע השני לאחר החיסון ובדרך כלל מראים שיתוק עולה מהזנב לגפה ולגפה הקדמית. הציון הקליני (כלומר, כימות הצטברות של ליקויים הקשורים למחלה) מוערך בדרך כלל באמצעות סולם7 בן 5 נקודות.

חיסון פעיל עם חלבון או פפטיד או העברה פסיבית של תאי T אנצפליטוגניים יכול לשמש כדי לגרום EAE בעכברים עם רקע גנטי שונה (למשל, SJL/J, C57BL/6, ועכברים שאינם שמנים סוכרתיים (NOD). חלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP), חלבון בסיסי מיאלין (MBP) וגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) הם דוגמאות לחלבונים במערכת העצבים המרכזית העצמית שמהם מיוצרים בדרך כלל אימונוגנים. בפרט, עכברי SJL/J שחוסנו באפיטופ החיסוני הדומיננטי של PLP (PLP139-151) מפתחים מהלך מחלה התקפי-הפוגתי (RR), בעוד שעכברי C57BL/6J שחוסנו בפפטיד MOG35-55 החיסוני הדומיננטי מראים EAE בעל אופי כרוני1. למרות מגבלות מסוימות, כגון מתן מידע מועט מאוד על התקדמות טרשת נפוצה, תפקידם של תאי B במחלה, מנגנוני האינסייד אאוט, או קשיים בחקר רמיאלינציה, המודלים של EAE תרמו רבות להבנת תהליכים אוטואימוניים ונוירו-דלקתיים, הגדילו את הידע בתחום הטרשת הנפוצה ובכך אפשרו פיתוח גישות טיפוליות חדשניות למחלה זו4, 6.

בעבודה הנוכחית התמקדנו בצורה מסוימת של EAE פעיל, פפטיד הגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין 35-55 (MOG35-55) המושרה בצורה 9,10,11,12. מודל EAE המושרה על ידי MOG35-55 הוא צורה כרונית של טרשת נפוצה. לאחר החיסון, העכברים עוברים שלב א-סימפטומטי בשבוע הראשון לאחר החיסון, לאחר מכן המחלה מופיעה בדרך כלל בשבוע השני לאחר החיסון, ואילו בין השבוע השלישי לרביעי לאחר החיסון, המחלה הופכת כרונית, ללא אפשרות להחלמה מלאה מהגירעונות המצטברים 7,8,13. באופן מעניין, ברוב המחקרים הקיימים בספרות14 לא נצפים הבדלים בין זכרים לנקבות בשכיחות, בהתפרצות המחלה, במהלכם או בהתקדמותה, גם אם פחות מחקרים משווים את המחלה בזכרים ובנקבות.

לעומת זאת, אצל בני אדם, פרמטרים אלה ידועים כדימורפיים מאוד מבחינה מינית2. טרשת נפוצה משפיעה על יותר נשים מאשר גברים; עם זאת, גברים בדרך כלל לפתח צורה אגרסיבית יותר של המחלה2. ראיות אלה הצביעו על תפקיד חיוני, כמו גם מורכב, של הורמוני הגונדל15; עם זאת, תפקידם ומנגנון הפעולה של הורמוני המין בפאתולוגיה נותרו לא ברורים. יתר על כן, נתונים ממודלים של בעלי חיים תומכים ברעיון שגם אסטרוגנים וגם אנדרוגנים מפעילים השפעות חיוביות על חלקים שונים של הפתולוגיה באופן ספציפי למין16,17.

מחקרים מסוימים מציעים גם השפעות נוירופרוטקטיביות, פרומיאלינטיות ואנטי דלקתיות של פרוגסטרון18 , ואף על פי שהראיות בחולי טרשת נפוצה הן נדירות18, סטרואידים נוירואקטיביים (כלומר, סטרואידים מסונתזים דה נובו על ידי מערכת העצבים, כגון פרגננולון, טטרהידרופרוגסטרון ודיהידרופרוגסטרון) עשויים להשפיע גם על הקורס הפתולוגי19. באופן קולקטיבי, נתונים אלה תומכים ברעיון כי הורמוני מין המיוצרים הן באופן היקפי והן בתוך מערכת העצבים המרכזית יש תפקיד חשוב וספציפי למין בהתפרצות המחלה והתקדמותה. לכן, בעבודה הנוכחית, אנו קוראים לאיסוף נתונים נפרדים הן מבעלי חיים זכריים והן מנקבות.

מנקודת מבט היסטופתולוגית, החומר הלבן של חוט השדרה משמש כאתר העיקרי של פגיעה במערכת העצבים המרכזית במודל זה, המאופיין באזורים רב-מוקדיים, מתמזגים של חדירה דלקתית חד-גרעינית ודמיאלינציה8. לכן, בתיאור פרוטוקול זה להשראת EAE המושרה על ידי MOG35-55-induced EAE בעכברי C57BL/6J, ניקח בחשבון את תוצאות המחלה בשני המינים ונספק כמה תובנות היסטופתולוגיות לגבי חוט השדרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הטיפול והטיפול בבעלי חיים בעבודה הנוכחית בוצעו בהתאם לדירקטיבת מועצת האיחוד האירופי מיום 22בספטמבר 2010 (2010/63/UE); כל ההליכים שדווחו במחקר הנוכחי אושרו על ידי משרד הבריאות האיטלקי (407/2018-PR) ועל ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת טורינו (פרויקט מס' 360384). אנו מציעים להתאים את התכנון הניסויי להנחיות ARRIVE שפורסמו במקור על ידי Kilkenny et al. בשנת 201020. לפני שתתחיל, ודא שהחומרים הדרושים זמינים (ראה טבלת חומרים). לעקר את כל כלי הזכוכית והכלים המשמשים להכנת תחליב MOG35-55 באוטוקלאב. סיכום של הליכי הניסוי מיוצג באיור 1.

