Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering van multiple sclerose bij de twee geslachten: MOG35-55-geïnduceerde experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65778
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,4
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

ERRATUM NOTICE

Summary

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis is een van de meest gebruikte muizenmodellen van multiple sclerose. In het huidige protocol worden C57BL/6J-muizen van beide geslachten geïmmuniseerd met myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide, wat voornamelijk resulteert in oplopende parese van de staart en ledematen. Hier bespreken we het protocol van EAE-inductie en -evaluatie.

Abstract

Multiple sclerose (MS) is een chronische auto-immuunziekte die het centrale zenuwstelsel (CZS) aantast. Het wordt gekenmerkt door een verschillende prevalentie bij de geslachten, die meer vrouwen dan mannen treft, en verschillende uitkomsten, met agressievere vormen bij mannen dan bij vrouwen. Bovendien is MS zeer heterogeen in termen van klinische aspecten, radiologische en pathologische kenmerken. Het is dus noodzakelijk om gebruik te maken van experimentele diermodellen die het mogelijk maken om zoveel mogelijk aspecten van de pathologie te onderzoeken. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) vertegenwoordigt een van de meest gebruikte modellen van MS bij muizen, waarbij verschillende ziektekenmerken worden gemodelleerd, van de activering van het immuunsysteem tot schade aan het CZS. Hier beschrijven we een protocol voor de inductie van EAE in zowel mannelijke als vrouwelijke C57BL/6J-muizen met behulp van myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide 35-55 (MOG35-55) immunisatie, wat leidt tot de ontwikkeling van een chronische vorm van de ziekte. We rapporteren ook de evaluatie van de dagelijkse klinische score en motorische prestaties van deze muizen gedurende 28 dagen na immunisatie (28 dpi). Ten slotte illustreren we enkele fundamentele histologische analyses op het niveau van het CZS, met de nadruk op het ruggenmerg als de primaire plaats van door de ziekte veroorzaakte schade.

Introduction

Multiple sclerose (MS) is een chronische auto-immuunziekte die het centrale zenuwstelsel (CZS) aantast. Het toont de aanwezigheid van perivasculaire infiltratie van ontstekingscellen, demyelinisatie, axonaal verlies en gliose1. De etiologie ervan blijft onbekend, en de klinische aspecten, radiografische en pathologische kenmerken suggereren een opmerkelijke heterogeniteit in de ziekte.

Vanwege de onbekende etiologie en complexiteit is er op dit moment geen enkel diermodel dat alle klinische en radiologische kenmerken recapituleert die worden vertoond bij menselijke MS 3,4. Er worden echter verschillende diermodellen gebruikt om verschillende aspecten van MS 3,4 te bestuderen. In deze modellen is het ontstaan van de ziekte doorgaans extreem kunstmatig en verschilt het tijdsbestek van het begin van klinische symptomen tussen mensen en muizen. Bij mensen zijn de pathofysiologische processen die ten grondslag liggen aan de ziekte bijvoorbeeld jarenlang onopgemerkt gebleven vóór het begin van klinische manifestaties. Omgekeerd kunnen de onderzoekers symptomen in diermodellen detecteren binnen enkele weken of zelfs dagen na MS-inductie4.

Drie basisdiermodellen produceren de kenmerken van demyelinisatie die kenmerkend zijn voor MS: modellen die door het virus worden geïnduceerd (bijv. Theiler's muizenencefalomyelitisvirus), modellen die worden geïnduceerd door toxische stoffen (bijv. cuprizon, lysolecithine) en de verschillende varianten van experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE)5. Elk model helpt bij het bestuderen van enkele specifieke facetten van de ziekte, maar geen enkel model repliceert alle kenmerken van MS6. Het is dus van cruciaal belang om het juiste model te kiezen, rekening houdend met de specifieke experimentele behoeften en de wetenschappelijke vragen die moeten worden beantwoord.

Dankzij immunisatieprocedures tegen myeline-afgeleide antigenen wordt EAE geïnduceerd door een auto-immuunrespons op CZS-componenten bij gevoelige muizen op te wekken. De wisselwerking tussen een breed scala aan immunopathologische en neuropathologische mechanismen veroorzaakt de ontwikkeling van de belangrijkste pathologische kenmerken van MS (d.w.z. ontsteking, demyelinisatie, axonaal verlies en gliose) bij de geïmmuniseerde muizen 7,8. Muizen beginnen klinische symptomen te vertonen rond de tweede week na immunisatie en vertonen over het algemeen oplopende verlamming van de staart tot de ledemaat en voorpoot. De klinische score (d.w.z. kwantificering van de accumulatie van ziektegerelateerde tekorten) wordt over het algemeen beoordeeld met behulp van een 5-puntsschaal7.

Actieve immunisatie met eiwit of peptide of passieve overdracht van encefalitogene T-cellen kan worden gebruikt om EAE te induceren bij muizen met verschillende genetische achtergronden (bijv. SJL/J, C57BL/6 en niet-zwaarlijvig-diabetische (NOD) muizen). Myeline-proteolipide-eiwit (PLP), myeline-basisch eiwit (MBP) en myeline-oligodendrocytglycoproteïne (MOG) zijn voorbeelden van zelf-CZS-eiwitten waaruit gewoonlijk immunogenen worden geproduceerd. Met name SJL/J-muizen geïmmuniseerd met het immunodominante epitoop van PLP (PLP139−151) ontwikkelen een relapsing-remitting (RR) ziekteverloop, terwijl C57BL/6J-muizen geïmmuniseerd met het immunodominante MOG35-55-peptide EAE vanchronische aard vertonen1. Ondanks enkele beperkingen, zoals het verstrekken van zeer weinig informatie over de progressie van MS, de rol van B-cellen in de ziekte, de inside-out-mechanismen of moeilijkheden bij het bestuderen van remyelinisatie, hebben de EAE-modellen enorm bijgedragen aan het begrip van auto-immuun- en neuro-inflammatoire processen, waardoor de kennis op het gebied van MS is toegenomen en zo de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen voor deze ziekte mogelijk is geworden. 6. okt.

In het huidige werk hebben we ons gericht op een bepaalde vorm van actieve EAE, de myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide 35-55 (MOG35-55)-geïnduceerde vorm 9,10,11,12. De MOG35-55-geïnduceerde EAE modelleert een chronische vorm van MS. Na immunisatie ondergaan de muizen een asymptomatische fase binnen de eerste week na immunisatie, waarna de ziekte meestal optreedt tijdens de tweede week na immunisatie, terwijl tussen de derde en vierde week na immunisatie de ziekte chronisch wordt, zonder mogelijkheid tot volledig herstel van de geaccumuleerde tekorten 7,8,13. Interessant is dat er geen verschillen tussen mannen en vrouwen worden waargenomen in incidentie, begin van de ziekte, verloop of progressie in de meeste onderzoeken die in de literatuur aanwezigzijn14, ook al vergelijken minder onderzoeken de ziekte bij mannen en vrouwen.

Bij mensen daarentegen is bekend dat deze parameters sterk seksueel dimorf zijn2. MS treft meer vrouwen dan mannen; Mannen ontwikkelen echter over het algemeen een agressievere vorm van de ziekte. Dit bewijs heeft een essentiële, maar ook complexe, rol van de gonadale hormonen gesuggereerd15; Desalniettemin blijven de rol en het werkingsmechanisme van geslachtshormonen in de pathologie onduidelijk. Bovendien ondersteunen gegevens van diermodellen het idee dat zowel oestrogenen als androgenen op een geslachtsspecifieke manier positieve effecten uitoefenen op verschillende delen van de pathologie16,17.

Sommige studies suggereren ook neuroprotectieve, promyeliniserende en ontstekingsremmende effecten van progesteron18 en, hoewel bewijs bij MS-patiënten schaars is18, kunnen neuroactieve steroïden (d.w.z. de novo gesynthetiseerde steroïden door het zenuwstelsel, zoals pregnenolon, tetrahydroprogesteron en dihydroprogesteron) ook het pathologische beloop beïnvloeden19. Gezamenlijk ondersteunen deze gegevens het idee dat geslachtshormonen die zowel perifeer als in het CZS worden geproduceerd, een belangrijke en geslachtsspecifieke rol spelen bij het ontstaan en de progressie van de ziekte. Daarom dringen we in dit werk aan op het verzamelen van afzonderlijke gegevens van zowel mannelijke als vrouwelijke dieren.

Vanuit histopathologisch oogpunt dient de witte stof van het ruggenmerg als de belangrijkste plaats van CZS-letsel in dit model, dat wordt gekenmerkt door multifocale, confluente regio's van mononucleaire inflammatoire infiltratie en demyelinisatie8. Bij het beschrijven van dit protocol voor de inductie van MOG35-55-geïnduceerde EAE in C57BL/6J-muizen, zullen we dus rekening houden met de uitkomst van de ziekte bij de twee geslachten en enkele histopathologische inzichten geven met betrekking tot het ruggenmerg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De verzorging en behandeling van de dieren in het kader van dit werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Unie van 22september 2010 (2010/63/UE); alle procedures die in deze studie zijn gerapporteerd, zijn goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (407/2018-PR) en door de ethische commissie van de Universiteit van Turijn (projectnr. 360384). We raden aan om het experimentele ontwerp te conformeren aan de ARRIVE-richtlijnen die oorspronkelijk zijn gepubliceerd door Kilkenny et al. in 201020. Voordat u begint, moet u ervoor zorgen dat de benodigde materialen beschikbaar zijn (zie Tabel met materialen). Steriliseer al het glaswerk en keukengerei dat wordt gebruikt voor de bereiding van de MOG35-55-emulsie in een autoclaaf. Een samenvatting van de experimentele procedures is weergegeven in figuur 1.

1. Bereiding van MOG35-55 emulsie

OPMERKING: Om de emulsie te bereiden, zijn MOG35-55, onvolledig Freud's adjuvans (IFA), Mycobacterium Tuberculosis stam H37Ra (MT) en fysiologische oplossing vereist (zie Tabel met materialen).

LET OP: Door hitte gedode MT kan de aangeboren immuunrespons stimuleren. Vermijd inademing, inslikken en contact met huid en ogen met behulp van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en weeg MT in een afgedekte bovenweger onder de motorkap.

Oplossing Compositie Notities
2 mg/ml MOG35-55 peptide-oplossing Gevriesdroogd MOG35-55-peptide verdund in fysiologische oplossing met een concentratie van 2 mg/ml Bewaar de reeds verdunde oplossing bij -80 °C.
5 μg/ml PT-oplossing Gevriesdroogde PT verdund in fysiologische oplossing in een concentratie van 5 μg/ml. Bewaar de reeds verdunde oplossing bij -80 °C.
Emulsie Het totale volume emulsie dat nodig is voor elke muis die moet worden geïmmuniseerd, is 300 μL als volgt verdeeld: Om wisselingen of besmetting te voorkomen, bereidt u de emulsie op de dag van de immunisatie.
200 μg/muis MOG35-55 , d.w.z. 100 μL MOG35-55 2 mg/ml oplossing.
50 μL fysiologische oplossing
150 μL IFA
4 mg/ml MT, d.w.z. 1,2 mg/muis
Fysiologische oplossing Natriumchloride 0,9% verdund in gedestilleerd water.

Tabel 1: Samenstelling van de oplossingen die worden gebruikt voor de immunisatieprocedure.

  1. Bereid de oplossing in een glazen bekerglas, voeg eerst de vloeibare component toe en tenslotte de MT.
    OPMERKING: Het totale volume emulsie dat nodig is voor elke muis die moet worden geïmmuniseerd, is 300 μL, gedeeld zoals aangegeven in tabel 1. De emulsie is erg stroperig en dik, dus tijdens de bereidings- en injectieprocedure kan er wat verlies optreden, vooral bij het bereiden van de oplossing voor een paar muizen. We raden aan om het uiteindelijke volume van de emulsie dat nodig is te berekenen door het aantal te immuniseren muizen met ten minste 1,5-2-voudig te overschatten.
  2. Plaats het bekerglas in ijs en gebruik de glazen spuit met een naald van 18 G om de oplossing te emulgeren.
    OPMERKING: De emulsie kan ook met andere strategieën worden bereid, bijvoorbeeld door de twee luchtvrije glazen spuiten te verbinden met een driewegkraan en de oplossing te mengen door de zuigers heen en weer te duwen21,22.
  3. Emulgeer de oplossing gedurende ten minste 15 minuten; Over het algemeen is 30 minuten emulgeren voldoende. Om de kwaliteit van de emulsie te controleren, voegt u een druppel emulsie toe in een transparante container gevuld met water: als de druppel zijn structuur behoudt en intact blijft, is de emulsie klaar.
  4. Plaats de emulsie direct in de spuiten van 1 ml die voor de immunisatie zullen worden gebruikt en bewaar deze tot gebruik bij +4 °C om de dikte van de emulsie te behouden en veranderingen of besmettingen te voorkomen.

2. Selectie en immunisatie van dieren

  1. Dierlijke selectie
    1. Selecteer volwassen C57BL/6J-muizen van beide geslachten op een leeftijd van 8-10 weken met een optimaal lichaamsgewicht van ~20 g. Zorg ervoor dat u muizen van dezelfde leeftijd en geslacht selecteert voor verschillende experimentele groepen, omdat de gevoeligheid voor ziekten kan variëren met leeftijd en geslacht.
      OPMERKING: Muizen moeten op de dag van immunisatie een vergelijkbaar lichaamsgewicht hebben, omdat de huidige procedure is geoptimaliseerd voor een bepaald lichaamsgewichtbereik (17-25 g).
    2. Huisvest dieren van hetzelfde geslacht in groepen (n = 4-5/kooi) om sociaal isolement te voorkomen in standaardomstandigheden in muizenkooien van 45 cm x 25 cm x 15 cm polypropyleen bij 22 ± 2 °C, onder 12:12 licht/donkercyclus (lichten aan om 08:00 uur). Zorg voor voedsel en water ad libitum.
      OPMERKING: Om de potentiële variabiliteit van het ziekteverloop bij de geïmmuniseerde dieren verder te beperken, stellen we uiteindelijk ook voor om voldoende experimentele groepen te vormen. Er zijn ook studies 8,23 die de timing van immunisatie beschrijven als een aandoening die de variatie in EAE-uitkomst bepaalt. Daarom raden we aan om de immunisatie bij alle dieren ongeveer op hetzelfde uur uit te voeren, bij voorkeur tijdens de lichturen van de dagelijkse licht/donker-cyclus23. Om stress te beperken, verdient het de voorkeur om de dieren vóór de dag van immunisatie te manipuleren en ze te markeren om ze gemakkelijk te identificeren voor dagelijkse evaluatie, bijvoorbeeld oorknippen of taggen.
  2. De immunisatieprocedure
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de procedure wordt uitgevoerd door een ervaren onderzoeker om stress voor dieren te minimaliseren en immunisatie te optimaliseren. Voordat u met de immunisatie begint, selecteert u de anesthesiemethode in overeenstemming met de richtlijnen van de institutionele dierenverzorging en ethische commissie. Ons laboratorium maakt gebruik van korte anesthesie met isofluraan.
    1. Verdoof de muis: 4% isofluraan voor anesthesie-inductie en 1,5-2% isofluraan voor anesthesieonderhoud. Wacht tot de anesthesie effectief is en gebruik een teenknijp in de voor- en voorvoet om het niveau van anesthesie te beoordelen. Om uitdroging van de ogen te voorkomen terwijl de muis onder narcose is, gebruikt u een door dierenartsen goedgekeurde oogzalf.
    2. PT intraveneuze injectie in de laterale caudale ader: sluit de staart van de muis voorzichtig af met een ethanoloplossing, die werkt als een vaatverwijdend, om de aderen weer te geven. Concentreer u op een van de twee laterale aders van de staart en injecteer met een injectiespuit van 0,5 ml met een naald van 30 g 500 ng PT (d.w.z. 100 μl PT verdund in fysiologische oplossing in een concentratie van 5 μg/ml).
    3. Subcutane injectie van MOG35-55-emulsie : voer met behulp van de spuit van 1 ml met een naald van 26 G drie subcutane injecties van de eerder bereide emulsie uit: twee onder het rostrale deel van de flanken en één aan de basis van de staart. Het volume van de emulsie die op elke plaats wordt geïnjecteerd, is 100 μL, voor een totaal volume van 300 μL emulsie dat in elke muis wordt geïnjecteerd.
      OPMERKING: De dag van immunisatie wordt geregistreerd als dag 0 na immunisatie (dpi); 48 uur later (d.w.z. bij 2 dpi) is het noodzakelijk om nog een intraveneuze injectie van PT uit te voeren die gelijk is aan de eerder uitgevoerde injectie. Het is mogelijk om de injectie zonder verdoving uit te voeren met behulp van een muisbeschermer. De hier beschreven procedure heeft tot doel het anesthetiseren van de muizen tijdens de immunisatieprocedure te induceren en te handhaven om mogelijk ongemak en bewegingen van de dieren of risico's voor zowel muizen als onderzoekers te voorkomen. Er zijn dus geen chirurgische ingrepen. Om de experimentele processen te optimaliseren, is het echter belangrijk om tijdens deze stappen de juiste steriele omstandigheden te handhaven en de toestand van de muis na deze procedures te controleren.
    4. Om te controleren of de muis is hersteld van de injecties, plaatst u hem na de procedures in een schone kooi en wacht u tot hij weer voldoende bij bewustzijn is om sternale lighouding te behouden. Nadat de muis volledig is hersteld, plaatst u hem terug in de thuiskooi met andere dieren.

3. Follow-up van EAE

  1. Lichaamsgewicht en voedselinname
    1. Controleer dagelijks het lichaamsgewicht van de dieren met behulp van een elektronische bovenweger, omdat de afname van het lichaamsgewicht een indicator is voor ziekteprogressie.
      LET OP: Deze daling mag niet hoger zijn dan een bepaald percentage, volgens de richtlijnen van de institutionele en ethische commissie voor dierenverzorging. Gewoonlijk, als een dier meer dan 20% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht verliest (d.w.z. het gewicht geregistreerd bij 0 dpi), moet het worden opgeofferd als de toepassing van het humane eindpunt. De euthanasiemethoden omvatten diepe onomkeerbare anesthesie voor inhalatie (bijv. 5% isofluraan) gevolgd door onthoofding.
    2. Bewaak de voedselinname (FI) - het voedsel dat een dier op een dag eet (g∙day-1∙animal-1), weeg de hoeveelheid voedsel in de specifieke container minstens één keer per week en verdeel de hoeveelheid gegeten voedsel voor de verstreken dagen over twee opeenvolgende metingen en het aantal dieren dat in de kooi aanwezig is.
      OPMERKING: Met deze meting kan de gemiddelde voedselinname worden geschat. Vanwege het verschijnen en de opeenstapeling van klinische ziekteverschijnselen, waarbij de ledematen verlamd raken, raden we aan om wat gedrenkt voedsel op de bodem van de kooi te leggen wanneer de dieren niet in staat zijn om stevig op hun achterpoten te staan en de voedselcontainer of de waterfles te bereiken. Om de voedselinname tijdens de follow-up periode zo nauwkeurig mogelijk te beoordelen, hebben we ook het drooggewicht van dit voer gemeten voordat we het nat maakten voor de muizen.
  2. Evaluatie van de oestrische cycliciteit tijdens EAE
    1. Controleer de oestrische cyclus gedurende ten minste twee cycli en evalueer de vaginale cytologie-uitstrijkjes zoals beschreven door McLean et al.24. Classificeer de fase van de oestrische cyclus op basis van de aanwezigheid van drie primaire celtypen - kernepitheelcellen, verhoornde plaveiselepitheelcellen en leukocyten - in de vaginale uitstrijkjes, als volgt:
      1. Classificeer als pro-oestrus op basis van een bijna exclusieve aanwezigheid van clusters van ronde, goed gevormde kernepitheelcellen.
      2. Classificeer als oestrus op basis van de overheersende aanwezigheid van dicht opeengepakte clusters van verhoornde plaveiselepitheelcellen.
      3. Classificeren als metestrus op basis van de overheersende aanwezigheid van kleine, donker gekleurde leukocyten en de geringe aanwezigheid van verhoornde plaveiselepitheelcellen.
      4. Classificeer als diestrus op basis van de zeer overheersende aanwezigheid van kleine, donker gekleurde leukocyten en zeldzame verhoornde plaveiselepitheelcellen, samen met het mogelijke verschijnen van kernvormige epitheelcellen.
        OPMERKING: Bij het evalueren van de ziekte bij beide geslachten is het belangrijk om de variabiliteit bij vrouwen als gevolg van de oestrische cyclus te controleren. We stellen voor om ons te concentreren op de evaluatie van de oestrische cyclus, vooral tussen de eerste en de tweede week na immunisatie (d.w.z. tijdens de acute fase van de EAE). Eerder is aangetoond dat de immunisatieprocedure de meest uitgesproken veranderingen van de oestrische cyclus binnen deze faseveroorzaakt 25. Bovendien is het belangrijk om te bedenken dat het uitvoeren van het uitstrijkje wanneer het dier een hoge klinische score bereikt (vooral >3) moeilijk is vanwege de posterieure parese en het gebrek aan tonus in de achterpoten.
  3. Klinische score
    1. Laat een geblindeerde onderzoeker dagelijks de klinische score van de dieren beoordelen. Ken aan elk dier een score toe van 0 tot 5 (zie tabel 2) om het ziekteverloop26 te evalueren zoals beschreven door Racke7.
      OPMERKING: Net als bij de afname van het lichaamsgewicht, is ook een humaan eindpunt nodig voor de toename van klinische scores, volgens de richtlijnen van de institutionele en ethische commissie voor dierenverzorging. Over het algemeen geldt dat als een dier niet langer in staat is zichzelf autonoom te voeden (dit gebeurt meestal wanneer een dier ten minste de score van 4 bereikt, volgens de schaal die we gebruiken), het moet worden opgeofferd als de toepassing van het humane eindpunt.
  4. Evaluatie van de motorprestaties door middel van rotarod-test
    OPMERKING: Evaluatie van de EAE-progressie wordt meestal uitgevoerd door dagelijks de klinische score toe te kennen, wat wordt gedaan door een volledig getrainde geblindeerde onderzoeker. Het zou echter nuttig kunnen zijn om het te flankeren met een meer kwantitatieve en objectieve evaluatie van de progressie van de ziekte. In een eerdere studie26 werd de rotarod-test gebruikt om de motorische prestaties van de geïmmuniseerde dieren te meten. Zoals beschreven door van den Berg et al.27, kan de evaluatie van de motorische prestaties door de rotarod-test de klinische scorebeoordeling ondersteunen om een meer kwantitatieve en nauwkeurige klinische evaluatie van het ziekteverloop te hebben. Voor een uitgebreide beschrijving, zie van den Berg et al.27.
    1. Laat de muizen dagelijks rotarod-sessies ondergaan, vanaf 1 dpi tot het offer (d.w.z. 28 dpi). Elke sessie bestaat uit een enkele sessie van 300 s waarin de hengelsnelheid lineair moet worden verhoogd van 4 naar 40 tpm.
    2. Registreer de score van het dier. Wanneer de muis niet in staat is om zijn evenwicht te bewaren en van het apparaat valt, valt hij op de grond en activeert een sensor, en de tijd(en) worden geregistreerd. De prestaties worden dus gescoord als latency to fall(s).

Graad Klinisch teken Beschrijving
0 Gezond Geen waargenomen klinisch symptoom. Het dier vertoont een normale toon en beweging van de staart. Hij loopt zonder te struikelen.
0.5 Verstoorde poort Het dier struikelt tijdens het lopen op een grill.
1 Slappe staart Wanneer het dier aan de basis van de staart wordt opgepakt, gaat de staart hangen (slappe staart).
1.5 Slappe staart en verminderde poort Het dier heeft een slappe staart en struikelt tijdens het lopen op een grill.
2 Ataxie Het dier heeft moeite met opstaan als het eenmaal op zijn rug is gedraaid.
2.5 Ataxie en parese van de achterpoten Het dier kan niet opstaan als het eenmaal op zijn rug is gedraaid en het verliest de toon van een van zijn achterpoten.
3 Verlamming van de achterpoten Het dier verliest de tonus van beide achterpoten.
3.5 Verlamming van de achterpoten en/of parese van de voorpoten Het dier verliest de tonus van beide achterpoten en een deel van de voorpoten. In feite vertoont het een verlies van kracht in de greep van de voorpoten.
4 Tetra parese Het dier verliest volledig de tonus van zijn ledematen.
4.5 Tetraparese en verlaagde lichaamstemperatuur Het dier verliest volledig de tonus van zijn ledematen en vertoont een daling van de lichaamstemperatuur (het is koud).
5 Stervend of dood Het dier is stervende (het reageert niet op een stimulus) of dood.

Tabel 2: Klinisch scoresysteem dat wordt gebruikt om EAE-progressie te beoordelen.

4. Evaluatie van EAE-geïnduceerde histopathologische symptomen op het niveau van het ruggenmerg

OPMERKING: Hier beschrijven we kort de procedure om de dieren te offeren en het ruggenmerg te verzamelen om histopathologische analyse uit te voeren; Voor een gedetailleerde beschrijving, zie deze referenties 10,26,28,29.

  1. Fixatie en weefselbemonstering
    OPMERKING: Voor een gedetailleerde beschrijving, zie deze referenties 10,26.
    1. Offeren van de dieren bij 28 dpi tijdens de chronische fase van de ziekte.
      1. Verdoof de muizen door diepe onomkeerbare anesthesie (intraperitoneale injectie van Zolazepam en Tiletamine 80 mg/kg / Xylazine 10 mg/kg).
      2. Transcardieel doordrenken de muizen met een zoutoplossing, gevolgd door een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing.
        NOTITIE: Let op bij het gebruik van PFA: aangezien het giftig is, vermijd inademing, inslikken en contact met huid en ogen met behulp van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Weeg het poeder, bereid de oplossing voor en voer de perfusie uit onder de kap.
    2. Verwijder het ruggenmerg van de wervelkolom30.
    3. Bewaar het ruggenmerg gedurende 24 uur in een 4% PFA-oplossing.
    4. Voer meerdere wasbeurten uit in 0,01 M zoutfosfaatbuffer (PBS).
    5. Veranker het ruggenmerg in paraffineblokken30.
  2. Histologische procedures
    OPMERKING: Voor een gedetailleerde beschrijving, zie Montarolo et al.10.
    1. Gebruik een microtoom om 10 μm dikke dwarse ruggenmergsecties door te snijden en verzamel ze op met gelatine beklede glaasjes. Oriënteer het doorsnijvlak zodat het overeenkomt met de tekeningen die overeenkomen met de dwarsdoorsneden van de ruggenmergatlas van de muis31.
    2. Voer de deparaffinisatie van de secties32 uit.
    3. Kleur de sectie met hematoxyline en eosine32.
    4. Dehydrateer de secties32.
    5. Bedek de secties met een montagemedium en laat ze drogen bij kamertemperatuur onder een chemische kap.
      OPMERKING: Hematoxyline-Eosine-kleuring maakt de detectie mogelijk van de aanwezigheid van de perivasculaire inflammatoire infiltraten (PvII's)26, wat wordt beoordeeld als een teken van de ziekte28.
  3. Kwantitatieve analyse van ruggenmergsecties
    1. Maak beelden van de gekleurde delen met een optische microscoop die is aangesloten op een digitale camera met een 20x objectief29.
    2. Analyseer het verkregen beeld om het aantal PvII's te verkrijgen, uitgedrukt als het aantal infiltraten per mm2.
      OPMERKING: Voor de analyse van de verkregen beelden is het handig om gebruik te maken van beeldanalysesoftware. Neuropathologische bevindingen die in dit werk worden gepresenteerd, worden gekwantificeerd in 10 volledige dwarsdoorsneden van het ruggenmerg per muis (n = 8/groep) die representatief zijn voor het hele ruggenmergniveau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EAE-follow-up na immunisatie
Dit werd beoordeeld zoals hieronder beschreven.

Lichaamsgewicht en voedselinname
De tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA) (geslacht en tijd als onafhankelijke variabelen) laat een afname zien van het BW van EAE-dieren van beide geslachten, vooral in de tweede week na inductie (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figuur 2A). Het seksuele dimorfisme in BW blijft echter altijd behouden (Figuur 2A). In termen van het percentage BW (F(1,57) = 23,935, p < 0,001; Figuur 2B), zowel mannen als vrouwen vertonen een enorm verlies tussen de 12 dpi en de 17 dpi (p < 0,001) in vergelijking met het oorspronkelijke BW, maar overschrijden nooit een totaal verlies van de 20% (Figuur 2B). Hoewel het BW-verlies dus begint vóór het begin van de ziekte, bereikt het zijn maximum tijdens de acute fase van EAE (Figuur 2A,B). Er zijn geen verschillen tussen de geslachten in termen van BW-verlies. Vrouwen hebben echter de neiging om eerder gewicht te verliezen en minder te herstellen tijdens de chronische fase (derde-vierde week na inductie) (Figuur 2B).

Bovendien vertoont de tweerichtings-ANOVA (geslacht en tijd als onafhankelijke variabelen) ook een significante afname van FI (F(9, 39) = 6.682, p < 0.001; Figuur 2C) bij beide geslachten, met name tijdens de tweede week na immunisatie, als gevolg van de toegenomen ernst van de EAE, waardoor het voor het dier moeilijker werd om toegang te krijgen tot het voedsel dat in de bovenste container in de kooi was geplaatst. Zoals we voorstelden, werd het voer vervolgens op de bodem van de kooi gelegd om verdere stress voor de dieren te verminderen. Hierdoor kon de FI terugkeren naar het oorspronkelijke niveau (Figuur 2C) en kon de BW zich gedeeltelijk herstellen (Figuur 2A,B).

Evaluatie van de oestrische cyclus bij de vrouwtjes
De vergelijking tussen de tijd die in de verschillende fasen van de oestrute werd doorgebracht, werd uitgevoerd met behulp van de t-toets van de student. De analyse toont verschillen in de tijd die wordt doorgebracht in de estrale fasen (d.w.z. pro-oestrus en oestrus) in vergelijking met die doorgebracht in de niet-oestrale fase (d.w.z. metestrus en diestrus) tussen de asymptomatische fase (vóór het begin van de EAE) en de symptomatische fase (na het begin van de EAE) (p = 0,042; Figuur 2D), voornamelijk als gevolg van een toename van de tijd die wordt doorgebracht in de diestrus tijdens de symptomatische fasen (p = 0,017) en een tendens om de tijd die aan pro-oestrus wordt doorgebracht te verminderen (p = 0,08).

Er is al beschreven dat de inductieprocedure leidt tot een verandering van de oestrische cyclus bij vrouwen, met name van invloed op de pro-oestrus25. Tijdens deze fase is bekend dat toenemende niveaus van oestrogenen ontstekingsremmende en neuroprotectieve effecten uitoefenen16 en dus mogelijk verantwoordelijk zijn voor de beschermende rol van die hormonen tijdens de presymptomatische fase. Wanneer het niveau van oestrogenen echter daalt, zoals we zien in de fase na het begin, eindigen ook hun beschermende effecten.

Klinische score en rotarod-prestaties
De tweerichtings-ANOVA (geslacht en tijd als onafhankelijke variabelen) vertoont een significante toename in tijd in de klinische score (CS) van zowel mannen als vrouwen (F(56-813) = 27.951, p < 0.001; Figuur 3A). Met name vanaf 10 dpi vertonen beide geslachten een significante toename van de CS (p < 0,001), die wordt gehandhaafd tot het eindpunt (28 dpi) (Figuur 3A). Vrouwtjes vertonen, ook al is het niet significant (p = 0,156), een hogere CS dan mannetjes (Figuur 3A). Wat de aanvang van de ziekte betreft, komt de ziekte over het algemeen voor rond de 10 dpi, met een neiging om eerder te beginnen bij vrouwen dan bij mannen (Figuur 3B). Bovendien vertonen vrouwen een significant hogere cumulatieve CS in vergelijking met mannen (p = 0,017; Figuur 3C).

Het verloop van de rotarod prestaties lijkt op de klinische evaluaties (Figuur 2D). Vanaf het begin van de ziekte neemt het af en bereikt het de minimale prestatie tijdens de tweede week na immunisatie, in de acute fase van EAE. De tweerichtings-ANOVA (geslacht en tijd als onafhankelijke variabelen) vertoont een significante afname in tijd in de rotatieprestaties van zowel mannen als vrouwen (F(46-673) = 5.365, p < 0.001; Figuur 3D). Met name mannetjes vertonen de minimale prestaties bij 16 dpi (p = 0,022), terwijl de vrouwtjes bij 17 dpi (p < 0,001). Mannen hebben de neiging om beter te presteren dan vrouwen, vooral tijdens de chronische fase van de ziekte (21-28 dpi), mogelijk als gevolg van een lagere CS (Figuur 3A,D).

Histopathologische evaluatie van het ruggenmerg
Eenrichtings-ANOVA (geslacht als onafhankelijke variabele) van de PvII's in de ruggenmergsecties wijst op een duidelijk verschil tussen mannen en vrouwen (Figuur 4A). Vrouwen vertonen een significant hoger aantal PvII's dan mannen (F(1,14)= 63.107, p < 0.001; Figuur 4B). Deze gegevens weerspiegelen mogelijk de hogere cumulatieve CS, de slechtere rotarodprestaties en de agressievere ziekte die werd waargenomen bij de vrouwtjes, vooral tijdens de chronische fase van EAE.

Deze gegevens weerspiegelen ook het feit dat vrouwelijke muizen een hogere gevoeligheid vertonen voor de ontwikkeling van agressievere EAE in vergelijking met mannen14, wat een van de belangrijkste verschillen is tussen dit ziektemodel en de MS die bij mensen voorkomt. Vrouwen vertonen een eerder begin van de ziekte, hebben een matig lagere prevalentie van primaire progressieve vormen en vertonen over het algemeen minder invaliditeitsprogressie dan mannen 2,33,34.

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave in de tijd van experimentele procedures. Gemaakt met BioRender.com. Afkortingen: i.v. = intraveneus; s.c. = subcutaan; MOG35-55 = myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide 35-55; = dpi = dag na immunisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Evaluatie van de EAE-effecten op het lichaamsgewicht, de voedselinname bij mannelijke en vrouwelijke muizen en de oestrische cyclus bij vrouwelijke muizen. Vanaf de dag van immunisatie (0 dpi) tot de dag van het offer (28 dpi) tonen de grafieken (A) het dagelijkse lichaamsgewicht, (B) het percentage lichaamsgewicht en (C) de wekelijkse evaluatie van de voedselinname bij de dieren van beide geslachten (n = 15/groep). (D) Tijd doorgebracht (uitgedrukt als gemiddeld percentage van de tijd) in de verschillende fasen van de oestrische cyclus, geëvalueerd door vaginale cytologie-uitstrijkjes, tijdens de asymptomatische fase (vóór het begin, linkerkolom van de grafiek) of de symptomatische fase (na het begin, rechterkolom van de grafiek) bij vrouwelijke muizen. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Statistische analyse onthulde een significant effect voor p≤ 0,05 (# = mannen vs. vrouwen; * = vergelijking tussen verschillende tijdstippen). Afkortingen: EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis; BW = lichaamsgewicht; FI = voedselinname; dpi = dag na immunisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Evaluatie van de klinische score en rotarodprestaties bij mannelijke en vrouwelijke muizen met EAE. (A) Beoordeling van de dagelijkse klinische score (van 0 tot 28 dpi) bij dieren van beide geslachten (n = 15/groep). (B) Aanvangsdag van de ziekte (gemiddelde dpi) bij muizen met EAE-getroffen mannetjes (linkerkolom) en vrouwtjes (rechterkolom). (C) Gemiddelde cumulatieve klinische score bereikt door EAE-aangetaste mannetjes (linkerkolom) en vrouwtjes (rechterkolom) muizen. (D) Beoordeling van de dagelijkse prestaties van de rotarod (gemeten als latentie van de val) van 6 tot 28 dpi (de 0 staat voor de basiswaarden die in de eerste 5 dagen van de test zijn verkregen) bij dieren van beide geslachten. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Statistische analyse onthulde een significant effect voor p≤ 0,05 (# = mannen vs. vrouwen; * = vergelijking tussen verschillende tijdstippen). Afkortingen: EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis; CS = klinische score; Cum CS = cumulatieve klinische score; dpi = dag na immunisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Analyse van ontsteking in het ruggenmerg van EAE-aangetaste muizen van beide geslachten. (A) Representatieve beelden van dwarse ruggenmergsecties gekleurd met hematoxyline-eosine benadrukken de aanwezigheid van PvII's (pijlen) bij mannelijke (bovenste afbeelding) en vrouwelijke (onderste afbeelding) muizen. (B) Meting van de aanwezigheid van PvII's in het ruggenmerg van EAE-aangetaste muizen van beide geslachten (n = 8/groep). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Statistische analyse toonde een significant effect voor p ≤ 0,05 (# = mannen vs. vrouwen). Schaalbalk = 200 μm (10x vergroting). Afkortingen: EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis; * = centraal kanaal; PvII's = perivasculaire inflammatoire infiltraten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het MOG35-55-geïnduceerde EAE-protocol dat we beschreven leidde tot de ontwikkeling van een chronische vorm van MS in C57BL/6J-muizen 7,8,13. In deze representatieve resultaten rapporteerden we dat de dieren van beide geslachten die de immunisatieprocedure ondergingen, een chronische vorm van de ziekte ontwikkelden (d.w.z. ze herstellen niet volledig na het begin van de ziekte, ze accumuleren tekorten en behouden een CS van ten minste 1,5 in de chronische fase).

Hoewel veel studies geen verschillen tussen mannen en vrouwen in dit model rapporteren14, houden slechts enkele studies rekening met beide geslachten. Gezien de substantiële seksuele dimorfismen die bij MS2 worden vertoond, zou het echter van primair belang moeten zijn om de uitkomst van de ziekte bij beide geslachten te bestuderen. Dankzij recentere studies die beide geslachten omvatten, is de aanwezigheid van enig seksueel dimorfisme ook beschreven in de MOG35-55-geïnduceerde EAE35. We merkten vooral op dat bij vrouwtjes MOG35-55-geïnduceerde EAE over het algemeen agressiever is (gezien de hogere gevoeligheid van vrouwelijke muizen met dit model)36, omdat ze de neiging hebben om eerder te beginnen en hogere cumulatieve klinische scores te hebben, wat wijst op een verhoogde ontsteking op het niveau van het ruggenmerg dan waargenomen bij mannen. Een belangrijke conclusie is dat dit protocol EAE kan induceren bij zowel mannelijke als vrouwelijke muizen, maar onderzoekers moeten niet vergeten dat sommige aspecten van de ziekte kunnen verschillen tussen de twee geslachten. Het is dus van cruciaal belang om de belangrijkste experimentele vraag die moet worden aangepakt goed te overwegen, het meest gunstige diermodel te kiezen en de noodzaak te evalueren om een of beide geslachten op te nemen.

Kritieke stappen en mogelijke probleemoplossing
Aangezien verschillende modellen van MS enkele specifieke aspecten van de ziekte produceren, maar niet alle6, is de eerste fundamentele stap het kiezen van het juiste model, rekening houdend met de specifieke experimentele behoeften en de wetenschappelijke vragen die moeten worden aangepakt. Ten tweede moet de immunisatieprocedure worden uitgevoerd door een deskundige om ervoor te zorgen dat deze correct wordt uitgevoerd en om fouten of variabiliteit als gevolg van onnauwkeurige procedures te voorkomen. Bovendien moet de onderzoeker op de hoogte zijn van de dierenwelzijnsvoorschriften die door de gastinstelling zijn vastgesteld.

Ten derde moet de emulsie in het experiment worden gestandaardiseerd. Opgemerkt moet worden dat elke muis een typische gevoeligheid voor inductie vertoont, en dus kunnen sommige dieren een minder agressieve ziekte ontwikkelen of helemaal niet ontwikkelen. In dat geval kunnen de incidentie en ernst van de ziekte worden geoptimaliseerd door de hoeveelheid MOG35-55 die aan de muizen wordt toegediend aan te passen. Ten vierde, hoewel PT-injectie veel wordt gebruikt om de inductie van EAE bij muizente vergemakkelijken 35,36, is het niet nodig voor elk protocol37,38. Bij afwezigheid van PT ontwikkelen muizen meestal een minder ernstige en meer variabele vorm van EAE39. Bovendien kan verdere variabiliteit worden veroorzaakt door verschillende manieren van PT-toediening (bijv. intraveneus versus intraperitoneaal) en omdat is beschreven dat de potentie van PT varieert tussen batches. Om dit probleem op te lossen, is het belangrijk om het volume aan te passen aan de potentie van elke gebruikte batch en om de PT-oplossing op de juiste manier te bereiden40,41. Gezien de experimentele doelen, de technische vaardigheden van de onderzoekers en de optimalisatie van dieronderzoek, is het van fundamenteel belang om het meest geschikte inductieprotocol te kiezen.

Ten vijfde, om gegevens op een objectievere manier te verzamelen, wordt het geblindeerd scoren van ziektesymptomen ten zeerste aanbevolen. Verder raden we klinische scores aan met een meer kwantitatieve en objectieve evaluatie van het ziekteverloop, zoals de evaluatie van de rotarod-prestaties. Ten slotte is de juiste selectie van voldoende talrijke experimentele groepen van fundamenteel belang voor het verkrijgen van betrouwbare en vergelijkbare gegevens (zie protocoldeel 2). Berekeningen van de steekproefomvang moeten worden uitgevoerd om de benodigde groepsgroottes te verkrijgen, afhankelijk van de verwachte effectgrootte.

Belangrijkste beperkingen
Ten eerste kan dit inductieprotocol leiden tot zeer variabele uitkomsten bij de geïmmuniseerde dieren, vooral als de groepsgroottes niet groot genoeg zijn of als de procedure niet goed wordt uitgevoerd. Vervolgens heeft MOG35-55-geïnduceerde EAE, net als elk ander beschikbaar model van MS, enkele beperkingen (d.w.z. het geeft zeer weinig informatie over MS-progressie, de rol van B-cellen in de ziekte, de inside-out-mechanismen of moeilijkheden bij het bestuderen van remyelinisatie)4,6. Daarom is het opnieuw van fundamenteel belang om het MS-model te kiezen dat nodig is om de specifieke wetenschappelijke vraag te beantwoorden. Ten slotte wordt de primaire plaats van schade vertegenwoordigd door het ruggenmerg en leidt de pathologie tot het verschijnen van histopathologische symptomen op een caudaal-craniale manier (d.w.z. beginnend bij het ruggenmerg en omhoog naar de hersenen). Dit is het tegenovergestelde van wat er bij mensen gebeurt en kan een aanzienlijke beperking van het model betekenen. Het is echter ook mogelijk om enkele veranderingen in de hersenen te waarderen, rekening houdend met specifieke doelen.

Voordelen
Ten eerste kan dit model een belangrijke bijdrage leveren aan het begrip van perifere immuungemedieerde mechanismen en aan de evaluatie van de neuro-inflammatoire en, gedeeltelijk, demyeliniserende processen in het CZS. Vervolgens zou dit model kunnen worden toegepast in enkele specifieke transgene muizenstammen om MS-uitkomsten te bestuderen die verband houden met specifieke genetische veranderingen.

Een ander voordeel is een klinische evaluatie op basis van twee methoden: de klinische scorebeoordeling en de rotarod-test. Dit leidt tot een meer kwantitatieve, minder subjectieve en preciezere klinische evaluatie van het ziekteverloop. Bovendien, zoals Van den Berg et al. opmerkten, is de op rotarode gebaseerde evaluatie sterk gecorreleerd met het oppervlak van inflammatoire laesies in de motorische systemen van het ruggenmerg27.

Zoals we eerder hebben besproken, hoewel dit model het seksuele dimorfisme van MS niet volledig reproduceert, geloven we dat dit een voordeel is. De combinatie van de inductie met andere mogelijke risicofactoren, met name de omgevingsfactoren, kan helpen bij het begrijpen van de specifieke effecten van dergelijke factoren en het identificeren van hun specifieke rol bij het optreden van sommige seksueel dimorfe aspecten van MS. Ten slotte is dit model op grote schaal gebruikt om een breed scala aan therapeutische geneesmiddelen te ontwikkelen en te testen en heeft het daarom het potentieel om nieuwe therapeutische benaderingen voor deze ziekte te helpen ontwikkelen 4,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te melden met betrekking tot het onderzoek, het auteurschap en/of de publicatie van dit artikel.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR-project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 en 2023-2027 aan Afdeling Neurowetenschappen Rita Levi Montalcini; Cavalieri-Ottolenghi Foundation, Orbassano, Italië. BB was fellow van INFRA-P, regio Piemonte (n.378-35) (2022-2023) en PRIN 2020 - 20203AMKTW. Wij danken Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) voor de steun. De publicatiekosten zijn ondersteund door de vriendelijke donatie van Distretto Rotaract 2031, en in het bijzonder Rotaract Club Torino Nord-Est. Wij danken Elaine Miller voor het proeflezen van ons manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), Zurich, Switzerland. 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , Chapter 9, Unit 9.7 (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It's complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida--a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Chapter 16 - Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. , Academic Press. 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).

Tags

Neuroscience MOG35-55-geïnduceerde experimentele auto-immuun encefalomyelitis Chronische auto-immuun ontstekingsziekte Centraal zenuwstelsel (CZS) Prevalentie bij geslachten Agressieve vormen Klinische aspecten Radiologische kenmerken Pathologische kenmerken Experimentele diermodellen Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J-muizen Myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide 35-55 (MOG35-55) Immunisatie chronische vorm van de ziekte dagelijkse klinische score Motor Prestaties histologische analyse ruggenmerg

Erratum

Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

Modellering van multiple sclerose bij de twee geslachten: MOG<sub>35-55-geïnduceerde</sub> experimentele auto-immuun encefalomyelitis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo,… More

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter