Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering av multippel sklerose hos de to kjønn: MOG35-55-indusert eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65778
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,4
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

ERRATUM NOTICE

Summary

Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt er en av de mest brukte murine modellene av multippel sklerose. I den nåværende protokollen immuniseres C57BL/6J-mus av begge kjønn med myelinoligodendrocyttglykoproteinpeptid, noe som hovedsakelig resulterer i stigende parese av hale og lemmer. Her diskuterer vi protokollen for EAE-induksjon og evaluering.

Abstract

Multippel sklerose (MS) er en kronisk autoimmun inflammatorisk sykdom som påvirker sentralnervesystemet (CNS). Det er preget av forskjellig prevalens hos kjønnene, som påvirker flere kvinner enn menn, og forskjellige utfall, som viser mer aggressive former hos menn enn hos kvinner. Videre er MS svært heterogen når det gjelder kliniske aspekter, radiologiske og patologiske egenskaper. Det er derfor nødvendig å dra nytte av eksperimentelle dyremodeller som tillater undersøkelse av så mange aspekter av patologien som mulig. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) representerer en av de mest brukte modellene av MS hos mus, modellering av forskjellige sykdomsfunksjoner, fra aktivering av immunsystemet til CNS-skade. Her beskriver vi en protokoll for induksjon av EAE hos både mannlige og kvinnelige C57BL/6J-mus ved bruk av myelinoligodendrocyttglykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55) immunisering, noe som fører til utvikling av en kronisk form av sykdommen. Vi rapporterer også evalueringen av den daglige kliniske poengsummen og motoriske ytelsen til disse musene i 28 dager etter immunisering (28 dpi). Til slutt illustrerer vi noen grunnleggende histologiske analyser på CNS-nivå, med fokus på ryggmargen som det primære stedet for sykdomsindusert skade.

Introduction

Multippel sklerose (MS) er en kronisk autoimmun inflammatorisk sykdom som påvirker sentralnervesystemet (CNS). Det viser tilstedeværelsen av perivaskulær infiltrasjon av inflammatoriske celler, demyelinisering, aksonalt tap og gliose1. Dens etiologi forblir ukjent, og dets kliniske aspekter, radiografiske og patologiske egenskaper antyder bemerkelsesverdig heterogenitet i sykdommen2.

På grunn av sin ukjente etiologi og kompleksitet, rekapitulerer ingen dyremodell for tiden alle kliniske og radiologiske egenskaper som vises i human MS 3,4. Imidlertid er ulike dyremodeller ansatt for å studere ulike aspekter av MS 3,4. I disse modellene er sykdomsinitiering vanligvis ekstremt kunstig, og tidsrammen for utbruddet av kliniske tegn er forskjellig mellom mennesker og mus. For eksempel, hos mennesker, er de patofysiologiske prosessene som ligger til grunn for sykdommen uoppdaget i mange år før utbruddet av kliniske manifestasjoner. Omvendt kan eksperimentene oppdage symptomer i dyremodeller innen uker eller dager etter MS-induksjon4.

Tre grunnleggende dyremodeller produserer egenskapene til demyelinisering som er karakteristiske for MS: de som er virusindusert (f.eks. Theilers murine encefalomyelittvirus), de som er indusert av toksiske stoffer (f.eks. cuprizon, lysolecithin) og de forskjellige varianter av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE)5. Hver modell bidrar til å studere noen spesifikke fasetter av sykdommen, men ingen replikerer alle funksjonene til MS6. Det er derfor viktig å velge riktig modell med tanke på de spesifikke eksperimentelle behovene og de vitenskapelige spørsmålene som skal tas opp.

Takket være immuniseringsprosedyrer mot myelinavledede antigener, induseres EAE ved å utløse en autoimmun respons på CNS-komponenter i følsomme mus. Samspillet mellom et bredt spekter av immunopatologiske og nevropatologiske mekanismer forårsaker utvikling av hovedpatologiske egenskaper ved MS (dvs. betennelse, demyelinisering, aksonalt tap og gliose) i de immuniserte musene 7,8. Mus begynner å vise kliniske symptomer rundt den andre uken etter immunisering og viser generelt stigende lammelse fra halen til lemmen og forbenet. Den kliniske skåren (dvs. kvantifisering av akkumulering av sykdomsrelaterte utfall) vurderes generelt ved hjelp av en 5-punkts skala7.

Aktiv immunisering med protein eller peptid eller passiv overføring av encefalittogene T-celler kan brukes til å indusere EAE hos mus med forskjellig genetisk bakgrunn (f.eks. SJL / J, C57BL / 6 og ikke-overvektige-diabetiske (NOD) mus). Myelinproteolipidprotein (PLP), myelinbasisk protein (MBP) og myelinoligodendrocyttglykoprotein (MOG) er eksempler på selv-CNS-proteiner hvorfra immunogener vanligvis produseres. Spesielt utvikler SJL/J-mus immunisert med den immundominante epitopen av PLP (PLP139-151) et attakkpreget (RR) sykdomsforløp, mens C57BL/6J-mus immunisert med det immundominante MOG35-55-peptidet viser EAE av kronisk natur1. Til tross for noen begrensninger, for eksempel å gi svært lite informasjon om MS-progresjon, B-cellenes rolle i sykdommen, innsiden ut mekanismer eller vanskeligheter med å studere remyelinisering, har EAE-modellene i stor grad bidratt til forståelsen av autoimmune og nevroinflammatoriske prosesser, økt kunnskapen innen MS-feltet og dermed tillatt utvikling av nye terapeutiske tilnærminger for denne sykdommen4, 6.