1. הכנת תחליב MOG35-55

הערה: כדי להכין את התחליב נדרשים MOG35-55, אדג'ובנט פרויד לא שלם (IFA), זן שחפת Mycobacterium H37Ra (MT) ופתרון פיזיולוגי (ראה טבלת חומרים).

אזהרה: MT שנהרג בחום עלול לעורר את התגובה החיסונית המולדת. יש להימנע משאיפה, בליעה ומגע עם העור והעיניים באמצעות ציוד מגן אישי מתאים ושקילת MT באיזון מדויק מכוסה מתחת למכסה המנוע.

תמיסה הרכב הערות
2 מ"ג/מ"ל MOG35-55 תמיסת פפטיד פפטיד MOG35-55 מדולל בתמיסה פיזיולוגית בריכוז של 2 מ"ג/מ"ל שמור על הפתרון כבר מדולל ב -80 ° C.
תמיסת PT של 5 מיקרוגרם/מ"ל PT מדולל בתמיסה פיזיולוגית בריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל. שמור על הפתרון כבר מדולל ב -80 ° C.
אמולסיה הנפח הכולל של תחליב הדרוש לכל עכבר כדי להיות מחוסן הוא 300 μL מחולק כדלקמן: כדי למנוע שינויים או זיהום, להכין את תחליב ביום החיסון.
200 מיקרוגרם / עכבר של MOG35-55 , כלומר, 100 מיקרוליטר של MOG35-55 2 מ"ג / מ"ל תמיסה.
50 μL של פתרון פיזיולוגי
150 μL של IFA
4 מ"ג/מ"ל MT, כלומר, 1.2 מ"ג/עכבר
פתרון פיזיולוגי נתרן כלורי 0.9% מדולל במים מזוקקים.

טבלה 1: הרכב הפתרונות המשמשים להליך החיסון.

  1. הכינו את התמיסה בכד זכוכית, הוסיפו תחילה את הרכיב הנוזלי ולבסוף את MT.
    הערה: הנפח הכולל של תחליב הדרוש לכל עכבר כדי להיות מחוסן הוא 300 μL, מחולק כפי שמצוין בטבלה 1. התחליב צמיג ועבה מאוד, כך שבמהלך הליך ההכנה וההזרקה, עלול להיות אובדן מסוים, במיוחד בעת הכנת התמיסה למספר עכברים. אנו מציעים לחשב את נפח התחליב הסופי הדרוש על ידי הערכת יתר של מספר העכברים שיש לחסן לפחות פי 1.5-2.
  2. מניחים את הכד בקרח ומשתמשים במזרק הזכוכית עם מחט 18 גרם כדי להתחיל להתחלב את התמיסה.
    הערה: ניתן להכין את האמולסיה גם באמצעות אסטרטגיות אחרות, לדוגמה, על ידי חיבור שני מזרקי זכוכית ללא אוויר עם סטופקוק תלת-כיווני וערבוב התמיסה על ידי דחיפת הבוכנות קדימה ואחורה21,22.
  3. תחליב את הפתרון במשך 15 דקות לפחות; באופן כללי, 30 דקות של תחליב מספיק. כדי לבדוק את איכות התחליב מוסיפים טיפת תחליב במיכל שקוף מלא מים: אם הטיפה שומרת על המבנה שלה ונשארת שלמה, התחליב מוכן.
  4. הניחו את התחליב ישירות בתוך מזרקי 1 מ"ל שישמשו לחיסון ואחסנו אותם ב +4 מעלות צלזיוס עד לשימוש כדי לשמור על עובי התחליב ולמנוע שינויים או זיהום.

2. בחירת בעלי חיים וחיסון

  1. ברירה של בעלי חיים
    1. בחר עכברי C57BL/6J בוגרים משני המינים בגיל 8-10 שבועות עם משקל גוף אופטימלי של ~20 גרם. הקפידו לבחור עכברים תואמי גיל ומין לקבוצות ניסוי שונות מכיוון שהרגישות למחלות יכולה להשתנות עם הגיל והמין.
      הערה: עכברים צריכים להיות בעלי משקל גוף דומה ביום החיסון מכיוון שההליך הנוכחי מותאם לטווח משקל גוף מסוים (17-25 גרם).
    2. שכן בעלי חיים חד מיניים בקבוצות (n = 4-5 / כלוב) כדי למנוע בידוד חברתי בתנאים סטנדרטיים בכלובי עכבר פוליפרופילן בגודל 45 ס"מ x 25 ס"מ x 15 ס"מ ב 22 ± 2 ° C, תחת מחזור אור / חושך 12: 12 (אורות דולקים בשעה 08:00 בבוקר). לספק מזון ומים עד ליביטום.
      הערה: בסופו של דבר, כדי להגביל עוד יותר את השונות הפוטנציאלית של מהלך המחלה בבעלי החיים המחוסנים, אנו מציעים גם ליצור קבוצות ניסוי רבות מספיק. ישנם גם מחקרים 8,23 המתארים את עיתוי החיסון כמצב הקובע שונות בתוצאות EAE. לכן, אנו מציעים לבצע את החיסון בערך באותה שעה בכל בעלי החיים, רצוי בשעות האור של מחזור האור / חושך היומי23. כדי להגביל את הלחץ, עדיף לתפעל את בעלי החיים לפני יום החיסון ולסמן אותם כדי לזהות אותם בקלות להערכה יומית, למשל, גזיזת אוזניים או תג.
  2. הליך החיסון
    הערה: ודא כי ההליך מבוצע על ידי חוקר מנוסה כדי למזער את הלחץ עבור בעלי חיים ולייעל את החיסון. לפני תחילת החיסון, יש לבחור את שיטת ההרדמה בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולאתיות. המעבדה שלנו משתמשת בהרדמה קצרה עם איזופלורן.
    1. הרדמת העכבר: 4% איזופלורן להשראת הרדמה ו-1.5-2% איזופלורן לתחזוקת הרדמה. המתן עד שההרדמה תהיה יעילה והשתמש בצביטה בבוהן כף הרגל האחורית והקדמית כדי להעריך את רמת ההרדמה. כדי למנוע יובש בעיניים בזמן שהעכבר נמצא תחת הרדמה, יש להשתמש במשחת עיניים מאושרת על ידי וטרינר.
    2. הזרקת PT תוך ורידי בווריד הקאודלי לרוחב: חבר את זנב העכבר בעדינות עם תמיסת אתנול, הפועלת כמרחיב כלי דם, כדי להציג את הוורידים. התמקדו באחד משני הוורידים הצדיים של הזנב, ובעזרת מזרק 0.5 מ"ל המצויד במחט 30 גרם, הזריקו 500 ננוגרם של PT (כלומר, 100 מיקרוליטר של PT מדולל בתמיסה פיזיולוגית בריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל).
    3. הזרקה תת עורית של תחליב MOG35-55 : באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26 גרם, לבצע שלוש זריקות תת עוריות של תחליב מוכן בעבר: שניים מתחת לחלק הרוסטרלי של האגפים ואחד בבסיס הזנב. נפח התחליב המוזרק בכל אתר הוא 100 μL, לנפח כולל של 300 μL תחליב המוזרק בכל עכבר.
      הערה: יום החיסון נרשם כיום 0 לאחר החיסון (dpi); 48 שעות מאוחר יותר (כלומר, ב 2 dpi), יש צורך לבצע הזרקה נוספת תוך ורידי של PT שווה לזה שבוצע בעבר. ניתן לבצע את ההזרקה ללא הרדמה, באמצעות ריסון עכבר. ההליך המתואר כאן נועד לגרום ולשמור על הרדמה של העכברים במהלך הליך החיסון כדי למנוע אי נוחות ותנועות אפשריות של בעלי החיים או סיכונים הן לעכברים והן לחוקרים. לכן, אין הליכים כירורגיים. עם זאת, כדי לייעל את תהליכי הניסוי, חשוב לשמור על תנאים סטריליים מתאימים במהלך שלבים אלה ולעקוב אחר מצבו של העכבר לאחר הליכים אלה.
    4. כדי לוודא שהעכבר התאושש מהזריקות, הניחו אותו בכלוב נקי לאחר ההליכים והמתינו עד שיחזור להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה. לאחר שהעכבר התאושש לחלוטין, החזירו אותו לכלוב הביתי עם בעלי חיים אחרים.

3. מעקב EAE

  1. משקל גוף וצריכת מזון
    1. עקוב מדי יום אחר משקל הגוף (BW) של בעלי החיים, באמצעות איזון מדויק אלקטרוני, מכיוון שהירידה ב- BW היא אינדיקטור להתקדמות המחלה.
      הערה: ירידה זו לא תעלה על אחוז מסוים, בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית והאתית לטיפול בבעלי חיים. בדרך כלל, אם בעל חיים מאבד יותר מ -20% ממשקל הגוף ההתחלתי (כלומר, המשקל שנרשם ב 0 dpi), יש להקריב אותו כיישום של נקודת הקצה האנושית. שיטות המתת החסד כוללות הרדמה עמוקה ובלתי הפיכה לשאיפה (למשל, 5% איזופלורן) ואחריה עריפת ראש.
    2. עקוב אחר צריכת המזון (FI) - המזון שנאכל על ידי בעל חיים ביום (g∙day-1∙animal-1), שקילת כמות המזון במיכל הספציפי לפחות פעם בשבוע, וחלוקת כמות המזון הנאכל עבור הימים שחלפו בין שתי מדידות עוקבות ומספר בעלי החיים הנמצאים בכלוב.
      הערה: מדידה זו מאפשרת להעריך את צריכת המזון הממוצעת. בגלל המראה וההצטברות של סימני מחלה קליניים, הכוללים שיתוק של הגפיים, אנו מציעים להניח מעט מזון מושקה על רצפת הכלוב כאשר בעלי החיים אינם מסוגלים לעמוד בחוזקה על גפיהם האחוריות ולהגיע למיכל המזון או לבקבוק המים. כדי להעריך את צריכת המזון במהלך תקופת המעקב בצורה מדויקת ככל האפשר, מדדנו גם את המשקל היבש של מזון זה לפני שהרטבנו אותו עבור העכברים.
  2. הערכה של מחזוריות ייחום במהלך EAE
    1. בדוק את מחזור הייחום במשך שני מחזורים לפחות, והערכת מריחות הציטולוגיה של הנרתיק כפי שתוארו על ידי McLean et al.24. לסווג את השלב של מחזור הייחום בהתבסס על נוכחותם של שלושה סוגי תאים ראשוניים - תאי אפיתל גרעין, תאי אפיתל קשקש cornified, ו leukocytes - בדגימות כתם הנרתיק, כדלקמן:
      1. מסווגים כפרוסטרוס בהתבסס על נוכחות כמעט בלעדית של אשכולות של תאי אפיתל עגולים ומעוצבים היטב.
      2. לסווג כמו ייחום מבוסס על נוכחות דומיננטית של אשכולות צפופים של תאי אפיתל קשקש cornified.
      3. לסווג כמו metestrus מבוסס על נוכחות דומיננטית של לויקוציטים מוכתמים כהה קטנים נוכחות מינורית של תאי אפיתל קשקש cornified.
      4. לסווג כמו diestrus מבוסס על נוכחות דומיננטית מאוד של לויקוציטים מוכתמים כהים קטנים תאי אפיתל קשקש נדיר cornified יחד עם המראה האפשרי של תאי אפיתל גרעין.
        הערה: בעת הערכת המחלה בשני המינים, חשוב לבדוק את השונות בנקבות עקב מחזור הייחום. אנו מציעים להתמקד בהערכת מחזור הייחום, במיוחד בין השבוע הראשון והשני לאחר החיסון (כלומר, בשלב החריף של EAE). הוכח בעבר כי הליך החיסון גורם לשינויים הבולטים ביותר של מחזור הייחום בשלבזה 25. יתר על כן, חשוב לקחת בחשבון כי ביצוע המריחה כאשר בעל החיים מגיע לציון קליני גבוה (במיוחד >3) קשה בשל paresis האחורי ואת חוסר טונוס בגפיים האחוריות.
  3. ציון קליני
    1. בקש מחוקר עיוור להעריך את הציון הקליני של בעלי החיים מדי יום. הקצו לכל בעל חיים ציון מדורג מ-0 עד 5 (ראו טבלה 2) כדי להעריך את מהלך המחלה26 כפי שמתואר על ידי Racke7.
      הערה: בדומה לירידה במשקל הגוף, גם נקודת קצה הומנית נחוצה לעלייה בציונים הקליניים, בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית והאתית לטיפול בבעלי חיים. באופן כללי, אם בעל חיים אינו מסוגל עוד להאכיל את עצמו באופן אוטונומי (זה קורה בדרך כלל כאשר בעל חיים מגיע לפחות לציון 4, על פי הסולם שבו אנו משתמשים), יש להקריב אותו כיישום של נקודת הקצה ההומאנית.
  4. הערכת ביצועים מוטוריים על ידי מבחן רוטרוד
    הערה: הערכה של התקדמות EAE מתבצעת בדרך כלל על ידי הקצאת הציון הקליני מדי יום, אשר נעשה על ידי חוקר עיוור מאומן לחלוטין. עם זאת, זה יכול להיות שימושי כדי לאגף אותו עם הערכה כמותית ואובייקטיבית יותר של התקדמות המחלה. במחקר קודם26, מבחן רוטרוד שימש למדידת הביצועים המוטוריים של בעלי החיים המחוסנים. כפי שתואר על ידי ואן דן ברג ואחרים 27, כדי לקבל הערכה קלינית כמותית ומדויקת יותר של מהלך המחלה, הערכת הביצועים המוטוריים על ידי מבחן רוטרוד יכולה לתמוך בהערכת הציון הקליני. לתיאור מפורט ראו Van den Berg et al.27.
    1. תנו לעכברים לעבור רוטרוד מדי יום, החל מ 1 dpi עד הקורבן (כלומר, 28 dpi). כל סשן מורכב מהפעלה אחת של 300 שניות שבמהלכה יש להגדיל את מהירות המוט באופן ליניארי מ-4 ל-40 סל"ד.
    2. רשום את הציון של החיה. כאשר העכבר אינו מסוגל לשמור על שיווי משקלו ונופל מהמכשיר, הוא נופל על הקרקע ומפעיל חיישן, והזמן (ים) נרשם. לפיכך, הביצועים מנוקדים כהשהיה ליפול (ים).

כיתה סימן קליני תיאור
0 בריא לא נצפה סימן קליני. החיה מראה טון רגיל ותנועה של הזנב. הוא הולך בלי למעוד.
0.5 שער פגום החיה מטיילת תוך כדי הליכה על גריל.
1 זנב צולע כאשר החיה מורמת על ידי בסיס הזנב, הזנב צונח (זנב רפוי).
1.5 זנב רפוי ושער לקוי החיה מראה זנב רפוי, והיא מטיילת תוך כדי הליכה על גריל.
2 אטקסיה בעל החיים מתקשה לעמוד לאחר שהופנה על גבו.
2.5 אטקסיה ופרזיס של הגפיים האחוריות מפגני החיות אינם יכולים לעמוד על רגליהם לאחר שהופנו על גבם, והם מאבדים את הטון של אחת מגפיהם האחוריות.
3 שיתוק הגפיים האחוריות החיה מאבדת את הטון של שתי הגפיים האחוריות.
3.5 שיתוק של הגפיים האחוריות ו/או פרזיס של הגפה הקדמית החיה מאבדת את הטון של שתי הגפיים האחוריות וחלקית של הגפיים הקדמיות. למעשה, זה מראה על אובדן כוח באחיזה של הגפיים הקדמיות.
4 טטרה פרזיס החיה מאבדת לחלוטין את טון איבריה.
4.5 טטרה פרזיס וירידה בטמפרטורת הגוף החיה מאבדת לחלוטין את טון איבריה, והיא מראה ירידה בטמפרטורת הגוף (היא קרה).
5 גוסס או מת החיה גוססת (היא אינה מגיבה לשום גירוי) או מתה.

טבלה 2: מערכת ניקוד קלינית המשמשת להערכת התקדמות EAE.

4. הערכה של סימנים היסטופתולוגיים הנגרמים על ידי EAE ברמת חוט השדרה

הערה: כאן, אנו מדווחים בקצרה על ההליך להקריב את בעלי החיים ולאסוף את חוט השדרה כדי לבצע ניתוח היסטופתולוגי; לקבלת תיאור מפורט, עיין בהפניות אלה 10,26,28,29.

