Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering af multipel sklerose hos de to køn: MOG35-55-induceret eksperimentel autoimmun encephalomyelitis

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65778
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,4
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

ERRATUM NOTICE

Summary

Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis er en af de mest anvendte murinmodeller af multipel sklerose. I den nuværende protokol immuniseres C57BL/6J-mus af begge køn med myelinoligodendrocytglycoproteinpeptid, hvilket hovedsageligt resulterer i stigende parese af halen og lemmerne. Her diskuterer vi protokollen for EAE-induktion og evaluering.

Abstract

Multipel sklerose (MS) er en kronisk autoimmun inflammatorisk sygdom, der påvirker centralnervesystemet (CNS). Det er kendetegnet ved forskellig forekomst i kønnene, der påvirker flere kvinder end mænd, og forskellige resultater, der viser mere aggressive former hos mænd end hos kvinder. Desuden er MS meget heterogen med hensyn til kliniske aspekter, radiologiske og patologiske træk. Det er således nødvendigt at udnytte eksperimentelle dyremodeller, der tillader undersøgelse af så mange aspekter af patologien som muligt. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) repræsenterer en af de mest anvendte modeller af MS hos mus, modellering af forskellige sygdomsfunktioner, fra aktivering af immunsystemet til CNS-skade. Her beskriver vi en protokol til induktion af EAE i både mandlige og kvindelige C57BL / 6J-mus ved hjælp af myelinoligodendrocytglycoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55) immunisering, hvilket fører til udvikling af en kronisk form af sygdommen. Vi rapporterer også evalueringen af den daglige kliniske score og motoriske ydeevne hos disse mus i 28 dage efter immunisering (28 dpi). Endelig illustrerer vi nogle grundlæggende histologiske analyser på CNS-niveau med fokus på rygmarven som det primære sted for sygdomsinduceret skade.

Introduction

Multipel sklerose (MS) er en kronisk autoimmun inflammatorisk sygdom, der påvirker centralnervesystemet (CNS). Det viser tilstedeværelsen af perivaskulær infiltration af inflammatoriske celler, demyelinisering, aksonalt tab og gliose1. Dens ætiologi forbliver ukendt, og dens kliniske aspekter, radiografiske og patologiske træk tyder på bemærkelsesværdig heterogenitet i sygdommen2.

På grund af sin ukendte ætiologi og kompleksitet er der på nuværende tidspunkt ingen dyremodel, der sammenfatter alle de kliniske og radiologiske træk, der vises i human MS 3,4. Imidlertid anvendes forskellige dyremodeller til at studere forskellige aspekter af MS 3,4. I disse modeller er sygdomsinitiering typisk ekstremt kunstig, og tidsrammen for udbrud af kliniske tegn er forskellig mellem mennesker og mus. For eksempel hos mennesker er de patofysiologiske processer, der ligger til grund for sygdommen, uopdaget i årevis før begyndelsen af kliniske manifestationer. Omvendt kan eksperimenterne opdage symptomer i dyremodeller inden for uger eller endda dage efter MS-induktion4.

Tre grundlæggende dyremodeller producerer de træk ved demyelinisering, der er karakteristiske for MS: dem, der er virusinduceret (f.eks. Theilers murin encephalomyelitis-virus), dem, der induceres af toksiske stoffer (f.eks. Cuprizone, lysolecithin) og de forskellige varianter af eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE)5. Hver model hjælper med at studere nogle specifikke facetter af sygdommen, men ingen replikerer alle funktionerne i MS6. Det er derfor afgørende at vælge den rigtige model under hensyntagen til de specifikke eksperimentelle behov og de videnskabelige spørgsmål, der skal behandles.

Takket være immuniseringsprocedurer mod myelinafledte antigener induceres EAE ved at udløse et autoimmun respons på CNS-komponenter hos modtagelige mus. Samspillet mellem en lang række immunpatologiske og neuropatologiske mekanismer forårsager udvikling af de vigtigste patologiske træk ved MS (dvs. inflammation, demyelinisering, aksonalt tab og gliosis) hos de immuniserede mus 7,8. Mus begynder at vise kliniske symptomer omkring den anden uge efter immunisering og viser generelt stigende lammelse fra halen til lemmen og forbenet. Den kliniske score (dvs. kvantificering af akkumuleringen af sygdomsrelaterede underskud) vurderes generelt ved hjælp af en 5-punkts skala7.

Aktiv immunisering med protein eller peptid eller passiv overførsel af encephalitogene T-celler kan anvendes til at inducere EAE hos mus med forskellige genetiske baggrunde (fx SJL / J, C57BL / 6 og ikke-overvægtige diabetiske (NOD) mus). Myelinproteolipidprotein (PLP), myelinbasisk protein (MBP) og myelinoligodendrocytglycoprotein (MOG) er eksempler på selv-CNS-proteiner, hvorfra immunogener normalt produceres. Især udvikler SJL / J-mus, der er immuniseret med den immunodominerende epitop af PLP (PLP139-151), et recidiverende-remitterende (RR) sygdomsforløb, mens C57BL / 6J-mus immuniseret med det immunodominant MOG35-55-peptid viser EAE af kroniskkarakter 1. På trods af nogle begrænsninger, såsom at give meget lidt information om MS-progression, B-cellernes rolle i sygdommen, indefra-ud-mekanismerne eller vanskeligheder med at studere remyelinisering, har EAE-modellerne bidraget enormt til forståelsen af autoimmune og neuroinflammatoriske processer, øget viden inden for MS-området og dermed muliggjort udviklingen af nye terapeutiske tilgange til denne sygdom4, 6.

I dette arbejde fokuserede vi på en bestemt form for aktiv EAE, myelinoligodendrocytglycoproteinpeptidet 35-55 (MOG35-55)-induceret form 9,10,11,12. MOG35-55-induceret EAE modellerer en kronisk form for MS. Efter immunisering gennemgår musene en asymptomatisk fase inden for den første uge efter immunisering, derefter opstår sygdommen typisk i den anden uge efter immunisering, mens sygdommen mellem den tredje og fjerde uge efter immunisering bliver kronisk uden mulighed for fuld genopretning fra de akkumulerede underskud 7,8,13. Interessant nok observeres ingen forskelle mellem mænd og kvinder i forekomst, sygdomsdebut, forløb eller progression i de fleste af de undersøgelser, der findes i litteraturen14, selvom færre undersøgelser sammenligner sygdommen hos mænd og kvinder.

I modsætning hertil er disse parametre hos mennesker kendt for at være stærkt seksuelt dimorfe2. MS påvirker flere kvinder end mænd; Imidlertid udvikler mænd generelt en mere aggressiv form for sygdommen2. Disse beviser har antydet en væsentlig såvel som kompleks rolle af gonadale hormoner15; Ikke desto mindre forbliver kønshormonernes rolle og virkningsmekanisme i patologien uklar. Desuden understøtter data fra dyremodeller ideen om, at både østrogener og androgener udøver positive virkninger på forskellige kanaler i patologien på en kønsspecifik måde16,17.

Nogle undersøgelser tyder også på neurobeskyttende, promyeliniserende og antiinflammatoriske virkninger af progesteron18 , og selvom beviser hos MS-patienter er knappe18, kan neuroaktive steroider (dvs. de novo syntetiserede steroider i nervesystemet, såsom pregnenolon, tetrahydroprogesteron og dihydroprogesteron) også påvirke det patologiske forløb19. Samlet set understøtter disse data ideen om, at kønshormoner, der produceres både perifert og inde i CNS, har en vigtig og kønsspecifik rolle i sygdomsdebut og progression. Derfor opfordrer vi i dette arbejde til indsamling af separate data fra både han- og hundyr.

Fra det histopatologiske synspunkt tjener rygmarvets hvide stof som det vigtigste sted for CNS-skade i denne model, som er karakteriseret ved multifokale, sammenflydende regioner af mononukleær inflammatorisk infiltration og demyelinering8. Når vi beskriver denne protokol til induktion af MOG35-55-induceret EAE i C57BL/6J-mus, vil vi således tage hensyn til sygdomsresultatet hos de to køn og give nogle histopatologiske indsigter vedrørende rygmarven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Pasning og håndtering af dyr i dette arbejde blev udført i overensstemmelse med Den Europæiske Unions rådsdirektiv af 22. september 2010 (2010/63/EUE); alle de procedurer, der er rapporteret i denne undersøgelse, blev godkendt af det italienske sundhedsministerium (407/2018-PR) og af det etiske udvalg ved universitetet i Torino (projekt nr. 360384). Vi foreslår at overholde det eksperimentelle design til ARRIVE-retningslinjerne, der oprindeligt blev offentliggjort af Kilkenny et al. i 201020. Før du starter, skal du sikre dig, at de nødvendige materialer er tilgængelige (se materialetabel). Steriliser alle glasvarer og redskaber, der anvendes til fremstilling af MOG35-55-emulsionen i en autoklave. Et resumé af forsøgsprocedurerne er vist i figur 1.

1. Fremstilling af MOG35-55 emulsion

BEMÆRK: For at forberede emulsionen kræves MOG35-55, ufuldstændig Freuds adjuvans (IFA), Mycobacterium Tuberculosis stamme H37Ra (MT) og fysiologisk opløsning (se materialetabel).

FORSIGTIG: Varmedræbt MT kan stimulere det medfødte immunrespons. Undgå indånding, indtagelse og kontakt med hud og øjne ved hjælp af korrekt personligt beskyttelsesudstyr og vejning MT i en overdækket præcisionsvægt under emhætten.

Opløsning Sammensætning Noter
2 mg/ml MOG35-55 peptidopløsning Frysetørret MOG35-55 peptid fortyndet i fysiologisk opløsning ved 2 mg/ml koncentration Den allerede fortyndede opløsning opbevares ved -80 °C.
5 μg/ml PT-opløsning Frysetørret PT fortyndet i fysiologisk opløsning ved 5 μg/ml koncentration. Den allerede fortyndede opløsning opbevares ved -80 °C.
Emulsion Det totale volumen emulsion, der er nødvendig for, at hver mus kan immuniseres, er 300 μL fordelt som følger: For at undgå ændringer eller forurening skal emulsionen fremstilles på vaccinationsdagen.
200 μg/mus af MOG35-55 , dvs. 100 μL MOG35-55 2 mg/ml opløsning.
50 μL fysiologisk opløsning
150 μL IFA
4 mg/ml MT, dvs. 1,2 mg/mus
Fysiologisk løsning Natriumchlorid 0,9% fortyndet i destilleret vand.

Tabel 1: Sammensætning af de opløsninger, der anvendes til immuniseringsproceduren.

  1. Opløsningen fremstilles i et glasbægerglas, idet den flydende komponent tilsættes først og til sidst MT.
    BEMÆRK: Det totale volumen emulsion, der er nødvendig for hver mus, der skal immuniseres, er 300 μL, divideret som angivet i tabel 1. Emulsionen er meget tyktflydende og tyk, så under forberedelses- og injektionsproceduren kan der være noget tab, især når opløsningen fremstilles til nogle få mus. Vi foreslår at beregne det endelige volumen emulsion, der er nødvendigt ved at overvurdere antallet af mus, der skal immuniseres med mindst 1,5-2 gange.
  2. Bægerglasset lægges i is og brug glassprøjten med en 18 G kanyle til at begynde at emulgere opløsningen.
    BEMÆRK: Emulsionen kan også fremstilles ved hjælp af andre strategier, for eksempel ved at forbinde de to luftfrie glassprøjter med en trevejs stophane og blande opløsningen ved at skubbe stemplerne frem og tilbage21,22.
  3. Emulgerer opløsningen i mindst 15 minutter; Generelt er 30 minutters emulgering nok. For at kontrollere emulsionens kvalitet tilsættes en dråbe emulsion i en gennemsigtig beholder fyldt med vand: Hvis dråben opretholder sin struktur og forbliver intakt, er emulsionen klar.
  4. Placer emulsionen direkte inde i 1 ml sprøjterne, der skal bruges til immunisering, og opbevar disse ved +4 °C indtil brug for at bevare emulsionens tykkelse og undgå ændringer eller forureninger.

2. Dyreudvælgelse og immunisering

  1. Valg af dyr
    1. Vælg voksne C57BL/6J-mus af begge køn i alderen 8-10 uger med en optimal kropsvægt på ~20 g. Sørg for at vælge alders- og kønsmatchede mus til forskellige eksperimentelle grupper, fordi modtageligheden for sygdom kan variere med alder og køn.
      BEMÆRK: Mus skal have sammenlignelig kropsvægt på vaccinationsdagen, fordi den nuværende procedure er optimeret til et bestemt kropsvægtinterval (17-25 g).
    2. Opstald dyr af samme køn i grupper (n = 4-5/bur) for at undgå social isolation under standardforhold i 45 cm x 25 cm x 15 cm polypropylenmusebure ved 22 ± 2 °C, under 12:12 lys/mørk cyklus (lys tændt kl. 08:00). Sørg for mad og vand ad libitum.
      BEMÆRK: For yderligere at begrænse den potentielle variabilitet af sygdomsforløb hos de immuniserede dyr foreslår vi også at danne tilstrækkeligt mange eksperimentelle grupper. Der er også undersøgelser 8,23, der beskriver tidspunktet for immunisering som en tilstand, der bestemmer variation i EAE-resultatet. Derfor foreslår vi at udføre immuniseringen omtrent på samme time hos alle dyr, helst i de lyse timer i den daglige lys / mørke cyklus23. For at begrænse stress foretrækkes det at manipulere dyrene inden immuniseringsdagen og markere dem for let at identificere dem til daglig evaluering, for eksempel øreklipning eller mærke.
  2. Immuniseringsproceduren
    BEMÆRK: Sørg for, at proceduren udføres af en erfaren efterforsker for at minimere stress for dyr og optimere immunisering. Inden immuniseringen påbegyndes, skal du vælge anæstesimetoden i overensstemmelse med retningslinjerne for institutionel dyrepleje og etisk komité. Vores laboratorium bruger kort anæstesi med isofluran.
    1. Bedøv musen: 4% isofluran til anæstesiinduktion og 1,5-2% isofluran til anæstesivedligeholdelse. Vent på, at anæstesien er effektiv, og brug en tåspids på bagsiden og forsiden til at vurdere anæstesiniveauet. For at forhindre tørhed i øjnene, mens musen er under bedøvelse, skal du bruge en dyrlægegodkendt øjensalve.
    2. PT intravenøs injektion i den laterale kaudale vene: Tilslut halen af musen forsigtigt med en ethanolopløsning, der fungerer som en vasodilator, for at vise venerne. Fokuser på en af de to laterale vener i halen, og injicer 500 ng PT (dvs. 100 μL PT fortyndet i fysiologisk opløsning i koncentrationen på 5 μg/ml) ved hjælp af en 0,5 ml sprøjte udstyret med en 30 g kanyle.
    3. Subkutan injektion af MOG35-55 emulsion: Brug 1 ml sprøjten med en 26 G nål, udfør tre subkutane injektioner af den tidligere fremstillede emulsion: to under den rostrale del af flankerne og en ved bunden af halen. Volumenet af emulsion injiceret på hvert sted er 100 μL, for et samlet volumen på 300 μL emulsion injiceret i hver mus.
      BEMÆRK: Vaccinationsdagen registreres som dag 0 efter immunisering (dpi); 48 timer senere (dvs. ved 2 dpi) er det nødvendigt at udføre en anden intravenøs injektion af PT svarende til den, der tidligere er udført. Det er muligt at udføre injektionen uden bedøvelse ved hjælp af en musefastholdelse. Proceduren beskrevet her sigter mod at fremkalde og opretholde bedøvelse af musene under immuniseringsproceduren for at undgå mulig ubehag og bevægelse af dyrene eller risici for både mus og efterforskere. Der er således ingen kirurgiske procedurer. For at optimere de eksperimentelle processer er det imidlertid vigtigt at opretholde passende sterile forhold under disse trin og at overvåge musens tilstand efter disse procedurer.
    4. For at kontrollere, at musen er kommet sig efter injektionerne, skal du placere den i et rent bur efter procedurerne og vente, indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende. Når musen er helt genoprettet, skal du returnere den til hjemmeburet med andre dyr.

3. Opfølgning på EAE

  1. Kropsvægt og fødeindtagelse
    1. Overvåg dagligt dyrenes kropsvægt (BW) ved hjælp af en elektronisk præcisionsbalance, fordi faldet i BW er en indikator for sygdomsprogression.
      BEMÆRK: Dette fald bør ikke overstige en vis procentdel i henhold til den institutionelle og etiske komités retningslinjer for dyrepleje. Normalt, hvis et dyr mister mere end 20% af den oprindelige kropsvægt (dvs. vægten registreret ved 0 dpi), skal det ofres som anvendelse af det humane endepunkt. Eutanasimetoderne involverer dyb irreversibel anæstesi til indånding (fx 5% isofluran) efterfulgt af halshugning.
    2. Overvåg fødeindtagelsen (FI) - den mad, der spises af et dyr på en dag (g∙dag-1∙dyr-1), vej mængden af mad i den specifikke beholder mindst en gang om ugen og divider mængden af spist mad i de dage, der er gået, mellem to sekventielle målinger og antallet af dyr, der er til stede i buret.
      BEMÆRK: Denne måling gør det muligt at estimere det gennemsnitlige fødeindtag. På grund af udseendet og ophobningen af kliniske sygdomstegn, som involverer lammelse af lemmerne, foreslår vi at placere noget vandet mad på burets gulv, når dyrene ikke er i stand til at stå fast på bagbenene og nå fødevarebeholderen eller vandflasken. For at vurdere fødeindtagelsen gennem opfølgningsperioden så præcist som muligt målte vi også tørvægten af dette foder, før vi fugtede det for musene.
  2. Evaluering af østruscyklicitet under EAE
    1. Kontroller østruscyklussen i mindst to cyklusser, evaluering af vaginale cytologiudstrygninger som beskrevet af McLean et al.24. Klassificer fasen af østruscyklussen baseret på tilstedeværelsen af tre primære celletyper - nukleerede epitelceller, cornified pladeepitelceller og leukocytter - i vaginale udstrygningsprøver som følger:
      1. Klassificer som proestrus baseret på en næsten udelukkende tilstedeværelse af klynger af runde, velformede nukleerede epitelceller.
      2. Klassificer som østrus baseret på den overvejende tilstedeværelse af tæt pakkede klynger af cornified pladeepitelceller.
      3. Klassificer som metøstrus baseret på den overvejende tilstedeværelse af små mørkfarvede leukocytter og den mindre tilstedeværelse af cornified pladeepitelceller.
      4. Klassificer som diestrus baseret på den meget overvejende tilstedeværelse af små mørkfarvede leukocytter og sjældne cornified pladeepitelceller sammen med det mulige udseende af nukleerede epitelceller.
        BEMÆRK: Ved evaluering af sygdommen hos begge køn er det vigtigt at kontrollere variabiliteten hos kvinder på grund af østruscyklussen. Vi foreslår at fokusere på evalueringen af østruscyklussen, især mellem den første og den anden uge efter immunisering (dvs. i den akutte fase af EAE). Det har tidligere vist sig, at immuniseringsproceduren forårsager de mest udtalte ændringer i østruscyklussen inden for denne fase25. Desuden er det vigtigt at overveje, at det er vanskeligt at udføre udtværingen, når dyret når en høj klinisk score (især >3) på grund af den bageste parese og manglen på tone i bagbenene.
  3. Klinisk score
    1. Få en blindet efterforsker til at vurdere dyrenes kliniske score dagligt. Giv hvert dyr en score vurderet fra 0 til 5 (se tabel 2) for at evaluere sygdomsforløbet26 som beskrevet af racke7.
      BEMÆRK: I lighed med vægttabet er et humant endepunkt også nødvendigt for stigningen i kliniske scorer i henhold til den institutionelle og etiske komités retningslinjer for dyrepleje. Generelt, hvis et dyr ikke længere er i stand til at fodre sig selv autonomt (dette sker normalt, når et dyr når mindst scoren på 4 i henhold til den skala, vi bruger), bør det ofres som anvendelse af det humane endepunkt.
  4. Evaluering af motorisk ydeevne ved rotarod-test
    BEMÆRK: Evaluering af EAE-progressionen udføres normalt ved at tildele den kliniske score dagligt, hvilket udføres af en fuldt uddannet blindet efterforsker. Det kan dog være nyttigt at flankere det med en mere kvantitativ og objektiv evaluering af sygdommens progression. I en tidligere undersøgelse26 blev rotarod-testen brugt til at måle de immuniserede dyrs motoriske ydeevne. Som beskrevet af van den Berg et al.27, for at få en mere kvantitativ og præcis klinisk evaluering af sygdomsforløbet, kan evalueringen af den motoriske ydeevne ved rotarod-testen understøtte den kliniske scorevurdering. For en detaljeret beskrivelse se van den Berg et al.27.
    1. Lad musene gennemgå rotarod-sessioner dagligt, startende fra 1 dpi indtil ofringen (dvs. 28 dpi). Hver session består af en enkelt 300 s session, hvor stanghastigheden skal øges lineært fra 4 til 40 o / min.
    2. Registrer dyrets score. Når musen ikke er i stand til at opretholde sin balance og falder af enheden, falder den på jorden og udløser en sensor, og tiden (e) registreres. Således scores præstationen som latenstid til fald (er).

Grad Klinisk tegn Beskrivelse
0 Sund Ingen observerede kliniske tegn. Dyret viser en normal tone og bevægelse af halen. Det går uden at snuble.
0.5 Forringet port Dyret tripper, mens man går på en grill.
1 Slap hale Når dyret afhentes af halebasis, hænger halen (blabby hale).
1.5 Slap hale og nedsat port Dyret viser en blabby hale, og det snubler, mens man går på en grill.
2 Ataksi Dyret viser vanskeligheder med at stå op, når det er blevet vendt om på ryggen.
2.5 Ataxi og parese af bagben Dyreudstillingerne kan ikke stå op, når det først er blevet vendt på ryggen, og det mister tonen i et af bagbenene.
3 Lammelse af bagben Dyret mister tonen i begge bagben.
3.5 Lammelse af bagben og / eller parese af forbenet Dyret mister tonen i begge bagben og delvist af forbenene. Faktisk viser det et tab af styrke i forbenenes greb.
4 Tetra parese Dyret mister helt tonen i sine lemmer.
4.5 Tetra parese og nedsat kropstemperatur Dyret mister helt tonen i sine lemmer, og det viser et fald i kropstemperaturen (det er koldt).
5 Døende eller død Dyret dør (det reagerer ikke på nogen stimulus) eller død.

Tabel 2: Klinisk scoringssystem anvendt til vurdering af EAE-progression.

4. Evaluering af EAE-inducerede histopatologiske tegn på rygmarvsniveau

BEMÆRK: Her rapporterer vi kort proceduren for at ofre dyrene og samle rygmarven for at udføre histopatologisk analyse; For en detaljeret beskrivelse, se disse referencer 10,26,28,29.

  1. Fiksering og vævsprøvetagning
    BEMÆRK: For en detaljeret beskrivelse, se disse referencer10,26.
    1. Ofre dyrene ved 28 dpi i den kroniske fase af sygdommen.
      1. Bedøv musene ved dyb irreversibel anæstesi (intraperitoneal injektion af Zolazepam og Tiletamin 80 mg / kg / Xylazin 10 mg / kg).
      2. Transkardialt perfusere musene med en saltopløsning efterfulgt af en 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning.
        BEMÆRK: Vær opmærksom, når du bruger PFA: Da det er giftigt, undgå indånding, indtagelse og kontakt med hud og øjne ved hjælp af korrekt personligt beskyttelsesudstyr. Vej pulveret, forbered opløsningen, og udfør perfusionen under emhætten.
    2. Fjern rygmarven fra rygsøjlen30.
    3. Opbevar rygmarven i en 4% PFA-opløsning i 24 timer.
    4. Udfør flere vaske i 0,01 M saltvandsfosfatbuffer (PBS).
    5. Indlejr rygmarven i paraffinblokke30.
  2. Histologiske procedurer
    BEMÆRK: For en detaljeret beskrivelse, se Montarolo et al.10.
    1. Brug et mikrotomt til at skære 10 μm tykke tværgående rygmarvssektioner og saml dem på gelatinebelagte dias. Orienter snitplanet, så det svarer til tegningerne svarende til tværsnittene i musens rygmarvsatlas31.
    2. Udfør afparaffinisering af afsnit32.
    3. Plet sektionen med hæmatoxylin og Eosin32.
    4. Dehydrer sektionerne32.
    5. Dæk sektionerne med et monteringsmedium og lad dem tørre ved stuetemperatur under en kemisk hætte.
      BEMÆRK: Hematoxylin-Eosin-farvning muliggør påvisning af tilstedeværelsen af de perivaskulære inflammatoriske infiltrater (PvII'er)26, hvilket vurderes som et tegn på sygdommen28.
  3. Kvantitativ analyse af rygmarvssektioner
    1. Få billeder af de farvede sektioner med et optisk mikroskop tilsluttet et digitalt kamera med et 20x mål29.
    2. Analyser det erhvervede billede for at opnå antallet af PvII'er, udtrykt som antallet af infiltrater pr. mm2.
      BEMÆRK: Til analyse af de erhvervede billeder er det nyttigt at drage fordel af billedanalysesoftware. Neuropatologiske fund præsenteret i dette arbejde er kvantificeret i 10 komplette tværsnit af rygmarven pr. mus (n = 8/gruppe), der er repræsentative for hele rygmarvsniveauer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EAE opfølgning efter immunisering
Dette blev vurderet som beskrevet nedenfor.

Kropsvægt og fødeindtagelse
Tovejsanalysen af varians (ANOVA) (køn og tid som uafhængige variabler) viser et fald i BW af EAE-dyr af begge køn, især inden for den anden uge efter induktion (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figur 2A). Imidlertid opretholdes den seksuelle dimorfisme i BW altid (figur 2A). Med hensyn til procentdelen af BW (F(1,57) = 23,935, p < 0,001; Figur 2B), viser både mænd og kvinder et stort tab mellem 12 dpi og 17 dpi (p < 0,001) sammenlignet med den oprindelige BW, men overstiger aldrig et samlet tab på 20% (figur 2B). Selvom BW-tabet starter før sygdommens begyndelse, når det således sit maksimum i den akutte fase af EAE (figur 2A, B). Der er ingen forskelle mellem kønnene med hensyn til BW-tab. Imidlertid har kvinder tendens til at tabe sig mere tidligere og komme sig mindre i den kroniske fase (tredje-fjerde uge efter induktion) (figur 2B).

Desuden viser tovejs ANOVA (køn og tid som uafhængige variabler) også et signifikant fald i FI (F(9, 39) = 6,682, p < 0,001; Figur 2C) hos begge køn, især i løbet af den anden postimmuniseringsuge, som følge af øget EAE-sværhedsgrad, hvilket gjorde det mere udfordrende for dyret at få adgang til den mad, der var placeret i den øverste beholder i buret. Som vi foreslog, blev maden efterfølgende lagt på burgulvet for at reducere yderligere stress på dyrene. Dette gjorde det muligt for FI at vende tilbage til de oprindelige niveauer (figur 2C) og BW at komme sig delvist (figur 2A, B).

Estrous cyklus evaluering hos kvinderne
Sammenligningen mellem den tid, der blev brugt i de forskellige faser af østrusen, blev udført ved hjælp af elevens t-test. Analysen viser forskelle i den tid, der bruges i østralfaserne (dvs. proestrus og østrus) sammenlignet med den, der bruges i den ikke-estrale fase (dvs. metestrus og diestrus) mellem den asymptomatiske fase (før EAE's begyndelse) og den symptomatiske fase (efter EAE's begyndelse) (p = 0,042; Figur 2D), hovedsagelig på grund af en stigning i den tid, der bruges i diestrus i de symptomatiske faser (p = 0,017) og en tendens til at reducere den tid, der bruges i proestrus (p = 0,08).

Det er allerede blevet beskrevet, at induktionsproceduren fører til en ændring af østruscyklussen hos kvinder, hvilket især påvirker proestrus25. I denne fase er stigende niveauer af østrogener kendt for at udøve antiinflammatoriske og neuroprotektive virkninger16 og er således muligvis ansvarlige for disse hormoners beskyttende rolle i den præsymptomatiske fase. Men når niveauet af østrogener falder, som vi ser i poststartfasen, slutter deres beskyttende virkninger også.

Klinisk score og rotarod ydeevne
Tovejs ANOVA (køn og tid som uafhængige variabler) viser en signifikant stigning i tid i den kliniske score (CS) for både mænd og kvinder (F (56-813) = 27,951, p < 0,001; Figur 3A). Især fra 10 dpi viser begge køn en signifikant stigning i CS (p < 0,001), som opretholdes indtil endepunktet (28 dpi) (figur 3A). Kvinder viser, selvom de ikke er signifikante (p = 0,156), højere CS end mænd (figur 3A). Med hensyn til sygdomsdebut forekommer det generelt omkring 10 dpi med en tendens til tidligere debut hos kvinder end hos mænd (figur 3B). Desuden viser kvinder en signifikant højere kumulativ CS sammenlignet med mænd (p = 0,017; Figur 3C).

Rotarod-præstationskurset ligner de kliniske evalueringer (figur 2D). Fra sygdommens begyndelse falder den og når den minimale ydeevne i den anden uge efter immunisering i den akutte fase af EAE. Tovejs ANOVA (køn og tid som uafhængige variabler) viser et signifikant fald i tid i rotarodpræstationen hos både mænd og kvinder (F (46-673) = 5,365, p < 0,001; Figur 3D). Især viser mænd minimumspræstationen ved 16 dpi (p = 0,022), mens hunnerne ved 17 dpi (p < 0,001). Mænd har tendens til at klare sig bedre end kvinder, især i den kroniske fase af sygdommen (21-28 dpi), muligvis som følge af lavere CS (figur 3A, D).

Histopatologisk evaluering af rygmarven
Envejs ANOVA (køn som den uafhængige variabel) af PvII'erne i rygmarvssektionerne fremhæver en klar forskel mellem mænd og kvinder (figur 4A). Kvinder viser et signifikant højere antal PvII'er end mænd (F(1,14)= 63,107, p < 0,001; Figur 4B). Disse data afspejler muligvis den højere kumulative CS, den dårligere rotarod-ydeevne og den mere aggressive sygdom, der observeres hos hunnerne, især i den kroniske fase af EAE.

Disse data afspejler også det faktum, at hunmus viser højere modtagelighed for udviklingen af mere aggressiv EAE sammenlignet med hanner14, hvilket er en af de største forskelle mellem denne sygdomsmodel og den MS, der forekommer hos mennesker. Kvinder viser en tidligere sygdomsdebut, har en moderat lavere forekomst af primære progressive former og viser generelt mindre handicapprogression end mænd 2,33,34.

Figure 1
Figur 1: Skematisk tidsmæssig gengivelse af eksperimentelle procedurer. Oprettet med BioRender.com. Forkortelser: i.v. = intravenøs; s.c. = subkutan; MOG35-55 = myelin oligodendrocytglycoprotein peptid 35-55; = dpi = dag efter immunisering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Evaluering af EAE-effekter på kropsvægt, fødeindtagelse hos han- og hunmus og brunstcyklus hos hunmus. Fra vaccinationsdagen (0 dpi) til offerdagen (28 dpi) viser graferne (A) daglig kropsvægt, (B) procentdel af kropsvægt og (C) ugentlig fødeindtagelse hos dyr af begge køn (n = 15/gruppe). (D) Tid tilbragt (udtrykt som gennemsnitlig procentdel af tid) i de forskellige faser af brunstcyklussen, evalueret ved vaginal cytologi smears, i den asymptomatiske fase (præ-debut, venstre kolonne i grafen) eller den symptomatiske fase (post-debut, højre kolonne af grafen) hos hunmus. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. Statistisk analyse afslørede en signifikant effekt for p≤ 0,05 (# = mænd vs. kvinder; * = sammenligning mellem forskellige tidspunkter). Forkortelser: EAE = eksperimentel autoimmun encephalomyelitis; BW = kropsvægt; FI = fødeindtagelse; DPI = dag efter immunisering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Evaluering af klinisk score og rotarodpræstation hos EAE-ramte han- og hunmus. (A) Vurdering af daglig klinisk score (fra 0 til 28 dpi) hos dyr af begge køn (n = 15/gruppe). (B) Dag for sygdomsdebut (gennemsnitlig dpi) hos EAE-ramte han- (venstre kolonne) og hunmus (højre kolonne). (C) Gennemsnitlig kumulativ klinisk score opnået af EAE-ramte hanmus (venstre kolonne) og hunmus (højre kolonne). D) Vurdering af den daglige rotarodpræstation (målt som faldlatenstid) fra 6 til 28 dpi (0 repræsenterer basisværdierne opnået inden for de første 5 dage efter testen) hos dyr af begge køn. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. Statistisk analyse afslørede en signifikant effekt for p≤ 0,05 (# = mænd vs. kvinder; * = sammenligning mellem forskellige tidspunkter). Forkortelser: EAE = eksperimentel autoimmun encephalomyelitis; CS = klinisk score; Cum CS = kumulativ klinisk score; DPI = dag efter immunisering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Analyse af inflammation i rygmarven hos EAE-ramte mus af begge køn. (A) Repræsentative billeder af tværgående rygmarvssektioner farvet med hæmatoxylin-Eosin fremhæver tilstedeværelsen af PvII'er (pile) hos hanmus (øverste billede) og hunmus (nederste billede). (B) Måling af PvIIs tilstedeværelse i rygmarven hos EAE-ramte mus af begge køn (n = 8/gruppe). Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. Statistisk analyse afslørede en signifikant effekt for p ≤ 0,05 (# = mænd vs. kvinder). Skalabjælke = 200 μm (10x forstørrelse). Forkortelser: EAE = eksperimentel autoimmun encephalomyelitis; * = central kanal; PvII'er = perivaskulære inflammatoriske infiltrater. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MOG35-55-induceret EAE-protokol, som vi beskrev, førte til udviklingen af en kronisk form for MS i C57BL/6J-mus 7,8,13. I disse repræsentative resultater rapporterede vi, at dyrene af begge køn, der gennemgik immuniseringsproceduren, udviklede en kronisk form af sygdommen (dvs. de genopretter ikke fuldt ud efter sygdommens begyndelse, de akkumulerer underskud og opretholder en CS mindst 1,5 i den kroniske fase).

Selvom mange undersøgelser ikke rapporterer nogen forskelle mellem mænd og kvinder i denne model14, overvejer kun få undersøgelser begge køn. I betragtning af de betydelige seksuelle dimorfier, der vises i MS2, bør det imidlertid være af primær relevans at undersøge sygdomsresultatet hos de to køn. Takket være nyere undersøgelser, der omfatter begge køn, er tilstedeværelsen af en vis seksuel dimorfisme også blevet beskrevet i MOG35-55-induceret EAE35. Vi bemærkede hovedsageligt, at hos kvinder er MOG35-55-induceret EAE generelt mere aggressiv (i betragtning af den højere modtagelighed hos hunmus med denne model)36, da de har tendens til at have tidligere debut og højere kumulative kliniske scorer, hvilket afspejler øget inflammation på rygmarvsniveau end den, der observeres hos mænd. En vigtig konklusion er, at denne protokol kan fremkalde EAE hos både mandlige og kvindelige mus, men efterforskere skal huske, at nogle aspekter af sygdommen kan variere mellem de to køn. Det er således afgørende at overveje det vigtigste eksperimentelle spørgsmål, der skal behandles, at vælge den gunstigste dyremodel og at evaluere nødvendigheden af at inkludere enten et eller begge køn.

Kritiske trin og mulig fejlfinding
Da forskellige modeller af MS producerer nogle specifikke aspekter af sygdommen, men ikke alle6, er det første grundlæggende skridt at vælge den rigtige model under hensyntagen til de specifikke eksperimentelle behov og de videnskabelige spørgsmål, der skal behandles. For det andet bør immuniseringsproceduren udføres af en ekspert for at sikre, at den udføres korrekt og undgå fejl eller variabilitet på grund af upræcise procedurer. Derudover skal investigator være bekendt med de dyrevelfærdsbestemmelser, der er vedtaget af værtsinstitutionen.

For det tredje bør emulsionen standardiseres i eksperimentet. Det skal bemærkes, at hver mus viser en typisk modtagelighed for induktionen, og dermed kan nogle dyr udvikle en mindre aggressiv sygdom eller slet ikke udvikle den. I så fald kan sygdomsforekomsten og sværhedsgraden optimeres ved at justere mængden af MOG35-55, der administreres til musene. For det fjerde, selvom PT-injektion i vid udstrækning anvendes til at lette induktionen af EAE hos mus35,36, er det ikke nødvendigt for hver protokol37,38. I fravær af PT udvikler mus normalt en mindre alvorlig og mere variabel form af EAE39. Desuden kan yderligere variabilitet skyldes forskellige måder at administrere PT på (f.eks. intravenøs vs. intraperitoneal), og fordi styrken af PT er beskrevet at variere mellem batcher. For at løse dette problem er det vigtigt at justere lydstyrken i henhold til styrken af hver anvendt batch og forberede PT-opløsningen korrekt40,41. I betragtning af de eksperimentelle mål, efterforskernes tekniske færdigheder og optimering af dyreforsøg er det grundlæggende at vælge den mest egnede induktionsprotokol.

For det femte, for at indsamle data på en mere objektiv måde, anbefales blindet scoring af sygdomssymptomer stærkt. Desuden foreslår vi klinisk scoring med en mere kvantitativ og objektiv evaluering af sygdomsforløbet, såsom evaluering af rotarodpræstationen. Endelig er korrekt udvælgelse af tilstrækkeligt talrige eksperimentelle grupper afgørende for at opnå pålidelige og sammenlignelige data (se protokolafsnit 2). Stikprøvestørrelsesberegninger skal udføres for at opnå de nødvendige gruppestørrelser afhængigt af den forventede effektstørrelse.

Vigtigste begrænsninger
For det første kan denne induktionsprotokol føre til meget variable resultater hos de immuniserede dyr, især hvis gruppestørrelserne ikke er store nok, eller hvis proceduren ikke udføres korrekt. Dernæst har MOG35-55-induceret EAE, ligesom alle andre tilgængelige modeller af MS, nogle begrænsninger (dvs. det giver meget lidt information om MS-progression, B-cellernes rolle i sygdommen, indefra-ud-mekanismerne eller vanskeligheder med at studere remyelinisering)4,6. Derfor er det endnu en gang afgørende at vælge den MS-model, der er nødvendig for at løse det specifikke videnskabelige spørgsmål. Endelig er det primære skadested repræsenteret af rygmarven, og patologien fører til udseendet af histopatologiske tegn på en kaudal-kraniel måde (dvs. startende fra rygmarven og går op til hjernen). Dette er det modsatte af, hvad der forekommer hos mennesker og kan repræsentere en betydelig begrænsning af modellen. Det er dog også muligt at sætte pris på nogle ændringer i hjernen, i betragtning af specifikke mål.

Fordele
For det første kan denne model bidrage væsentligt til forståelsen af perifere immunmedierede mekanismer og til at evaluere de neuroinflammatoriske og delvist demyeliniserende processer i CNS. Dernæst kunne denne model anvendes i nogle specifikke transgene musestammer til at studere MS-resultater relateret til specifikke genetiske ændringer.

En anden fordel er at have en klinisk evaluering baseret på to metoder: den kliniske score vurdering og rotarod testen. Dette fører til en mere kvantitativ, mindre subjektiv og mere præcis klinisk evaluering af sygdomsforløbet. Som van den Berg et al. påpegede, er den rotarodbaserede evaluering desuden stærkt korreleret med overfladearealet af inflammatoriske læsioner i rygmarvens motoriske systemer27.

Som vi diskuterede tidligere, selvom denne model ikke helt reproducerer MS's seksuelle dimorfisme, mener vi, at dette er en fordel. Kombinationen af induktion med andre mulige risikofaktorer, især de miljømæssige, kan hjælpe med at forstå de specifikke virkninger af sådanne faktorer og identificere deres specifikke rolle i forekomsten af nogle seksuelt dimorfe aspekter af MS. Endelig er denne model blevet brugt i vid udstrækning til at udvikle og teste en bred vifte af terapeutiske lægemidler og har derfor potentiale til at hjælpe med at udvikle nye terapeutiske tilgange til denne sygdom 4,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen af forfatterne har nogen interessekonflikter at erklære med hensyn til forskning, forfatterskab og / eller offentliggørelse af denne artikel.

Acknowledgments

Dette arbejde er blevet støttet af Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR-projektet Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 og 2023-2027 til Institut for Neurovidenskab Rita Levi Montalcini; Cavalieri-Ottolenghi Foundation, Orbassano, Italien. BB var stipendiat i INFRA-P, Piemonte-regionen (n.378-35) (2022-2023) og PRIN 2020 - 20203AMKTW. Vi takker Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) for støtten. Udgivelsesgebyrerne er blevet støttet af den venlige donation af Distretto Rotaract 2031, og især Rotaract Club Torino Nord-Est. Vi takker Elaine Miller for korrekturlæsningen af vores manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), Zurich, Switzerland. 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , Chapter 9, Unit 9.7 (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It's complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida--a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Chapter 16 - Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. , Academic Press. 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).

Tags

Neurovidenskab udgave 200 MOG35-55-induceret eksperimentel autoimmun encephalomyelitis kronisk autoimmun inflammatorisk sygdom centralnervesystemet (CNS) forekomst hos køn aggressive former kliniske aspekter radiologiske træk patologiske træk eksperimentelle dyremodeller eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) mandlige og kvindelige C57BL / 6J mus myelin oligodendrocyt glycoprotein peptid 35-55 (MOG35-55) immunisering kronisk form af sygdommen daglig klinisk score motor Ydeevne histologisk analyse rygmarv

Erratum

Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

Modellering af multipel sklerose hos de to køn: MOG<sub>35-55-induceret</sub> eksperimentel autoimmun encephalomyelitis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo,… More

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter