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Neuroscience

Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65778
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,4
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

ERRATUM NOTICE

Summary

A encefalomielite autoimune experimental é um dos modelos murinos de esclerose múltipla mais utilizados. No protocolo atual, camundongos C57BL/6J de ambos os sexos são imunizados com peptídeo glicoproteico oligodendrócito de mielina, resultando principalmente em paresia ascendente da cauda e membros. Aqui discutimos o protocolo de indução e avaliação da EAE.

Abstract

A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica autoimune que afeta o sistema nervoso central (SNC). Caracteriza-se por diferentes prevalências entre os sexos, acometendo mais mulheres do que homens, e desfechos diferentes, mostrando formas mais agressivas em homens do que em mulheres. Além disso, a EM é altamente heterogênea em termos de aspectos clínicos, radiológicos e patológicos. Assim, faz-se necessário o aproveitamento de modelos experimentais animais que permitam a investigação do maior número possível de aspectos da patologia. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) representa um dos modelos de EM mais utilizados em camundongos, modelando diferentes características da doença, desde a ativação do sistema imune até danos ao SNC. Descrevemos aqui um protocolo para a indução de EAE em camundongos C57BL/6J machos e fêmeas usando imunização com o peptídeo glicoproteico 35-55 de oligodendrócitos de mielina (MOG35-55), que leva ao desenvolvimento de uma forma crônica da doença. Relatamos também a avaliação do escore clínico diário e do desempenho motor desses camundongos durante 28 dias pós-imunização (28 dpi). Finalmente, ilustramos algumas análises histológicas básicas em nível do SNC, enfocando a medula espinhal como o sítio primário de dano induzido pela doença.

Introduction

A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica autoimune que afeta o sistema nervoso central (SNC). Mostra a presença de infiltração perivascular de células inflamatórias, desmielinização, perda axonal e gliose1. Sua etiologia permanece desconhecida e seus aspectos clínicos, radiográficos e patológicos sugerem notável heterogeneidade nadoença2.

Devido à sua etiologia e complexidade desconhecidas, até o momento, nenhum modelo animal recapitula todas as características clínicas e radiológicas apresentadas na EM humana 3,4. No entanto, vários modelos animais são empregados para estudar diferentes aspectos da SM 3,4. Nesses modelos, o início da doença é tipicamente extremamente artificial, e o período de tempo do início dos sinais clínicos é diferente entre humanos e camundongos. Por exemplo, em humanos, os processos fisiopatológicos subjacentes à doença não são detectados por anos antes do início das manifestações clínicas. Por outro lado, os experimentadores podem detectar sintomas em modelos animais dentro de semanas ou até dias após a indução da SM4.

Três modelos animais básicos produzem as características da desmielinização características da EM: os induzidos por vírus (por exemplo, o vírus da encefalomielite murina de Theiler), os induzidos por agentes tóxicos (por exemplo, cuprizona, lisolecitina) e as diferentes variantes da encefalomielite autoimune experimental (EAE)5. Cada modelo ajuda a estudar algumas facetas específicas da doença, mas nenhuma replica todas as características da EM6. Assim, é fundamental a escolha do modelo correto considerando as necessidades experimentais específicas e as questões científicas a serem abordadas.

Graças aos procedimentos de imunização contra antígenos derivados da mielina, o EAE é induzido pelo desencadeamento de uma resposta autoimune aos componentes do SNC em camundongos suscetíveis. A interação entre uma ampla gama de mecanismos imunopatológicos e neuropatológicos causa o desenvolvimento das principais características patológicas da EM (isto é, inflamação, desmielinização, perda axonal e gliose) nos camundongos imunizados 7,8. Os camundongos começam a apresentar sintomas clínicos por volta da segunda semana após a imunização e geralmente apresentam paralisia ascendente da cauda para o membro e membro anterior. O escore clínico (isto é, a quantificação do acúmulo de déficits relacionados à doença) é geralmente avaliado por meio de uma escala de 5pontos7.

A imunização ativa com proteína ou peptídeo ou a transferência passiva de células T encefalitogênicas podem ser usadas para induzir EAE em camundongos com diferentes origens genéticas (por exemplo, SJL/J, C57BL/6 e camundongos não obesos-diabéticos (NOD). A proteína proteolipídica da mielina (PLP), a proteína básica da mielina (MBP) e a glicoproteína oligodendrócita da mielina (MOG) são exemplos de proteínas do auto-SNC a partir das quais os imunógenos são usualmente produzidos. Particularmente, camundongos SJL/J imunizados com o epítopo imunodominante de PLP (PLP139−151) desenvolvem um curso de doença remitente-recorrente (RR), enquanto camundongos C57BL/6J imunizados com o peptídeo MOG35-55 imunodominante apresentam EAE de natureza crônica1. Apesar de algumas limitações, como fornecer poucas informações sobre a progressão da SM, o papel das células B na doença, os mecanismos de dentro para fora ou dificuldades no estudo da remielinização, os modelos EAE têm contribuído enormemente para a compreensão dos processos autoimunes e neuroinflamatórios, aumentando o conhecimento no campo da EM e, assim, permitindo o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para essa doença4, 6º.

No presente trabalho, focamos em uma forma particular de EAE ativo, a forma induzida pelo peptídeo glicoproteico 35-55 (MOG35-55) 9,10,11,12. O EAE induzido pelo MOG35-55 modela uma forma crônica de EM. Após a imunização, os camundongos passam por uma fase assintomática na primeira semana após a imunização, então a doença geralmente surge durante a segunda semana após a imunização, enquanto entre a terceira e a quarta semanas após a imunização, a doença torna-se crônica, sem possibilidade de recuperação completa dos déficits acumulados 7,8,13. Curiosamente, não há diferenças entre homens e mulheres na incidência, início, curso ou progressão da doença na maioria dos estudos presentes naliteratura14, mesmo que menos estudos comparem a doença em homens e mulheres.

Em contraste, em humanos, esses parâmetros são conhecidos por serem fortemente dimórficossexualmente2. A SM afeta mais mulheres do que homens; no entanto, os homens geralmente desenvolvem uma forma mais agressiva da doença2. Essas evidências sugerem um papel essencial, bem como complexo, dos hormônios gonadais15; No entanto, o papel e o mecanismo de ação dos hormônios sexuais na patologia permanecem obscuros. Além disso, dados de modelos animais apoiam a ideia de que tanto estrógenos quanto andrógenos exercem efeitos positivos em diferentes tratos da patologia de forma específica por sexo16,17.

Alguns estudos também sugerem efeitos neuroprotetores, promielinizantes e anti-inflamatórios da progesterona18 e, embora as evidências em pacientes com EM sejam escassas18, esteroides neuroativos (ou seja, esteroides sintetizados de novo pelo sistema nervoso, como pregnenolona, tetrahidroprogesterona e diidroprogesterona) também podem afetar o curso patológico19. Coletivamente, esses dados apoiam a ideia de que os hormônios sexuais produzidos tanto perifericamente quanto dentro do SNC têm um papel importante e específico do sexo no início e progressão da doença. Portanto, no presente trabalho, pedimos a coleta de dados separados de animais machos e fêmeas.

Do ponto de vista histopatológico, a substância branca da medula espinhal é o principal sítio de lesão do SNC nesse modelo, que se caracteriza por regiões multifocais e confluentes de infiltrado inflamatório mononuclear e desmielinização8. Assim, ao descrever este protocolo para a indução de EAE induzida por MOG35-55 em camundongos C57BL/6J, levaremos em consideração o desfecho da doença nos dois sexos e forneceremos alguns insights histopatológicos em relação à medula espinhal.

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Protocol

Os cuidados e manejo dos animais no presente trabalho foram realizados de acordo com a Diretiva do Conselho da União Europeia de 22de setembro de 2010 (2010/63/UE); todos os procedimentos relatados no presente estudo foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano (407/2018-PR) e pelo Comitê de Ética da Universidade de Torino (Projeto n° 360384). Sugerimos adequar o desenho experimental às diretrizes ARRIVE originalmente publicadas por Kilkenny et al., em 201020. Antes de começar, certifique-se de que os materiais necessários estão disponíveis (consulte a Tabela de Materiais). Esterilizar todos os utensílios e vidrarias utilizados para a preparação da emulsão MOG35-55 em autoclave. Um resumo dos procedimentos experimentais está representado na Figura 1.

1. Preparação da emulsão MOG35-55

NOTA: Para preparar a emulsão, MOG35-55, adjuvante de Freud incompleto (RIFI), cepa H37Ra (MT) de Mycobacterium tuberculosis e solução fisiológica são necessários (ver Tabela de Materiais).

CUIDADO: MT morto pelo calor pode estimular a resposta imune inata. Evite inalação, ingestão e contato com a pele e os olhos usando equipamentos de proteção individual adequados e pesando MT em uma balança de precisão coberta sob o capô.

Solução Composição Anotações
2 mg/mL MOG35-55 solução peptídica Peptídeo MOG35-55 liofilizado diluído em solução fisiológica na concentração de 2 mg/mL Conservar a solução já diluída a -80 °C.
5 μg/mL de solução de TP TP liofilizado diluído em solução fisiológica na concentração de 5 μg/mL. Conservar a solução já diluída a -80 °C.
Emulsão O volume total de emulsão necessário para cada camundongo a ser imunizado é de 300 μL dividido da seguinte forma: Para evitar alterações ou contaminação, prepare a emulsão no dia da imunização.
200 μg/camundongo de MOG35-55 , ou seja, 100 μL de MOG35-55 2 mg/mL de solução.
50 μL de solução fisiológica
150 μL de IFA
4 mg/mL MT, ou seja, 1,2 mg/camundongo
Solução fisiológica Cloreto de sódio a 0,9% diluído em água destilada.

Tabela 1: Composição das soluções utilizadas para o procedimento de imunização.

  1. Prepare a solução em um copo de vidro, adicionando primeiro o componente líquido e, finalmente, o MT.
    OBS: O volume total de emulsão necessário para cada camundongo a ser imunizado é de 300 μL, dividido conforme indicado na Tabela 1. A emulsão é muito viscosa e espessa, portanto, durante o procedimento de preparação e injeção, pode haver alguma perda, especialmente ao preparar a solução para alguns camundongos. Sugerimos calcular o volume final de emulsão necessário superestimando o número de camundongos a serem imunizados em pelo menos 1,5-2 vezes.
  2. Coloque o copo no gelo e utilize a seringa de vidro com uma agulha de 18 G para começar a emulsionar a solução.
    NOTA: A emulsão também pode ser preparada usando outras estratégias, por exemplo, conectando as duas seringas de vidro air-free com uma torneira de três vias e misturando a solução empurrando os êmbolos para frente e para trás21,22.
  3. Emulsionar a solução durante, pelo menos, 15 min; Geralmente, 30 min de emulsificação são suficientes. Para verificar a qualidade da emulsão, adicione uma gota de emulsão em um recipiente transparente cheio de água: se a gota mantiver sua estrutura e permanecer intacta, a emulsão está pronta.
  4. Coloque a emulsão diretamente dentro das seringas de 1 mL que serão utilizadas para a imunização e guarde-as a +4 °C até o uso para preservar a espessura da emulsão e evitar alterações ou contaminações.

2. Seleção e imunização dos animais

  1. Seleção de animais
    1. Selecione camundongos adultos C57BL/6J de ambos os sexos com 8-10 semanas de idade com um peso corporal ideal de ~20 g. Certifique-se de selecionar camundongos pareados por idade e sexo para diferentes grupos experimentais, pois a suscetibilidade à doença pode variar com a idade e o sexo.
      NOTA: Os ratos devem ter um peso corporal comparável no dia da imunização, porque o presente procedimento é otimizado para uma determinada faixa de peso corporal (17-25 g).
    2. Abrigar animais do mesmo sexo em grupos (n = 4-5/gaiola) para evitar o isolamento social em condições padrão em gaiolas de camundongos de polipropileno de 45 cm x 25 cm x 15 cm a 22 ± 2 °C, sob ciclo claro/escuro de 12:12 (luzes acesas às 08:00 AM). Fornecer comida e água ad libitum.
      NOTA: Eventualmente, para limitar ainda mais a variabilidade potencial do curso da doença nos animais imunizados, também sugerimos a formação de grupos experimentais suficientemente numerosos. Há também estudos 8,23 que descrevem o momento da imunização como uma condição que determina a variação no desfecho EAE. Assim, sugere-se realizar a imunização aproximadamente na mesma hora em todos os animais, preferencialmente durante as horas claras do ciclo claro/escuro diário23. Para limitar o estresse, é preferível manipular os animais antes do dia da imunização e marcá-los para identificá-los facilmente para avaliação diária, por exemplo, corte de orelha ou etiqueta.
  2. O procedimento de imunização
    NOTA: Certifique-se de que o procedimento seja realizado por um investigador experiente para minimizar o estresse dos animais e otimizar a imunização. Antes de iniciar a imunização, selecione o método anestésico de acordo com as diretrizes institucionais do comitê de ética e cuidados com os animais. Nosso laboratório utiliza anestesia breve com isoflurano.
    1. Anestesiar o camundongo: isoflurano a 4% para indução anestésica e isoflurano a 1,5-2% para manutenção da anestesia. Aguarde a eficácia da anestesia e use uma pinça dos dedos dos pés de trás e da frente para avaliar o nível de anestesia. Para evitar o ressecamento dos olhos enquanto o rato está sob anestesia, use uma pomada ocular aprovada por veterinário.
    2. Injeção intravenosa de TP na veia caudal lateral: tampar a cauda do camundongo suavemente com uma solução de etanol, que atua como vasodilatador, para exibir as veias. Focalizar uma das duas veias laterais da cauda e, usando uma seringa de 0,5 mL equipada com uma agulha de 30 G, injetar 500 ng de TP (ou seja, 100 μL de TP diluídos em solução fisiológica na concentração de 5 μg/mL).
    3. Injeção subcutânea de emulsão MOG35-55 : utilizando a seringa de 1 mL com agulha de 26 G, realizar três injeções subcutâneas da emulsão previamente preparada: duas sob a parte rostral dos flancos e uma na base da cauda. O volume de emulsão injetado em cada local é de 100 μL, para um volume total de 300 μL de emulsão injetado em cada camundongo.
      OBS: O dia da imunização é registrado como dia 0 pós-imunização (dpi); 48 h depois (ou seja, a 2 dpi), é necessária a realização de nova injeção intravenosa de TP igual à realizada anteriormente. É possível realizar a injeção sem anestesia, usando um filtro de mouse. O procedimento aqui descrito visa induzir e manter a anestesia dos camundongos durante o procedimento de imunização para evitar possíveis desconfortos e movimentos dos animais ou riscos tanto para camundongos quanto para os pesquisadores. Assim, não há procedimentos cirúrgicos. No entanto, para otimizar os processos experimentais, é importante manter condições estéreis adequadas durante essas etapas e monitorar a condição do camundongo após esses procedimentos.
    4. Para verificar se o rato se recuperou das injeções, coloque-o em uma gaiola limpa após os procedimentos e aguarde até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Depois que o rato estiver totalmente recuperado, devolva-o à gaiola de casa com outros animais.

3. Acompanhamento do EAE

  1. Peso corporal e ingestão alimentar
    1. Monitorar diariamente o peso corporal (PC) dos animais, utilizando balança eletrônica de precisão, pois a diminuição do PN é um indicador da progressão da doença.
      OBS: Essa diminuição não deve ultrapassar um determinado percentual, de acordo com as diretrizes institucionais e do comitê de ética para cuidados com os animais. Normalmente, se um animal perde mais de 20% do peso corporal inicial (ou seja, o peso registrado em 0 dpi), ele deve ser sacrificado como a aplicação do desfecho humano. Os métodos de eutanásia envolvem anestesia profunda irreversível para inalação (por exemplo, isoflurano a 5%) seguida de decapitação.
    2. Monitorar a ingestão alimentar (IA) - o alimento ingerido por um animal em um dia (g∙dia-1∙animal-1), pesando a quantidade de alimento no recipiente específico pelo menos uma vez por semana e dividindo a quantidade de alimento ingerido para os dias passados entre duas medidas sequenciais e o número de animais presentes na gaiola.
      OBS: Esta medida permite estimar a média de consumo alimentar. Devido ao aparecimento e acúmulo de sinais clínicos da doença, que envolvem a paralisia dos membros, sugerimos colocar algum alimento regado no chão da gaiola quando os animais não forem capazes de ficar firmes em seus membros posteriores e alcançar o recipiente de comida ou a garrafa de água. Para avaliar a ingestão alimentar ao longo do período de acompanhamento da forma mais precisa possível, também medimos o peso seco desse alimento antes de molhá-lo para os camundongos.
  2. Avaliação da ciclicidade estral durante EAE
    1. Verificar o ciclo estral por pelo menos dois ciclos, avaliando os esfregaços citológicos vaginais conforme descrito por McLean et al.24. Classificar a fase do ciclo estral com base na presença de três tipos celulares primários - células epiteliais nucleadas, células epiteliais escamosas cornificadas e leucócitos - nas amostras de esfregaço vaginal, da seguinte forma:
      1. Classificar como proestro com base na presença quase exclusiva de aglomerados de células epiteliais nucleadas arredondadas e bem formadas.
      2. Classificar como estro com base na presença predominante de aglomerados densamente compactados de células epiteliais escamosas cornificadas.
      3. Classificar como metestro com base na presença predominante de pequenos leucócitos escuros e na menor presença de células epiteliais escamosas cornificadas.
      4. Classificar como diestro com base na presença altamente predominante de pequenos leucócitos corados escuramente e raras células epiteliais escamosas cornificadas, juntamente com o possível aparecimento de células epiteliais nucleadas.
        OBS: Ao avaliar a doença em ambos os sexos, é importante verificar a variabilidade no sexo feminino devido ao ciclo estral. Sugere-se focar na avaliação do ciclo estral, especialmente entre a primeira e a segunda semana pós-imunização (ou seja, durante a fase aguda das EAE). Já foi demonstrado anteriormente que o procedimento de imunização provoca as alterações mais pronunciadas do ciclo estral dentro dessa fase25. Além disso, é importante considerar que a realização do esfregaço quando o animal atinge um escore clínico alto (principalmente >3) é difícil devido à paresia posterior e à falta de tônus nos membros pélvicos.
  3. Escore clínico
    1. Peça a um investigador cego que avalie diariamente o escore clínico dos animais. Atribua a cada animal uma pontuação de 0 a 5 (ver Tabela 2) para avaliar o curso da doença26 , conforme descrito por Racke7.
      OBS: Semelhante à diminuição do peso corporal, um desfecho humanizado também é necessário para o aumento dos escores clínicos, de acordo com as diretrizes do comitê de ética institucional para cuidados com os animais. Geralmente, se um animal não é mais capaz de se alimentar de forma autônoma (isso geralmente ocorre quando um animal atinge pelo menos a pontuação de 4, de acordo com a escala que usamos), ele deve ser sacrificado como a aplicação do endpoint humano.
  4. Avaliação do desempenho motor pelo teste rotarod
    NOTA: A avaliação da progressão do EAE é geralmente realizada atribuindo-se o escore clínico diariamente, o que é feito por um investigador cego totalmente treinado. No entanto, poderia ser útil ladeá-la com uma avaliação mais quantitativa e objetiva da progressão da doença. Em estudo prévio26, o teste rotarod foi utilizado para medir o desempenho motor dos animais imunizados. Como descrito por van den Berg et al.27, para uma avaliação clínica mais quantitativa e precisa do curso da doença, a avaliação do desempenho motor pelo teste rotarod pode subsidiar a avaliação do escore clínico. Para uma descrição detalhada, ver van den Berg et al.27.
    1. Deixe os ratos serem submetidos a sessões de rotarod diariamente, a partir de 1 dpi até o sacrifício (ou seja, 28 dpi). Cada sessão consiste em uma única sessão de 300 s, durante a qual a velocidade da haste deve ser aumentada linearmente de 4 a 40 rpm.
    2. Registre a pontuação do animal. Quando o mouse não é capaz de manter seu equilíbrio e cai do dispositivo, ele cai no chão e aciona um sensor, e o(s) tempo(s) é registrado(s). Assim, o desempenho é pontuado como latência para queda(s).

Grau Sinal clínico Descrição
0 Saudável Nenhum sinal clínico observado. O animal apresenta um tom normal e movimentação da cauda. Anda sem tropeçar.
0.5 Portão prejudicado O animal tropeça enquanto caminha em uma churrasqueira.
1 Cauda manca Quando o animal é apanhado pela base da cauda, a cauda cai (cauda flácida).
1.5 Cauda manca e portão prejudicado O animal mostra uma cauda flácida, e tropeça enquanto caminha em uma churrasqueira.
2 Ataxia O animal apresenta dificuldades em levantar-se depois de ter sido virado de costas.
2.5 Ataxia e paresia de membro posterior O animal não consegue se levantar depois de ter sido virado de costas, e perde o tom de um de seus membros posteriores.
3 Paralisia dos membros posteriores O animal perde o tônus de ambos os membros posteriores.
3.5 Paralisia de membros pélvicos e/ou paresia de membro torácico O animal perde o tônus de ambos os membros pélvicos e parcialmente dos membros torácicos. Na verdade, mostra uma perda de força na preensão dos membros anteriores.
4 Tetraparesia O animal perde completamente o tônus de seus membros.
4.5 Tetraparesia e diminuição da temperatura corporal O animal perde completamente o tônus de seus membros, e apresenta uma diminuição da temperatura corporal (está frio).
5 Morrer ou morrer O animal está morrendo (não responde a nenhum estímulo) ou morto.

Tabela 2: Sistema de escore clínico utilizado para avaliar a progressão do EAE.

4. Avaliação dos sinais histopatológicos induzidos por EAE ao nível da medula espinhal

OBS: Relatamos brevemente o procedimento de sacrifício dos animais e coleta medular para análise histopatológica; Para uma descrição detalhada, ver estas referências 10,26,28,29.

  1. Fixação e amostragem de tecidos
    NOTA: Para obter uma descrição detalhada, consulte estas referências10,26.
    1. Sacrificar os animais a 28 dpi durante a fase crônica da doença.
      1. Anestesiar os camundongos por anestesia profunda irreversível (injeção intraperitoneal de Zolazepam e Tiletamina 80 mg/kg / Xilazina 10 mg/kg).
      2. Perfundir os camundongos por via transcárdica com solução salina seguida de solução de paraformaldeído (PFA) a 4%.
        OBS: Preste atenção ao usar o PFA: por ser tóxico, evite inalação, ingestão e contato com a pele e os olhos utilizando equipamentos de proteção individual adequados. Pesar o pó, preparar a solução e realizar a perfusão sob o capô.
    2. Remover a medula espinhal da coluna vertebral30.
    3. Armazenar a medula espinhal em uma solução de PFA a 4% por 24 horas.
    4. Realizar várias lavagens em tampão fosfato salino (PBS) 0,01 M.
    5. Embutir a medula espinhal em blocos de parafina30.
  2. Procedimentos histológicos
    NOTA: Para uma descrição detalhada, ver Montarolo et al.10.
    1. Use um micrótomo para cortar cortes transversais da medula espinhal de 10 μm de espessura e coletá-los em lâminas revestidas de gelatina. Orientar o plano de secção para corresponder aos desenhos correspondentes às secções transversais do atlas da medula espinhal do rato31.
    2. Realizar a desparafinização dos cortes32.
    3. Coloração do corte com Hematoxilina e Eosina32.
    4. Desidratar as secções32.
    5. Cubra as seções com um meio de montagem e deixe-as secar à temperatura ambiente sob uma coifa química.
      NOTA: A coloração pela hematoxilina-eosina permite detectar a presença de infiltrados inflamatórios perivasculares (PvIIs)26, o que é avaliado como sinal dadoença28.
  3. Análise quantitativa dos cortes medulares
    1. Adquirir imagens dos cortes corados com microscópio óptico conectado a uma câmera digital com objetiva 20x29.
    2. Analise a imagem adquirida para obter o número de PvIIs, expresso como o número de infiltrados por mm2.
      NOTA: Para a análise das imagens adquiridas, é útil tirar proveito de um software de análise de imagens. Os achados neuropatológicos apresentados neste trabalho são quantificados em 10 cortes transversais completos da medula espinhal por camundongo (n = 8/grupo) representativos de todos os níveis medulares.

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Representative Results

Acompanhamento das EAE após a imunização
Isso foi avaliado conforme descrito a seguir.

Peso corporal e ingestão alimentar
A análise de variância (ANOVA) two-way (sexo e tempo como variáveis independentes) mostra uma diminuição no PN dos animais EAE de ambos os sexos, especialmente na segunda semana pós-indução (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figura 2A). No entanto, o dimorfismo sexual no PN é sempre mantido (Figura 2A). Quanto ao percentual de PN (F(1,57) = 23,935, p < 0,001; Figura 2B), tanto homens quanto mulheres apresentam uma enorme perda entre os 12 dpi e os 17 dpi (p < 0,001) em relação ao PC inicial, mas nunca excedem uma perda total de 20% (Figura 2B). Assim, embora a perda de PN se inicie antes do início da doença, ela atinge seu máximo durante a fase aguda do EAE (Figura 2A,B). Não há diferenças entre os sexos quanto à perda de PN. No entanto, as fêmeas tendem a perder mais peso mais precocemente e se recuperar menos durante a fase crônica (terceira e quarta semana pós-indução) (Figura 2B).

Além disso, a ANOVA two-way (sexo e tempo como variáveis independentes) também mostra uma diminuição significativa na IA (F(9, 39) = 6,682, p < 0,001; Figura 2C) em ambos os sexos, particularmente durante a segunda semana pós-imunização, como resultado do aumento da gravidade do EAE, o que tornou mais difícil para o animal acessar o alimento colocado no recipiente superior da gaiola. Como sugerimos, o alimento foi posteriormente colocado no chão da gaiola para reduzir o estresse adicional sobre os animais. Isso permitiu que o FI retornasse aos níveis iniciais (Figura 2C) e o PN se recuperasse parcialmente (Figura 2A,B).

Avaliação do ciclo estral em fêmeas
A comparação entre o tempo despendido nas diferentes fases do estro foi realizada por meio do teste t de Student. A análise mostra diferenças no tempo gasto nas fases estrais (i.e., proestro e estro) em comparação com o gasto na fase não estral (i.e., metestro e diestro) entre a fase assintomática (antes do início das EAE) e a fase sintomática (após o início das EAE) (p = 0,042; Figura 2D), principalmente devido ao aumento do tempo gasto em diestro durante as fases sintomáticas (p = 0,017) e uma tendência de redução do tempo gasto em proestro (p = 0,08).

Já foi descrito que o procedimento de indução leva a uma alteração do ciclo estral em fêmeas, afetando particularmente o proestro25. Durante essa fase, sabe-se que níveis crescentes de estrógenos exercem efeitos anti-inflamatórios e neuroprotetores16 e, portanto, são possivelmente responsáveis pelo papel protetor desses hormônios durante a fase pré-sintomática. No entanto, quando o nível de estrogênios cai, como vemos na fase pós-início, seus efeitos protetores também terminam.

Escore clínico e desempenho do rotarod
A ANOVA two-way (sexo e tempo como variáveis independentes) mostra um aumento significativo no tempo no escore clínico (EC) de ambos os sexos (F(56-813) = 27,951, p < 0,001; Figura 3A). Em particular, a partir de 10 dpi, ambos os sexos apresentam um aumento significativo no CS (p < 0,001), que se mantém até o desfecho (28 dpi) (Figura 3A). O sexo feminino apresenta, mesmo que não significativamente (p = 0,156), maior CS que o masculino (Figura 3A). Em relação ao início da doença, ocorre geralmente em torno de 10 dpi, com tendência de início mais precoce no sexo feminino do que no masculino (Figura 3B). Além disso, as mulheres apresentam um aumento significativo da capacidade cumulativa de CS em relação aos homens (p = 0,017; Figura 3C).

O curso de desempenho do rotarod assemelha-se às avaliações clínicas (Figura 2D). A partir do início da doença, ela diminui, atingindo o desempenho mínimo durante a segunda semana pós-imunização, na fase aguda do EAE. A ANOVA two-way (sexo e tempo como variáveis independentes) mostra uma diminuição significativa no tempo no desempenho do rotarod de machos e fêmeas (F(46-673) = 5,365, p < 0,001; Figura 3D). Particularmente, os machos apresentam desempenho mínimo de 16 dpi (p = 0,022), enquanto as fêmeas de 17 dpi (p < 0,001). Os homens tendem a apresentar melhor desempenho do que as mulheres, especialmente durante a fase crônica da doença (21-28 dpi), possivelmente como consequência da menor SC (Figura 3A,D).

Avaliação histopatológica da medula espinhal
A ANOVA one-way (sexo como variável independente) dos PvIIs nos cortes medulares destaca uma clara diferença entre homens e mulheres (Figura 4A). As mulheres apresentam um número significativamente maior de PvII do que os machos (F(1,14)= 63,107, p < 0,001; Figura 4B). Esses dados possivelmente refletem o maior SC cumulativo, o pior desempenho do rotarod e a doença mais agressiva observada nas fêmeas, especialmente durante a fase crônica do EAE.

Esses dados também refletem o fato de que camundongos fêmeas apresentam maior suscetibilidade ao desenvolvimento de EAE mais agressivos em comparação aos machos14, o que é uma das principais diferenças entre esse modelo de doença e a SM que ocorre em humanos. As mulheres apresentam início mais precoce da doença, têm prevalência moderadamente menor de formas primárias progressivas e, em geral, apresentam menor progressão da incapacidade do que os homens 2,33,34.

Figure 1
Figura 1: Representação temporal esquemática dos procedimentos experimentais. Criado com BioRender.com. Abreviaturas: i.v. = intravenosa; s.c. = subcutâneo; MOG35-55 = peptídeo glicoproteico oligodendrócito de mielina 35-55; = dpi = dia pós-imunização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Avaliação dos efeitos das EAE sobre o peso corporal, ingestão alimentar em camundongos machos e fêmeas e ciclo estral em camundongos fêmeas. Desde o dia da imunização (0 dpi) até o dia do sacrifício (28 dpi), os gráficos mostram (A) peso corporal diário, (B) percentual de peso corporal e (C) avaliação da ingestão alimentar semanal nos animais de ambos os sexos (n = 15/grupo). (D) Tempo gasto (expresso em porcentagem média de tempo) nas diferentes fases do ciclo estral, avaliado por esfregaço citológico vaginal, durante a fase assintomática (pré-início, coluna esquerda do gráfico) ou sintomática (pós-início, coluna direita do gráfico) em camundongos fêmeas. Os dados são apresentados como média ± EPM. A análise estatística revelou efeito significativo para p≤ 0,05 (# = homens vs. mulheres; * = comparação entre diferentes momentos). Abreviações: EAE = encefalomielite autoimune experimental; PN = peso corporal; IA = consumo alimentar; dpi = dia pós-imunização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Avaliação do escore clínico e desempenho do rotarod em camundongos machos e fêmeas afetados pelo EAE. (A) Avaliação do escore clínico diário (de 0 a 28 dpi) nos animais de ambos os sexos (n = 15/grupo). (B) Dia de início da doença (dpi médio) em camundongos machos (coluna esquerda) e fêmeas (coluna direita) afetados pelo EAE. (C) Escore clínico cumulativo médio atingido por camundongos machos (coluna esquerda) e fêmeas (coluna direita) afetados por EAE. (D) Avaliação do desempenho diário do rotarod (medido como latência de queda) de 6 a 28 dpi (o 0 representa os valores basais obtidos nos primeiros 5 dias do teste) nos animais de ambos os sexos. Os dados são apresentados como média ± EPM. A análise estatística revelou efeito significativo para p≤ 0,05 (# = homens vs. mulheres; * = comparação entre diferentes momentos). Abreviações: EAE = encefalomielite autoimune experimental; EC = escore clínico; Cum CS = escore clínico cumulativo; dpi = dia pós-imunização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise da inflamação na medula espinhal de camundongos afetados por EAE de ambos os sexos. (A) Imagens representativas de cortes transversais da medula corados com Hematoxilina-Eosina destacam a presença de PvIIs (setas) em camundongos machos (imagem superior) e fêmeas (imagem inferior). (B) Medida da presença de PvIIs na medula espinhal de camundongos afetados por EAE de ambos os sexos (n = 8/grupo). Os dados são apresentados como média ± EPM. A análise estatística revelou um efeito significativo para p ≤ 0,05 (# = homens vs. mulheres). Barra de escala = 200 μm (aumento de 10x). Abreviações: EAE = encefalomielite autoimune experimental; * = canal central; PvIIs = infiltrados inflamatórios perivasculares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo de EAE induzido por MOG35-55 que descrevemos levou ao desenvolvimento de uma forma crônica de EM em camundongos C57BL/6J7,8,13. Nesses resultados representativos, relatamos que os animais de ambos os sexos submetidos ao procedimento de imunização desenvolveram uma forma crônica da doença (ou seja, não se recuperam totalmente após o início da doença, acumulam déficits e mantêm um EC de pelo menos 1,5 na fase crônica).

Mesmo que muitos estudos não relatem diferenças entre homens e mulheres nessemodelo14, poucos estudos consideram ambos os sexos. No entanto, dados os substanciais dimorfismos sexuais exibidos na EM2, deve ser de relevância primária estudar o desfecho da doença nos dois sexos. Graças a estudos mais recentes que incluem ambos os sexos, a presença de algum dimorfismo sexual também tem sido descrita no EAE35-55-induzido pelo MOG35. Observamos principalmente que, em fêmeas, o EAE induzido por MOG35-55 é geralmente mais agressivo (dada a maior suscetibilidade de camundongos fêmeas com esse modelo)36, pois tendem a ter início mais precoce e escores clínicos cumulativos mais altos, o que reflete inflamação aumentada ao nível da medula espinhal do que a observada em machos. Uma conclusão importante é que esse protocolo pode induzir EAE em camundongos machos e fêmeas, mas os pesquisadores devem lembrar que alguns aspectos da doença podem diferir entre os dois sexos. Assim, é fundamental considerar adequadamente a principal questão experimental a ser abordada, escolher o modelo animal mais favorável e avaliar a necessidade de incluir um ou ambos os sexos.

Etapas críticas e possível solução de problemas
Como diferentes modelos de EM produzem alguns aspectos específicos da doença, mas não todos6, o primeiro passo fundamental é escolher o modelo correto, considerando as necessidades experimentais específicas e as questões científicas a serem abordadas. Em segundo lugar, o procedimento de imunização deve ser realizado por um especialista para garantir que seja feito corretamente e evitar erros ou variabilidade devido a procedimentos imprecisos. Além disso, o investigador deve estar ciente das normas de bem-estar animal adotadas pela instituição de acolhimento.

Terceiro, a emulsão deve ser padronizada no experimento. Deve-se notar que todos os camundongos apresentam uma suscetibilidade típica à indução e, portanto, alguns animais podem desenvolver uma doença menos agressiva ou não desenvolvê-la. Nesse caso, a incidência e a gravidade da doença podem ser otimizadas ajustando a quantidade de MOG35-55 administrada aos camundongos. Quarto, embora a injeção de TP seja amplamente utilizada para facilitar a indução de EAE em camundongos35,36, ela não é necessária para todos os protocolos37,38. Na ausência de TP, camundongos geralmente desenvolvem uma forma menos grave e mais variável de EAE39. Além disso, uma maior variabilidade pode ser causada por diferentes formas de administração de TP (por exemplo, intravenosa vs. intraperitoneal) e porque a potência da TP tem sido descrita para variar entre lotes. Para superar essa questão, é importante ajustar o volume de acordo com a potência de cada lote utilizado e preparar adequadamente a solução de TP40,41. Considerando os objetivos experimentais, a habilidade técnica dos pesquisadores e a otimização da pesquisa com animais, é fundamental a escolha do protocolo de indução mais adequado.

Em quinto lugar, para coletar dados de forma mais objetiva, a pontuação cega dos sintomas da doença é altamente recomendada. Além disso, sugerimos escore clínico com avaliação mais quantitativa e objetiva do curso da doença, como a avaliação do desempenho do rotarod. Finalmente, a seleção correta de grupos experimentais adequadamente numerosos é fundamental para a obtenção de dados confiáveis e comparáveis (ver seção 2 do protocolo). Cálculos de tamanho de amostra devem ser realizados para obter os tamanhos de grupo necessários, dependendo do tamanho de efeito esperado.

Principais limitações
Em primeiro lugar, esse protocolo de indução pode levar a desfechos muito variáveis nos animais imunizados, especialmente se os tamanhos dos grupos não forem grandes o suficiente ou se o procedimento não for realizado adequadamente. Em seguida, o EAE induzido pelo MOG35-55, como qualquer outro modelo disponível de EM, tem algumas limitações (isto é, fornece muito pouca informação sobre a progressão da EM, o papel das células B na doença, os mecanismos de dentro para fora ou dificuldades no estudo da remielinização)4,6. Assim, mais uma vez, é fundamental escolher adequadamente o modelo de EM necessário para abordar a questão científica específica. Finalmente, o sítio primário de dano é representado pela medula espinhal, e a patologia leva ao aparecimento de sinais histopatológicos de forma caudal-craniana (ou seja, começando pela medula espinhal e indo até o cérebro). Isso é o oposto do que ocorre em humanos e pode representar uma limitação considerável do modelo. No entanto, é possível também apreciar algumas alterações no cérebro, considerando alvos específicos.

Vantagens
Em primeiro lugar, esse modelo pode contribuir significativamente para o entendimento dos mecanismos imunomediados periféricos e para a avaliação dos processos neuroinflamatórios e, parcialmente, desmielinizantes no SNC. Em seguida, esse modelo poderia ser aplicado em algumas linhagens específicas de camundongos transgênicos para estudar desfechos de SM relacionados a alterações genéticas específicas.

Outra vantagem é a avaliação clínica baseada em dois métodos: a avaliação do escore clínico e o teste rotarod. Isso leva a uma avaliação clínica mais quantitativa, menos subjetiva e mais precisa do curso da doença. Além disso, como ressaltaram van den Berg e col., a avaliação baseada em rotarod está fortemente correlacionada com a área de superfície de lesões inflamatórias no sistema motor da medula espinhal27.

Como discutimos anteriormente, embora esse modelo não reproduza inteiramente o dimorfismo sexual da EM, acreditamos que isso seja uma vantagem. A combinação da indução com outros possíveis fatores de risco, especialmente os ambientais, pode auxiliar na compreensão dos efeitos específicos de tais fatores e na identificação de seu papel específico na ocorrência de alguns aspectos sexualmente dimórficos da SM. Finalmente, esse modelo tem sido amplamente utilizado para desenvolver e testar uma ampla gama de drogas terapêuticas e, portanto, tem potencial para ajudar a desenvolver novas abordagens terapêuticas para essadoença4,6.

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Disclosures

Nenhum dos autores tem conflitos de interesse a declarar com relação à pesquisa, autoria e/ou publicação deste artigo.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR projeto Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 e 2023-2027 para o Departamento de Neurociência Rita Levi Montalcini; Fundação Cavalieri-Ottolenghi, Orbassano, Itália. BB foi fellow do INFRA-P, Região do Piemonte (n.378-35) (2022-2023) e PRIN 2020-20203AMKTW. Agradecemos à Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) pelo apoio. As taxas de publicação foram apoiadas pela doação do Distretto Rotaract 2031 e, particularmente, do Rotaract Club Torino Nord-Est. Agradecemos a Elaine Miller pela revisão de nosso manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic

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References

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Neurociência Edição 200 Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55 Doença Inflamatória Autoimune Crônica Sistema Nervoso Central (SNC) Prevalência em Sexos Formas Agressivas Aspectos Clínicos Características Radiológicas Características Patológicas Modelos Animais Experimentais Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) Camundongos C57BL/6J Masculinos e Femininos Peptídeo Glicoproteico Oligodendrócito de Mielina 35-55 (MOG35-55) Imunização Forma Crônica Da Doença Escore Clínico Diário Motor Desempenho Análise Histológica Medula Espinhal

Erratum

Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG<sub>35-55</sub>
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Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo,… More

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).

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