  1. קיבוע ודגימת רקמות
    הערה: לקבלת תיאור מפורט, עיין בהפניות אלה 10,26.
    1. להקריב את בעלי החיים ב 28 dpi במהלך השלב הכרוני של המחלה.
      1. מרדימים את העכברים בהרדמה עמוקה ובלתי הפיכה (הזרקה תוך צפקית של זולאזפם וטילטמין 80 מ"ג/ק"ג/קסילזין 10 מ"ג/ק"ג).
      2. יש לנקב את העכברים באמצעות תמיסת מלח ואחריה תמיסת פרפורמלדהיד (PFA) 4%.
        הערה: שימו לב בעת השימוש ב-PFA: מכיוון שהוא רעיל, הימנעו משאיפה, בליעה ומגע עם העור והעיניים באמצעות ציוד מגן אישי מתאים. שוקלים את האבקה, מכינים את התמיסה ומבצעים את הזילוח מתחת למכסה המנוע.
    2. הסר את חוט השדרה מעמוד השדרה30.
    3. אחסן את חוט השדרה בתמיסת 4% PFA למשך 24 שעות.
    4. בצע מספר שטיפות במאגר פוספט מי מלח 0.01 M (PBS).
    5. הטמע את חוטי השדרה בגושי פרפין30.
  2. הליכים היסטולוגיים
    הערה: לקבלת תיאור מפורט, ראה Montarolo et al.10.
    1. השתמש במיקרוטום כדי לחתוך קטעי חוט שדרה רוחביים בעובי 10 מיקרומטר ולאסוף אותם על שקופיות מצופות ג'לטין. כוון את מישור החתך כך שיתאים לציורים המתאימים לחלקים הרוחביים של אטלס חוט השדרהשל העכבר 31.
    2. לבצע את deparaffinization של סעיפים32.
    3. מכתימים את הקטע עם Hematoxylin ו Eosin32.
    4. לייבש את הסעיפים32.
    5. מכסים את החלקים באמצעי הרכבה ומניחים להם להתייבש בטמפרטורת החדר מתחת למכסה מנוע כימי.
      הערה: צביעת Hematoxylin-Eosin מאפשרת זיהוי של נוכחות של חדירות דלקתיות perivascular (PvIIs)26, אשר מוערך כסימן של המחלה28.
  3. ניתוח כמותי של חלקי חוט השדרה
    1. קבל תמונות של החלקים המוכתמים עם מיקרוסקופ אופטי מחובר למצלמה דיגיטלית עם מטרה 20x29.
    2. נתח את התמונה שנרכשה כדי לקבל את מספר PvIIs, מבוטא כמספר הסתננויות למ"מ2.
      הערה: לניתוח התמונות שנרכשו, כדאי לנצל את תוכנת ניתוח התמונות. ממצאים נוירופתולוגיים המוצגים בעבודה זו מכומתים ב-10 חתכים שלמים של חוט השדרה לכל עכבר (n = 8/קבוצה) המייצגים את כל רמות חוט השדרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מעקב EAE לאחר החיסון
זה הוערך כמתואר להלן.

משקל גוף וצריכת מזון
הניתוח הדו-כיווני של השונות (ANOVA) (מין וזמן כמשתנים בלתי תלויים) מראה ירידה ב-BW של חיות EAE משני המינים, במיוחד בשבוע השני לאחר האינדוקציה (F(1,57) = 4.952, p < 0.001; איור 2A). אולם הדימורפיזם המיני ב-BW נשמר תמיד (איור 2A). במונחים של אחוז BW (F(1,57) = 23.935, p < 0.001; איור 2B), גם זכרים וגם נקבות מציגים אובדן עצום בין 12 dpi ל-17 dpi (p < 0.001) בהשוואה ל-BW הראשוני, אך לעולם לא עולים על אובדן כולל של 20% (איור 2B). לכן, אף על פי שאיבוד BW מתחיל לפני הופעת המחלה, הוא מגיע למקסימום שלו במהלך השלב החריף של EAE (איור 2A,B). אין הבדלים בין המינים מבחינת אובדן BW. אולם נקבות נוטות לרדת יותר במשקל מוקדם יותר ולהתאושש פחות במהלך השלב הכרוני (השבוע השלישי עד הרביעי לאחר הזירוז) (איור 2B).

יתר על כן, ANOVA דו כיווני (מין וזמן כמשתנים בלתי תלויים) מראה גם ירידה משמעותית FI (F(9, 39) = 6.682, p < 0.001; איור 2C) בשני המינים, במיוחד בשבוע השני שלאחר החיסון, כתוצאה מעלייה בחומרת EAE, מה שהקשה על בעל החיים לגשת למזון שהונח במיכל העליון בכלוב. כפי שהצענו, המזון הונח לאחר מכן על רצפת הכלוב כדי להפחית לחץ נוסף על בעלי החיים. זה אפשר ל-FI לחזור לרמות התחלתיות (איור 2C), ול-BW להתאושש חלקית (איור 2A,B).

הערכת מחזור אסטרוס אצל הנקבות
ההשוואה בין הזמן שבילה בשלבים השונים של הייחום בוצעה באמצעות מבחן t של התלמיד. הניתוח מראה הבדלים בזמן המושקע בשלבים האסטרליים (כלומר, פרואסטרוס וייחום) בהשוואה לזה המושקע בשלב הלא אסטרלי (כלומר, מטסטרוס ודיסטרוס) בין השלב האסימפטומטי (לפני תחילת EAE) לבין השלב הסימפטומטי (לאחר תחילת EAE) (p = 0.042; איור 2D), בעיקר בשל עלייה בזמן השהייה בדיסטרוס במהלך השלבים הסימפטומטיים (p = 0.017) ונטייה בהפחתת זמן השהייה בפרואסטרוס (p = 0.08).

כבר תואר כי הליך האינדוקציה מוביל לשינוי מחזור הייחום אצל נקבות, במיוחד משפיע על proestrus25. במהלך שלב זה, רמות הולכות וגדלות של אסטרוגנים ידועים כבעלי השפעות אנטי דלקתיות ונוירופרוטקטיביות16 ולכן, ייתכן שהם אחראים לתפקיד המגן של הורמונים אלה במהלך השלב הפרה-סימפטומטי. עם זאת, כאשר רמת האסטרוגנים יורדת, כפי שאנו רואים בשלב שלאחר ההתפרצות, גם ההשפעות המגינות שלהם מסתיימות.

ציון קליני וביצועי רוטרוד
ANOVA הדו-כיווני (מין וזמן כמשתנים בלתי תלויים) מראה עלייה משמעותית בזמן בציון הקליני (CS) של גברים ונשים כאחד (F(56-813) = 27.951, p < 0.001; איור 3A). בפרט, החל מ-10 dpi, שני המינים מראים עלייה משמעותית ב-CS (p <-0.001), שנשמר עד לנקודת הקצה (28 dpi) (איור 3A). נקבות מציגות, גם אם לא באופן משמעותי (p = 0.156), CS גבוה יותר מאשר זכרים (איור 3A). במונחים של התפרצות מחלה, היא מתרחשת בדרך כלל בסביבות 10 dpi, עם נטייה להתפרצות מוקדמת יותר אצל נקבות מאשר אצל זכרים (איור 3B). יתר על כן, הנקבות מראות CS מצטבר גבוה יותר בהשוואה לזכרים (p = 0.017; איור 3C).

מסלול ביצועי הרוטרוד דומה להערכות הקליניות (איור 2D). החל מתחילת המחלה, הוא פוחת, ומגיע לביצועים המינימליים במהלך השבוע השני לאחר החיסון, בשלב החריף של EAE. ANOVA הדו-כיווני (מין וזמן כמשתנים בלתי תלויים) מראה ירידה משמעותית בזמן בביצועי הרוטרוד של זכרים ונקבות כאחד (F(46-673) = 5.365, p < 0.001; איור 3D). בפרט, הזכרים מציגים את הביצועים המינימליים ב- 16 dpi (p = 0.022) ואילו הנקבות ב- 17 dpi (p < 0.001). זכרים נוטים לתפקד טוב יותר מנקבות, במיוחד במהלך השלב הכרוני של המחלה (21-28 dpi), אולי כתוצאה מניתוח קיסרי נמוך יותר (איור 3A,D).

הערכה היסטופתולוגית של חוט השדרה
ANOVA חד-כיווני (מין כמשתנה בלתי תלוי) של PvIIs במקטעי חוט השדרה מדגיש הבדל ברור בין זכרים ונקבות (איור 4A). נקבות מראות מספר גבוה משמעותית של PvII מאשר זכרים (F(1,14)= 63.107, p < 0.001; איור 4B). נתונים אלה עשויים לשקף את ה- CS המצטבר הגבוה יותר, את ביצועי הרוטרוד הגרועים יותר, ואת המחלה האגרסיבית יותר שנצפתה אצל הנקבות, במיוחד במהלך השלב הכרוני של EAE.

נתונים אלה משקפים גם את העובדה שנקבות עכברים מציגות רגישות גבוהה יותר להתפתחות של EAE אגרסיבי יותר בהשוואה לזכרים14, וזה אחד ההבדלים העיקריים בין מודל מחלה זה לבין טרשת נפוצה המתרחשת בבני אדם. נשים מציגות התפרצות מוקדמת יותר של המחלה, יש שכיחות נמוכה למדי של צורות פרוגרסיביות ראשוניות, ומראות באופן כללי פחות התקדמות מוגבלות מאשר גברים 2,33,34.

Figure 1
איור 1: ייצוג זמני סכמטי של הליכים ניסיוניים. נוצר באמצעות BioRender.com. קיצורים: i.v. = תוך ורידי; s.c. = תת עורי; MOG35-55 = פפטיד גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין 35-55; = dpi = יום לאחר החיסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הערכת השפעות EAE על משקל הגוף, צריכת מזון בעכברים זכרים ונקבות ומחזור הייחום בעכברים נקבות. מיום החיסון (0 dpi) ועד יום הקורבן (28 dpi), הגרפים מראים (A) משקל גוף יומי, (B) אחוז ממשקל הגוף, ו-(C) הערכת צריכת מזון שבועית בבעלי חיים משני המינים (n = 15/קבוצה). (D) זמן השהייה (מבוטא כאחוז ממוצע של זמן) בשלבים השונים של מחזור הייחום, המוערך על ידי מריחות ציטולוגיה וגינלית, במהלך השלב האסימפטומטי (טרום ההתפרצות, העמודה השמאלית של הגרף) או השלב הסימפטומטי (לאחר ההתפרצות, העמודה הימנית של הגרף) בעכברות נקבות. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. ניתוח סטטיסטי גילה השפעה משמעותית עבור p≤ 0.05 (# = זכרים לעומת נקבות; * = השוואה בין נקודות זמן שונות). קיצורים: EAE = אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית; BW = משקל גוף; FI = צריכת מזון; dpi = יום לאחר החיסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הערכת הציון הקליני וביצועי הרוטרוד בעכברים זכרים ונקבות שנפגעו מ-EAE. (A) הערכת הציון הקליני היומי (מ-0 עד 28 dpi) בבעלי חיים משני המינים (n = 15/קבוצה). (B) יום הופעת המחלה (ממוצע dpi) בזכרים מושפעי EAE (עמודה שמאלית) ונקבות (עמודה ימנית) עכברים. (C) ציון קליני מצטבר ממוצע שאליו הגיעו זכרים מושפעי EAE (עמודה שמאלית) ונקבות עכברים (עמודה ימנית). (D) הערכה של ביצועי רוטרוד יומיים (הנמדדים כחביון של נפילה) מ-6 עד 28 dpi (ה-0 מייצג את ערכי הבסיס שהתקבלו ב-5 הימים הראשונים של הבדיקה) בבעלי חיים משני המינים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. ניתוח סטטיסטי גילה השפעה משמעותית עבור p≤ 0.05 (# = זכרים לעומת נקבות; * = השוואה בין נקודות זמן שונות). קיצורים: EAE = אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית; CS = ציון קליני; Cum CS = ציון קליני מצטבר; dpi = יום לאחר החיסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח דלקת בחוט השדרה של עכברים משני המינים שנפגעו מ-EAE. (A) תמונות מייצגות של קטעי חוט השדרה הרוחביים המוכתמים בהמטוקסילין-אאוסין מדגישות את נוכחותם של PvII (חצים) בעכברים זכרים (תמונה עליונה) ונקביים (תמונה תחתונה). (B) מדידת נוכחות PvII בעמוד השדרה של עכברים מושפעי EAE משני המינים (n = 8/קבוצה). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. ניתוח סטטיסטי גילה השפעה משמעותית עבור p ≤ 0.05 (# = זכרים לעומת נקבות). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (הגדלה פי 10). קיצורים: EAE = אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית; * = תעלה מרכזית; PvIIs = חדירות דלקתיות פריווסקולריות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול EAE המושרה על ידי MOG35-55 שתיארנו הוביל לפיתוח צורה כרונית של טרשת נפוצה בעכברי C57BL/6J 7,8,13. בתוצאות מייצגות אלה, דיווחנו כי בעלי חיים משני המינים שעברו את הליך החיסון פיתחו צורה כרונית של המחלה (כלומר, הם אינם מחלימים לחלוטין לאחר הופעת המחלה, הם צוברים גירעונות, ושומרים על ניתוח קיסרי לפחות של 1.5 בשלב הכרוני).

גם אם מחקרים רבים אינם מדווחים על הבדלים בין זכרים ונקבות במודלזה 14, רק מחקרים מעטים מתייחסים לשני המינים. עם זאת, בהתחשב בדימורפיזמים המיניים המשמעותיים המוצגים בטרשת נפוצה2, זה צריך להיות רלוונטי ביותר לחקור את תוצאות המחלה בשני המינים. הודות למחקרים עדכניים יותר הכוללים את שני המינים, נוכחות של דימורפיזם מיני מסוים תוארה גם ב- MOG35-55-induced EAE35. שמנו לב בעיקר שבנקבות, EAE המושרה על ידי MOG35-55 הוא בדרך כלל אגרסיבי יותר (בהתחשב ברגישות הגבוהה יותר של עכברות נקבות עם מודל זה)36, מכיוון שהן נוטות להיות בעלות התחלה מוקדמת יותר וציונים קליניים מצטברים גבוהים יותר, מה שמשקף דלקת מוגברת ברמת חוט השדרה מאשר זו שנצפתה אצל זכרים. מסקנה עיקרית אחת היא שפרוטוקול זה יכול לגרום ל-EAE בעכברים זכרים ונקבות כאחד, אך החוקרים חייבים לזכור כי היבטים מסוימים של המחלה עשויים להיות שונים בין שני המינים. לכן, קריטי לשקול כראוי את שאלת הניסוי העיקרית שיש להתייחס אליה, לבחור את המודל המועדף ביותר על בעלי חיים, ולהעריך את הצורך לכלול אחד או שני המינים.

שלבים קריטיים ופתרון בעיות אפשרי
מכיוון שמודלים שונים של טרשת נפוצה מייצרים כמה היבטים ספציפיים של המחלה, אך לא את כל6, הצעד הבסיסי הראשון הוא לבחור את המודל הנכון בהתחשב בצרכים הניסיוניים הספציפיים ובשאלות המדעיות שיש להתייחס אליהן. שנית, הליך החיסון צריך להתבצע על ידי מומחה כדי לוודא שהוא נעשה כראוי ולמנוע טעויות או שונות עקב נהלים לא מדויקים. בנוסף, על החוקר להיות מודע לתקנות צער בעלי חיים שאומצו על ידי המוסד המארח.

שלישית, האמולסיה צריכה להיות סטנדרטית בניסוי. יש לציין כי כל עכבר מפגין רגישות אופיינית לאינדוקציה, ולכן חלק מבעלי החיים עלולים לפתח מחלה פחות אגרסיבית או לא לפתח אותה כלל. במקרה כזה, ניתן לייעל את שכיחות המחלה וחומרתה על ידי התאמת כמות MOG35-55 הניתנת לעכברים. רביעית, למרות שהזרקת PT נמצאת בשימוש נרחב כדי להקל על השראת EAE בעכברים35,36, היא אינה הכרחית לכל פרוטוקול37,38. בהיעדר PT, עכברים בדרך כלל מפתחים צורה פחות חמורה ויותר משתנה של EAE39. יתר על כן, שונות נוספת יכולה להיגרם על ידי דרכים שונות של מתן PT (למשל, תוך ורידי לעומת intraperitoneal) ומכיוון שהעוצמה של PT תוארה כמשתנה בין אצוות. כדי להתגבר על בעיה זו, חשוב להתאים את עוצמת הקול בהתאם לעוצמה של כל אצווה בשימוש ולהכין את תמיסת PT כראוי40,41. בהתחשב במטרות הניסוי, בכישורים הטכניים של החוקרים ובאופטימיזציה של מחקר בבעלי חיים, חיוני לבחור את פרוטוקול האינדוקציה המתאים ביותר.

חמישית, כדי לאסוף נתונים בצורה אובייקטיבית יותר, מומלץ מאוד לתת ניקוד עיוור של תסמיני המחלה. יתר על כן, אנו מציעים ניקוד קליני עם הערכה כמותית ואובייקטיבית יותר של מהלך המחלה, כגון הערכת ביצועי הרוטרוד. לבסוף, בחירה נכונה של קבוצות ניסוי רבות היא בסיסית להשגת נתונים אמינים וברי השוואה (ראה פרוטוקול סעיף 2). יש לבצע חישובי גודל מדגם כדי להשיג את גדלי הקבוצה הדרושים, בהתאם לגודל האפקט הצפוי.

מגבלות עיקריות
ראשית, פרוטוקול זה של אינדוקציה יכול להוביל לתוצאות משתנות מאוד בבעלי החיים המחוסנים, במיוחד אם גודל הקבוצה אינו גדול מספיק או אם ההליך אינו מבוצע כראוי. לאחר מכן, ל-MOG35-55-induced EAE, כמו לכל מודל זמין אחר של טרשת נפוצה, יש כמה מגבלות (כלומר, הוא מספק מעט מאוד מידע על התקדמות הטרשת הנפוצה, תפקידם של תאי B במחלה, מנגנוני ה-inside-out, או קשיים בחקר רמיאלינציה)4,6. לכן, שוב, זה בסיסי לבחור כראוי את מודל הטרשת הנפוצה הדרוש כדי לענות על השאלה המדעית הספציפית. לבסוף, האתר העיקרי של הנזק מיוצג על ידי חוט השדרה, והפתולוגיה מובילה להופעת סימנים היסטופתולוגיים בצורה קאודלית-גולגולתית (כלומר, החל מחוט השדרה ועולה למוח). זה הפוך ממה שקורה אצל בני אדם ועשוי לייצג מגבלה ניכרת של המודל. עם זאת, ניתן גם להעריך כמה שינויים במוח, בהתחשב במטרות ספציפיות.

יתרונות
ראשית, מודל זה יכול לתרום באופן משמעותי להבנה של מנגנונים מתווכים חיסוניים היקפיים ולהעריך את התהליכים הנוירו-דלקתיים, ובאופן חלקי, דה-מיאלינציה במערכת העצבים המרכזית. לאחר מכן, מודל זה יכול להיות מיושם בכמה זנים ספציפיים של עכברים טרנסגניים כדי לחקור תוצאות טרשת נפוצה הקשורות לשינויים גנטיים ספציפיים.

יתרון נוסף הוא הערכה קלינית המבוססת על שתי שיטות: הערכת הציון הקליני ומבחן הרוטארוד. זה מוביל להערכה קלינית כמותית יותר, פחות סובייקטיבית ויותר מדויקת של מהלך המחלה. יתר על כן, כפי שציינו ואן דן ברג ואחרים, הערכה מבוססת רוטרוד נמצאת בקורלציה חזקה לשטח הפנים של נגעים דלקתיים במערכות המוטוריות של חוט השדרה27.

כפי שציינו קודם לכן, למרות שמודל זה אינו משחזר לחלוטין את הדימורפיזם המיני של טרשת נפוצה, אנו מאמינים שזה יתרון. השילוב של האינדוקציה עם גורמי סיכון אפשריים אחרים, במיוחד הסביבתיים, יכול לסייע בהבנת ההשפעות הספציפיות של גורמים אלה ובזיהוי תפקידם הספציפי בהתרחשות של כמה היבטים דימורפיים מינית של טרשת נפוצה. לבסוף, מודל זה נמצא בשימוש נרחב לפיתוח ובדיקה של מגוון רחב של תרופות טיפוליות ולכן, יש פוטנציאל לסייע בפיתוח גישות טיפוליות חדשות למחלה זו 4,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לאף אחד מהמחברים אין ניגודי עניינים להצהיר ביחס למחקר, למחבר ו/או לפרסום של מאמר זה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 ו- 2023-2027 למחלקה למדעי המוח ריטה לוי מונטלצ'יני; קרן קאבליירי-אוטולנגי, אורבסאנו, איטליה. BB היה עמית של INFRA-P, אזור פיימונטה (n.378-35) (2022-2023) ו-PRIN 2020-20203AMKTW. אנו מודים ל-Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) על התמיכה. דמי הפרסום נתמכו על ידי התרומה הנדיבה של Distretto Rotaract 2031, ובמיוחד, Rotaract Club Torino Nord-Est. אנו מודים לאיליין מילר על ההגהה של כתב היד שלנו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), Zurich, Switzerland. 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , Chapter 9, Unit 9.7 (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It's complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida--a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Chapter 16 - Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. , Academic Press. 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).

Tags

מדעי המוח גיליון 200 MOG35-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis מחלה דלקתית אוטואימונית כרונית מערכת העצבים המרכזית (CNS) שכיחות בין המינים צורות אגרסיביות היבטים קליניים תכונות רדיולוגיות תכונות פתולוגיות מודלים ניסיוניים של בעלי חיים אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) עכברי C57BL/6J זכרים ונקבות מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין פפטיד 35-55 (MOG35-55) חיסון צורה כרונית של המחלה ציון קליני יומי מוטורי ביצועים ניתוח היסטולוגי חוט השדרה

Erratum

Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

מידול טרשת נפוצה בשני המינים: MOG<sub>35-induced</sub> ניסיוני אוטואימוני אנצפלומיאליטיס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo,… More

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter