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Summary
実験的自己免疫性脳脊髄炎は、多発性硬化症の最も広く使用されているマウスモデルの1つです。現在のプロトコルでは、雌雄のC57BL/6Jマウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドを免疫し、主に尾と四肢の上行麻痺を引き起こします。ここでは、EAEの誘導と評価のプロトコルについて説明します。
Abstract
多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)に影響を与える慢性自己免疫性炎症性疾患です。これは、性別で有病率が異なり、男性よりも女性に多く影響し、結果が異なり、女性よりも男性でより攻撃的な形態を示すことを特徴としています。さらに、MSは、臨床的側面、放射線学的、および病理学的特徴の点で非常に異質です。したがって、病理学のできるだけ多くの側面の調査を可能にする実験動物モデルを利用する必要があります。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、マウスで最もよく使用されるMSモデルの1つであり、免疫系の活性化から中枢神経系の損傷まで、さまざまな疾患の特徴をモデル化しています。ここでは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35-55(MOG35-55)免疫を使用して、雌雄のC57BL / 6JマウスにEAEを誘導するためのプロトコルについて説明します。また、これらのマウスの免疫後28日間(28dpi)の毎日の臨床スコアと運動能力の評価についても報告します。最後に、中枢神経系レベルでの基本的な組織学的解析を、疾患誘発性損傷の原発部位としての脊髄に焦点をあてて説明する。
Introduction
多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)に影響を与える慢性自己免疫性炎症性疾患です。炎症細胞の血管周囲浸潤、脱髄、軸索喪失、およびグリオーシスの存在を示します1。その病因は不明のままであり、その臨床的側面、X線写真、および病理学的特徴は、この疾患の顕著な異質性を示唆しています2。
その病因と複雑さが不明なため、現在のところ、ヒトMS3,4に示されたすべての臨床的および放射線学的特徴を再現する動物モデルはありません。しかし、MS 3,4のさまざまな側面を研究するために、さまざまな動物モデルが採用されています。これらのモデルでは、疾患の開始は通常、非常に人工的であり、臨床徴候の発症の時間枠はヒトとマウスで異なります。例えば、ヒトでは、疾患の根底にある病態生理学的過程は、臨床症状の発症前に何年も検出されない。逆に、実験者は、MS導入後数週間または数日以内に動物モデルの症状を検出することができます4。
MSに特徴的な脱髄の特徴は、ウイルス誘発性モデル(例:Theilerマウス脳脊髄炎ウイルス)、毒性物質(例:クプリゾン、リゾレシチン)によって誘発されるモデル、および実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)のさまざまな変異体である5。各モデルは、この疾患のいくつかの特定の側面を研究するのに役立ちますが、MS6のすべての機能を再現するものはありません。したがって、特定の実験ニーズと対処すべき科学的問題を考慮して、正しいモデルを選択することが重要です。
ミエリン由来抗原に対する免疫処置により、EAEは感受性マウスのCNS成分に対する自己免疫応答を誘発することによって誘導されます。広範囲の免疫病理学的および神経病理学的メカニズムの相互作用は、免疫マウスにおけるMSの主要な病理学的形質(すなわち、炎症、脱髄、軸索喪失、およびグリオーシス)の発症を引き起こします7,8。マウスは接種後2週目頃から臨床症状を示し始め、一般的に尾から四肢、前肢にかけて上行麻痺を示します。臨床スコア(すなわち、疾患関連欠損の蓄積の定量化)は、一般に5段階評価7を用いて評価される。
タンパク質またはペプチドによる能動的免疫、または脳原性T細胞の受動的導入を使用して、異なる遺伝的背景を持つマウス(例、SJL/J、C57BL/6、および非肥満糖尿病(NOD)マウス)にEAEを誘導できます。ミエリンプロテオ脂質タンパク質(PLP)、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)は、免疫原が通常産生される自己CNSタンパク質の例です。特に、PLPの免疫優性エピトープ(PLP139−151)で免疫されたSJL/Jマウスは再発寛解(RR)疾患の経過をたどり、免疫優性MOG35-55 ペプチドで免疫されたC57BL/6Jマウスは慢性的なEAEを示す1。多発性硬化症の進行、疾患におけるB細胞の役割、インサイドアウトのメカニズム、再髄鞘形成の研究の難しさなど、いくつかの制限があるにもかかわらず、EAEモデルは自己免疫および神経炎症プロセスの理解に大きく貢献し、MS分野の知識を増やし、この疾患の新しい治療法の開発を可能にしました4。6.
本研究では、活性EAEの特定の形態であるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35-55(MOG35-55)誘導型9,10,11,12に着目しました。MOG35-55誘発EAEは、慢性型のMSをモデル化します。予防接種後、マウスは予防接種後1週間以内に無症候性期を経験し、その後、通常、予防接種後2週間目に発症し、予防接種後3週間から4週間の間に、病気は慢性化し、累積された赤字から完全に回復する可能性はありません7,8,13.興味深いことに、男性と女性の疾患を比較した研究が少ないとしても、文献14に存在するほとんどの研究で、発生率、疾患の発症、経過、または進行に男性と女性の間に差は観察されていません。
対照的に、ヒトでは、これらのパラメータは強く性的二形であることが知られています2。多発性硬化症は男性よりも女性に多く罹患します。しかし、男性は一般的により攻撃的な形態の病気を発症します2。この証拠は、生殖腺ホルモンの本質的かつ複雑な役割を示唆しています15。それにもかかわらず、病理学における性ホルモンの役割と作用機序は不明のままです。さらに、動物モデルからのデータは、エストロゲンとアンドロゲンの両方が性特異的な方法で病理学のさまざまな管にプラスの効果を及ぼすという考えを支持しています16,17。
いくつかの研究はまた、プロゲステロンの神経保護作用、前髄形成作用、および抗炎症作用を示唆しており18 、MS患者における証拠は乏しいが18、神経活性ステロイド(すなわち、プレグネノロン、テトラヒドロプロゲステロン、ジヒドロプロゲステロンなどの神経系による de novo 合成ステロイド)も病理学的経過に影響を与える可能性がある19.まとめると、これらのデータは、末梢と中枢神経系の両方で産生される性ホルモンが、疾患の発症と進行に重要かつ性特異的な役割を果たしているという考えを支持しています。したがって、本研究では、雄と雌の両方の動物から別々のデータを収集することを強く求めます。
組織病理学的観点から、脊髄の白質は、単核炎症性浸潤および脱髄の多発性、合流領域を特徴とするこのモデルにおけるCNS損傷の主要な部位として機能する8。したがって、C57BL / 6JマウスにおけるMOG35-55誘発性EAEの誘導のためのこのプロトコルを説明する際に、私たちは2つの性別の疾患転帰を考慮に入れ、脊髄に関するいくつかの組織病理学的洞察を提供します。
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Protocol
本作業における動物の飼育と取り扱いは、2010年9 月22日の欧州連合理事会指令(2010/63/UE)に従って行われました。本研究で報告されたすべての手順は、イタリア保健省(407/2018-PR)およびトリノ大学の倫理委員会(プロジェクトn°360384)によって承認されました。2010年にKilkennyらによって最初に発表されたARRIVEガイドラインに実験計画に準拠することをお勧めします20。開始する前に、必要な材料が揃っていることを確認してください( 材料表を参照)。MOG35-55 エマルジョンの調製に使用されるすべてのガラス器具および調理器具をオートクレーブで滅菌します。実験手順の概要を 図1に示します。
1. MOG35-55 エマルジョンの調製
注:エマルジョンを調製するには、MOG35-55、不完全フロイトアジュバント(IFA)、 結核菌 株H37Ra(MT)、および生理学的溶液が必要です( 材料表を参照)。
注意:熱殺されたMTは、自然免疫反応を刺激する可能性があります。吸入、摂取、皮膚や目への接触を避け、適切な個人用保護具を使用し、ボンネットの下の覆われた精密天びんでMTを計量してください。
| 解決 | 組成 | 筆記 |
| 2 mg/mL MOG35-55 ペプチド溶液 | 凍結乾燥したMOG35-55ペプチドを生理液中で2 mg/mLの濃度で希釈したもの | 希釈した溶液を-80°Cで保存します。 |
| 5 μg/mL PT 溶液 | 凍結乾燥PTを生理液で5μg/mLの濃度で希釈した。 | 希釈した溶液を-80°Cで保存します。 |
| 乳剤 | 免疫する各マウスに必要なエマルジョンの総容量は、300μLを次のように分割します。 | 変質や汚染を避けるために、予防接種の日にエマルジョンを準備してください。 |
| MOG35-55 の 200 μg/マウス、すなわち、MOG35-55 2 mg/mL 溶液 100 μL。 | ||
| 50 μLの生理液 | ||
| 150 μL の IFA | ||
| 4 mg/mL MT、すなわち1.2 mg/マウス | ||
| 生理学的解決 | 塩化ナトリウム0.9%を蒸留水で希釈した。 |
表1: 予防接種手順に使用される溶液の組成。
- ガラスビーカーで溶液を調製し、最初に液体成分を加え、最後にMTを加えます。
注:免疫する各マウスに必要なエマルジョンの総容量は、 表1に示すように分割して300 μLです。エマルジョンは非常に粘性があり、厚いため、調製および注入手順中に、特に数匹のマウス用の溶液を調製する場合、いくらかの損失が生じる可能性があります。免疫するマウスの数を少なくとも1.5〜2倍過大評価して、必要なエマルジョンの最終量を計算することをお勧めします。 - ビーカーを氷に入れ、18Gの針が付いたガラスシリンジを使用して溶液の乳化を開始します。
注:エマルジョンは、例えば、2つのエアフリーガラスシリンジを三方活栓で接続し、プランジャーを前後に押して溶液を混合することによって、他の戦略を用いて調製することもできる21,22。 - 溶液を少なくとも15分間乳化します。一般的には、30分の乳化で十分です。エマルジョンの品質を確認するには、水で満たされた透明な容器にエマルジョンを一滴加えます:液滴がその構造を維持し、無傷のままであれば、エマルジョンの準備が整います。
- エマルジョンを免疫に使用する1 mLシリンジ内に直接入れ、使用するまで+4°Cで保管して、エマルジョンの厚さを維持し、変質や汚染を防ぎます。
2. 動物の選択と予防接種
- 動物の選択
- 8-10週齢で、最適体重が~20gの雌雄の成体C57BL/6Jマウスを選択します。病気に対する感受性は年齢や性別によって異なる可能性があるため、実験グループごとに年齢と性別が一致したマウスを必ず選択してください。
注:マウスは、現在の手順が特定の体重範囲(17〜25 g)に最適化されているため、予防接種当日の体重が同等である必要があります。 - 45 cm x 25 cm x 15 cmのポリプロピレン製マウスケージに、22±°Cから2°C、12:12の明暗サイクル(08:00 AMに点灯)で、標準的な条件下で社会的孤立を避けるために、同性動物をグループ(n = 4-5/ケージ)で飼育します。食べ物と水を 自由に提供してください。
注:最終的には、免疫動物における疾患経過の潜在的な変動性をさらに制限するために、十分な数の実験グループを形成することも提案します。また、EAE転帰の変動を決定する条件として予防接種のタイミングを説明する研究8,23もある。したがって、我々は、すべての動物においてほぼ同じ時間に、好ましくは毎日の明暗サイクル23の明るい時間帯に免疫化を行うことを提案する。ストレスを制限するには、予防接種日の前に動物を操作し、耳切りやタグなど、日常的な評価のために動物を簡単に識別できるようにマークを付けることが好ましい。
- 8-10週齢で、最適体重が~20gの雌雄の成体C57BL/6Jマウスを選択します。病気に対する感受性は年齢や性別によって異なる可能性があるため、実験グループごとに年齢と性別が一致したマウスを必ず選択してください。
- 予防接種の手順
注:動物のストレスを最小限に抑え、予防接種を最適化するために、手順が経験豊富な研究者によって実行されることを確認してください。予防接種を開始する前に、施設の動物管理および倫理委員会のガイドラインに従って麻酔方法を選択してください。当研究室では、イソフルランによる短時間の麻酔を行っています。- マウスに麻酔をかけます:麻酔導入には4%イソフルラン、麻酔維持には1.5〜2%イソフルラン。麻酔が効くのを待ち、後ろ足と前足のつま先をつまんで麻酔のレベルを評価します。マウスが麻酔下にある間の目の乾燥を防ぐために、獣医が承認した眼軟膏を使用してください。
- 側尾静脈へのPT静脈内注射:血管拡張剤として作用するエタノール溶液でマウスの尾部を静かに塞ぎ、静脈を表示します。尾部の2つの側静脈のうちの1つに焦点を合わせ、30 Gの針を装着した0.5 mLのシリンジを使用して、500 ngのPT(すなわち、100 μLのPTを生理学的溶液で5 μg/mLの濃度で希釈)を注入します。
- MOG35-55 エマルジョンの皮下注射:26 G針付きの1 mLシリンジを使用して、以前に調製したエマルジョンの皮下注射を3回行います:脇腹の吻側部分の下に2回、尾の付け根に1回。各部位に注入されるエマルジョンの量は100μLであり、各マウスに注入されるエマルジョンの総量は300μLである。
注:予防接種日は、予防接種後0日目(dpi)として記録されます。48時間後(すなわち、2dpiで)、以前に行ったものと等しいPTの別の静脈内注射を行う必要がある。麻酔なしで注射を行うことは、マウス拘束具を用いて行うことができる。ここで説明する手順は、マウスと研究者の両方にとっての動物の不快感や動き、またはリスクの可能性を回避するために、予防接種手順中にマウスの麻酔を誘発および維持することを目的としています。したがって、外科的処置はありません。ただし、実験プロセスを最適化するには、これらのステップ中に適切な無菌状態を維持し、これらの手順後のマウスの状態を監視することが重要です。 - マウスが注射から回復したことを確認するには、処置後にマウスを清潔なケージに入れ、胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで待ちます。マウスが完全に回復したら、他の動物と一緒にホームケージに戻します。
3. EAEフォローアップ
- 体重と食物摂取量
- 体重の減少は病気の進行の指標であるため、電子精密天びんを使用して動物の体重(BW)を毎日監視します。
注:この減少は、動物ケアに関する制度的および倫理的委員会のガイドラインに従って、一定の割合を超えてはなりません。通常、動物が初期体重の20%以上を失った場合(すなわち、0dpiで記録された体重)、人道的エンドポイントの適用として犠牲にすべきである。安楽死法では、吸入のための深い不可逆麻酔(例:.、5%イソフルラン)とそれに続く斬首が含まれます。 - 動物が1日に食べた餌(g∙day-1∙animal-1)の食物摂取量(FI)を監視し、少なくとも週に1回、特定の容器内の餌の量を量り、2回の連続測定とケージ内にいる動物の数の間で経過した日数の食べた餌の量を割ります。
注:この測定により、平均食物摂取量を推定できます。手足の麻痺を伴う臨床疾患の兆候の出現と蓄積のため、動物が後ろ肢でしっかりと立って餌容器や水筒に到達できない場合は、水をやりた餌をケージの床に置くことをお勧めします。追跡期間中の餌の摂取量をできるだけ正確に評価するために、マウスを濡らす前にこの餌の乾燥重量も測定しました。
- 体重の減少は病気の進行の指標であるため、電子精密天びんを使用して動物の体重(BW)を毎日監視します。
- EAE中の発情周期性の評価
- McLeanらによって説明されているように、膣細胞診塗抹標本を評価して、少なくとも2サイクルの発情周期をチェックします24。膣塗抹標本中の3種類の原発細胞(有核上皮細胞、角化扁平上皮細胞、白血球)の存在に基づいて、発情周期の段階を次のように分類します。
- 発情前症として分類されるのは、円形で整形した有核上皮細胞のクラスターがほぼ排他的に存在することに基づいています。
- 角質化扁平上皮細胞の密集したクラスターの優勢な存在に基づいて発情として分類します。
- 暗く染色された小さな白血球の優勢な存在と角化扁平上皮細胞のわずかな存在に基づいて、メテストルスとして分類します。
- 暗く染色された小さな白血球とまれな角化扁平上皮細胞の非常に優勢な存在と、有核上皮細胞の出現の可能性に基づいて、ジストラスとして分類されます。
注:男女ともにこの病気を評価するときは、発情周期による女性の変動性を確認することが重要です。特に予防接種後1週間目から2週目の間(すなわち、EAEの急性期)の発情周期の評価に焦点を当てることを提案する。予防接種手順は、この段階25内で発情周期の最も顕著な変化を引き起こすことが以前に示されています。さらに、動物が高い臨床スコア(特に>3)に達したときに塗抹標本を行うことは、後肢麻痺と後肢の緊張の欠如のために困難であることを考慮することが重要です。
- McLeanらによって説明されているように、膣細胞診塗抹標本を評価して、少なくとも2サイクルの発情周期をチェックします24。膣塗抹標本中の3種類の原発細胞(有核上皮細胞、角化扁平上皮細胞、白血球)の存在に基づいて、発情周期の段階を次のように分類します。
- 臨床スコア
- 盲検化された治験責任医師に、動物の臨床スコアを毎日評価してもらいます。各動物に0から5の評価されたスコアを割り当て(表2を参照)、Racke7に記載されているように疾患経過26を評価します。
注:体重の減少と同様に、動物ケアに関する制度的および倫理的委員会のガイドラインによると、臨床スコアの増加には人道的エンドポイントも必要です。一般に、動物が自律的に餌を食べることができなくなった場合(これは通常、私たちが使用する尺度に応じて、動物が少なくとも4のスコアに達したときに発生します)、人道的エンドポイントの適用として犠牲にする必要があります。
- 盲検化された治験責任医師に、動物の臨床スコアを毎日評価してもらいます。各動物に0から5の評価されたスコアを割り当て(表2を参照)、Racke7に記載されているように疾患経過26を評価します。
- ロータロッド試験によるモータ性能評価
注:EAEの進行の評価は通常、臨床スコアを毎日割り当てることによって行われますが、これは完全に訓練された盲検化された研究者によって行われます。しかし、病気の進行をより定量的かつ客観的に評価することは有用かもしれません。以前の研究26では、ロータロッドテストを使用して、免疫された動物の運動能力を測定しました。van den Berg et al.27 によって記述されているように、疾患経過のより定量的かつ正確な臨床評価を行うために、ロータロッドテストによる運動性能の評価は、臨床スコア評価をサポートすることができます。詳細な説明については、van den Berg et al.27 を参照してください。- マウスに、犠牲になるまで1dpi(つまり、28dpi)まで、毎日ロータロッドセッションを受けさせます。各セッションは 300 秒のセッションで構成され、その間にロッド速度を 4 rpm から 40 rpm まで直線的に増加させる必要があります。
- 動物のスコアを登録します。マウスがそのバランスを維持できず、デバイスから落ちると、地面に落下してセンサーがトリガーされ、時間が記録されます。したがって、パフォーマンスは低下するレイテンシとしてスコアリングされます。
| 等級 | 臨床徴候 | 形容 | |||
| 0 | 元気 | 臨床徴候は観察されません。動物は通常の口調と尾の動きを示します。つまずかずに歩きます。 | |||
| 0.5 | ゲートの障害 | グリルの上を歩いていると動物がつまずきます。 | |||
| 1 | リンプテール | 動物が尻尾の付け根で拾われると、尻尾が垂れ下がります(たるんだ尾)。 | |||
| 1.5 | リンプテールとゲート障害 | 動物はたるんだ尻尾を示し、グリルの上を歩いているときにつまずきます。 | |||
| 2 | 失調 | この動物は、一度仰向けになると立ち上がるのが困難になります。 | |||
| 2.5 | 運動失調と後肢麻痺 | 動物のディスプレイは、仰向けになると立ち上がれなくなり、後肢の1つのトーンが失われます。 | |||
| 3 | 後肢の麻痺 | 動物は両方の後肢の緊張を失います。 | |||
| 3.5 | 後肢の麻痺および/または前肢の麻痺 | 動物は両方の後肢と前肢の一部の色調を失います。実際、前肢の握力が低下していることを示しています。 | |||
| 4 | 四肢麻痺 | 動物は手足の調子を完全に失います。 | |||
| 4.5 | 四肢麻痺と体温の低下 | 動物は手足の調子を完全に失い、体温の低下を示します(寒いです)。 | |||
| 5 | 死ぬか死ぬか | 動物は死にかけている(刺激に反応しない)か、死んでいる。 | |||
表2: EAEの進行を評価するために使用される臨床スコアリングシステム。
4. EAE誘発性病理組織学的徴候の脊髄レベルでの評価
注:ここでは、動物を犠牲にし、脊髄を採取して病理組織学的分析を行う手順を簡単に報告します。詳細な説明については、参考文献10、26、28、29 を参照してください。
- 固定と組織サンプリング
メモ: 詳細については、参考資料10、26 を参照してください。- 病気の慢性期に28dpiで動物を犠牲にします。
- 深い不可逆麻酔(ゾラゼパムとチレタミン80 mg / kg / Xylazine 10 mg / kgの腹腔内注射)によってマウスを麻酔します。.
- マウスに生理食塩水とそれに続く4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液で経心灌流します。
注:PFAを使用する際は注意してください:PFAは有毒であるため、適切な個人用保護具を使用して、吸入、摂取、皮膚や目との接触を避けてください。粉末を秤量し、溶液を調製し、ボンネットの下で灌流を実行します。
- 脊柱30から脊髄を取り外します。
- 脊髄を4%PFA溶液に24時間保存します。
- 0.01 M生理食塩水リン酸緩衝液(PBS)で数回洗浄します。
- 脊髄をパラフィンブロック30に埋め込む。
- 病気の慢性期に28dpiで動物を犠牲にします。
- 組織学的処置
注: 詳細な説明については、Montarolo et al.10 を参照してください。- ミクロトームを使用して厚さ10μmの脊髄横断切片を切断し、ゼラチンでコーティングされたスライドに収集します。マウス脊髄アトラス31の横断面に対応する図面に一致するように切片面を向ける。
- セクション32の脱パラフィン処理を行う。
- 切片をヘマトキシリンとエオシン32で染色します。
- セクション32を脱水します。
- 切片を封入剤で覆い、薬品フードの下で室温で乾燥させます。
注:ヘマトキシリン-エオシン染色により、血管周囲炎症性浸潤(PvII)26の存在を検出することができ、これは疾患の徴候として評価されます28。
- 脊髄切片の定量分析
- 20倍対物レンズ29のデジタルカメラに接続された光学顕微鏡で染色切片の画像を取得します。
- 取得した画像を解析して、mm2あたりの浸潤数として表されるPvIIの数を取得します。
注:取得した画像の解析には、画像解析ソフトウェアを利用すると便利です。この研究で提示された神経病理学的所見は、脊髄レベル全体を表すマウスあたりの脊髄の10の完全な断面(n = 8 /グループ)で定量化されています。
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Representative Results
予防接種後のEAEフォローアップ
これは、以下のように評価されました。
体重と食物摂取量
二元配置分散分析(ANOVA)(独立変数としての性別と時間)は、特に導入後2週間以内に、雌雄のEAE動物のBWの減少を示しています(F(1,57) = 4.952、 p < 0.001; 図2A)。しかし、BWの性的二型は常に維持されています(図2A)。BWのパーセンテージ(F(1,57) = 23.935、 p <0.001; 図2B)、男女ともに、最初のBWと比較して、12dpiから17dpiの間で大きな損失(p < 0.001)を示しますが、20%の総損失を超えることはありません(図2B)。したがって、BW損失は疾患の発症前に始まりますが、EAEの急性期に最大に達します(図2A、B)。BWの損失に関しては、男女間に違いはありません。しかし、女性は慢性期(導入後3〜4週目)に早期に体重を減らし、回復が少なくなる傾向があります(図2B)。
さらに、二元配置分散分析(独立変数としての性別と時間)もFIの有意な減少を示しています(F(9, 39) = 6.682, p < 0.001; 図2C)雌雄ともに、特に予防接種後2週目には、EAEの重症度が高まった結果、動物がケージの上部容器に入れられた餌にアクセスすることがより困難になりました。私たちが提案したように、その後、動物へのさらなるストレスを軽減するために、餌はケージの床に置かれました。これにより、FIは初期レベルに戻り(図2C)、BWは部分的に回復しました(図2A、B)。
女性の発情周期評価
発情期の異なる段階に費やされた時間の比較は、スチューデントの t検定を使用して行われました。この分析では、無症候期(EAEの発症前)と症候期(EAEの発症後)の間で、非発情期(すなわち、発情期および発情期)で費やされた時間と比較して、非発情期(すなわち、発情前および発情期)で費やされた時間の違いが示されています(p = 0.042; 図2D)、主に症候期に発情期で過ごす時間の増加(p = 0.017)と発情前期で過ごす時間の短縮傾向(p = 0.08)によるものです。
誘導手順は、女性の発情周期の変化をもたらし、特に発情前期に影響を与えることはすでに説明した25。この段階では、エストロゲンのレベルが上昇すると、抗炎症作用と神経保護作用を発揮することが知られており16 、したがって、発症前の段階でこれらのホルモンの保護的役割を担っている可能性があります。しかし、エストロゲンのレベルが下がると、発症後の段階で見られるように、それらの保護効果も終了します。
臨床スコアとロータロッドのパフォーマンス
二元配置分散分析(独立変数としての性別と時間)は、男性と女性の両方の臨床スコア(CS)の時間の有意な増加を示しています(F(56-813) = 27.951、p < 0.001; 図3A)。特に、10 dpiから開始すると、男女ともにCSの有意な増加(p < 0.001)が示され、エンドポイント(28 dpi)まで維持されます(図3A)。雌は、有意ではないにしても(p = 0.156)、雄よりも高いCSを示します(図3A)。疾患の発症に関しては、一般的に10dpi前後で発生し、男性よりも女性の方が早期に発症する傾向があります(図3B)。さらに、女性は男性と比較して有意に高い累積CSを示します(p = 0.017; 図3C)。
ロータロッドのパフォーマンスコースは、臨床評価に似ています(図2D)。病気の発症から始めて、それは減少し、EAEの急性期では、予防接種後2週間で最低性能に達します。二元配置分散分析(独立変数としての性別と時間)は、男性と女性の両方のロータロッドパフォーマンスの時間の有意な減少を示しています(F(46-673) = 5.365、 p < 0.001; 図3D)。特に、男性は16dpi(p =0.022)、女性は17dpi(p< 0.001)で最低性能を発揮します。男性は女性よりも成績が良い傾向があり、特に疾患の慢性期(21〜28 dpi)では、おそらくCSが低いためであると考えられます(図3A、D)。
脊髄の病理組織学的評価
脊髄切片のPvIIの一元配置ANOVA(独立変数としての性別)は、男性と女性の明確な違いを強調しています(図4A)。女性は男性よりも有意に多くのPvIIを示します(F(1,14)= 63.107、 p < 0.001; 図4B)。これらのデータは、特にEAEの慢性期に、女性で観察されたより高い累積CS、より悪いロータロッドパフォーマンス、およびより攻撃的な疾患を反映している可能性があります。
これらのデータは、雌マウスが雄マウスと比較してより攻撃的なEAEの発症に対する感受性が高いという事実も反映しており14、これはこの疾患モデルとヒトに発生するMSとの主な違いの1つである。女性は男性よりも早期に疾患を発症し、原発性進行型の有病率が中等度に低く、全体的に障害の進行が少ないことを示しています2,33,34。
図1:実験手順の概略的な時間的表現。 BioRender.com で作成。略語:i.v. =静脈内;s.c. = 皮下;MOG35-55 = ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35-55;= dpi = 予防接種後日。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:雌雄マウスの体重、食物摂取量、雌マウスの発情周期に対するEAE効果の評価。 雌雄ともに、予防接種日(0dpi)から犠牲日(28dpi)まで、(A)1日体重、(B)体重割合、(C)1週間の摂餌量評価をグラフで示した。(D)雌マウスの無症候期(発症前、グラフの左列)または症候期(発症後、グラフの右列)に、膣細胞診塗抹標本によって評価された、発情周期のさまざまな段階で費やされた時間(平均時間の割合で表される)。データはSEM±平均値として表示されます。 統計解析により、 p≤0.05(#=男性対女性、*=異なる時点間の比較)に有意な効果が明らかになりました。略語:EAE =実験的自己免疫性脳脊髄炎;BW =体重;FI =食物摂取量;DPI = 予防接種後日。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:EAEに罹患した雌雄マウスにおける臨床スコアとロータロッドパフォーマンスの評価。 (A)雌雄の動物における毎日の臨床スコア(0〜28dpi)の評価(n = 15 /グループ)。(B)EAE罹患した雄(左列)および雌(右列)マウスの発症日(平均dpi)。(C)EAEに罹患した雄(左列)および雌(右列)マウスが到達した平均累積臨床スコア。(D) 雌雄の動物における 6 から 28 dpi までの毎日のロータロッド パフォーマンス (転倒潜伏として測定) の評価 (0 はテストの最初の 5 日以内に得られたベースライン値を表します)。データはSEM±平均値として表示されます。 統計解析により、 p≤0.05(#=男性対女性、*=異なる時点間の比較)に有意な効果が明らかになりました。略語:EAE =実験的自己免疫性脳脊髄炎;CS = 臨床スコア;ごっくんCS =累積臨床スコア;DPI = 予防接種後日。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:EAEに罹患した雌雄マウスの脊髄の炎症の解析。 (A)ヘマトキシリン-エオシンで染色した脊髄横切片の代表的な画像は、雄(上図)と雌(下図)のマウスにPvIIs(矢印)が存在することを強調しています。(B)雌雄のEAE罹患マウスの脊髄におけるPvIIの存在の測定(n = 8/グループ)。データはSEM±平均値として表示されます。 統計解析により、 p≤0.05(#=男性対女性)に有意な効果が明らかになりました。スケールバー = 200 μm (倍率 10 倍)。略語:EAE =実験的自己免疫性脳脊髄炎;* = 中央運河;PvII = 血管周囲炎症性浸潤。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々が記述したMOG35-55誘導EAEプロトコルは、C57BL/6Jマウス7,8,13において慢性型MSの発症につながりました。これらの代表的な結果では、免疫処置を受けた雌雄ともに慢性疾患を発症した(発症後に完全に回復せず、欠損を蓄積し、慢性期でCS1.5以上を維持する)ことを報告した。
多くの研究が、このモデル14で男性と女性の間に違いがないと報告しているとしても、両方の性別を考慮している研究はごくわずかです。しかし、MS2 で示される実質的な性的二型を考えると、2 つの性別の疾患転帰を研究することが第一の関連性を持つはずです。両性を含むより最近の研究のおかげで、いくつかの性的二型の存在もMOG35-55誘発EAE35で説明されています。我々は主に、雌では、MOG35-55誘発EAEは、雄で観察されたものよりも脊髄レベルでの炎症の増加を反映して、発症が早く、累積臨床スコアが高い傾向があるため、一般的に攻撃的であることに気づきました(このモデルでは雌マウスの感受性が高いことを考えると)36。1つの主要な結論は、このプロトコルが雄と雌の両方のマウスにEAEを誘発できるということですが、研究者は、病気のいくつかの側面が2つの性別で異なる可能性があることを覚えておく必要があります。したがって、対処すべき主な実験的問題を適切に検討し、最も好ましい動物モデルを選択し、一方または両方の性別を含める必要性を評価することが重要です。
重要な手順と可能なトラブルシューティング
多発性硬化症のさまざまなモデルが疾患の特定の側面を生成しますが、6つすべてを生成するわけではないため、最初の基本的なステップは、特定の実験ニーズと対処すべき科学的問題を考慮して正しいモデルを選択することです。第二に、予防接種手順は、正しく行われていることを確認し、不正確な手順によるエラーや変動性を回避するために、専門家が実行する必要があります。さらに、治験責任医師は、受入機関が採用している動物福祉規制を認識している必要があります。
第三に、エマルジョンは実験で標準化されるべきです。すべてのマウスは誘導に対する典型的な感受性を示すため、一部の動物はそれほど攻撃性の低い病気を発症するか、まったく発症しない可能性があることに注意する必要があります。その場合、疾患の発生率および重症度は、マウスに投与されるMOG35〜55の量を調整することによって最適化することができる。第4に、PT注射はマウスにおけるEAEの誘導を促進するために広く用いられているが35,36、すべてのプロトコルに必要というわけではない37,38。PTがない場合、マウスは通常、重症度が低く、より変動の大きい形態のEAE39を発症する。さらに、さらなる変動は、PT投与のさまざまな方法(例:.、静脈内と腹腔内)およびPTの効力がバッチ間で異なることが説明されているためです。.この問題を克服するには、使用する各バッチの効力に応じて容量を調整し、PT溶液を適切に調製することが重要です40,41。実験目標、研究者の技術的スキル、および動物研究の最適化を考慮すると、最適な誘導プロトコルを選択することが基本です。
第 5 に、より客観的な方法でデータを収集するために、疾患症状の盲検スコアリングを強くお勧めします。さらに、ロータロッド性能の評価など、疾患経過をより定量的かつ客観的に評価した臨床スコアリングを提案します。最後に、十分に多くの実験グループを正しく選択することは、信頼性が高く比較可能なデータを得るための基本です(プロトコルセクション2を参照)。サンプルサイズの計算は、予想される効果サイズに応じて、必要なグループサイズを取得するために実行する必要があります。
主な制限事項
第一に、この誘導プロトコルは、特にグループサイズが十分に大きくない場合、または手順が適切に実行されていない場合、免疫された動物で非常に変動する結果につながる可能性があります。次に、MOG35-55誘導EAEは、MSの他のすべての利用可能なモデルと同様に、いくつかの制限があります(すなわち、MSの進行、疾患におけるB細胞の役割、裏返しのメカニズム、または再髄鞘形成の研究の難しさに関する情報をほとんど提供しません)4,6。したがって、繰り返しになりますが、特定の科学的問題に対処するために必要なMSモデルを適切に選択することが基本です。最後に、損傷の主な部位は脊髄によって表され、病理学は尾頭蓋の方法で(すなわち、脊髄から脳まで)組織病理学的徴候の出現をもたらす。これは、人間で起こることの反対であり、モデルのかなりの限界を表している可能性があります。しかし、特定のターゲットを考慮して、脳内のいくつかの変化を評価することも可能です。
利点
第一に、このモデルは、末梢免疫介在メカニズムの理解と、中枢神経系における神経炎症および部分的な脱髄プロセスの評価に大きく貢献することができます。次に、このモデルをいくつかの特定のトランスジェニックマウス系統に適用して、特定の遺伝子変異に関連するMSの結果を研究することができます。
もう一つの利点は、臨床スコア評価とロータロッドテストの2つの方法に基づいて臨床評価を受けることです。これにより、疾患経過のより定量的で主観的ではなく、より正確な臨床評価が可能になります。さらに、van den Bergらが指摘したように、ロタロッドベースの評価は、脊髄の運動系における炎症性病変の表面積と強く相関している27。
前述したように、このモデルは多発性硬化症の性的二型を完全に再現するわけではありませんが、これは利点であると考えています。誘導と他の考えられる危険因子、特に環境因子との組み合わせは、そのような要因の特定の影響を理解し、MSのいくつかの性的二形的側面の発生におけるそれらの特定の役割を特定するのに役立ちます。最後に、このモデルは幅広い治療薬の開発と試験に広く使用されており、したがって、この疾患の新しい治療アプローチの開発に役立つ可能性があります4,6。
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Disclosures
著者のいずれも、この記事の研究、著者、および/または出版に関して宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 and 2023-2027 to Department of Neuroscience Rita Levi Montalciniの支援を受けています。Cavalieri-Ottolenghi財団、オルバッサーノ、イタリア。BBは、INFRA-P、ピエモンテ地域(n.378-35)(2022-2023)およびPRIN 2020-20203AMKTWのフェローでした。Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus(FORB)の支援に感謝します。掲載料は、2031年ローターアクト地区、特にトリノ北東ローターアクトクラブからの寄付によって支えられています。原稿の校正をしてくれたElaine Millerに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
| Digital camera connected to the optical microscope | NIKON DS-U1 digital camera | ||
| Electronic precision balance | Merck | Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
| Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml | Sacco System | L003465 | |
| Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
| Hematoxylin (Mayer’s) | Sigma-Aldrich | MHS32 | Filter before using it. |
| Image analysis Software | Fiji | ||
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C. |
| Isoflurane | Wellona Pharma | This drug is used as inhalational anaesthetic. | |
| Male and female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory, Envigo | Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. | |
| Microtome | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
| Mounting Medium | Merck | 107961 | |
| Mouse Rotarod | Ugo Basile | #47600 | |
| Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra | Difco Laboratories Inc. | 231141 | Store at +4 °C. |
| Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) | Espikem | EPK1 | Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. |
| Optical microscope | NIKON eclipse 90i | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. |
| Pertussis toxin (PT) | Duotech | PT.181 | Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution |
| Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) | B. Eurospital | A 032182038 | Store at +4 °C once opened. |
| Saline phosphate buffer (PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | |
| Software for image acquisition | NIS-Element AR 2.10 | ||
| Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
| Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
| Vet ointment for eyes | Lacrilube, Lacrigel Europhta | ||
| Xylazine | Rompun | This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. | |
| Zolazepam and Tiletamine | Zoletil 100 | This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic |
References
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神経科学、200号、MOG35-55誘発性実験的自己免疫性脳脊髄炎、慢性自己免疫性炎症性疾患、中枢神経系(CNS)、有病率、攻撃型、臨床的側面、放射線学的特徴、病理学的特徴、実験動物モデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)、雌雄C57BL / 6Jマウス、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35-55(MOG35-55)予防接種、慢性型疾患、毎日の臨床スコア、運動パフォーマンス、組織学的分析、脊髄Erratum
Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2024.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.