I dette arbeidet fokuserte vi på en bestemt form for aktiv EAE, myelinoligodendrocyttglykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55)-indusert form 9,10,11,12. MOG35-55-induserte EAE modellerer en kronisk form for MS. Etter immunisering gjennomgår musene en asymptomatisk fase innen den første uken etter immunisering, da oppstår sykdommen vanligvis i løpet av den andre uken etter immunisering, mens mellom tredje og fjerde uke etter immunisering blir sykdommen kronisk, uten mulighet for full gjenoppretting fra de akkumulerte underskuddene 7,8,13. Interessant nok er det ikke observert forskjeller mellom menn og kvinner i forekomst, sykdomsdebut, forløp eller progresjon i de fleste studiene som er tilstede i litteraturen14, selv om færre studier sammenligner sykdommen hos menn og kvinner.

I kontrast, hos mennesker, er disse parametrene kjent for å være sterkt seksuelt dimorfe2. MS rammer flere kvinner enn menn; Imidlertid utvikler menn generelt en mer aggressiv form for sykdommen2. Dette beviset har antydet en viktig, så vel som kompleks, rolle av gonadale hormoner15; Likevel forblir rollen og virkningsmekanismen for kjønnshormoner i patologien uklar. Videre støtter data fra dyremodeller ideen om at både østrogener og androgener utøver positive effekter på forskjellige områder av patologien på en kjønnsspesifikk måte16,17.

Noen studier foreslår også nevrobeskyttende, promyeliniserende og antiinflammatoriske effekter av progesteron18 , og selv om bevis hos MS-pasienter er knappe18, kan nevroaktive steroider (dvs. de novo-syntetiserte steroider i nervesystemet, som pregnenolon, tetrahydroprogesteron og dihydroprogesteron) også påvirke det patologiske forløpet19. Samlet støtter disse dataene ideen om at kjønnshormoner produsert både perifert og inne i CNS har en viktig og kjønnsspesifikk rolle i sykdomsutbrudd og progresjon. Derfor, i det nåværende arbeidet, oppfordrer vi til innsamling av separate data fra både hann- og hunndyr.

Fra det histopatologiske synspunktet tjener den hvite substansen i ryggmargen som hovedstedet for CNS-skade i denne modellen, som er preget av multifokale, konfluente regioner av mononukleær inflammatorisk infiltrasjon og demyelinisering8. Når vi beskriver denne protokollen for induksjon av MOG35-55-indusert EAE i C57BL/6J-mus, vil vi derfor ta hensyn til sykdomsutfallet hos de to kjønnene og gi noen histopatologiske innsikter angående ryggmargene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrepleie og håndtering i det foreliggende arbeidet ble utført i henhold til EUs rådsdirektiv av 22. september 2010 (2010/63/UE); alle prosedyrene rapportert i denne studien ble godkjent av det italienske helsedepartementet (407/2018-PR) og av den etiske komiteen ved Universitetet i Torino (prosjekt n° 360384). Vi foreslår at det er i samsvar med det eksperimentelle designet til ARRIVE-retningslinjene, opprinnelig publisert av Kilkenny et al. i 2010,20. Før du starter, må du kontrollere at de nødvendige materialene er tilgjengelige (se Materialfortegnelse). Steriliser alt glass og redskaper som brukes til fremstilling av MOG35-55-emulsjonen i en autoklav. Et sammendrag av de eksperimentelle prosedyrene er representert i figur 1.

1. Fremstilling av MOG35-55 emulsjon

MERK: For å forberede emulsjonen kreves MOG35-55, ufullstendig Freuds adjuvans (IFA), Mycobacterium Tuberculosis stamme H37Ra (MT) og fysiologisk løsning (se materialfortegnelse).

FORSIKTIG: Varmedrept MT kan stimulere den medfødte immunresponsen. Unngå innånding, inntak og kontakt med hud og øyne ved hjelp av egnet personlig verneutstyr og veiing av MT i en tildekket presisjonsvekt under panseret.

Løsning Komposisjon Notater
2 mg/ml MOG35-55 peptidoppløsning Lyofilisert MOG35-55 peptid fortynnet i fysiologisk oppløsning ved 2 mg/ml konsentrasjon Ta vare på den allerede fortynnede oppløsningen ved -80 °C.
5 mikrog/ml PT-oppløsning Lyofilisert PT fortynnet i fysiologisk oppløsning ved 5 μg/ml konsentrasjon. Ta vare på den allerede fortynnede oppløsningen ved -80 °C.
Emulsjon Det totale volumet av emulsjon som trengs for hver mus som skal immuniseres, er 300 μL fordelt som følger: For å unngå alteraioner eller forurensning, klargjør emulsjonen dagen for immuniseringen.
200 μg/mus MOG35-55 , dvs. 100 mikrol MOG35-55 2 mg/ml oppløsning.
50 μL fysiologisk løsning
150 μL IFA
4 mg/ml MT, dvs. 1,2 mg/mus
Fysiologisk løsning Natriumklorid 0,9% fortynnet i destillert vann.

Tabell 1 Sammensetning av løsningene som brukes til immuniseringsprosedyren.

  1. Forbered løsningen i et glassbeger, tilsett væskekomponenten først og til slutt MT.
    MERK: Det totale volumet av emulsjon som trengs for hver mus som skal immuniseres, er 300 μL, delt som angitt i tabell 1. Emulsjonen er meget viskøs og tykk, så under fremstillings- og injeksjonsprosedyren kan det være noe tap, spesielt når du klargjør løsningen for noen få mus. Vi foreslår at du beregner det endelige volumet av emulsjon som trengs ved å overvurdere antall mus som skal immuniseres med minst 1,5-2 ganger.
  2. Plasser begeret i is og bruk glasssprøyten med en 18 G kanyle for å starte emulgeringen av oppløsningen.
    MERK: Emulsjonen kan også fremstilles ved hjelp av andre strategier, for eksempel ved å koble de to luftfrie glasssprøytene med en treveis stoppekran og blande løsningen ved å skyve stemplene frem og tilbake21,22.
  3. Emulgerer løsningen i minst 15 minutter; Vanligvis er 30 min emulgering nok. For å kontrollere kvaliteten på emulsjonen, tilsett en dråpe emulsjon i en gjennomsiktig beholder fylt med vann: Hvis dråpen opprettholder sin struktur og forblir intakt, er emulsjonen klar.
  4. Plasser emulsjonen direkte inne i 1 ml sprøytene som skal brukes til immuniseringen, og oppbevar disse ved +4 °C til bruk for å bevare tykkelsen på emulsjonen og unngå endringer eller forurensninger.

2. Dyrevalg og immunisering

  1. Valg av dyr
    1. Velg voksne C57BL/6J-mus av begge kjønn ved 8-10 ukers alder med en optimal kroppsvekt på ~20 g. Sørg for å velge alders- og kjønnsmatchede mus for forskjellige eksperimentelle grupper fordi følsomheten for sykdom kan variere med alder og kjønn.
      MERK: Mus bør ha sammenlignbar kroppsvekt på immuniseringsdagen fordi den nåværende prosedyren er optimalisert for et bestemt kroppsvektområde (17-25 g).
    2. Oppbevar likekjønnede dyr i grupper (n = 4-5/bur) for å unngå sosial isolasjon under standardforhold i 45 cm x 25 cm x 15 cm polypropylen musebur ved 22 ± 2 °C, under 12:12 lys/mørk syklus (lys på kl. 08:00). Gi mat og vann ad libitum.
      MERK: Til slutt, for ytterligere å begrense den potensielle variasjonen i sykdomsforløpet hos de immuniserte dyrene, foreslår vi også å danne tilstrekkelig mange eksperimentelle grupper. Det er også studier 8,23 som beskriver tidspunktet for immunisering som en tilstand som bestemmer variasjon i EAE-utfall. Derfor foreslår vi å utføre immuniseringen omtrent på samme tidspunkt hos alle dyr, helst i de lyse timene i den daglige lys / mørke syklusen23. For å begrense stress, er det å foretrekke å manipulere dyrene før immuniseringsdagen og å merke dem for enkelt å identifisere dem for daglig evaluering, for eksempel øreklipping eller tag.
  2. Immuniseringsprosedyren
    MERK: Sørg for at prosedyren utføres av en erfaren etterforsker for å minimere stress for dyr og optimalisere immunisering. Før du starter immuniseringen, velg anestesimetoden i samsvar med retningslinjene for institusjonell dyrepleie og etisk komité. Vårt laboratorium bruker kortvarig anestesi med isofluran.
    1. Bedøv musen: 4% isofluran for anestesiinduksjon og 1,5-2% isofluran for anestesivedlikehold. Vent til anestesien skal være effektiv og bruk en bak- og fremre fottåklemme for å vurdere anestesinivået. For å forhindre tørrhet i øynene mens musen er under anestesi, bruk en veterinærgodkjent øyesalve.
    2. PT intravenøs injeksjon i den laterale kaudale venen: plugg musens hale forsiktig med en etanolløsning, som fungerer som en vasodilator, for å vise venene. Fokuser på en av de to laterale venene i halen, og bruk en 0,5 ml sprøyte utstyrt med en 30 G nål, injiser 500 ng PT (dvs. 100 μL PT fortynnet i fysiologisk oppløsning i konsentrasjonen på 5 μg / ml).
    3. Subkutan injeksjon av MOG35-55 emulsjon: Bruk 1 ml sprøyten med en 26 G nål, utfør tre subkutane injeksjoner av den tidligere tilberedte emulsjonen: to under rostraldelen av flankene og en ved bunnen av halen. Volumet av emulsjon injisert i hvert sted er 100 μL, for et totalt volum på 300 μL emulsjon injisert i hver mus.
      MERK: Dagen for immunisering registreres som dag 0 etter immunisering (dpi); 48 timer senere (dvs. ved 2 dpi) er det nødvendig å utføre en annen intravenøs injeksjon av PT lik den som tidligere ble utført. Det er mulig å utføre injeksjonen uten anestesi, ved hjelp av en musestøtte. Prosedyren beskrevet her tar sikte på å indusere og opprettholde bedøvelse av musene under immuniseringsprosedyren for å unngå mulig ubehag og bevegelser av dyrene eller risiko for både mus og etterforskere. Dermed er det ingen kirurgiske prosedyrer. For å optimalisere de eksperimentelle prosessene er det imidlertid viktig å opprettholde passende sterile forhold under disse trinnene og å overvåke musens tilstand etter disse prosedyrene.
    4. For å bekrefte at musen har kommet seg etter injeksjonene, plasser den i et rent bur etter prosedyrene og vent til den har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Etter at musen har fullstendig gjenopprettet, returner den til hjemmeburet med andre dyr.

3. EAE-oppfølging

  1. Kroppsvekt og matinntak
    1. Overvåk daglig kroppsvekten (BW) til dyrene, ved hjelp av en elektronisk presisjonsbalanse, fordi reduksjonen i BW er en indikator på sykdomsprogresjon.
      MERK: Denne nedgangen bør ikke overstige en viss prosentandel, i henhold til den institusjonelle og etiske komiteens retningslinjer for dyrepleie. Vanligvis, hvis et dyr mister mer enn 20% av den opprinnelige kroppsvekten (dvs. vekten registrert ved 0 dpi), bør det ofres som anvendelse av det humane endepunktet. Eutanasimetodene involverer dyp irreversibel anestesi for innånding (f.eks. 5% isofluran) etterfulgt av halshogging.
    2. Overvåk matinntaket (FI) - maten spist av et dyr på en dag (g ∙ dag-1 ∙ dyr - 1), veier mengden mat i den spesifikke beholderen minst en gang i uken, og deler mengden spist mat for dagene som går mellom to sekvensielle målinger og antall dyr som er tilstede i buret.
      MERK: Denne målingen gjør det mulig å estimere gjennomsnittlig matinntak. På grunn av utseendet og akkumuleringen av kliniske sykdomstegn, som involverer lammelse av lemmer, foreslår vi å plassere litt vannet mat på gulvet i buret når dyrene ikke er i stand til å stå fast på bakre lemmer og nå matbeholderen eller vannflasken. For å vurdere matinntaket gjennom oppfølgingsperioden så nøyaktig som mulig, målte vi også tørrvekten til denne maten før vi fuktet den for musene.
  2. Evaluering av brunstsyklisitet under EAE
    1. Sjekk brunstsyklusen i minst to sykluser, evaluer vaginale cytologiutstryk som beskrevet av McLean et al.24. Klassifiser fasen av brunstsyklusen basert på tilstedeværelsen av tre primære celletyper - kjernefysiske epitelceller, cornified squamous epitelceller og leukocytter - i vaginale smøreprøver, som følger:
      1. Klassifiser som proøstrus basert på en nesten eksklusiv tilstedeværelse av klynger av runde, velformede kjernefysiske epitelceller.
      2. Klassifiser som østrus basert på den overveiende tilstedeværelsen av tettpakkede klynger av cornified squamous epitelceller.
      3. Klassifiser som metestrus basert på den overveiende tilstedeværelsen av små mørkfargede leukocytter og den mindre tilstedeværelsen av cornified plateepitelceller.
      4. Klassifiser som diestrus basert på den svært dominerende tilstedeværelsen av små mørkfargede leukocytter og sjeldne cornified plateepitelceller sammen med mulig utseende av kjernefysiske epitelceller.
        MERK: Når du vurderer sykdommen hos begge kjønn, er det viktig å kontrollere variasjonen hos kvinner på grunn av brunstsyklusen. Vi foreslår at du fokuserer på evalueringen av brunstsyklusen, spesielt mellom første og andre uke etter immunisering (dvs. i den akutte fasen av EAE). Det har tidligere blitt vist at immuniseringsprosedyren forårsaker de mest uttalt endringene i brunstsyklusen i denne fase25. Videre er det viktig å vurdere at det er vanskelig å utføre smøret når dyret når en høy klinisk score (spesielt >3) på grunn av bakre parese og mangel på tone i bakbenene.
  3. Klinisk skår
    1. Få en blindet etterforsker til å vurdere den kliniske poengsummen til dyrene daglig. Gi hvert dyr en poengsum rangert fra 0 til 5 (se tabell 2) for å evaluere sykdomsforløpet26 som beskrevet i Racke7.
      MERK: I likhet med kroppsvektreduksjonen er et humant endepunkt også nødvendig for økningen i kliniske poeng, i henhold til institusjonens og etiske komités retningslinjer for dyrepleie. Generelt, hvis et dyr ikke lenger er i stand til å mate seg autonomt (dette skjer vanligvis når et dyr når minst poengsummen på 4, i henhold til skalaen vi bruker), bør det ofres som anvendelse av det humane endepunktet.
  4. Evaluering av motorytelse ved rotarodtest
    MERK: Evaluering av EAE-progresjonen utføres vanligvis ved å tildele den kliniske poengsummen daglig, som gjøres av en fullt utdannet blindet etterforsker. Det kan imidlertid være nyttig å flankere den med en mer kvantitativ og objektiv vurdering av sykdommens progresjon. I en tidligere studie26 ble rotarod-testen brukt til å måle motorytelsen til de immuniserte dyrene. Som beskrevet av van den Berg et al.27, for å få en mer kvantitativ og presis klinisk evaluering av sykdomsforløpet, kan evalueringen av motorisk ytelse ved rotarodtesten støtte vurderingen av klinisk poengsum. For en detaljert beskrivelse, se van den Berg et al.27.
    1. La musene gjennomgå rotarod-økter daglig, fra 1 dpi til offeret (dvs. 28 dpi). Hver økt består av en enkelt 300 s økt hvor stanghastigheten må økes lineært fra 4 til 40 o / min.
    2. Registrer dyrets poengsum. Når musen ikke er i stand til å opprettholde balansen og faller av enheten, faller den på bakken og utløser en sensor, og tiden (e) registreres. Dermed blir ytelsen scoret som latens til fall (er).

Trinn Klinisk tegn Beskrivelse
0 Sunn Ingen observerte kliniske tegn. Dyret viser en normal tone og bevegelse av halen. Den går uten å snuble.
0.5 Svekket port Dyret snubler mens du går på en grill.
1 Slapp hale Når dyret blir plukket opp på grunnlag av halen, henger halen (flabby hale).
1.5 Slapp hale og nedsatt port Dyret viser en flabby hale, og det snubler mens du går på en grill.
2 Ataksi Dyret viser vanskeligheter med å reise seg når det har blitt snudd på ryggen.
2.5 Ataksi og parese av baklem Dyret kan ikke reise seg når det er snudd på ryggen, og det mister tonen i en av baklemmene.
3 Lammelse av bakre lemmer Dyret mister tonen i begge baklemmer.
3.5 Lammelse av baklemmer og/eller pareser i forbenet Dyret mister tonen i begge bakbenene og delvis av forbenene. Faktisk viser det et tap av styrke i forbenets grep.
4 Tetra parese Dyret mister helt tonen i lemmer.
4.5 Tetra parese og redusert kroppstemperatur Dyret mister helt tonen i lemmer, og det viser en nedgang i kroppstemperaturen (det er kaldt).
5 Døende eller død Dyret er døende (det reagerer ikke på noen stimulans) eller død.

Tabell 2: Klinisk skåringssystem som brukes til å vurdere EAE-progresjon.

4. Evaluering av EAE-induserte histopatologiske tegn på ryggmargsnivå

MERK: Her rapporterer vi kort prosedyren for å ofre dyrene og samle ryggmargen for å utføre histopatologisk analyse; For en detaljert beskrivelse, se disse referansene 10,26,28,29.

  1. Fiksering og vevsprøvetaking
    MERK: For en detaljert beskrivelse, se disse referansene 10,26.
    1. Ofre dyrene ved 28 dpi i kronisk fase av sykdommen.
      1. Bedøv musene ved dyp irreversibel anestesi (intraperitoneal injeksjon av zolazepam og tiletamin 80 mg / kg / xylazin 10 mg / kg).
      2. Transkardielt perfusere musene med en saltoppløsning etterfulgt av en 4% paraformaldehyd (PFA) løsning.
        MERK: Vær oppmerksom når du bruker PFA: da det er giftig, unngå innånding, inntak og kontakt med hud og øyne ved hjelp av riktig personlig verneutstyr. Vei pulveret, klargjør oppløsningen og utfør perfusjonen under hetten.
    2. Fjern ryggmargene fra ryggsøylen30.
    3. Oppbevar ryggmargen i en 4% PFA-løsning i 24 timer.
    4. Utfør flere vasker i 0,01 M saltvannsfosfatbuffer (PBS).
    5. Legg ryggmargen i parafinblokker30.
  2. Histologiske prosedyrer
    MERK: For en detaljert beskrivelse, se Montarolo et al.10.
    1. Bruk en mikrotome til å kutte 10 μm tykke tverrgående ryggmargsseksjoner og samle dem på gelatinbelagte lysbilder. Orienter seksjonsplanet slik at det samsvarer med tegningene som svarer til de tverrgående delene av musens ryggmargsatlas31.
    2. Utfør deparaffinisering av seksjonene32.
    3. Beis seksjonen med hematoksylin og eosin32.
    4. Dehydrere seksjonene32.
    5. Dekk seksjonene med et monteringsmedium og la dem tørke ved romtemperatur under en kjemisk hette.
      MERK: Hematoksylin-Eosin-farging gjør det mulig å oppdage tilstedeværelsen av perivaskulære inflammatoriske infiltrater (PvIIs)26, som vurderes som et tegn på sykdommen28.
  3. Kvantitativ analyse av ryggmargssnitt
    1. Ta bilder av de fargede seksjonene med et optisk mikroskop koblet til et digitalkamera med et 20x mål29.
    2. Analyser det oppkjøpte bildet for å oppnå antall PvIIer, uttrykt som antall infiltrater per mm2.
      MERK: For analyse av de oppkjøpte bildene er det nyttig å dra nytte av bildeanalyseprogramvare. Nevropatologiske funn presentert i dette arbeidet er kvantifisert i 10 komplette tverrsnitt av ryggmargen per mus (n = 8/gruppe) representativt for hele ryggmargsnivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EAE-oppfølging etter immunisering
Dette ble vurdert som beskrevet nedenfor.

Kroppsvekt og matinntak
Toveisvariansanalysen (ANOVA) (kjønn og tid som uavhengige variabler) viser en nedgang i BW hos EAE-dyr av begge kjønn, spesielt innen den andre uken etter induksjon (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figur 2A). Imidlertid opprettholdes den seksuelle dimorfismen i BW alltid (figur 2A). Når det gjelder prosentandelen av BW (F(1,57) = 23,935, p < 0,001; Figur 2B), viser både menn og kvinner et stort tap mellom 12 dpi til 17 dpi (p < 0,001) sammenlignet med den opprinnelige BW, men overstiger aldri et totalt tap på 20% (figur 2B). Selv om BW-tapet starter før sykdommen begynner, når det sitt maksimum i den akutte fasen av EAE (figur 2A,B). Det er ingen forskjeller mellom kjønnene når det gjelder BW-tap. Imidlertid har kvinner en tendens til å miste mer vekt tidligere og komme seg mindre i kronisk fase (tredje til fjerde uke etter induksjon) (figur 2B).

Videre viser toveis ANOVA (kjønn og tid som uavhengige variabler) også en signifikant reduksjon i FI (F(9, 39) = 6,682, p < 0,001; Figur 2C) hos begge kjønn, spesielt i løpet av den andre uken etter immunisering, som et resultat av økt EAE-alvorlighetsgrad, noe som gjorde det mer utfordrende for dyret å få tilgang til maten som ble plassert i den øvre beholderen i buret. Som vi foreslo, ble maten deretter lagt på burgulvet for å redusere ytterligere stress på dyrene. Dette tillot FI å gå tilbake til opprinnelige nivåer (figur 2C), og BW å delvis gjenopprette (figur 2A, B).

Brunstsyklusevaluering hos hunnene
Sammenligningen mellom tid brukt i de ulike brunstfasene ble utført med Student t-test. Analysen viser forskjeller i tiden brukt i østralfasene (dvs. proestrus og østrus) sammenlignet med den som ble brukt i ikke-østralfasen (dvs. metestrus og diestrus) mellom den asymptomatiske fasen (før EAE begynner) og den symptomatiske fasen (etter EAEs begynnelse) (p = 0,042; Figur 2D), hovedsakelig på grunn av økt tid ved diestrus i symptomgivende faser (p = 0,017) og tendens til redusert oppholdstid ved proestrus (p = 0,08).

Det er allerede beskrevet at induksjonsprosedyren fører til en endring av brunstsyklusen hos kvinner, spesielt påvirker proestrus25. I løpet av denne fasen er økende nivåer av østrogener kjent for å utøve antiinflammatoriske og nevrobeskyttende effekter16 og er dermed muligens ansvarlige for den beskyttende rollen til disse hormonene i den presymptomatiske fasen. Men når nivået av østrogener faller, som vi ser i fasen etter utbruddet, slutter deres beskyttende effekter også.

Klinisk score og rotarodytelse
Toveis ANOVA (kjønn og tid som uavhengige variabler) viser en signifikant økning i tid i klinisk skår (CS) hos både menn og kvinner (F(56-813) = 27,951, p < 0,001; Figur 3A). Spesielt fra 10 dpi viser begge kjønn en signifikant økning i CS (p < 0,001), som opprettholdes til endepunktet (28 dpi) (figur 3A). Hunnene viser, selv om de ikke er signifikante (p = 0,156), høyere CS enn menn (figur 3A). Når det gjelder sykdomsdebut, forekommer den generelt rundt 10 dpi, med tendens til tidligere debut hos kvinner enn hos menn (figur 3B). Videre viser kvinner en signifikant høyere kumulativ CS sammenlignet med menn (p = 0,017; Figur 3C).

Rotarod-ytelsesforløpet ligner de kliniske evalueringene (figur 2D). Fra begynnelsen av sykdommen, reduseres den og når minimumsytelsen i løpet av den andre uken etter immunisering, i den akutte fasen av EAE. Toveis ANOVA (kjønn og tid som uavhengige variabler) viser en signifikant reduksjon i tid i rotarodytelsen til både menn og kvinner (F(46-673) = 5,365, p < 0,001; Figur 3D). Spesielt viser menn minimumsytelsen ved 16 dpi (p = 0,022), mens hunnene ved 17 dpi (p < 0,001). Menn har en tendens til å prestere bedre enn kvinner, spesielt i kronisk fase av sykdommen (21-28 dpi), muligens som følge av lavere CS (figur 3A,D).

Histopatologisk evaluering av ryggmargen
Enveis ANOVA (kjønn som uavhengig variabel) av PvII i ryggmargsseksjonene fremhever en klar forskjell mellom menn og kvinner (figur 4A). Hunnene viser et signifikant høyere antall PvII enn menn (F(1,14)= 63,107, p < 0,001; Figur 4B). Disse dataene gjenspeiler muligens høyere kumulativ CS, dårligere rotarodytelse og den mer aggressive sykdommen observert hos hunnene, spesielt i den kroniske fasen av EAE.

Disse dataene gjenspeiler også det faktum at kvinnelige mus viser høyere mottakelighet for utvikling av mer aggressiv EAE sammenlignet med menn14, noe som er en av hovedforskjellene mellom denne sykdomsmodellen og MS som forekommer hos mennesker. Kvinner debuterer tidligere, har moderat lavere forekomst av primære progredierende former og viser samlet sett mindre sykdomsprogresjon enn menn 2,33,34.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk tidsmessig fremstilling av eksperimentelle prosedyrer. Laget med BioRender.com. Forkortelser: i.v. = intravenøs; s.c. = subkutan; MOG35-55 = myelinoligodendrocytt glykoproteinpeptid 35-55; = dpi = dag etter immunisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Evaluering av EAE-effekter på kroppsvekt, matinntak hos hann- og hunnmus og brunstsyklus hos hunnmus. Fra vaksinasjonsdagen (0 dpi) til offerdagen (28 dpi) viser grafene (A) daglig kroppsvekt, (B) prosentandel kroppsvekt og (C) ukentlig evaluering av matinntak hos dyr av begge kjønn (n = 15/gruppe). (D) Tid brukt (uttrykt som gjennomsnittlig prosentandel av tid) i de forskjellige fasene av brunstsyklusen, evaluert ved vaginale cytologiutstryk, i den asymptomatiske fasen (før debut, venstre kolonne i grafen) eller den symptomatiske fasen (post-onset, høyre kolonne i grafen) hos hunnmus. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse viste en signifikant effekt for p≤ 0,05 (# = menn vs. kvinner; * = sammenligning mellom ulike tidspunkter). Forkortelser: EAE = eksperimentell autoimmun encefalomyelitt; BW = kroppsvekt; FI = matinntak; dpi = dag etter immunisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Evaluering av klinisk score og rotarodytelse hos EAE-affiserte hann- og hunnmus. (A) Vurdering av daglig klinisk score (fra 0 til 28 dpi) hos dyr av begge kjønn (n = 15/gruppe). (B) Sykdomsdebut (gjennomsnittlig dpi) hos EAE-affiserte hanner (venstre kolonne) og hunnmus (høyre kolonne). (C) Gjennomsnittlig kumulativ klinisk score nådd av EAE-affiserte hanner (venstre kolonne) og hunnmus (høyre kolonne). (D) Vurdering av daglig rotarodytelse (målt som falllatens) fra 6 til 28 dpi (0 representerer utgangsverdiene oppnådd innen de første 5 dagene av testen) hos dyr av begge kjønn. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse viste en signifikant effekt for p≤ 0,05 (# = menn vs. kvinner; * = sammenligning mellom ulike tidspunkter). Forkortelser: EAE = eksperimentell autoimmun encefalomyelitt; CS = klinisk score; Cum CS = kumulativ klinisk score; dpi = dag etter immunisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Analyse av inflammasjon i ryggmargen hos EAE-affiserte mus av begge kjønn. (A) Representative bilder av tverrgående ryggmargsseksjoner farget med hematoksylin-eosin fremhever tilstedeværelsen av PvII (piler) hos mannlige (øvre bilde) og kvinnelige (nedre bilde) mus. (B) Mål på PvIIs tilstedeværelse i ryggmargen hos EAE-berørte mus av begge kjønn (n = 8/gruppe). Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse viste signifikant effekt for p ≤ 0,05 (# = menn vs. kvinner). Skalastang = 200 μm (10x forstørrelse). Forkortelser: EAE = eksperimentell autoimmun encefalomyelitt; * = sentralkanalen; PvII = perivaskulære inflammatoriske infiltrater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MOG35-55-indusert EAE-protokoll som vi beskrev, førte til utvikling av en kronisk form for MS i C57BL/6J-mus 7,8,13. I disse representative resultatene rapporterte vi at dyrene av begge kjønn som gjennomgikk immuniseringsprosedyren, utviklet en kronisk form av sykdommen (dvs. de gjenoppretter ikke fullt ut etter sykdomsutbruddet, de akkumulerer underskudd og opprettholder en CS minst 1,5 i kronisk fase).

Selv om mange studier rapporterer ingen forskjeller mellom menn og kvinner i denne modellen14, er det bare noen få studier som vurderer begge kjønn. Gitt de betydelige seksuelle dimorfismene som vises i MS2, bør det imidlertid være av primær relevans å studere sykdomsutfallet hos de to kjønnene. Takket være nyere studier som inkluderer begge kjønn, har tilstedeværelsen av noen seksuell dimorfisme også blitt beskrevet i MOG35-55-indusert EAE35. Vi la hovedsakelig merke til at hos kvinner er MOG35-55-indusert EAE generelt mer aggressiv (gitt den høyere følsomheten til hunnmus med denne modellen)36, da de har en tendens til å ha tidligere debut og høyere kumulative kliniske score, noe som gjenspeiler økt betennelse på ryggmargsnivå enn det som er observert hos menn. En hovedkonklusjon er at denne protokollen kan indusere EAE hos både mannlige og kvinnelige mus, men etterforskere må huske at noen aspekter av sykdommen kan variere mellom de to kjønnene. Det er derfor viktig å vurdere det viktigste eksperimentelle spørsmålet som skal tas opp, å velge den mest gunstige dyremodellen, og å vurdere nødvendigheten av å inkludere enten ett eller begge kjønn.

Kritiske trinn og mulig feilsøking
Siden forskjellige modeller av MS produserer noen spesifikke aspekter av sykdommen, men ikke alle6, er det første grunnleggende trinnet å velge riktig modell med tanke på de spesifikke eksperimentelle behovene og de vitenskapelige spørsmålene som skal tas opp. For det andre bør immuniseringsprosedyren utføres av en ekspert for å sikre at den gjøres riktig og unngå feil eller variabilitet på grunn av upresise prosedyrer. I tillegg må utprøver være oppmerksom på dyrevelferdsforskriften vedtatt av vertsinstitusjonen.

For det tredje bør emulsjonen standardiseres i forsøket. Det skal bemerkes at hver mus viser en typisk følsomhet for induksjonen, og dermed kan noen dyr utvikle en mindre aggressiv sykdom eller ikke utvikle den i det hele tatt. I så fall kan sykdomsforekomsten og alvorlighetsgraden optimaliseres ved å justere mengden MOG35-55 administrert til musene. For det fjerde, selv om PT-injeksjon er mye brukt for å lette induksjonen av EAE hos mus35,36, er det ikke nødvendig for hver protokoll37,38. I fravær av PT utvikler mus vanligvis en mindre alvorlig og mer variabel form for EAE39. Videre kan ytterligere variabilitet skyldes forskjellige måter å administrere PT på (f.eks. intravenøs vs. intraperitoneal) og fordi styrken av PT har blitt beskrevet å variere mellom batcher. For å overvinne dette problemet er det viktig å justere volumet i henhold til styrken til hver batch som brukes og å klargjøre PT-løsningen riktig40,41. Med tanke på de eksperimentelle målene, etterforskernes tekniske ferdigheter og optimalisering av dyreforsøk, er det grunnleggende å velge den mest passende induksjonsprotokollen.

For det femte, for å samle inn data på en mer objektiv måte, anbefales blindet scoring av sykdomssymptomer sterkt. Videre foreslår vi klinisk skåring med en mer kvantitativ og objektiv evaluering av sykdomsforløpet, for eksempel evaluering av rotarod-ytelsen. Endelig er riktig utvalg av tilstrekkelig mange eksperimentelle grupper grunnleggende for å oppnå pålitelige og sammenlignbare data (se protokoll avsnitt 2). Beregning av prøvestørrelse bør utføres for å oppnå de nødvendige gruppestørrelsene, avhengig av forventet effektstørrelse.

Hovedbegrensninger
For det første kan denne induksjonsprotokollen føre til svært variable utfall hos immuniserte dyr, spesielt hvis gruppestørrelsene ikke er store nok eller hvis prosedyren ikke utføres riktig. Deretter har MOG35-55-indusert EAE, som alle andre tilgjengelige modeller av MS, noen begrensninger (dvs. det gir svært lite informasjon om MS-progresjon, B-cellenes rolle i sykdommen, innsiden ut mekanismer eller vanskeligheter med å studere remyelinisering) 4,6. Derfor er det igjen grunnleggende å velge riktig MS-modellen som trengs for å løse det spesifikke vitenskapelige spørsmålet. Endelig er det primære skadestedet representert av ryggmargen, og patologien fører til utseendet av histopatologiske tegn på en kaudal-kranial måte (dvs. starter fra ryggmargen og går opp til hjernen). Dette er det motsatte av hva som skjer hos mennesker og kan representere en betydelig begrensning av modellen. Det er imidlertid mulig å også sette pris på noen endringer i hjernen, med tanke på bestemte mål.

Fordeler
For det første kan denne modellen i betydelig grad bidra til forståelsen av perifere immunmedierte mekanismer og til å evaluere de nevroinflammatoriske og delvis demyeliniserende prosessene i CNS. Deretter kan denne modellen brukes i noen spesifikke transgene musestammer for å studere MS-utfall relatert til spesifikke genetiske endringer.

En annen fordel er å ha en klinisk evaluering basert på to metoder: vurderingen av klinisk score og rotarod-testen. Dette fører til en mer kvantitativ, mindre subjektiv og mer presis klinisk vurdering av sykdomsforløpet. Videre, som van den Berg et al. påpekte, er den rotarodbaserte evalueringen sterkt korrelert med overflaten av inflammatoriske lesjoner i ryggmargens motorsystemer27.

Som vi diskuterte tidligere, selv om denne modellen ikke helt reproduserer den seksuelle dimorfismen til MS, tror vi dette er en fordel. Kombinasjonen av induksjonen med andre mulige risikofaktorer, spesielt de miljømessige, kan hjelpe til med å forstå de spesifikke effektene av slike faktorer og identifisere deres spesifikke rolle i forekomsten av noen seksuelt dimorfe aspekter ved MS. Endelig har denne modellen blitt mye brukt til å utvikle og teste et bredt spekter av terapeutiske legemidler og har derfor potensial til å bidra til å utvikle nye terapeutiske tilnærminger for denne sykdommen 4,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen av forfatterne har noen interessekonflikter å oppgi med hensyn til forskning, forfatterskap og/eller publisering av denne artikkelen.

Acknowledgments

Dette arbeidet er støttet av Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR-prosjektet Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 og 2023-2027 til Institutt for nevrovitenskap Rita Levi Montalcini; Cavalieri-Ottolenghi Foundation, Orbassano, Italia. BB var medlem av INFRA-P, Piemonte-regionen (n.378-35) (2022-2023) og PRIN 2020 - 20203AMKTW. Vi takker Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) for støtten. Publiseringsavgiftene har blitt støttet av den slags donasjon av Distretto Rotaract 2031, og spesielt Rotaract Club Torino Nord-Est. Vi takker Elaine Miller for korrekturlesingen av manuskriptet vårt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), Zurich, Switzerland. 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , Chapter 9, Unit 9.7 (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It's complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida--a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Chapter 16 - Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. , Academic Press. 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).

Tags

Nevrovitenskap utgave 200 MOG35-55-indusert eksperimentell autoimmun encefalomyelitt kronisk autoimmun inflammatorisk sykdom sentralnervesystemet (CNS) prevalens hos kjønn aggressive former kliniske aspekter radiologiske trekk patologiske trekk eksperimentelle dyremodeller eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) mannlige og kvinnelige C57BL/6J-mus myelinoligodendrocytt glykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55) immunisering kronisk form av sykdommen daglig klinisk score motorisk Ytelse histologisk analyse ryggmarg

Erratum

Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

Modellering av multippel sklerose hos de to kjønn: MOG<sub>35-55-indusert</sub> eksperimentell autoimmun encefalomyelitt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo,… More

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter