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Neuroscience

Modellazione della sclerosi multipla nei due sessi: encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG35-55

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65778
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,4
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

ERRATUM NOTICE

Summary

L'encefalomielite autoimmune sperimentale è uno dei modelli murini più utilizzati di sclerosi multipla. Nel protocollo attuale, i topi C57BL/6J di entrambi i sessi sono immunizzati con il peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina, con conseguente paresi ascendente della coda e degli arti. Qui discutiamo il protocollo di induzione e valutazione dell'EAE.

Abstract

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica autoimmune che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). È caratterizzata da una diversa prevalenza nei sessi, che colpisce più donne che uomini, e da esiti diversi, mostrando forme più aggressive negli uomini che nelle donne. Inoltre, la SM è altamente eterogenea in termini di aspetti clinici, caratteristiche radiologiche e patologiche. Pertanto, è necessario sfruttare modelli animali sperimentali che consentano di indagare il maggior numero possibile di aspetti della patologia. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) rappresenta uno dei modelli più utilizzati di SM nei topi, modellando diverse caratteristiche della malattia, dall'attivazione del sistema immunitario al danno al SNC. Qui descriviamo un protocollo per l'induzione di EAE in topi C57BL/6J sia maschi che femmine utilizzando l'immunizzazione con il peptide glicoproteico 35-55 (MOG35-55) degli oligodendrociti mielinici, che porta allo sviluppo di una forma cronica della malattia. Riportiamo anche la valutazione del punteggio clinico giornaliero e delle prestazioni motorie di questi topi per 28 giorni dopo l'immunizzazione (28 dpi). Infine, illustriamo alcune analisi istologiche di base a livello del SNC, concentrandoci sul midollo spinale come sede primaria del danno indotto dalla malattia.

Introduction

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica autoimmune che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). Mostra la presenza di infiltrazione perivascolare di cellule infiammatorie, demielinizzazione, perdita assonale e gliosi1. La sua eziologia rimane sconosciuta e i suoi aspetti clinici, radiografici e patologici suggeriscono una notevole eterogeneità nella malattia2.

A causa della sua eziologia e complessità sconosciute, al momento, nessun modello animale ricapitola tutte le caratteristiche cliniche e radiologiche mostrate nella SMumana 3,4. Tuttavia, vari modelli animali sono impiegati per studiare diversi aspetti della MS 3,4. In questi modelli, l'inizio della malattia è in genere estremamente artificiale e il periodo di insorgenza dei segni clinici è diverso tra gli esseri umani e i topi. Ad esempio, nell'uomo, i processi fisiopatologici alla base della malattia non vengono rilevati per anni prima dell'insorgenza delle manifestazioni cliniche. Al contrario, gli sperimentatori possono rilevare i sintomi nei modelli animali entro settimane o addirittura giorni dopo l'induzione della SM4.

Tre modelli animali di base producono le caratteristiche della demielinizzazione che sono caratteristiche della SM: quelli indotti da virus (ad esempio, il virus dell'encefalomielite murina di Theiler), quelli indotti da agenti tossici (ad esempio, cuprizone, lisolecitina) e le diverse varianti dell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE)5. Ogni modello aiuta a studiare alcuni aspetti specifici della malattia, ma nessuno replica tutte le caratteristiche della SM6. Pertanto, è fondamentale scegliere il modello corretto considerando le specifiche esigenze sperimentali e le questioni scientifiche da affrontare.

Grazie alle procedure di immunizzazione contro gli antigeni derivati dalla mielina, l'EAE è indotta dall'innesco di una risposta autoimmune ai componenti del SNC nei topi predisposti. L'interazione tra un'ampia gamma di meccanismi immunopatologici e neuropatologici provoca lo sviluppo dei principali tratti patologici della SM (cioè infiammazione, demielinizzazione, perdita assonale e gliosi) nei topi immunizzati 7,8. I topi iniziano a mostrare sintomi clinici intorno alla seconda settimana dopo l'immunizzazione e generalmente mostrano una paralisi ascendente dalla coda all'arto e all'arto anteriore. Il punteggio clinico (cioè la quantificazione dell'accumulo di deficit correlati alla malattia) è generalmente valutato utilizzando una scala a 5 punti7.

L'immunizzazione attiva con proteine o peptidi o il trasferimento passivo di cellule T encefalitogene possono essere utilizzate per indurre EAE in topi con diversi background genetici (ad esempio, SJL/J, C57BL/6 e topi non obesi-diabetici (NOD)). La proteina proteolipidica della mielina (PLP), la proteina basica della mielina (MBP) e la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) sono esempi di proteine del sistema nervoso centrale da cui vengono solitamente prodotti gli immunogeni. In particolare, i topi SJL/J immunizzati con l'epitopo immunodominante di PLP (PLP139−151) sviluppano un decorso di malattia recidivante-remittente (RR), mentre i topi C57BL/6J immunizzati con il peptide immunodominante MOG35-55 mostrano EAE di natura cronica1. Nonostante alcune limitazioni, come la scarsità di informazioni sulla progressione della SM, il ruolo delle cellule B nella malattia, i meccanismi inside-out o le difficoltà nello studio della rimielinizzazione, i modelli EAE hanno contribuito enormemente alla comprensione dei processi autoimmuni e neuroinfiammatori, aumentando le conoscenze nel campo della SM e consentendo così lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per questa malattia4, 6. Introduzione

Nel presente lavoro, ci siamo concentrati su una particolare forma di EAE attivo, la formaindotta dal peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina 35-55 (MOG35-55) 9,10,11,12. L'EAE indotta da MOG35-55 modella una forma cronica di SM. Dopo l'immunizzazione, i topi vanno incontro a una fase asintomatica entro la prima settimana dopo l'immunizzazione, quindi la malattia insorge tipicamente durante la seconda settimana dopo l'immunizzazione, mentre tra la terza e la quarta settimana dopo l'immunizzazione, la malattia diventa cronica, senza possibilità di pieno recupero dai deficit accumulati 7,8,13. È interessante notare che nella maggior parte degli studi presentiin letteratura non si osservano differenze tra maschi e femmine in termini di incidenza, insorgenza della malattia, decorso o progressione, anche se un numero inferiore di studi confronta la malattia nei maschi e nelle femmine.

Al contrario, negli esseri umani, questi parametri sono noti per essere fortemente dimorfici sessualmente2. La sclerosi multipla colpisce più le donne che gli uomini; Tuttavia, gli uomini generalmente sviluppano una forma più aggressiva della malattia2. Queste evidenze hanno suggerito un ruolo essenziale, oltre che complesso, degli ormoni gonadici15; Tuttavia, il ruolo e il meccanismo d'azione degli ormoni sessuali nella patologia rimangono poco chiari. Inoltre, i dati provenienti da modelli animali supportano l'idea che sia gli estrogeni che gli androgeni esercitino effetti positivi su diversi tratti della patologia in modo sesso-specifico 16,17.

Alcuni studi suggeriscono anche effetti neuroprotettivi, promielinizzanti e antinfiammatori del progesterone18 e, sebbene le prove nei pazienti con SM siano scarse18, gli steroidi neuroattivi (cioè steroidi sintetizzati de novo dal sistema nervoso, come il pregnenolone, il tetraidroprogesterone e il diidroprogesterone) potrebbero anche influenzare il decorso patologico19. Collettivamente, questi dati supportano l'idea che gli ormoni sessuali prodotti sia perifericamente che all'interno del sistema nervoso centrale abbiano un ruolo importante e specifico per sesso nell'insorgenza e nella progressione della malattia. Pertanto, nel presente lavoro, sollecitiamo la raccolta di dati separati da animali maschi e femmine.

Dal punto di vista istopatologico, la sostanza bianca del midollo spinale funge da sito principale di lesione del SNC in questo modello, che è caratterizzato da regioni multifocali e confluenti di infiltrazione infiammatoria mononucleare e demielinizzazione8. Pertanto, nel descrivere questo protocollo per l'induzione di EAE indotta da MOG35-55 in topi C57BL/6J, prenderemo in considerazione l'esito della malattia nei due sessi e forniremo alcune informazioni istopatologiche riguardanti il midollo spinale.

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Protocol

La cura e la movimentazione degli animali nel presente lavoro è stata eseguita secondo la Direttiva del Consiglio dell'Unione Europea del 22settembre 2010 (2010/63/UE); tutte le procedure riportate nel presente studio sono state approvate dal Ministero della Salute (407/2018-PR) e dal Comitato Etico dell'Università di Torino (Progetto n° 360384). Suggeriamo di conformarsi al disegno sperimentale alle linee guida ARRIVE originariamente pubblicate da Kilkenny et al. nel 201020. Prima di iniziare, assicurarsi che siano disponibili i materiali necessari (vedi Tabella dei materiali). Sterilizzare in autoclave tutta la vetreria e gli utensili utilizzati per la preparazione dell'emulsione MOG35-55 . Una sintesi delle procedure sperimentali è rappresentata nella Figura 1.

1. Preparazione dell'emulsione MOG35-55

NOTA: Per preparare l'emulsione sono necessari MOG35-55, adiuvante di Freud incompleto (IFA), Mycobacterium Tuberculosis ceppo H37Ra (MT) e soluzione fisiologica (vedi Tabella dei materiali).

ATTENZIONE: La MT uccisa dal calore può stimolare la risposta immunitaria innata. Evitare l'inalazione, l'ingestione e il contatto con la pelle e gli occhi utilizzando dispositivi di protezione individuale adeguati e pesando MT in una bilancia di precisione coperta sotto il cofano.

Soluzione Composizione Note
2 mg/mL di soluzione peptidica MOG35-55 Peptide MOG35-55 liofilizzato diluito in soluzione fisiologica alla concentrazione di 2 mg/mL Conservare la soluzione già diluita a -80 °C.
Soluzione PT 5 μg/mL PT liofilizzato diluito in soluzione fisiologica alla concentrazione di 5 μg/mL. Conservare la soluzione già diluita a -80 °C.
Emulsione Il volume totale di emulsione necessario per ciascun topo da immunizzare è di 300 μL così suddiviso: Per evitare alterazioni o contaminazioni, preparare l'emulsione il giorno dell'immunizzazione.
200 μg/topo di MOG35-55 , cioè 100 μL di MOG35-55 2 mg/mL di soluzione.
50 μL di soluzione fisiologica
150 μL di IFA
4 mg/mL MT, cioè 1,2 mg/topo
Soluzione fisiologica Cloruro di sodio 0,9% diluito in acqua distillata.

Tabella 1: Composizione delle soluzioni utilizzate per la procedura di immunizzazione.

  1. Preparare la soluzione in un becher di vetro, aggiungendo prima la componente liquida e infine il MT.
    NOTA: Il volume totale di emulsione necessario per ciascun topo da immunizzare è di 300 μL, suddiviso come indicato nella Tabella 1. L'emulsione è molto viscosa e densa, quindi durante la procedura di preparazione e iniezione, potrebbe esserci qualche perdita, soprattutto quando si prepara la soluzione per alcuni topi. Suggeriamo di calcolare il volume finale di emulsione necessario sovrastimando il numero di topi da immunizzare di almeno 1,5-2 volte.
  2. Immergere il becher nel ghiaccio e utilizzare la siringa di vetro con un ago da 18 G per iniziare ad emulsionare la soluzione.
    NOTA: L'emulsione può essere preparata anche utilizzando altre strategie, ad esempio collegando le due siringhe di vetro air-free con un rubinetto a tre vie e mescolando la soluzione spingendo avanti e indietro gli stantuffi21,22.
  3. Emulsionare la soluzione per almeno 15 min; Generalmente, 30 minuti di emulsione sono sufficienti. Per verificare la qualità dell'emulsione, aggiungere una goccia di emulsione in un contenitore trasparente riempito d'acqua: se la goccia mantiene la sua struttura e rimane intatta, l'emulsione è pronta.
  4. Posizionare l'emulsione direttamente all'interno delle siringhe da 1 mL che verranno utilizzate per l'immunizzazione e conservarle a +4 °C fino al momento dell'utilizzo per preservare lo spessore dell'emulsione ed evitare alterazioni o contaminazioni.

2. Selezione e immunizzazione degli animali

  1. Selezione degli animali
    1. Selezionare topi adulti C57BL/6J di entrambi i sessi a 8-10 settimane di età con un peso corporeo ottimale di ~20 g. Assicurati di selezionare topi abbinati per età e sesso per diversi gruppi sperimentali perché la suscettibilità alla malattia può variare con l'età e il sesso.
      NOTA: I topi dovrebbero avere un peso corporeo comparabile il giorno dell'immunizzazione perché la presente procedura è ottimizzata per un certo intervallo di peso corporeo (17-25 g).
    2. Alloggiare animali dello stesso sesso in gruppi (n = 4-5/gabbia) per evitare l'isolamento sociale in condizioni standard in gabbie per topi in polipropilene da 45 cm x 25 cm x 15 cm a 22 ± 2 °C, con ciclo luce/buio inferiore alle 12:12 (luci accese alle 08:00). Fornire cibo e acqua ad libitum.
      NOTA: Infine, per limitare ulteriormente la potenziale variabilità del decorso della malattia negli animali immunizzati, suggeriamo anche di formare gruppi sperimentali sufficientemente numerosi. Ci sono anche studi 8,23 che descrivono la tempistica dell'immunizzazione come una condizione che determina la variazione dell'esito dell'EAE. Pertanto, suggeriamo di eseguire l'immunizzazione approssimativamente alla stessa ora in tutti gli animali, preferibilmente durante le ore di luce del ciclo giorno/buio23. Per limitare lo stress, è preferibile manipolare gli animali prima del giorno dell'immunizzazione e contrassegnarli per identificarli facilmente per la valutazione quotidiana, ad esempio ritagliando le orecchie o etichettandole.
  2. La procedura di immunizzazione
    NOTA: Assicurarsi che la procedura sia eseguita da uno sperimentatore esperto per ridurre al minimo lo stress per gli animali e ottimizzare l'immunizzazione. Prima di iniziare l'immunizzazione, selezionare il metodo di anestesia in conformità con le linee guida del comitato etico e di cura degli animali istituzionali. Il nostro laboratorio utilizza l'anestesia breve con isoflurano.
    1. Anestetizzare il topo: isoflurano al 4% per l'induzione dell'anestesia e isoflurano all'1,5-2% per il mantenimento dell'anestesia. Attendere che l'anestesia sia efficace e utilizzare un pizzico di dita del piede posteriore e anteriore per valutare il livello di anestesia. Per prevenire la secchezza degli occhi mentre il topo è sotto anestesia, utilizzare un unguento per gli occhi approvato dal veterinario.
    2. Iniezione endovenosa PT nella vena caudale laterale: tappare delicatamente la coda del topo con una soluzione di etanolo, che funge da vasodilatatore, per visualizzare le vene. Mettere a fuoco una delle due nervature laterali della coda e, utilizzando una siringa da 0,5 mL dotata di un ago da 30 G, iniettare 500 ng di PT (cioè 100 μL di PT diluiti in soluzione fisiologica alla concentrazione di 5 μg/mL).
    3. Iniezione sottocutanea dell'emulsione MOG35-55 : utilizzando la siringa da 1 mL con ago da 26 G, eseguire tre iniezioni sottocutanee dell'emulsione precedentemente preparata: due sotto la parte rostrale dei fianchi e una alla base della coda. Il volume di emulsione iniettato in ciascun sito è di 100 μL, per un volume totale di 300 μL di emulsione iniettata in ciascun topo.
      NOTA: Il giorno dell'immunizzazione viene registrato come giorno 0 dopo l'immunizzazione (dpi); 48 ore dopo (cioè a 2 dpi), è necessario eseguire un'altra iniezione endovenosa di PT uguale a quella precedentemente eseguita. È possibile eseguire l'iniezione senza anestesia, utilizzando un sistema di ritenuta per topi. La procedura qui descritta ha lo scopo di indurre e mantenere l'anestesia dei topi durante la procedura di immunizzazione per evitare possibili disagi e movimenti degli animali o rischi sia per i topi che per gli sperimentatori. Pertanto, non ci sono procedure chirurgiche. Tuttavia, per ottimizzare i processi sperimentali, è importante mantenere condizioni di sterilità appropriate durante queste fasi e monitorare le condizioni del topo dopo queste procedure.
    4. Per verificare che il topo si sia ripreso dalle iniezioni, metterlo in una gabbia pulita dopo le procedure e attendere che abbia ripreso conoscenza a sufficienza per mantenere il decubito sternale. Dopo che il topo si è completamente ripreso, rimettilo nella gabbia di casa con altri animali.

3. Follow-up dell'EAE

  1. Peso corporeo e assunzione di cibo
    1. Monitorare quotidianamente il peso corporeo (BW) degli animali, utilizzando una bilancia elettronica di precisione, perché la diminuzione del peso corporeo è un indicatore della progressione della malattia.
      NOTA: Questa diminuzione non deve superare una certa percentuale, secondo le linee guida del comitato istituzionale ed etico per la cura degli animali. Di solito, se un animale perde più del 20% del peso corporeo iniziale (cioè il peso registrato a 0 dpi), dovrebbe essere sacrificato come applicazione del punto finale umano. I metodi di eutanasia prevedono l'anestesia profonda irreversibile per inalazione (ad esempio, isoflurano al 5%) seguita da decapitazione.
    2. Monitorare l'assunzione di cibo (FI) - il cibo consumato da un animale in un giorno (g∙giorno-1∙animale-1), pesando la quantità di cibo nell'apposito contenitore almeno una volta alla settimana, e dividendo la quantità di cibo consumato per i giorni trascorsi tra due misurazioni sequenziali e il numero di animali presenti nella gabbia.
      NOTA: Questa misurazione consente di stimare l'assunzione media di cibo. A causa della comparsa e dell'accumulo di segni clinici di malattia, che comportano la paralisi degli arti, si consiglia di posizionare del cibo annaffiato sul pavimento della gabbia quando gli animali non sono in grado di stare saldamente in piedi sugli arti posteriori e raggiungere il contenitore del cibo o la bottiglia d'acqua. Per valutare l'assunzione di cibo durante il periodo di follow-up nel modo più preciso possibile, abbiamo anche misurato il peso secco di questo alimento prima di bagnarlo per i topi.
  2. Valutazione della ciclicità estrale durante l'EAE
    1. Controllare il ciclo estrale per almeno due cicli, valutando gli strisci citologici vaginali come descritto da McLean et al.24. Classificare la fase del ciclo estrale in base alla presenza di tre tipi di cellule primarie - cellule epiteliali nucleate, cellule epiteliali squamose cornificate e leucociti - nei campioni di striscio vaginale, come segue:
      1. Classificare come proestro in base alla presenza quasi esclusiva di gruppi di cellule epiteliali nucleate rotonde e ben formate.
      2. Classificare come estro in base alla presenza predominante di ammassi densamente impacchettati di cellule epiteliali squamose cornificate.
      3. Classificare come metestro in base alla presenza predominante di piccoli leucociti colorati di scuro e alla minore presenza di cellule epiteliali squamose cornificate.
      4. Classificazione come diestro in base alla presenza altamente predominante di piccoli leucociti colorati di scuro e rare cellule epiteliali squamose cornificate insieme alla possibile comparsa di cellule epiteliali nucleate.
        NOTA: Quando si valuta la malattia in entrambi i sessi, è importante verificare la variabilità nelle femmine dovuta al ciclo estrale. Suggeriamo di concentrarsi sulla valutazione del ciclo estrale, soprattutto tra la prima e la seconda settimana dopo l'immunizzazione (cioè durante la fase acuta dell'EAE). È stato precedentemente dimostrato che la procedura di immunizzazione provoca le alterazioni più pronunciate del ciclo estrale all'interno di questa fase25. Inoltre, è importante considerare che l'esecuzione dello striscio quando l'animale raggiunge un punteggio clinico elevato (soprattutto >3) è difficoltosa a causa della paresi posteriore e della mancanza di tono negli arti posteriori.
  3. Punteggio clinico
    1. Chiedere a uno sperimentatore in cieco di valutare quotidianamente il punteggio clinico degli animali. Assegnare a ciascun animale un punteggio da 0 a 5 (vedere Tabella 2) per valutare il decorso della malattia26 come descritto da Racke7.
      NOTA: Analogamente alla diminuzione del peso corporeo, è necessario anche un endpoint umano per l'aumento dei punteggi clinici, secondo le linee guida del comitato istituzionale ed etico per la cura degli animali. Generalmente, se un animale non è più in grado di nutrirsi autonomamente (questo di solito accade quando un animale raggiunge almeno il punteggio di 4, secondo la scala che utilizziamo), dovrebbe essere sacrificato come applicazione del punto finale umano.
  4. Valutazione delle prestazioni del motore mediante test rotarod
    NOTA: La valutazione della progressione dell'EAE viene solitamente eseguita assegnando il punteggio clinico giornalmente, che viene eseguito da uno sperimentatore in cieco completamente addestrato. Tuttavia, potrebbe essere utile affiancarla a una valutazione più quantitativa e oggettiva della progressione della malattia. In un precedente studio26, il test rotarod è stato utilizzato per misurare le prestazioni motorie degli animali immunizzati. Come descritto da van den Berg et al.27, per avere una valutazione clinica più quantitativa e precisa del decorso della malattia, la valutazione delle prestazioni motorie mediante il test rotarod può supportare la valutazione del punteggio clinico. Per una descrizione dettagliata, vedi van den Berg et al.27.
    1. Lascia che i topi si sottopongano a sessioni di rotarod ogni giorno, a partire da 1 dpi fino al sacrificio (cioè 28 dpi). Ogni sessione consiste in una singola sessione di 300 s durante la quale la velocità dell'asta deve essere aumentata linearmente da 4 a 40 giri/min.
    2. Registra il punteggio dell'animale. Quando il mouse non è in grado di mantenere l'equilibrio e cade dal dispositivo, cade a terra e attiva un sensore e viene registrato il tempo o i tempi. Pertanto, le prestazioni vengono valutate come latenza per cadere (s).

Grado Segni clinici Descrizione
0 Sano Nessun segno clinico osservato. L'animale mostra un tono normale e il movimento della coda. Cammina senza inciampare.
0.5 Cancello danneggiato L'animale inciampa mentre cammina su una griglia.
1 Coda floscia Quando l'animale viene afferrato per la base della coda, la coda si abbassa (coda flaccida).
1.5 Coda floscia e cancello compromesso L'animale mostra una coda flaccida e inciampa mentre cammina su una griglia.
2 Atassia L'animale mostra difficoltà a stare in piedi una volta girato sul dorso.
2.5 Atassia e paresi degli arti posteriori L'animale non può stare in piedi una volta che è stato girato sulla schiena e perde il tono di uno dei suoi arti posteriori.
3 Paralisi degli arti posteriori L'animale perde il tono di entrambi gli arti posteriori.
3.5 Paralisi degli arti posteriori e/o paresi degli arti anteriori L'animale perde il tono di entrambi gli arti posteriori e parzialmente degli arti anteriori. Infatti, mostra una perdita di forza nella presa degli arti anteriori.
4 Tetra paresi L'animale perde completamente il tono delle sue membra.
4.5 Tetraparesi e diminuzione della temperatura corporea L'animale perde completamente il tono degli arti e mostra una diminuzione della temperatura corporea (ha freddo).
5 Morire o morire L'animale sta morendo (non risponde a nessuno stimolo) o è morto.

Tabella 2: Sistema di punteggio clinico utilizzato per valutare la progressione dell'EAE.

4. Valutazione dei segni istopatologici indotti da EAE a livello del midollo spinale

NOTA: Di seguito, riportiamo brevemente la procedura per sacrificare gli animali e prelevare il midollo spinale per eseguire l'analisi istopatologica; Per una descrizione dettagliata, vedere questi riferimenti 10,26,28,29.

  1. Fissazione e prelievo di tessuti
    NOTA: Per una descrizione dettagliata, vedere questi riferimenti10,26.
    1. Sacrificare gli animali a 28 dpi durante la fase cronica della malattia.
      1. Anestetizzare i topi mediante anestesia profonda irreversibile (iniezione intraperitoneale di Zolazepam e Tiletamina 80 mg/kg / Xilazina 10 mg/kg).
      2. Perfondere per via transcardiaca i topi con una soluzione salina seguita da una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4%.
        NOTA: Prestare attenzione durante l'utilizzo del PFA: poiché è tossico, evitare l'inalazione, l'ingestione e il contatto con la pelle e gli occhi utilizzando adeguati dispositivi di protezione individuale. Pesare la polvere, preparare la soluzione ed eseguire la perfusione sotto il cofano.
    2. Rimuovere il midollo spinale dalla colonna vertebrale30.
    3. Conservare il midollo spinale in una soluzione di PFA al 4% per 24 ore.
    4. Eseguire diversi lavaggi in tampone fosfato salino (PBS) da 0,01 M.
    5. Incorporare il midollo spinale in blocchi di paraffina30.
  2. Procedure istologiche
    NOTA: Per una descrizione dettagliata, vedere Montarolo et al.10.
    1. Utilizzare un microtomo per tagliare sezioni trasversali del midollo spinale spesse 10 μm e raccoglierle su vetrini rivestiti di gelatina. Orientare il piano di sezionamento in modo che corrisponda ai disegni corrispondenti alle sezioni trasversali dell'atlante del midollo spinale del topo31.
    2. Eseguire la deparaffinizzazione delle sezioni32.
    3. Colorare la sezione con ematossilina ed eosina32.
    4. Disidratare le sezioni32.
    5. Coprire le sezioni con un mezzo di montaggio e lasciarle asciugare a temperatura ambiente sotto una cappa chimica.
      NOTA: La colorazione ematossilina-eosina consente di rilevare la presenza degli infiltrati infiammatori perivascolari (PvII)26, che viene valutata come segno della malattia28.
  3. Analisi quantitativa delle sezioni del midollo spinale
    1. Acquisire le immagini delle sezioni colorate con un microscopio ottico collegato a una fotocamera digitale con obiettivo 20x29.
    2. Analizzare l'immagine acquisita per ottenere il numero di PvII, espresso come numero di infiltrati per mm2.
      NOTA: Per l'analisi delle immagini acquisite è utile avvalersi di software di analisi delle immagini. I risultati neuropatologici presentati in questo lavoro sono quantificati in 10 sezioni trasversali complete del midollo spinale per topo (n = 8/gruppo) rappresentative dei livelli dell'intero midollo spinale.

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Representative Results

Follow-up dell'EAE dopo l'immunizzazione
Questo è stato valutato come descritto di seguito.

Peso corporeo e assunzione di cibo
L'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA) (sesso e tempo come variabili indipendenti) mostra una diminuzione del peso corporeo degli animali EAE di entrambi i sessi, soprattutto entro la seconda settimana dopo l'induzione (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figura 2A). Tuttavia, il dimorfismo sessuale nella BW viene sempre mantenuto (Figura 2A). In termini di percentuale di BW (F(1,57) = 23,935, p < 0,001; Figura 2B), sia i maschi che le femmine mostrano un'enorme perdita tra i 12 dpi e i 17 dpi (p < 0,001) rispetto al BW iniziale, ma non superano mai una perdita totale del 20% (Figura 2B). Pertanto, sebbene la perdita di BW inizi prima dell'insorgenza della malattia, raggiunge il suo massimo durante la fase acuta dell'EAE (Figura 2A,B). Non ci sono differenze tra i sessi in termini di perdita di BW. Tuttavia, le femmine tendono a perdere più peso prima e a recuperare meno durante la fase cronica (terza-quarta settimana dopo l'induzione) (Figura 2B).

Inoltre, anche l'ANOVA bidirezionale (sesso e tempo come variabili indipendenti) mostra una significativa diminuzione di FI (F(9, 39) = 6.682, p < 0.001; Figura 2C) in entrambi i sessi, in particolare durante la seconda settimana post-immunizzazione, a causa dell'aumento della gravità dell'EAE, che ha reso più difficile per l'animale accedere al cibo posto nel contenitore superiore della gabbia. Come abbiamo suggerito, il cibo è stato successivamente messo sul pavimento della gabbia per ridurre ulteriormente lo stress degli animali. Ciò ha permesso al FI di tornare ai livelli iniziali (Figura 2C) e al BW di riprendersi parzialmente (Figura 2A,B).

Valutazione del ciclo estrale nelle femmine
Il confronto tra il tempo trascorso nelle diverse fasi dell'estro è stato eseguito utilizzando il test t di Student. L'analisi mostra differenze nel tempo trascorso nelle fasi estrali (cioè proestro ed estro) rispetto a quello trascorso nella fase non estrale (cioè metestro e diestro) tra la fase asintomatica (prima dell'insorgenza dell'EAE) e la fase sintomatica (dopo l'insorgenza dell'EAE) (p = 0,042; Figura 2D), principalmente a causa di un aumento del tempo trascorso in diestro durante le fasi sintomatiche (p = 0,017) e di una tendenza a ridurre il tempo trascorso in proestro (p = 0,08).

E' già stato descritto che la procedura di induzione porta ad un'alterazione del ciclo estrale nelle femmine, interessando in particolare il proestro25. Durante questa fase, è noto che l'aumento dei livelli di estrogeni esercita effetti antinfiammatori e neuroprotettivi16 e, quindi, è possibile che sia responsabile del ruolo protettivo di tali ormoni durante la fase presintomatica. Tuttavia, quando il livello di estrogeni diminuisce, come vediamo nella fase post-insorgenza, terminano anche i loro effetti protettivi.

Punteggio clinico e prestazioni del rotarod
L'ANOVA bidirezionale (sesso e tempo come variabili indipendenti) mostra un significativo aumento del tempo nel punteggio clinico (CS) sia dei maschi che delle femmine (F(56-813) = 27.951, p < 0.001; Figura 3A). In particolare, a partire da 10 dpi, entrambi i sessi mostrano un aumento significativo del CS (p < 0,001), che si mantiene fino all'endpoint (28 dpi) (Figura 3A). Le femmine mostrano, anche se non in modo significativo (p = 0,156), un CS più elevato rispetto ai maschi (Figura 3A). In termini di insorgenza della malattia, si verifica generalmente intorno ai 10 dpi, con una tendenza ad esordio più precoce nelle femmine rispetto ai maschi (Figura 3B). Inoltre, le femmine mostrano un CS cumulativo significativamente più elevato rispetto ai maschi (p = 0,017; Figura 3C).

Il corso delle prestazioni di rotarod assomiglia alle valutazioni cliniche (Figura 2D). A partire dall'esordio della malattia, diminuisce, raggiungendo la prestazione minima durante la seconda settimana dopo l'immunizzazione, nella fase acuta dell'EAE. L'ANOVA bidirezionale (sesso e tempo come variabili indipendenti) mostra una significativa diminuzione nel tempo delle prestazioni del rotarod sia nei maschi che nelle femmine (F(46-673) = 5,365, p < 0,001; Figura 3D). In particolare, i maschi mostrano le prestazioni minime a 16 dpi (p = 0,022) mentre le femmine a 17 dpi (p < 0,001). I maschi tendono a ottenere prestazioni migliori rispetto alle femmine, specialmente durante la fase cronica della malattia (21-28 dpi), probabilmente come conseguenza di una CS più bassa (Figura 3A,D).

Valutazione istopatologica del midollo spinale
L'ANOVA unidirezionale (sesso come variabile indipendente) dei PvII nelle sezioni del midollo spinale evidenzia una chiara differenza tra maschi e femmine (Figura 4A). Le femmine mostrano un numero significativamente più alto di PvII rispetto ai maschi (F(1,14)= 63.107, p < 0.001; Figura 4B). Questi dati riflettono probabilmente la CS cumulativa più elevata, le peggiori prestazioni di rotarod e la malattia più aggressiva osservata nelle femmine, specialmente durante la fase cronica dell'EAE.

Questi dati riflettono anche il fatto che i topi femmina mostrano una maggiore suscettibilità allo sviluppo di EAE più aggressivi rispetto ai maschi14, che è una delle principali differenze tra questo modello di malattia e la SM che si verifica negli esseri umani. Le donne mostrano un esordio precoce della malattia, hanno una prevalenza moderatamente inferiore di forme primarie progressive e mostrano una progressione della disabilità complessivamente inferiore rispetto agli uomini 2,33,34.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione temporale schematica delle procedure sperimentali. Creato con BioRender.com. Abbreviazioni: i.v. = endovenoso; s.c. = sottocutaneo; MOG35-55 = peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina 35-55; = dpi = giorno dopo l'immunizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Valutazione degli effetti dell'EAE sul peso corporeo, sull'assunzione di cibo nei topi maschi e femmine e sul ciclo estrale nei topi femmine. Dal giorno dell'immunizzazione (0 dpi) fino al giorno del sacrificio (28 dpi), i grafici mostrano (A) il peso corporeo giornaliero, (B) la percentuale del peso corporeo e (C) la valutazione settimanale dell'assunzione di cibo negli animali di entrambi i sessi (n = 15/gruppo). (D) Tempo trascorso (espresso come percentuale media di tempo) nelle diverse fasi del ciclo estrale, valutato mediante strisci citologici vaginali, durante la fase asintomatica (pre-insorgenza, colonna di sinistra del grafico) o la fase sintomatica (post-insorgenza, colonna di destra del grafico) nei topi femmine. I dati sono presentati come media ± SEM. L'analisi statistica ha rivelato un effetto significativo per p≤ 0,05 (# = maschi vs. femmine; * = confronto tra diversi punti temporali). Abbreviazioni: EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale; BW = peso corporeo; FI = assunzione di cibo; DPI = giorno dopo l'immunizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Valutazione del punteggio clinico e delle prestazioni di rotarod in topi maschi e femmine affetti da EAE. (A) Valutazione del punteggio clinico giornaliero (da 0 a 28 dpi) negli animali di entrambi i sessi (n = 15/gruppo). (B) Giorno di insorgenza della malattia (dpi medio) nei topi maschi affetti da EAE (colonna sinistra) e femmine (colonna destra). (C) Punteggio clinico cumulativo medio raggiunto dai topi maschi (colonna di sinistra) e femmine (colonna di destra) affetti da EAE. (D) Valutazione delle prestazioni giornaliere di rotarod (misurate come latenza di caduta) da 6 a 28 dpi (lo 0 rappresenta i valori basali ottenuti entro i primi 5 giorni della prova) negli animali di entrambi i sessi. I dati sono presentati come media ± SEM. L'analisi statistica ha rivelato un effetto significativo per p≤ 0,05 (# = maschi vs. femmine; * = confronto tra diversi punti temporali). Abbreviazioni: EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale; CS = punteggio clinico; Cum CS = punteggio clinico cumulativo; DPI = giorno dopo l'immunizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Analisi dell'infiammazione nel midollo spinale di topi affetti da EAE di entrambi i sessi. (A) Immagini rappresentative di sezioni trasversali del midollo spinale colorate con ematossilina-eosina evidenziano la presenza di PvII (frecce) in topi maschi (immagine in alto) e femmine (immagine in basso). (B) Misura della presenza di PvII nel midollo spinale di topi affetti da EAE di entrambi i sessi (n = 8/gruppo). I dati sono presentati come media ± SEM. L'analisi statistica ha rivelato un effetto significativo per p ≤ 0,05 (# = maschi vs. femmine). Barra della scala = 200 μm (ingrandimento 10x). Abbreviazioni: EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale; * = canale centrale; PvIIs = infiltrati infiammatori perivascolari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo EAE indotto da MOG35-55 che abbiamo descritto ha portato allo sviluppo di una forma cronica di SM nei topi C57BL/6J 7,8,13. In questi risultati rappresentativi, abbiamo riportato che gli animali di entrambi i sessi che sono stati sottoposti alla procedura di immunizzazione hanno sviluppato una forma cronica della malattia (cioè, non si riprendono completamente dopo l'insorgenza della malattia, accumulano deficit e mantengono un CS di almeno 1,5 nella fase cronica).

Anche se molti studi non riportano differenze tra maschi e femmine in questo modello14, solo pochi studi considerano entrambi i sessi. Tuttavia, dati i sostanziali dimorfismi sessuali mostrati nella MS2, dovrebbe essere di primaria importanza studiare l'esito della malattia nei due sessi. Grazie a studi più recenti che hanno coinvolto entrambi i sessi, la presenza di un certo dimorfismo sessuale è stata descritta anche nell'EAE35 indotto da MOG35-55. Abbiamo notato principalmente che nelle femmine, l'EAE indotto da MOG35-55 è generalmente più aggressivo (data la maggiore suscettibilità dei topi femmina con questo modello)36, poiché tendono ad avere un esordio più precoce e punteggi clinici cumulativi più elevati, che riflettono un aumento dell'infiammazione a livello del midollo spinale rispetto a quella osservata nei maschi. Una delle principali conclusioni è che questo protocollo può indurre EAE sia nei topi maschi che in quelli femmine, ma i ricercatori devono ricordare che alcuni aspetti della malattia potrebbero differire tra i due sessi. Pertanto, è fondamentale considerare correttamente la principale questione sperimentale da affrontare, scegliere il modello animale più favorevole e valutare la necessità di includere uno o entrambi i sessi.

Passaggi critici ed eventuale risoluzione dei problemi
Poiché diversi modelli di SM producono alcuni aspetti specifici della malattia, ma non tutti e6, il primo passo fondamentale è quello di scegliere il modello corretto considerando le specifiche esigenze sperimentali e le questioni scientifiche da affrontare. In secondo luogo, la procedura di immunizzazione dovrebbe essere eseguita da un esperto per garantire che sia eseguita correttamente ed evitare errori o variabilità dovuti a procedure imprecise. Inoltre, lo sperimentatore deve essere a conoscenza delle norme sul benessere degli animali adottate dall'istituto ospitante.

In terzo luogo, l'emulsione dovrebbe essere standardizzata nell'esperimento. Va notato che ogni topo mostra una tipica suscettibilità all'induzione e, quindi, alcuni animali potrebbero sviluppare una malattia meno aggressiva o non svilupparla affatto. In tal caso, l'incidenza e la gravità della malattia possono essere ottimizzate regolando la quantità di MOG35-55 somministrata ai topi. In quarto luogo, sebbene l'iniezione di PT sia ampiamente utilizzata per facilitare l'induzione di EAE nei topi35,36, non è necessaria per tutti i protocolli37,38. In assenza di PT, i topi di solito sviluppano una forma meno grave e più variabile di EAE39. Inoltre, un'ulteriore variabilità può essere causata da diverse modalità di somministrazione del PT (ad esempio, per via endovenosa vs. intraperitoneale) e perché è stato descritto che la potenza del PT varia tra i lotti. Per ovviare a questo problema, è importante regolare il volume in base alla potenza di ciascun lotto utilizzato e preparare correttamente la soluzione PT40,41. Considerando gli obiettivi sperimentali, le competenze tecniche dei ricercatori e l'ottimizzazione della ricerca sugli animali, è fondamentale scegliere il protocollo di induzione più adatto.

In quinto luogo, per raccogliere i dati in modo più oggettivo, il punteggio in cieco dei sintomi della malattia è altamente raccomandato. Inoltre, suggeriamo uno scoring clinico con una valutazione più quantitativa e oggettiva del decorso della malattia, come la valutazione delle prestazioni del rotarod. Infine, la corretta selezione di gruppi sperimentali sufficientemente numerosi è fondamentale per ottenere dati affidabili e comparabili (vedi protocollo sezione 2). I calcoli delle dimensioni del campione devono essere eseguiti per ottenere le dimensioni del gruppo necessarie, a seconda della dimensione dell'effetto previsto.

Principali limitazioni
In primo luogo, questo protocollo di induzione potrebbe portare a risultati altamente variabili negli animali immunizzati, soprattutto se le dimensioni del gruppo non sono abbastanza grandi o se la procedura non viene eseguita correttamente. Inoltre, l'EAE indotta da MOG35-55, come ogni altro modello disponibile di SM, ha alcune limitazioni (ad esempio, fornisce pochissime informazioni sulla progressione della SM, sul ruolo delle cellule B nella malattia, sui meccanismi inside-out o sulle difficoltà nello studio della rimielinizzazione)4,6. Quindi, ancora una volta, è fondamentale scegliere correttamente il modello di SM necessario per affrontare la specifica questione scientifica. Infine, la sede primaria del danno è rappresentata dal midollo spinale, e la patologia porta alla comparsa di segni istopatologici in modo caudale-craniale (cioè partendo dal midollo spinale e risalendo fino al cervello). Questo è l'opposto di ciò che accade nell'uomo e può rappresentare un limite considerevole del modello. Tuttavia, è possibile apprezzare anche alcune alterazioni nel cervello, considerando bersagli specifici.

Vantaggi
In primo luogo, questo modello può contribuire in modo significativo alla comprensione dei meccanismi immuno-mediati periferici e alla valutazione dei processi neuroinfiammatori e, parzialmente, demielinizzanti nel SNC. Successivamente, questo modello potrebbe essere applicato in alcuni specifici ceppi murini transgenici per studiare gli esiti della SM correlati a specifiche alterazioni genetiche.

Un altro vantaggio è quello di avere una valutazione clinica basata su due metodi: la valutazione del punteggio clinico e il test rotarod. Questo porta a una valutazione clinica più quantitativa, meno soggettiva e più precisa del decorso della malattia. Inoltre, come van den Berg et al. hanno sottolineato, la valutazione basata su rotarod è fortemente correlata all'area superficiale delle lesioni infiammatorie nei sistemi motori del midollo spinale27.

Come abbiamo discusso in precedenza, anche se questo modello non riproduce interamente il dimorfismo sessuale della SM, riteniamo che questo sia un vantaggio. La combinazione dell'induzione con altri possibili fattori di rischio, in particolare quelli ambientali, può aiutare a comprendere gli effetti specifici di tali fattori e ad identificare il loro ruolo specifico nell'insorgenza di alcuni aspetti sessualmente dimorfici della SM. Infine, questo modello è stato ampiamente utilizzato per sviluppare e testare un'ampia gamma di farmaci terapeutici e, pertanto, ha il potenziale per aiutare a sviluppare nuovi approcci terapeutici per questa malattia 4,6.

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Disclosures

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare in relazione alla ricerca, alla paternità e/o alla pubblicazione di questo articolo.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 e 2023-2027 al Dipartimento di Neuroscienze Rita Levi Montalcini; Fondazione Cavalieri-Ottolenghi, Orbassano, Italia. BB è stato borsista di INFRA-P, Regione Piemonte (n.378-35) (2022-2023) e PRIN 2020 - 20203AMKTW. Si ringrazia la Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) per il sostegno. Le spese di pubblicazione sono state sostenute dalla gentile donazione del Distretto Rotaract 2031, e in particolare del Rotaract Club Torino Nord-Est. Ringraziamo Elaine Miller per la correzione di bozze del nostro manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic

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References

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Neuroscienze Numero 200 Encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG35-55 Malattia infiammatoria cronica autoimmune Sistema nervoso centrale (SNC) Prevalenza nei sessi Forme aggressive Aspetti clinici Caratteristiche radiologiche Caratteristiche patologiche Modelli animali sperimentali Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) Topi C57BL/6J maschi e femmine Peptide glicoproteico oligodendrocitario mielinico 35-55 (MOG35-55) Immunizzazione Forma cronica della malattia Punteggio clinico giornaliero Motore Prestazione Analisi istologica Midollo spinale

Erratum

Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

Modellazione della sclerosi multipla nei due sessi: encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG<sub>35-55</sub>
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Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo,… More

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).

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