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Neuroscience

दो लिंगों में मल्टीपल स्केलेरोसिस मॉडलिंग: एमओजी35-55-प्रेरित प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65778
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,4
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

ERRATUM NOTICE

Summary

प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस मल्टीपल स्केलेरोसिस के सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले म्यूरिन मॉडल में से एक है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, दोनों लिंगों के C57BL/6J चूहों को माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन पेप्टाइड के साथ प्रतिरक्षित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मुख्य रूप से पूंछ और अंगों के आरोही पैरेसिस होते हैं। यहां हम ईएई प्रेरण और मूल्यांकन के प्रोटोकॉल पर चर्चा करते हैं।

Abstract

मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) एक पुरानी ऑटोइम्यून सूजन की बीमारी है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को प्रभावित करती है। यह लिंगों में अलग-अलग प्रसार की विशेषता है, पुरुषों की तुलना में अधिक महिलाओं को प्रभावित करता है, और विभिन्न परिणाम, महिलाओं की तुलना में पुरुषों में अधिक आक्रामक रूप दिखाते हैं। इसके अलावा, एमएस नैदानिक पहलुओं, रेडियोलॉजिकल और रोग संबंधी विशेषताओं के संदर्भ में अत्यधिक विषम है। इस प्रकार, प्रयोगात्मक पशु मॉडल का लाभ उठाना आवश्यक है जो पैथोलॉजी के अधिक से अधिक पहलुओं की जांच की अनुमति देता है। प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) चूहों में एमएस के सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले मॉडल में से एक का प्रतिनिधित्व करता है, प्रतिरक्षा प्रणाली की सक्रियता से लेकर सीएनएस क्षति तक, विभिन्न रोग सुविधाओं का मॉडलिंग। यहां हम माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन पेप्टाइड 35-55 (एमओजी35-55) टीकाकरण का उपयोग करके पुरुष और महिला C57BL/6J चूहों दोनों में EAE को शामिल करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिससे रोग का एक पुराना रूप विकसित होता है। हम टीकाकरण के बाद 28 दिनों के लिए इन चूहों के दैनिक नैदानिक स्कोर और मोटर प्रदर्शन के मूल्यांकन की भी रिपोर्ट करते हैं (28 डीपीआई)। अंत में, हम सीएनएस स्तर पर कुछ बुनियादी ऊतकीय विश्लेषण का वर्णन करते हैं, जो रीढ़ की हड्डी पर रोग-प्रेरित क्षति की प्राथमिक साइट के रूप में ध्यान केंद्रित करते हैं।

Introduction

मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) एक पुरानी ऑटोइम्यून सूजन की बीमारी है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को प्रभावित करती है। यह भड़काऊ कोशिकाओं, डिमाइलिनेशन, एक्सोनल लॉस और ग्लियोसिस1 के पेरिवस्कुलर घुसपैठ की उपस्थिति को दर्शाता है। इसका एटियलजि अज्ञात रहता है, और इसके नैदानिक पहलू, रेडियोग्राफिक और रोग संबंधी विशेषताएं रोग2 में उल्लेखनीय विविधता का सुझाव देती हैं।

इसकी अज्ञात एटियलजि और जटिलता के कारण, वर्तमान में, कोई भी पशु मॉडल मानव एमएस 3,4 में प्रदर्शित सभी नैदानिक और रेडियोलॉजिकल विशेषताओं को पुन: प्रस्तुत नहीं करता है। हालांकि, एमएस 3,4 के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए विभिन्न पशु मॉडल कार्यरत हैं। इन मॉडलों में, रोग की शुरुआत आमतौर पर बेहद कृत्रिम होती है, और नैदानिक संकेतों की शुरुआत की समय सीमा मनुष्यों और चूहों के बीच अलग होती है। उदाहरण के लिए, मनुष्यों में, नैदानिक अभिव्यक्तियों की शुरुआत से पहले रोग को अंतर्निहित करने वाली पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं का पता नहीं लगाया जाता है। इसके विपरीत, प्रयोगकर्ता एमएस इंडक्शन4 के बाद हफ्तों या दिनों के भीतर पशु मॉडल में लक्षणों का पता लगा सकते हैं।

तीन बुनियादी पशु मॉडल डिमाइलिनेशन की विशेषताओं का उत्पादन करते हैं जो एमएस की विशेषता हैं: वे जो वायरस-प्रेरित हैं (जैसे, थिइलर के म्यूरिन एन्सेफैलोमाइलाइटिस वायरस), जो विषाक्त एजेंटों (जैसे, क्यूप्रीज़ोन, लियोकोसिथिन) द्वारा प्रेरित होते हैं, और प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) 5 के विभिन्न रूप। प्रत्येक मॉडल रोग के कुछ विशिष्ट पहलुओं का अध्ययन करने में मदद करता है लेकिन कोई भी एमएस6 की सभी विशेषताओं को दोहराता नहीं है। इस प्रकार, विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और संबोधित किए जाने वाले वैज्ञानिक प्रश्नों पर विचार करते हुए सही मॉडल चुनना महत्वपूर्ण है।

माइलिन-व्युत्पन्न एंटीजन के खिलाफ टीकाकरण प्रक्रियाओं के लिए धन्यवाद, ईएई अतिसंवेदनशील चूहों में सीएनएस घटकों के लिए एक ऑटोइम्यून प्रतिक्रिया को ट्रिगर करके प्रेरित होता है। इम्यूनोपैथोलॉजिकल और न्यूरोपैथोलॉजिकल तंत्र की एक विस्तृत श्रृंखला के बीच परस्पर क्रिया प्रतिरक्षित चूहों 7,8 में एमएस (यानी, सूजन, डिमाइलिनेशन, एक्सोनल हानि, और ग्लियोसिस) के प्रमुख रोग लक्षणों के विकास का कारण बनती है। चूहे टीकाकरण के बाद दूसरे सप्ताह के आसपास नैदानिक लक्षण दिखाना शुरू करते हैं और आम तौर पर पूंछ से अंग और अग्रभाग तक आरोही पक्षाघात दिखाते हैं। नैदानिक स्कोर (यानी, रोग से संबंधित घाटे के संचय की मात्रा का ठहराव) आमतौर पर 5-बिंदु पैमाने7 का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है।

प्रोटीन या पेप्टाइड या एन्सेफलोजेनिक टी कोशिकाओं के निष्क्रिय हस्तांतरण के साथ सक्रिय टीकाकरण का उपयोग विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि (जैसे, एसजेएल / जे, सी 57 बीएल / 6, और गैर-मोटापे-मधुमेह (एनओडी) चूहों) के साथ चूहों में ईएई को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है। माइलिन प्रोटीओलिपिड प्रोटीन (पीएलपी), माइलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी), और माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) स्व-सीएनएस प्रोटीन के उदाहरण हैं जिनसे आमतौर पर इम्युनोजेन्स का उत्पादन होता है। विशेष रूप से, पीएलपी (पीएलपी139−151) के इम्यूनोडोमिनेंट एपिटोप के साथ प्रतिरक्षित एसजेएल/जे चूहों ने एक रिलैपसिंग-रिमिटिंग (आरआर) रोग पाठ्यक्रम विकसित किया, जबकि सी 57 बीएल / 6 जे चूहों ने इम्यूनोडोमिनेंट एमओजी35-55 पेप्टाइड शो ईएई के साथ प्रतिरक्षित किया एक पुरानी प्रकृति1. कुछ सीमाओं के बावजूद, जैसे एमएस प्रगति के बारे में बहुत कम जानकारी प्रदान करना, रोग में बी कोशिकाओं की भूमिका, अंदर-बाहर तंत्र, या पुनर्मिलन का अध्ययन करने में कठिनाइयों, ईएई मॉडल ने ऑटोइम्यून और न्यूरोइन्फ्लेमेटरी प्रक्रियाओं की समझ में बेहद योगदान दिया है, एमएस क्षेत्र में ज्ञान बढ़ाना और इस प्रकार इस बीमारी के लिए उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास की अनुमति देना4, 6.

वर्तमान कार्य में, हमने सक्रिय ईएई के एक विशेष रूप पर ध्यान केंद्रित किया, माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन पेप्टाइड 35-55 (एमओजी35-55) -प्रेरित फॉर्म 9,10,11,12। एमओजी35-55-प्रेरित ईएई एमएस का एक पुराना रूप मॉडल करता है। टीकाकरण के बाद, चूहों टीकाकरण के बाद पहले सप्ताह के भीतर एक स्पर्शोन्मुख चरण से गुजरना, तो रोग आम तौर पर टीकाकरण के बाद दूसरे सप्ताह के दौरान उठता है, जबकि टीकाकरण के बाद तीसरे और चौथे सप्ताह के बीच, रोग पुरानी हो जाता है, संचित घाटे से पूरी वसूली की कोई संभावना नहीं के साथ 7,8,13. दिलचस्प बात यह है कि साहित्य14 में मौजूद अधिकांश अध्ययनों में घटनाओं, बीमारी की शुरुआत, पाठ्यक्रम या प्रगति में पुरुषों और महिलाओं के बीच कोई अंतर नहीं देखा जाता है, भले ही कम अध्ययन पुरुषों और महिलाओं में बीमारी की तुलना करते हों।

इसके विपरीत, मनुष्यों में, इन मापदंडों को दृढ़ता से यौन रूप से मंद माना जाता है2. एमएस पुरुषों की तुलना में अधिक महिलाओं को प्रभावित करता है; हालांकि, पुरुष आमतौर पर बीमारी का अधिक आक्रामक रूप विकसित करते हैं2. इस सबूत ने एक आवश्यक, साथ ही जटिल, गोनाडल हार्मोन15 की भूमिका का सुझाव दिया है; फिर भी, पैथोलॉजी में सेक्स हार्मोन की भूमिका और कार्रवाई का तंत्र स्पष्ट नहीं है। इसके अलावा, पशु मॉडल से डेटा दोनों एस्ट्रोजेन और एण्ड्रोजन एक सेक्स विशिष्ट तरीके से16,17 पैथोलॉजी के विभिन्न इलाकों पर सकारात्मक प्रभाव डालती है कि विचार का समर्थन.

कुछ अध्ययनों से प्रोजेस्टेरोन18 के न्यूरोप्रोटेक्टिव, प्रोमाइलिनेटिंग और एंटी-इंफ्लेमेटरी प्रभाव भी सुझाए गए हैं और, हालांकि एमएस रोगियों में सबूत दुर्लभ18 हैं, न्यूरोएक्टिव स्टेरॉयड (यानी, तंत्रिका तंत्र द्वारा डे नोवो संश्लेषित स्टेरॉयड, जैसे कि प्रेग्नेनोलोन, टेट्राहाइड्रोप्रोजेस्टेरोन, और डायहाइड्रोप्रोजेस्टेरोन) भी रोग पाठ्यक्रम19 को प्रभावित कर सकता है. सामूहिक रूप से, ये आंकड़े इस विचार का समर्थन करते हैं कि परिधीय रूप से और सीएनएस के अंदर उत्पादित सेक्स हार्मोन की बीमारी की शुरुआत और प्रगति में एक महत्वपूर्ण और सेक्स-विशिष्ट भूमिका है। इसलिए, वर्तमान कार्य में, हम नर और मादा दोनों जानवरों से अलग-अलग डेटा एकत्र करने का आग्रह करते हैं।

हिस्टोपैथोलॉजिकल दृष्टिकोण से, रीढ़ की हड्डी का सफेद पदार्थ इस मॉडल में सीएनएस चोट की प्रमुख साइट के रूप में कार्य करता है, जो मोनोन्यूक्लियर भड़काऊ घुसपैठ और डिमाइलिनेशन8 के मल्टीफोकल, संगम क्षेत्रों की विशेषता है। इस प्रकार, C57BL/6J चूहों में MOG35-55-प्रेरित EAE को शामिल करने के लिए इस प्रोटोकॉल का वर्णन करने में, हम दो लिंगों में रोग के परिणाम को ध्यान में रखेंगे और रीढ़ की हड्डी के बारे में कुछ हिस्टोपैथोलॉजिकल अंतर्दृष्टि प्रदान करेंगे।

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Protocol

वर्तमान कार्य में जानवरों की देखभाल और हैंडलिंग 22सितंबर 2010 (2010/63 / यूई) के यूरोपीय संघ परिषद के निर्देश के अनुसार की गई थी; वर्तमान अध्ययन में रिपोर्ट की गई सभी प्रक्रियाओं को इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (407/2018-पीआर) और टोरिनो विश्वविद्यालय (प्रोजेक्ट एन ° 360384) की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। हम मूल रूप से 201020 में किलकेनी एट अल द्वारा प्रकाशित ARRIVAL दिशानिर्देशों के प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुरूप सुझाव देते हैं। शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि आवश्यक सामग्री उपलब्ध है ( सामग्री की तालिकादेखें)। एक आटोक्लेव में MOG35-55 पायस की तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी कांच के बने पदार्थ और बर्तनों को जीवरहित करें। प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का सारांश चित्रा 1 में दर्शाया गया है।

1. एमओजी35-55 पायस की तैयारी

नोट: पायस तैयार करने के लिए, एमओजी35-55, अपूर्ण फ्रायड के सहायक (आईएफए), माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस स्ट्रेन एच 37 आरए (एमटी), और शारीरिक समाधान की आवश्यकता होती है ( सामग्री की तालिकादेखें)।

चेतावनी: हीट-किल्ड एमटी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को उत्तेजित कर सकता है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करके और हुड के नीचे एक ढके हुए सटीक संतुलन में एमटी का वजन करना, साँस लेना, अंतर्ग्रहण और त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें।

विलयन संयोजन नोट्स
2 mg/mL MOG35-55 पेप्टाइड समाधान Lyophilized MOG35-55 पेप्टाइड 2 mg/mL एकाग्रता पर शारीरिक समाधान में पतला -80 डिग्री सेल्सियस पर पहले से ही पतला समाधान संरक्षित करें।
5 μg/mL PT समाधान Lyophilized पीटी 5 μg/mL एकाग्रता पर शारीरिक समाधान में पतला. -80 डिग्री सेल्सियस पर पहले से ही पतला समाधान संरक्षित करें।
पायस प्रत्येक माउस प्रतिरक्षित किया जा करने के लिए आवश्यक पायस की कुल मात्रा 300 माइक्रोन निम्नानुसार विभाजित है: परिवर्तन या संदूषण से बचने के लिए, टीकाकरण के दिन पायस तैयार करें।
MOG35-55 का 200 μg/माउस, यानी, MOG35-55 2 mg/mL समाधान का 100 μL।
शारीरिक समाधान के 50 माइक्रोन
आईएफए के 150 माइक्रोन
4 मिलीग्राम / एमएल एमटी, यानी, 1.2 मिलीग्राम / माउस
शारीरिक समाधान सोडियम क्लोराइड 0.9% आसुत जल में पतला।

तालिका 1: टीकाकरण प्रक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधानों की संरचना।

  1. एक ग्लास बीकर में समाधान तैयार करें, पहले तरल घटक और अंत में एमटी जोड़कर।
    नोट: प्रत्येक माउस प्रतिरक्षित किया जा करने के लिए आवश्यक पायस की कुल मात्रा 300 माइक्रोन, तालिका 1 में संकेत के रूप में विभाजित है. पायस बहुत चिपचिपा और मोटा है, इसलिए तैयारी और इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान, कुछ नुकसान हो सकता है, खासकर जब कुछ चूहों के लिए समाधान तैयार करना। हम कम से कम 1.5-2 गुना से प्रतिरक्षित किया जा करने के लिए चूहों की संख्या overestimated द्वारा आवश्यक पायस की अंतिम मात्रा की गणना का सुझाव.
  2. बर्फ में बीकर प्लेस और एक 18 जी सुई के साथ ग्लास सिरिंज का उपयोग करने के लिए समाधान पायसीकारी शुरू करने के लिए.
    नोट: पायस भी एक तीन तरह पानी निकलने की टोंटी के साथ दो हवा मुक्त ग्लास सीरिंज जोड़ने और सवार आगे और पीछे21,22 धक्का द्वारा समाधान मिश्रण द्वारा उदाहरण के लिए, अन्य रणनीतियों का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है.
  3. कम से कम 15 मिनट के लिए समाधान पायसीकार; आम तौर पर, पायसीकरण के 30 मिनट पर्याप्त है. पायस की गुणवत्ता की जांच करने के लिए, पानी से भरे पारदर्शी कंटेनर में पायस की एक बूंद जोड़ें: यदि बूंद अपनी संरचना को बनाए रखती है और बरकरार रहती है, तो पायस तैयार है।
  4. इमल्शन को सीधे 1 एमएल सीरिंज के अंदर रखें जिसका उपयोग टीकाकरण के लिए किया जाएगा और इन्हें +4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि पायस की मोटाई को संरक्षित करने और परिवर्तन या संदूषण से बचने के लिए उपयोग न किया जाए।

2. पशु चयन और टीकाकरण

  1. पशु चयन
    1. ~ 57 ग्राम के इष्टतम शरीर के वजन के साथ 8-10 सप्ताह की उम्र में दोनों लिंगों के वयस्क C20BL/6J चूहों का चयन करें। विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के लिए उम्र- और लिंग-मिलान वाले चूहों का चयन करना सुनिश्चित करें क्योंकि बीमारी की संवेदनशीलता उम्र और लिंग के साथ भिन्न हो सकती है।
      नोट: चूहों को टीकाकरण के दिन तुलनीय शरीर के वजन का होना चाहिए क्योंकि वर्तमान प्रक्रिया एक निश्चित शरीर के वजन सीमा (17-25 ग्राम) के लिए अनुकूलित है।
    2. समूहों में घर समान-लिंग वाले जानवर (एन = 4-5/पिंजरे) 45 सेमी x 25 सेमी x 15 सेमी पॉलीप्रोपाइलीन माउस पिंजरों में मानक परिस्थितियों में सामाजिक अलगाव से बचने के लिए 22 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर, 12:12 प्रकाश/अंधेरे चक्र (08:00 बजे रोशनी)। भोजन और पानी एड लिबिटम प्रदान करें।
      नोट: आखिरकार, प्रतिरक्षित जानवरों में रोग पाठ्यक्रम की संभावित परिवर्तनशीलता को और सीमित करने के लिए, हम पर्याप्त रूप से कई प्रयोगात्मक समूहों को बनाने का भी सुझाव देते हैं। अध्ययन 8,23 भी हैं जो टीकाकरण के समय को एक ऐसी स्थिति के रूप में वर्णित करते हैं जो ईएई परिणाम में भिन्नता निर्धारित करता है। इस प्रकार, हम सभी जानवरों में लगभग एक ही घंटे में टीकाकरण प्रदर्शन करने का सुझाव, अधिमानतः दैनिक प्रकाश / अंधेरे चक्र23 के प्रकाश घंटे के दौरान. तनाव को सीमित करने के लिए, टीकाकरण के दिन से पहले जानवरों में हेरफेर करना और उन्हें दैनिक मूल्यांकन के लिए आसानी से पहचानने के लिए चिह्नित करना बेहतर होता है, उदाहरण के लिए, कान कतरन या टैग।
  2. टीकाकरण प्रक्रिया
    नोट: सुनिश्चित करें कि प्रक्रिया जानवरों के लिए तनाव को कम करने और टीकाकरण का अनुकूलन करने के लिए एक अनुभवी अन्वेषक द्वारा की जाती है। टीकाकरण शुरू करने से पहले, संस्थागत पशु देखभाल और नैतिक समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार संज्ञाहरण विधि का चयन करें। हमारी प्रयोगशाला आइसोफ्लुरेन के साथ संक्षिप्त संज्ञाहरण का उपयोग करती है।
    1. माउस को एनेस्थेटाइज करें: एनेस्थीसिया इंडक्शन के लिए 4% आइसोफ्लुरेन और एनेस्थीसिया रखरखाव के लिए 1.5-2% आइसोफ्लुरेन। संज्ञाहरण के प्रभावी होने की प्रतीक्षा करें और संज्ञाहरण के स्तर का आकलन करने के लिए पीठ और सामने के पैर की अंगुली चुटकी का उपयोग करें। आंखों की सूखापन को रोकने के लिए, जबकि माउस संज्ञाहरण के तहत है, एक पशु चिकित्सक द्वारा अनुमोदित आंख मरहम का उपयोग करें.
    2. पार्श्व दुम नस में पीटी अंतःशिरा इंजेक्शन: नसों को प्रदर्शित करने के लिए एक इथेनॉल समाधान, जो एक वाहिकाविस्फारक के रूप में कार्य करता है के साथ धीरे माउस की पूंछ प्लग. पूंछ के दो पार्श्व नसों में से एक पर ध्यान केंद्रित करें, और, 30 जी सुई के साथ फिट 0.5 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, पीटी के 500 एनजी (यानी, 5 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता पर शारीरिक समाधान में पतला पीटी के 100 माइक्रोन) इंजेक्ट करें।
    3. एमओजी35-55 पायस के चमड़े के नीचे इंजेक्शन: 26 जी सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, पहले से तैयार पायस के तीन चमड़े के नीचे इंजेक्शन करें: दो फ्लैंक्स के रोस्ट्रल भाग के नीचे और एक पूंछ के आधार पर। प्रत्येक साइट में इंजेक्ट किए गए पायस की मात्रा 100 माइक्रोन है, प्रत्येक माउस में इंजेक्ट किए गए पायस के 300 माइक्रोन की कुल मात्रा के लिए।
      नोट: टीकाकरण का दिन दिन 0 पोस्ट टीकाकरण (डीपीआई) के रूप में दर्ज किया गया है; 48 घंटे बाद में (यानी, 2 डीपीआई पर), पहले किए गए एक के बराबर पीटी का एक और अंतःशिरा इंजेक्शन करना आवश्यक है। माउस निरोधक का उपयोग करके, संज्ञाहरण के बिना इंजेक्शन करना संभव है। यहाँ वर्णित प्रक्रिया प्रेरित करने और संभव असुविधा और जानवरों के आंदोलनों या चूहों और जांचकर्ताओं दोनों के लिए जोखिम से बचने के लिए टीकाकरण प्रक्रिया के दौरान चूहों के संवेदनाहारी बनाए रखने के उद्देश्य से है. इस प्रकार, कोई सर्जिकल प्रक्रियाएं नहीं हैं। हालांकि, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का अनुकूलन करने के लिए, यह इन चरणों के दौरान उचित बाँझ शर्तों को बनाए रखने के लिए और इन प्रक्रियाओं के बाद माउस की हालत की निगरानी करने के लिए महत्वपूर्ण है.
    4. माउस इंजेक्शन से बरामद किया है सत्यापित करने के लिए, प्रक्रियाओं के बाद एक साफ पिंजरे में जगह है और यह उरोंचना recumbency बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना हासिल की है जब तक प्रतीक्षा करें. माउस पूरी तरह से ठीक हो गया है के बाद, यह अन्य जानवरों के साथ घर पिंजरे में वापसी.

3. ईएई अनुवर्ती

  1. शरीर का वजन और भोजन का सेवन
    1. इलेक्ट्रॉनिक परिशुद्धता संतुलन का उपयोग करके जानवरों के शरीर के वजन (बीडब्ल्यू) की दैनिक निगरानी करें, क्योंकि बीडब्ल्यू में कमी रोग की प्रगति का संकेतक है।
      नोट: पशु देखभाल के लिए संस्थागत और नैतिक समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार, यह कमी एक निश्चित प्रतिशत से अधिक नहीं होनी चाहिए। आमतौर पर, यदि कोई जानवर प्रारंभिक शरीर के वजन का 20% से अधिक खो देता है (यानी, 0 डीपीआई पर दर्ज वजन), तो इसे मानवीय समापन बिंदु के आवेदन के रूप में बलिदान किया जाना चाहिए। इच्छामृत्यु विधियों में साँस लेना (जैसे, 5% आइसोफ्लुरेन) के लिए गहरी अपरिवर्तनीय संज्ञाहरण शामिल है, जिसके बाद सिर काटना होता है।
    2. भोजन के सेवन (FI) की निगरानी करें - एक दिन में एक जानवर द्वारा खाया जाने वाला भोजन (g∙day-1∙animal-1), सप्ताह में कम से कम एक बार विशिष्ट कंटेनर में भोजन की मात्रा का वजन करना, और दो अनुक्रमिक मापों और पिंजरे में मौजूद जानवरों की संख्या के बीच पारित दिनों के लिए खाए गए भोजन की मात्रा को विभाजित करना।
      नोट: यह माप औसत भोजन सेवन के अनुमान की अनुमति देता है। नैदानिक रोग के संकेतों की उपस्थिति और संचय के कारण, जिसमें अंगों का पक्षाघात शामिल है, हम सुझाव देते हैं कि पिंजरे के फर्श पर कुछ पानी का भोजन रखें जब जानवर अपने हिंद अंगों पर मजबूती से खड़े होने और खाद्य कंटेनर या पानी की बोतल तक पहुंचने में सक्षम न हों। अनुवर्ती अवधि के माध्यम से भोजन के सेवन का यथासंभव आकलन करने के लिए, हमने चूहों के लिए इसे गीला करने से पहले इस भोजन के सूखे वजन को भी मापा।
  2. ईएई के दौरान एस्ट्रस चक्रीयता का मूल्यांकन
    1. कम से कम दो चक्रों के लिए एस्ट्रस चक्र की जांच करें, योनि कोशिका विज्ञान स्मीयरों का मूल्यांकन करें जैसा कि मैकलीन एट अल.24द्वारा वर्णित है। योनि स्मीयर नमूनों में तीन प्राथमिक कोशिका प्रकारों की उपस्थिति के आधार पर एस्ट्रस चक्र के चरण को वर्गीकृत करें-न्यूक्लियेटेड एपिथेलियल कोशिकाएं, कॉर्निफाइड स्क्वैमस एपिथेलियल कोशिकाएं, और ल्यूकोसाइट्स-योनि स्मीयर नमूनों में, निम्नानुसार हैं:
      1. गोल, अच्छी तरह से गठित न्यूक्लिएटेड उपकला कोशिकाओं के समूहों की लगभग अनन्य उपस्थिति के आधार पर प्रोस्ट्रस के रूप में वर्गीकृत करें।
      2. कॉर्निफाइड स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं के घने पैक समूहों की प्रमुख उपस्थिति के आधार पर एस्ट्रस के रूप में वर्गीकृत करें।
      3. छोटे गहरे रंग के दाग वाले ल्यूकोसाइट्स की प्रमुख उपस्थिति और कॉर्निफाइड स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं की मामूली उपस्थिति के आधार पर मेटेस्ट्रस के रूप में वर्गीकृत करें।
      4. न्यूक्लियेटेड एपिथेलियल कोशिकाओं की संभावित उपस्थिति के साथ-साथ छोटे गहरे रंग के सना हुआ ल्यूकोसाइट्स और दुर्लभ कॉर्निफाइड स्क्वैमस एपिथेलियल कोशिकाओं की अत्यधिक प्रमुख उपस्थिति के आधार पर डायस्ट्रस के रूप में वर्गीकृत करें।
        नोट: दोनों लिंगों में बीमारी का मूल्यांकन करते समय, एस्ट्रस चक्र के कारण महिलाओं में परिवर्तनशीलता की जांच करना महत्वपूर्ण है। हम एस्ट्रस चक्र के मूल्यांकन पर ध्यान केंद्रित करने का सुझाव देते हैं, विशेष रूप से पहले और दूसरे सप्ताह के टीकाकरण के बीच (यानी, ईएई के तीव्र चरण के दौरान)। यह पहले दिखाया गया है कि टीकाकरण प्रक्रिया इस चरण25 के भीतर एस्ट्रस चक्र के सबसे स्पष्ट परिवर्तनों का कारण बनती है। इसके अलावा, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि जब जानवर उच्च नैदानिक स्कोर (विशेष रूप से >3) तक पहुंचता है, तो पीछे के पैरेसिस और हिंदलिंब्स में टोन की कमी के कारण धब्बा करना मुश्किल होता है।
  3. नैदानिक स्कोर
    1. एक अंधे अन्वेषक दैनिक जानवरों के नैदानिक स्कोर का आकलन है. प्रत्येक जानवर को रैके7 द्वारा वर्णित रोग पाठ्यक्रम26 का मूल्यांकन करने के लिए 0 से 5 तक रेटेड स्कोर (तालिका 2 देखें) असाइन करें।
      नोट: शरीर के वजन में कमी के समान, नैदानिक स्कोर में वृद्धि के लिए एक मानवीय समापन बिंदु भी आवश्यक है, पशु देखभाल के लिए संस्थागत और नैतिक समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार। आम तौर पर, यदि कोई जानवर अब खुद को स्वायत्त रूप से खिलाने में सक्षम नहीं है (यह आमतौर पर तब होता है जब कोई जानवर हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले पैमाने के अनुसार कम से कम 4 के स्कोर तक पहुंच जाता है), तो इसे मानवीय समापन बिंदु के आवेदन के रूप में बलिदान किया जाना चाहिए।
  4. रोटारोड परीक्षण द्वारा मोटर प्रदर्शन मूल्यांकन
    नोट: ईएई प्रगति का मूल्यांकन आमतौर पर दैनिक नैदानिक स्कोर निर्दिष्ट करके किया जाता है, जो पूरी तरह से प्रशिक्षित अंधा अन्वेषक द्वारा किया जाता है। हालांकि, रोग की प्रगति के अधिक मात्रात्मक और वस्तुनिष्ठ मूल्यांकन के साथ इसे फ़्लैंक करना उपयोगी हो सकता है। पिछले अध्ययन26 में, रोटारोड परीक्षण का उपयोग प्रतिरक्षित जानवरों के मोटर प्रदर्शन को मापने के लिए किया गया था। जैसा कि वैन डेन बर्ग एट अल 27 द्वारा वर्णित है, रोग पाठ्यक्रम का अधिक मात्रात्मक और सटीक नैदानिक मूल्यांकन करने के लिए, रोटारोड परीक्षण द्वारा मोटर प्रदर्शन का मूल्यांकन नैदानिक स्कोर मूल्यांकन का समर्थन कर सकता है। विस्तृत विवरण के लिए, वैन डेन बर्ग एट अल.27 देखें।
    1. चूहों रोटरोड सत्र दैनिक से गुजरना करते हैं, बलिदान (यानी, 28 डीपीआई) तक 1 डीपीआई से शुरू. प्रत्येक सत्र में एक एकल 300 एस सत्र होता है, जिसके दौरान रॉड की गति को 4 से 40 आरपीएम तक रैखिक रूप से बढ़ाना पड़ता है।
    2. पशु के स्कोर रजिस्टर. जब माउस अपना संतुलन बनाए रखने में सक्षम नहीं होता है और डिवाइस से गिर जाता है, तो यह जमीन पर गिर जाता है और एक सेंसर को ट्रिगर करता है, और समय (ओं) को रिकॉर्ड किया जाता है। इस प्रकार, प्रदर्शन को गिरने के लिए विलंबता के रूप में स्कोर किया जाता है।

श्रेणीकरण नैदानिक संकेत या क़िस्‍म
0 स्वस्थ कोई मनाया नैदानिक संकेत नहीं। जानवर एक सामान्य स्वर और पूंछ की गति दिखाता है। यह बिना ट्रिप के चलता है।
0.5 बिगड़ा हुआ गेट ग्रिल पर चलते समय जानवर यात्रा करता है।
1 लंगड़ा पूंछ जब जानवर को पूंछ के आधार से उठाया जाता है, तो पूंछ झुक जाती है (पिलपिला पूंछ)।
1.5 लंगड़ा पूंछ और बिगड़ा हुआ गेट जानवर एक पिलपिला पूंछ दिखाता है, और यह ग्रिल पर चलते समय यात्रा करता है।
2 गतिभंग जानवर अपनी पीठ पर मुड़ने के बाद खड़े होने में कठिनाइयों को प्रदर्शित करता है।
2.5 हिंडलिंब का गतिभंग और पैरेसिस एक बार अपनी पीठ पर घुमाए जाने के बाद पशु प्रदर्शन खड़ा नहीं हो सकता है, और यह अपने एक हिंद अंग का स्वर खो देता है।
3 हिंडलिंब्स का पक्षाघात जानवर दोनों हिंदलिंब का स्वर खो देता है।
3.5 हिंद अंगों का पक्षाघात और/या अग्रभाग का पैरेसिस जानवर दोनों हिंदलिंब्स और आंशिक रूप से फोरलिंब के स्वर को खो देता है। वास्तव में, यह अग्रभाग की पकड़ में ताकत का नुकसान दिखाता है।
4 टेट्रा पैरेसिस जानवर पूरी तरह से अपने अंगों का स्वर खो देता है।
4.5 टेट्रा पैरेसिस और शरीर के तापमान में कमी जानवर पूरी तरह से अपने अंगों के स्वर को खो देता है, और यह शरीर के तापमान में कमी दिखाता है (यह ठंडा है)।
5 मरना या मरना जानवर मर रहा है (यह किसी भी उत्तेजना का जवाब नहीं देता है) या मृत।

तालिका 2: ईएई प्रगति का आकलन करने के लिए नैदानिक स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग किया जाता है।

4. रीढ़ की हड्डी के स्तर पर ईएई-प्रेरित हिस्टोपैथोलॉजिकल संकेतों का मूल्यांकन

नोट: यहां, हम संक्षेप में जानवरों की बलि देने और हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण करने के लिए रीढ़ की हड्डी को इकट्ठा करने की प्रक्रिया की रिपोर्ट करते हैं; विस्तृत विवरण के लिए, इन संदर्भोंको 10,26,28,29 देखें।

  1. निर्धारण और ऊतक नमूनाकरण
    नोट: विस्तृत विवरण के लिए, इन संदर्भोंको 10,26 देखें।
    1. रोग के जीर्ण चरण के दौरान 28 डीपीआई पर जानवरों की बलि दें।
      1. गहरी अपरिवर्तनीय संज्ञाहरण (ज़ोलाज़ेपम और टिलेटामाइन 80 मिलीग्राम / किग्रा / ज़ाइलाज़ीन 10 मिलीग्राम / किग्रा के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन) द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज़ करें।
      2. Transcardially एक 4% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान के द्वारा पीछा एक खारा समाधान के साथ चूहों perfuses.
        नोट: पीएफए का उपयोग करते समय ध्यान दें: चूंकि यह विषाक्त है, उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करके साँस लेना, अंतर्ग्रहण और त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें। पाउडर वजन, समाधान तैयार, और हुड के नीचे छिड़काव प्रदर्शन.
    2. रीढ़ की हड्डी के स्तंभ30 से रीढ़ की हड्डी निकालें.
    3. रीढ़ की हड्डी को 24 घंटे के लिए 4% पीएफए समाधान में स्टोर करें।
    4. 0.01 एम खारा फॉस्फेट बफर (पीबीएस) में कई washes प्रदर्शन.
    5. पैराफिन ब्लॉक30 में रीढ़ की हड्डी एम्बेड करें.
  2. हिस्टोलॉजिकल प्रक्रियाएं
    नोट: विस्तृत विवरण के लिए, मोंटारोलो एट अल 10 देखें।
    1. 10 माइक्रोन मोटी अनुप्रस्थ रीढ़ की हड्डी वर्गों में कटौती और जिलेटिन लेपित स्लाइड पर उन्हें इकट्ठा करने के लिए एक microtome का प्रयोग करें. माउस रीढ़ की हड्डी एटलस31 के अनुप्रस्थ वर्गों के अनुरूप चित्र मैच करने के लिए sectioning के विमान ओरिएंट.
    2. वर्गों32 के deparaffinization प्रदर्शन.
    3. Hemtooxylin और Eosin32 के साथ अनुभाग दाग.
    4. वर्गों को निर्जलितकरें 32.
    5. एक बढ़ते माध्यम के साथ वर्गों को कवर करें और उन्हें एक रासायनिक हुड के तहत कमरे के तापमान पर सूखने दें।
      नोट: हेमेटोक्सिलिन-ईओसिन धुंधला हो जाना पेरिवास्कुलर भड़काऊ घुसपैठ (पीवीआईआई) 26 की उपस्थिति का पता लगाने की अनुमति देता है, जिसे रोग28 के संकेत के रूप में मूल्यांकन किया जाता है।
  3. रीढ़ की हड्डी वर्गों का मात्रात्मक विश्लेषण
    1. एक 20x उद्देश्य29 के साथ एक डिजिटल कैमरे से जुड़े ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ सना हुआ वर्गों की छवियों को प्राप्त करें।
    2. PvII की संख्या प्राप्त करने के लिए अधिग्रहित छवि का विश्लेषण करें, जिसे प्रति मिमी2 घुसपैठ की संख्या के रूप में व्यक्त किया गया है।
      नोट: अधिग्रहित छवियों के विश्लेषण के लिए, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का लाभ उठाना उपयोगी है। इस काम में प्रस्तुत न्यूरोपैथोलॉजिकल निष्कर्षों को रीढ़ की हड्डी के 10 पूर्ण क्रॉस-सेक्शन में मात्रा निर्धारित की जाती है, प्रति माउस (एन = 8 / समूह) पूरे रीढ़ की हड्डी के स्तर के प्रतिनिधि।

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Representative Results

टीकाकरण के बाद ईएई अनुवर्ती
इसका मूल्यांकन नीचे वर्णित के रूप में किया गया था।

शरीर का वजन और भोजन का सेवन
विचरण (एनोवा) (स्वतंत्र चर के रूप में सेक्स और समय) का दो-तरफा विश्लेषण दोनों लिंगों के ईएई जानवरों के बीडब्ल्यू में कमी दिखाता है, विशेष रूप से दूसरे सप्ताह के बाद प्रेरण (एफ (1,57) = 4.952, पी < 0.001; चित्रा 2 ए)। हालांकि, बीडब्ल्यू में यौन द्विरूपता हमेशा बनाए रखा जाता है (चित्रा 2 ए)। बीडब्ल्यू के प्रतिशत के संदर्भ में (एफ (1,57) = 23.935, पी < 0.001; चित्रा 2 बी), दोनों पुरुषों और महिलाओं प्रारंभिक बीडब्ल्यू की तुलना में 12 डीपीआई से 17 डीपीआई (पी < 0.001) के बीच एक बड़ा नुकसान प्रदर्शित करते हैं, लेकिन 20% (चित्रा 2 बी) के कुल नुकसान से अधिक कभी नहीं। इस प्रकार, हालांकि बीडब्ल्यू नुकसान रोग की शुरुआत से पहले शुरू होता है, यह ईएई के तीव्र चरण (चित्रा 2 ए, बी) के दौरान अपनी अधिकतम तक पहुंच जाता है। बीडब्ल्यू नुकसान के मामले में लिंगों के बीच कोई अंतर नहीं है। हालांकि, महिलाएं पहले अधिक वजन कम करती हैं और क्रोनिक चरण (तीसरे-चौथे सप्ताह के बाद प्रेरण) (चित्रा 2 बी) के दौरान कम ठीक होती हैं।

इसके अलावा, दो-तरफा एनोवा (स्वतंत्र चर के रूप में सेक्स और समय) भी एफआई (एफ (9, 39) = 6.682, पी < 0.001 में महत्वपूर्ण कमी दिखाता है; चित्र 2C) दोनों लिंगों में, विशेष रूप से दूसरे पोस्ट-टीकाकरण सप्ताह के दौरान, ईएई गंभीरता में वृद्धि के परिणामस्वरूप, जिसने जानवर के लिए पिंजरे में ऊपरी कंटेनर में रखे भोजन तक पहुंचना अधिक चुनौतीपूर्ण बना दिया। जैसा कि हमने सुझाव दिया था, जानवरों पर और तनाव को कम करने के लिए भोजन को बाद में पिंजरे के फर्श पर रखा गया था। इसने एफआई को प्रारंभिक स्तर(चित्रा 2सी)पर लौटने की अनुमति दी, और बीडब्ल्यू को आंशिक रूप से पुनर्प्राप्त करने के लिए(चित्रा 2ए,बी)।

महिलाओं में एस्ट्रस चक्र मूल्यांकन
एस्ट्रस के विभिन्न चरणों में बिताए गए समय के बीच तुलना छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। विश्लेषण एस्ट्रल चरणों (यानी, प्रोस्ट्रस और एस्ट्रस) में बिताए गए समय में अंतर दिखाता है, जो कि स्पर्शोन्मुख चरण (यानी, मेटेस्टस और डायस्ट्रस) में स्पर्शोन्मुख चरण (ईएई की शुरुआत से पहले) और रोगसूचक चरण (ईएई की शुरुआत के बाद) (पी = 0.042; चित्रा 2 डी), मुख्य रूप से रोगसूचक चरणों (पी = 0.017) के दौरान डायस्ट्रस में बिताए गए समय में वृद्धि और प्रोस्ट्रस (पी = 0.08) में बिताए गए समय को कम करने की प्रवृत्ति के कारण।

यह पहले से ही वर्णित किया गया है कि प्रेरण प्रक्रिया महिलाओं में एस्ट्रस चक्र के परिवर्तन की ओर ले जाती है, विशेष रूप से प्रोस्ट्रस25 को प्रभावित करती है। इस चरण के दौरान, एस्ट्रोजेन के बढ़ते स्तर विरोधी भड़काऊ और न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव16 डालने के लिए जाना जाता है और इस प्रकार, संभवतः presymptomatic चरण के दौरान उन हार्मोन की सुरक्षात्मक भूमिका के लिए जिम्मेदार हैं. हालांकि, जब एस्ट्रोजेन का स्तर गिरता है, जैसा कि हम पोस्ट शुरुआत चरण में देखते हैं, तो उनके सुरक्षात्मक प्रभाव भी समाप्त हो जाते हैं।

नैदानिक स्कोर और रोटारोड प्रदर्शन
दो-तरफा एनोवा (स्वतंत्र चर के रूप में सेक्स और समय) पुरुषों और महिलाओं दोनों के नैदानिक स्कोर (सीएस) में समय में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाता है (एफ (56-813) = 27.951, पी < 0.001; चित्रा 3 ए)। विशेष रूप से, 10 डीपीआई से शुरू, दोनों लिंग सीएस (पी < 0.001) में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाते हैं, जिसे समापन बिंदु (28 डीपीआई)(चित्रा 3ए)तक बनाए रखा जाता है। महिलाएं प्रदर्शित करती हैं, भले ही काफी नहीं (पी = 0.156), पुरुषों की तुलना में उच्च सीएस (चित्रा 3ए)। रोग की शुरुआत के संदर्भ में, यह आम तौर पर लगभग 10 डीपीआई होता है, जिसमें पुरुषों की तुलना में महिलाओं में पहले की शुरुआत की प्रवृत्ति होती है (चित्र 3बी)। इसके अलावा, महिलाएं पुरुषों की तुलना में एक महत्वपूर्ण उच्च संचयी सीएस दिखाती हैं (पी = 0.017; चित्रा 3 सी)।

रोटारोड प्रदर्शन पाठ्यक्रम नैदानिक मूल्यांकन(चित्रा 2डी)जैसा दिखता है। रोग की शुरुआत से शुरू होकर, यह कम हो जाता है, ईएई के तीव्र चरण में, टीकाकरण के बाद दूसरे सप्ताह के दौरान न्यूनतम प्रदर्शन तक पहुंच जाता है। दो-तरफा एनोवा (स्वतंत्र चर के रूप में सेक्स और समय) पुरुषों और महिलाओं दोनों के रोटारोड प्रदर्शन में समय में उल्लेखनीय कमी दिखाता है (एफ (46-673) = 5.365, पी < 0.001; चित्रा 3 डी)। विशेष रूप से, पुरुष 16 डीपीआई (पी = 0.022) पर न्यूनतम प्रदर्शन प्रदर्शित करते हैं जबकि महिलाएं 17 डीपीआई (पी < 0.001) पर प्रदर्शित होती हैं। नर महिलाओं की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करते हैं, खासकर बीमारी के जीर्ण चरण (21-28 डीपीआई) के दौरान, संभवतः कम सीएस (चित्रा 3 ए, डी) के परिणामस्वरूप।

रीढ़ की हड्डी का हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन
रीढ़ की हड्डी के वर्गों में PvII के एक तरफा एनोवा (स्वतंत्र चर के रूप में सेक्स) पुरुषों और महिलाओं(चित्रा 4A)के बीच एक स्पष्ट अंतर पर प्रकाश डाला गया. महिलाएं पुरुषों की तुलना में काफी अधिक संख्या में PvII दिखाती हैं (एफ (1,14) = 63.107, पी < 0.001; चित्रा 4 बी)। ये डेटा संभवतः उच्च संचयी सीएस, खराब रोटारोड प्रदर्शन, और महिलाओं में देखी गई अधिक आक्रामक बीमारी को दर्शाते हैं, खासकर ईएई के पुराने चरण के दौरान।

ये आंकड़े इस तथ्य को भी दर्शाते हैं कि मादा चूहे पुरुषों14 की तुलना में अधिक आक्रामक ईएई के विकास के लिए उच्च संवेदनशीलता प्रदर्शित करते हैं, जो इस रोग मॉडल और मनुष्यों में होने वाले एमएस के बीच मुख्य अंतरों में से एक है। महिलाएं पहले की बीमारी की शुरुआत प्रदर्शित करती हैं, प्राथमिक प्रगतिशील रूपों का मामूली कम प्रसार होता है, और पुरुषों की तुलना में समग्र रूप से कम विकलांगता प्रगति दिखाती है 2,33,34.

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के योजनाबद्ध अस्थायी प्रतिनिधित्व। BioRender.com के साथ बनाया गया। संक्षिप्ताक्षर: i.v. = अंतःशिरा; s.c. = चमड़े के नीचे; एमओजी35-55 = माइलिन ओलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन पेप्टाइड 35-55; = डीपीआई = टीकाकरण के बाद का दिन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: शरीर के वजन पर ईएई प्रभाव का मूल्यांकन, पुरुष और महिला चूहों में भोजन का सेवन, और महिला चूहों में एस्ट्रस चक्र। टीकाकरण के दिन (0 डीपीआई) से बलिदान के दिन (28 डीपीआई) तक, ग्राफ (ए) दैनिक शरीर के वजन, (बी) शरीर के वजन का प्रतिशत, और (सी) दोनों लिंगों के जानवरों में साप्ताहिक भोजन सेवन मूल्यांकन दिखाते हैं (एन = 15 / समूह)। (डी) एस्ट्रस चक्र के विभिन्न चरणों में बिताए गए समय (समय के औसत प्रतिशत के रूप में व्यक्त), योनि कोशिका विज्ञान स्मीयरों द्वारा मूल्यांकन किया गया, स्पर्शोन्मुख चरण (पूर्व-शुरुआत, ग्राफ के बाएं स्तंभ) या रोगसूचक चरण (पोस्ट-शुरुआत, ग्राफ का दायां स्तंभ) महिला चूहों में। ±सांख्यिकीय विश्लेषण ने पी≤ 0.05 (# = पुरुष बनाम महिलाएं; * = विभिन्न समय बिंदुओं के बीच तुलना) के लिए एक महत्वपूर्ण प्रभाव का खुलासा किया। संक्षिप्ताक्षर: ईएई = प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस; BW = शरीर का वजन; FI = भोजन का सेवन; डीपीआई = टीकाकरण के बाद का दिन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ईएई प्रभावित पुरुष और महिला चूहों में नैदानिक स्कोर और रोटारोड प्रदर्शन का मूल्यांकन। (ए) दोनों लिंगों के जानवरों में दैनिक नैदानिक स्कोर (0 से 28 डीपीआई तक) का आकलन (एन = 15/समूह)। (बी) ईएई प्रभावित पुरुषों (बाएं स्तंभ) और महिलाओं (दाएं स्तंभ) चूहों में रोग की शुरुआत (मतलब डीपीआई) का दिन। (सी) ईएई प्रभावित पुरुषों (बाएं स्तंभ) और महिलाओं (दाएं स्तंभ) चूहों द्वारा औसत संचयी नैदानिक स्कोर तक पहुंच गया। (डी) दोनों लिंगों के जानवरों में 6 से 28 डीपीआई (0 परीक्षण के पहले 5 दिनों के भीतर प्राप्त आधारभूत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करता है) से दैनिक रोटारोड प्रदर्शन (गिरावट की विलंबता के रूप में मापा जाता है) का आकलन। सांख्यिकीय विश्लेषण ने पी ±≤ 0.05 (# = पुरुष बनाम महिलाएं; * = विभिन्न समय बिंदुओं के बीच तुलना) के लिए एक महत्वपूर्ण प्रभाव का खुलासा किया। संक्षिप्ताक्षर: ईएई = प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस; सीएस = नैदानिक स्कोर; सह सीएस = संचयी नैदानिक स्कोर; डीपीआई = टीकाकरण के बाद का दिन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: दोनों लिंगों के ईएई प्रभावित चूहों की रीढ़ की हड्डी में सूजन का विश्लेषण। (ए)हेमेटोक्सिलिन-ईओसिन के साथ दाग अनुप्रस्थ रीढ़ की हड्डी के वर्गों की प्रतिनिधि छवियां पुरुष (ऊपरी छवि) और महिला (निचली छवि) चूहों में पीवीआईआई (तीर) की उपस्थिति को उजागर करती हैं। (बी) दोनों लिंगों के ईएई-प्रभावित चूहों की रीढ़ की हड्डी में पीवीआईआई की उपस्थिति का उपाय (एन = 8 / समूह)। सांख्यिकीय विश्लेषण ने पी ±≤ 0.05 (# = पुरुष बनाम महिलाएं) के लिए एक महत्वपूर्ण प्रभाव का खुलासा किया। स्केल बार = 200 माइक्रोन (10x आवर्धन)। संक्षिप्ताक्षर: ईएई = प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस; * = केंद्रीय नहर; PvII = पेरिवास्कुलर इंफ्लेमेटरी घुसपैठ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

MOG35-55-प्रेरित EAE प्रोटोकॉल जिसका हमने वर्णन किया है, C57BL/6J चूहों 7,8,13 में MS के जीर्ण रूप के विकास का नेतृत्व किया। इन प्रतिनिधि परिणामों में, हमने बताया कि टीकाकरण प्रक्रिया से गुजरने वाले दोनों लिंगों के जानवरों ने बीमारी का एक पुराना रूप विकसित किया (यानी, वे बीमारी की शुरुआत के बाद पूरी तरह से ठीक नहीं होते हैं, वे घाटे जमा करते हैं, और बनाए रखते हैं सीएस कम से कम 1.5 पुराने चरण में)।

यहां तक कि अगर कई अध्ययन इस मॉडल14 में पुरुषों और महिलाओं के बीच कोई अंतर नहीं बताते हैं, तो केवल कुछ अध्ययन दोनों लिंगों पर विचार करते हैं। हालांकि, एमएस2 में प्रदर्शित पर्याप्त यौन द्विरूपता को देखते हुए, दो लिंगों में रोग के परिणाम का अध्ययन करना प्राथमिक प्रासंगिकता का होना चाहिए। हाल के अध्ययनों के लिए धन्यवाद जिसमें दोनों लिंगों को शामिल किया गया है, एमओजी35-55-प्रेरित ईएई35 में कुछ यौन द्विरूपता की उपस्थिति का भी वर्णन किया गया है। हमने मुख्य रूप से देखा कि महिलाओं में, एमओजी35-55-प्रेरित ईएई आम तौर पर अधिक आक्रामक होता है (इस मॉडल के साथ मादा चूहों की उच्च संवेदनशीलता को देखते हुए)36, क्योंकि वे पहले शुरुआत और उच्च संचयी नैदानिक स्कोर रखते हैं, जो पुरुषों में देखे गए रीढ़ की हड्डी के स्तर पर सूजन को दर्शाता है। एक प्रमुख निष्कर्ष यह है कि यह प्रोटोकॉल नर और मादा चूहों दोनों में ईएई को प्रेरित कर सकता है, लेकिन जांचकर्ताओं को यह याद रखना चाहिए कि बीमारी के कुछ पहलू दो लिंगों के बीच भिन्न हो सकते हैं। इस प्रकार, मुख्य प्रयोगात्मक प्रश्न को ठीक से संबोधित करने, सबसे अनुकूल पशु मॉडल चुनने और एक या दोनों लिंगों को शामिल करने की आवश्यकता का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

महत्वपूर्ण कदम और संभावित समस्या निवारण
चूंकि एमएस के विभिन्न मॉडल रोग के कुछ विशिष्ट पहलुओं का उत्पादन करते हैं, लेकिन सभी6 नहीं, पहला मौलिक कदम विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और संबोधित किए जाने वाले वैज्ञानिक प्रश्नों पर विचार करते हुए सही मॉडल चुनना है। दूसरा, टीकाकरण प्रक्रिया एक विशेषज्ञ द्वारा की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह सही तरीके से किया गया है और अभेद्य प्रक्रियाओं के कारण त्रुटियों या परिवर्तनशीलता से बचा जाए। इसके अतिरिक्त, अन्वेषक को मेजबान संस्था द्वारा अपनाए गए पशु कल्याण नियमों के बारे में पता होना चाहिए।

तीसरा, पायस प्रयोग में मानकीकृत किया जाना चाहिए. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रत्येक माउस प्रेरण के लिए एक विशिष्ट संवेदनशीलता प्रदर्शित करता है, और इस प्रकार, कुछ जानवरों को एक कम आक्रामक बीमारी विकसित हो सकता है या यह सब पर विकसित नहीं कर सकता है. उस मामले में, रोग की घटना और गंभीरता को चूहों को प्रशासित एमओजी35-55 की मात्रा को समायोजित करके अनुकूलित किया जा सकता है। चौथा, हालांकि पीटी इंजेक्शन व्यापक रूप से चूहों35,36 में ईएई के प्रेरण की सुविधा के लिए प्रयोग किया जाता है, यह हर प्रोटोकॉल 37,38 के लिए आवश्यक नहीं है. पीटी की अनुपस्थिति में, चूहे आमतौर पर ईएई39 का कम गंभीर और अधिक परिवर्तनशील रूप विकसित करते हैं। इसके अलावा, आगे परिवर्तनशीलता पीटी प्रशासन के विभिन्न तरीकों (जैसे, अंतःशिरा बनाम इंट्रापेरिटोनियल) के कारण हो सकती है और क्योंकि पीटी की शक्ति को बैचों के बीच भिन्न होने के लिए वर्णित किया गया है। इस समस्या को दूर करने के लिए, उपयोग किए गए प्रत्येक बैच की शक्ति के अनुसार वॉल्यूम को समायोजित करना और पीटी समाधान को ठीक से40,41 तैयार करना महत्वपूर्ण है। प्रयोगात्मक लक्ष्यों को ध्यान में रखते हुए, जांचकर्ताओं के तकनीकी कौशल, और पशु अनुसंधान के अनुकूलन, यह प्रेरण का सबसे उपयुक्त प्रोटोकॉल का चयन करने के लिए मौलिक है.

पांचवां, अधिक उद्देश्यपूर्ण तरीके से डेटा एकत्र करने के लिए, रोग के लक्षणों के अंधे स्कोरिंग की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। इसके अलावा, हम रोग पाठ्यक्रम के अधिक मात्रात्मक और उद्देश्य मूल्यांकन के साथ नैदानिक स्कोरिंग का सुझाव देते हैं, जैसे कि रोटारोड प्रदर्शन का मूल्यांकन। अंत में, पर्याप्त रूप से कई प्रयोगात्मक समूहों का सही चयन विश्वसनीय और तुलनीय डेटा प्राप्त करने के लिए मौलिक है (प्रोटोकॉल अनुभाग 2 देखें)। अपेक्षित प्रभाव आकार के आधार पर, आवश्यक समूह आकार प्राप्त करने के लिए नमूना आकार गणना की जानी चाहिए।

मुख्य सीमाएँ
सबसे पहले, प्रेरण के इस प्रोटोकॉल प्रतिरक्षित जानवरों में अत्यधिक परिवर्तनशील परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकता है, समूह आकार काफी बड़ा नहीं कर रहे हैं या प्रक्रिया ठीक से नहीं किया जाता है, तो विशेष रूप से अगर. अगला, एमओजी35-55-प्रेरित ईएई, एमएस के हर दूसरे उपलब्ध मॉडल की तरह, कुछ सीमाएं हैं (यानी, यह एमएस प्रगति, रोग में बी कोशिकाओं की भूमिका, अंदर-बाहर तंत्र, या पुनर्मिलन का अध्ययन करने में कठिनाइयों के बारे में बहुत कम जानकारी प्रदान करता है)4,6. इसलिए, एक बार फिर, विशिष्ट वैज्ञानिक प्रश्न को संबोधित करने के लिए आवश्यक एमएस मॉडल को ठीक से चुनना मौलिक है। अंत में, क्षति की प्राथमिक साइट को रीढ़ की हड्डी द्वारा दर्शाया जाता है, और पैथोलॉजी एक दुम-कपाल तरीके से हिस्टोपैथोलॉजिकल संकेतों की उपस्थिति की ओर जाता है (यानी, रीढ़ की हड्डी से शुरू होकर मस्तिष्क तक जाता है)। यह मनुष्यों में होने वाली घटनाओं के विपरीत है और मॉडल की काफी सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकता है। हालांकि, विशिष्ट लक्ष्यों पर विचार करते हुए, मस्तिष्क में कुछ बदलावों की सराहना करना भी संभव है।

लाभ
सबसे पहले, यह मॉडल परिधीय प्रतिरक्षा-मध्यस्थता तंत्र की समझ में महत्वपूर्ण योगदान दे सकता है और सीएनएस में न्यूरोइन्फ्लेमेटरी और, आंशिक रूप से, डिमाइलेटिंग प्रक्रियाओं का मूल्यांकन कर सकता है। इसके बाद, इस मॉडल को विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तनों से संबंधित एमएस परिणामों का अध्ययन करने के लिए कुछ विशिष्ट ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों में लागू किया जा सकता है।

एक अन्य लाभ दो तरीकों के आधार पर नैदानिक मूल्यांकन कर रहा है: नैदानिक स्कोर मूल्यांकन और रोट्रोड परीक्षण। यह रोग पाठ्यक्रम के अधिक मात्रात्मक, कम व्यक्तिपरक और अधिक सटीक नैदानिक मूल्यांकन की ओर जाता है। इसके अलावा, वैन डेन बर्ग एट अल के रूप में बताया, रोटारोड आधारित मूल्यांकन दृढ़ता से रीढ़ की हड्डी27 के मोटर सिस्टम में भड़काऊ घावों की सतह क्षेत्र से संबंधित है.

जैसा कि हमने पहले चर्चा की थी, भले ही यह मॉडल एमएस के यौन द्विरूपता को पूरी तरह से पुन: पेश नहीं करता है, हम मानते हैं कि यह एक फायदा है। अन्य संभावित जोखिम कारकों, विशेष रूप से पर्यावरणीय लोगों के साथ प्रेरण का संयोजन, ऐसे कारकों के विशिष्ट प्रभावों को समझने और एमएस के कुछ यौन मंद पहलुओं की घटना में उनकी विशिष्ट भूमिका की पहचान करने में सहायता कर सकता है। अंत में, इस मॉडल का व्यापक रूप से चिकित्सीय दवाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को विकसित करने और परीक्षण करने के लिए उपयोग किया गया है और इसलिए, इस बीमारी के लिए नए चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करने में मदद करने की क्षमता है 4,6.

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Disclosures

लेखकों में से किसी के पास इस लेख के अनुसंधान, लेखकत्व और/या प्रकाशन के संबंध में घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को मिनिस्टरो डेल'इस्ट्रूज़ियोन, डेल'यूनिवर्सिटी ई डेला रिसेर्का - MIUR प्रोजेक्ट डिपार्टमेंटी डिपार्टमेंटी डि एक्सेलेन्ज़ा 2018-2022 और 2023-2027 द्वारा न्यूरोसाइंस विभाग रीटा लेवी मोंटालिनी द्वारा समर्थित किया गया है; कैवेलियरी-ओटोलेघी फाउंडेशन, ओरबासानो, इटली। बीबी INFRA-P, पीडमोंट क्षेत्र (n.378-35) (2022-2023) और PRIN 2020 - 20203AMKTW के साथी थे। हम समर्थन के लिए Fondazione प्रति la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) को धन्यवाद देते हैं। प्रकाशन शुल्क को डिस्ट्रेटो रोटारैक्ट 2031 और विशेष रूप से, रोटारैक्ट क्लब टोरिनो नॉर्ड-एस्ट के दयालु दान द्वारा समर्थित किया गया है। हम अपनी पांडुलिपि की प्रूफरीडिंग के लिए ऐलेन मिलर को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 200 MOG35-55-प्रेरित प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस क्रोनिक ऑटोइम्यून इंफ्लेमेटरी डिजीज सेंट्रल नर्वस सिस्टम (CNS) लिंगों में व्यापकता आक्रामक रूप नैदानिक पहलू रेडियोलॉजिकल विशेषताएं पैथोलॉजिकल विशेषताएं प्रायोगिक पशु मॉडल प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (EAE) पुरुष और महिला C57BL/6J चूहे माइलिन ओलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन पेप्टाइड 35-55 (MOG35-55) टीकाकरण रोग का जीर्ण रूप दैनिक नैदानिक स्कोर मोटर प्रदर्शन हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण रीढ़ की हड्डी

Erratum

Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

दो लिंगों में मल्टीपल स्केलेरोसिस मॉडलिंग: एमओजी<sub>35-55-प्रेरित</sub> प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस
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Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo,… More

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).

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