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Neuroscience

Modelización de la esclerosis múltiple en los dos sexos: encefalomielitis autoinmune experimental inducida por MOG35-55

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65778
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,4
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

ERRATUM NOTICE

Summary

La encefalomielitis autoinmune experimental es uno de los modelos murinos de esclerosis múltiple más utilizados. En el protocolo actual, los ratones C57BL/6J de ambos sexos son inmunizados con el péptido glicoproteico de los oligodendrocitos de mielina, lo que resulta principalmente en paresia ascendente de la cola y las extremidades. Aquí discutimos el protocolo de inducción y evaluación de EAE.

Abstract

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica que afecta al sistema nervioso central (SNC). Se caracteriza por una prevalencia diferente en los sexos, afectando más a las mujeres que a los hombres, y diferentes resultados, mostrando formas más agresivas en los hombres que en las mujeres. Además, la EM es muy heterogénea en cuanto a aspectos clínicos, características radiológicas y patológicas. Por lo tanto, es necesario aprovechar los modelos animales experimentales que permiten investigar la mayor cantidad posible de aspectos de la patología. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) representa uno de los modelos de EM más utilizados en ratones, modelando diferentes características de la enfermedad, desde la activación del sistema inmune hasta el daño en el SNC. En este trabajo describimos un protocolo para la inducción de EAE en ratones C57BL/6J machos y hembras mediante inmunización con el péptido glicoproteico de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG35-55), que conduce al desarrollo de una forma crónica de la enfermedad. También informamos de la evaluación de la puntuación clínica diaria y el rendimiento motor de estos ratones durante 28 días después de la inmunización (28 dpi). Por último, ilustramos algunos análisis histológicos básicos a nivel del SNC, centrándonos en la médula espinal como el sitio primario de daño inducido por la enfermedad.

Introduction

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica que afecta al sistema nervioso central (SNC). Muestra la presencia de infiltración perivascular de células inflamatorias, desmielinización, pérdida axonal y gliosis1. Su etiología sigue siendo desconocida y sus aspectos clínicos, radiográficos y patológicos sugieren una notable heterogeneidad en la enfermedad2.

Debido a su etiología y complejidad desconocidas, en la actualidad, ningún modelo animal recapitula todas las características clínicas y radiológicas mostradas en la EM humana 3,4. Sin embargo, se emplean varios modelos animales para estudiar diferentes aspectos de la EM 3,4. En estos modelos, el inicio de la enfermedad suele ser extremadamente artificial, y el período de tiempo de aparición de los signos clínicos es diferente entre humanos y ratones. Por ejemplo, en los seres humanos, los procesos fisiopatológicos subyacentes a la enfermedad no se detectan durante años antes de la aparición de las manifestaciones clínicas. Por el contrario, los experimentadores pueden detectar síntomas en modelos animales dentro de las semanas o incluso días posteriores a la inducción de la EM4.

Tres modelos animales básicos producen las características de desmielinización que son características de la EM: las que son inducidas por virus (p. ej., el virus de la encefalomielitis murina de Theiler), las que son inducidas por agentes tóxicos (p. ej., cuprizona, lisolecitina) y las diferentes variantes de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE)5. Cada modelo ayuda a estudiar algunas facetas específicas de la enfermedad, pero ninguno replica todas las características de la EM6. Por lo tanto, es fundamental elegir el modelo correcto teniendo en cuenta las necesidades experimentales específicas y las cuestiones científicas que se abordarán.

Gracias a los procedimientos de inmunización contra antígenos derivados de mielina, la EAE es inducida mediante el desencadenamiento de una respuesta autoinmune a los componentes del SNC en ratones susceptibles. La interacción entre una amplia gama de mecanismos inmunopatológicos y neuropatológicos provoca el desarrollo de los principales rasgos patológicos de la EM (es decir, inflamación, desmielinización, pérdida axonal y gliosis) en los ratones inmunizados 7,8. Los ratones comienzan a mostrar síntomas clínicos alrededor de la segunda semana después de la inmunización y, por lo general, muestran una parálisis ascendente desde la cola hasta la extremidad y la extremidad anterior. La puntuación clínica (es decir, la cuantificación de la acumulación de déficits relacionados con la enfermedad) se evalúa generalmente mediante una escala de 5 puntos7.

La inmunización activa con proteínas o péptidos o la transferencia pasiva de células T encefalitógenas se puede utilizar para inducir EAE en ratones con diferentes antecedentes genéticos (p. ej., SJL/J, C57BL/6 y ratones no obesos-diabéticos (NOD)). La proteína proteolípida de mielina (PLP), la proteína básica de mielina (MBP) y la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) son ejemplos de proteínas del SNC a partir de las cuales generalmente se producen inmunógenos. En particular, los ratones SJL/J inmunizados con el epítopo inmunodominante de PLP (PLP139-151) desarrollan un curso de enfermedad remitente-recurrente (RR), mientras que los ratones C57BL/6J inmunizados con el péptido inmunodominante MOG35-55 muestran EAE de naturaleza crónica1. A pesar de algunas limitaciones, como la escasa información sobre la progresión de la EM, el papel de las células B en la enfermedad, los mecanismos de adentro hacia afuera o las dificultades en el estudio de la remielinización, los modelos EAE han contribuido enormemente a la comprensión de los procesos autoinmunes y neuroinflamatorios, aumentando el conocimiento en el campo de la EM y permitiendo así el desarrollo de nuevas aproximaciones terapéuticas para esta enfermedad4. 6.

En el presente trabajo, nos centramos en una forma particular de EAE activa,la forma 9,10,11,12 inducida por el péptido glicoproteico de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG35-55). La EAE inducida por MOG35-55 modela una forma crónica de EM. Después de la inmunización, los ratones pasan por una fase asintomática dentro de la primera semana después de la inmunización, luego la enfermedad suele surgir durante la segunda semana después de la inmunización, mientras que entre la tercera y cuarta semana después de la inmunización, la enfermedad se vuelve crónica, sin posibilidad de recuperación completa de los déficits acumulados 7,8,13. Curiosamente, en la mayoría de los estudios presentes en la literatura no se observan diferencias entre hombres y mujeres en cuanto a la incidencia, el inicio de la enfermedad, el curso o la progresión14, aunque son pocos los estudios que comparan la enfermedad en hombres y mujeres.

Por el contrario, en los seres humanos, se sabe que estos parámetros son fuertemente dimórficossexualmente 2. La esclerosis múltiple afecta más a las mujeres que a los hombres; Sin embargo, los hombres generalmente desarrollan una forma más agresiva de la enfermedad2. Esta evidencia ha sugerido un papel esencial, así como complejo, de las hormonas gonadales15; Sin embargo, el papel y el mecanismo de acción de las hormonas sexuales en la patología siguen sin estar claros. Además, los datos de modelos animales apoyan la idea de que tanto los estrógenos como los andrógenos ejercen efectos positivos en diferentes tractos de la patología de forma específica para cada sexo16,17.

Algunos estudios también sugieren efectos neuroprotectores, promielinizantes y antiinflamatorios de la progesterona18 y, aunque la evidencia en pacientes con EM es escasa18, los esteroides neuroactivos (es decir, esteroides sintetizados de novo por el sistema nervioso, como la pregnenolona, la tetrahidroprogesterona y la dihidroprogesterona) también podrían afectar el curso patológico19. En conjunto, estos datos apoyan la idea de que las hormonas sexuales producidas tanto periféricamente como dentro del SNC tienen un papel importante y específico del sexo en la aparición y progresión de la enfermedad. Por lo tanto, en el presente trabajo, instamos a la recopilación de datos separados de los animales machos y hembras.

Desde el punto de vista histopatológico, la sustancia blanca de la médula espinal sirve como el sitio principal de lesión del SNC en este modelo, que se caracteriza por regiones multifocales y confluentes de infiltración inflamatoria mononuclear y desmielinización8. Por lo tanto, al describir este protocolo para la inducción de EAE inducida por MOG35-55 en ratones C57BL/6J, tendremos en cuenta el resultado de la enfermedad en los dos sexos y proporcionaremos algunos conocimientos histopatológicos sobre la médula espinal.

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Protocol

El cuidado y manejo de los animales en el presente trabajo se realizó de acuerdo con la Directiva del Consejo de la Unión Europea de 22de septiembre de 2010 (2010/63/UE); todos los procedimientos relatados en el presente estudio fueron aprobados por el Ministerio de Salud italiano (407/2018-PR) y por el Comité de Ética de la Universidad de Turín (Proyecto n° 360384). Sugerimos ajustar el diseño experimental a las guías ARRIVE, publicadas originalmente por Kilkenny et al. en 201020. Antes de comenzar, asegúrese de que los materiales necesarios estén disponibles (consulte la tabla de materiales). Esterilizar toda la cristalería y utensilios utilizados para la preparación de la emulsión MOG35-55 en autoclave. En la Figura 1 se presenta un resumen de los procedimientos experimentales.

1. Preparación de la emulsión MOG35-55

NOTA: Para preparar la emulsión, se requiere MOG35-55, adyuvante de Freud (IFA) incompleto, cepa H37Ra (MT) de Mycobacterium Tuberculosis y solución fisiológica (ver Tabla de Materiales).

PRECAUCIÓN: La MT muerta por calor puede estimular la respuesta inmunitaria innata. Evite la inhalación, la ingestión y el contacto con la piel y los ojos utilizando el equipo de protección personal adecuado y pesando la MT en una balanza de precisión cubierta debajo del capó.

Solución Composición Notas
2 mg/ml de solución peptídica MOG35-55 Péptido MOG35-55 liofilizado diluido en solución fisiológica a una concentración de 2 mg/mL Conservar la solución ya diluida a -80 °C.
5 μg/mL de solución de PT PT liofilizado diluido en solución fisiológica a una concentración de 5 μg/mL. Conservar la solución ya diluida a -80 °C.
Emulsión El volumen total de emulsión necesario para cada ratón a inmunizar es de 300 μL, dividido de la siguiente manera: Para evitar alteraciones o contaminación, prepare la emulsión el día de la inmunización.
200 μg/ratón de MOG35-55 , es decir, 100 μL de solución de MOG35-55 2 mg/mL.
50 μL de solución fisiológica
150 μL de IFA
4 mg/mL MT, es decir, 1,2 mg/ratón
Solución fisiológica Cloruro de sodio al 0,9% diluido en agua destilada.

Tabla 1: Composición de las soluciones utilizadas para el procedimiento de inmunización.

  1. Preparar la solución en un vaso de precipitados de vidrio, añadiendo primero el componente líquido y finalmente el MT.
    NOTA: El volumen total de emulsión necesario para cada ratón a inmunizar es de 300 μL, dividido como se indica en la Tabla 1. La emulsión es muy viscosa y espesa, por lo que durante el procedimiento de preparación e inyección, podría haber alguna pérdida, especialmente al preparar la solución para unos pocos ratones. Sugerimos calcular el volumen final de emulsión necesario sobreestimando el número de ratones a inmunizar en al menos 1,5-2 veces.
  2. Coloque el vaso de precipitados en hielo y utilice la jeringa de vidrio con una aguja de 18 G para comenzar a emulsionar la solución.
    NOTA: La emulsión también se puede preparar utilizando otras estrategias, por ejemplo, conectando las dos jeringas de vidrio sin aire con una llave de paso de tres vías y mezclando la solución empujando los émbolos hacia adelante y hacia atrás21,22.
  3. Emulsionar la solución durante al menos 15 min; Generalmente, 30 minutos de emulsificación son suficientes. Para comprobar la calidad de la emulsión, agregue una gota de emulsión en un recipiente transparente lleno de agua: si la gota mantiene su estructura y permanece intacta, la emulsión está lista.
  4. Colocar la emulsión directamente dentro de las jeringas de 1 mL que se utilizarán para la inmunización y almacenarlas a +4 °C hasta su uso para preservar el espesor de la emulsión y evitar alteraciones o contaminaciones.

2. Selección e inmunización de animales

  1. Selección de animales
    1. Seleccionar ratones adultos C57BL/6J de ambos sexos a las 8-10 semanas de edad con un peso corporal óptimo de ~20 g. Asegúrese de seleccionar ratones de la misma edad y sexo para diferentes grupos experimentales, ya que la susceptibilidad a la enfermedad puede variar con la edad y el sexo.
      NOTA: Los ratones deben tener un peso corporal comparable el día de la inmunización porque el procedimiento actual está optimizado para un cierto rango de peso corporal (17-25 g).
    2. Alojar a los animales del mismo sexo en grupos (n = 4-5/jaula) para evitar el aislamiento social en condiciones estándar en jaulas de polipropileno de 45 cm x 25 cm x 15 cm a 22 ± 2 °C, en un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 (luces encendidas a las 08:00 AM). Proporcionar comida y agua ad libitum.
      NOTA: Eventualmente, para limitar aún más la variabilidad potencial del curso de la enfermedad en los animales inmunizados, también sugerimos formar grupos experimentales suficientemente numerosos. También existen estudios 8,23 que describen el momento de la inmunización como una condición que determina la variación en el resultado de la EAE. Por lo tanto, sugerimos realizar la inmunización aproximadamente a la misma hora en todos los animales, preferiblemente durante las horas luz del ciclo diario de luz/oscuridad23. Para limitar el estrés, es preferible manipular a los animales antes del día de la inmunización y marcarlos para identificarlos fácilmente para su evaluación diaria, por ejemplo, cortando las orejas o marcando.
  2. El procedimiento de inmunización
    NOTA: Asegúrese de que el procedimiento sea realizado por un investigador experimentado para minimizar el estrés de los animales y optimizar la inmunización. Antes de iniciar la inmunización, seleccione el método de anestesia de acuerdo con las directrices del comité institucional de ética y cuidado de animales. Nuestro laboratorio utiliza anestesia breve con isoflurano.
    1. Anestesiar al ratón: 4% de isoflurano para la inducción de la anestesia y 1,5-2% de isoflurano para el mantenimiento de la anestesia. Espere a que la anestesia sea efectiva y use un pellizco en la parte posterior y delantera del pie para evaluar el nivel de anestesia. Para prevenir la sequedad de los ojos mientras el ratón está bajo anestesia, use un ungüento para los ojos aprobado por el veterinario.
    2. Inyección intravenosa de PT en la vena caudal lateral: tapar suavemente la cola del ratón con una solución de etanol, que actúa como vasodilatador, para mostrar las venas. Concéntrese en una de las dos venas laterales de la cola y, utilizando una jeringa de 0,5 ml equipada con una aguja de 30 g, inyecte 500 ng de PT (es decir, 100 μl de PT diluido en solución fisiológica a una concentración de 5 μg/ml).
    3. Inyección subcutánea de emulsión MOG35-55 : utilizando la jeringa de 1 mL con aguja de 26 G, realizar tres inyecciones subcutáneas de la emulsión previamente preparada: dos debajo de la parte rostral de los flancos y una en la base de la cola. El volumen de emulsión inyectado en cada sitio es de 100 μL, para un volumen total de 300 μL de emulsión inyectada en cada ratón.
      NOTA: El día de la inmunización se registra como el día 0 después de la inmunización (dpi); 48 h después (es decir, a 2 dpi), es necesario realizar otra inyección intravenosa de TP igual a la realizada anteriormente. Es posible realizar la inyección sin anestesia, utilizando un retenedor de ratón. El procedimiento aquí descrito tiene como objetivo inducir y mantener la anestesia de los ratones durante el procedimiento de inmunización para evitar posibles molestias y movimientos de los animales o riesgos tanto para los ratones como para los investigadores. Por lo tanto, no hay procedimientos quirúrgicos. Sin embargo, para optimizar los procesos experimentales, es importante mantener las condiciones estériles adecuadas durante estos pasos y monitorear la condición del ratón después de estos procedimientos.
    4. Para verificar que el ratón se ha recuperado de las inyecciones, colóquelo en una jaula limpia después de los procedimientos y espere hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Una vez que el ratón se haya recuperado por completo, devuélvelo a la jaula de la casa con otros animales.

3. Seguimiento de EAE

  1. Peso corporal e ingesta de alimentos
    1. Controlar diariamente el peso corporal (PC) de los animales, utilizando una balanza electrónica de precisión, ya que la disminución del peso corporal es un indicador de la progresión de la enfermedad.
      NOTA: Esta disminución no debe exceder un determinado porcentaje, de acuerdo con los lineamientos del comité institucional y de ética para el cuidado de los animales. Por lo general, si un animal pierde más del 20% del peso corporal inicial (es decir, el peso registrado a 0 dpi), debe sacrificarse como aplicación del criterio de valoración humanitario. Los métodos de eutanasia implican anestesia profunda irreversible para la inhalación (por ejemplo, isoflurano al 5%) seguida de la decapitación.
    2. Controle la ingesta de alimentos (IF), es decir, los alimentos ingeridos por un animal en un día (g∙día-1∙animal-1), pesando la cantidad de alimento en el recipiente específico al menos una vez a la semana y dividiendo la cantidad de alimentos ingeridos durante los días transcurridos entre dos mediciones secuenciales y el número de animales presentes en la jaula.
      NOTA: Esta medida permite estimar la ingesta media de alimentos. Debido a la aparición y acumulación de signos clínicos de la enfermedad, que implican la parálisis de las extremidades, sugerimos colocar algún alimento regado en el suelo de la jaula cuando los animales no sean capaces de pararse firmemente sobre sus extremidades traseras y alcanzar el recipiente de comida o la botella de agua. Para evaluar la ingesta de alimentos durante el período de seguimiento con la mayor precisión posible, también medimos el peso seco de este alimento antes de mojarlo para los ratones.
  2. Evaluación de la ciclicidad estral durante la EAE
    1. Comprobar el ciclo estral durante al menos dos ciclos, evaluando los frotis de citología vaginal descritos por McLean et al.24. Clasifique la fase del ciclo estral en función de la presencia de tres tipos de células primarias (células epiteliales nucleadas, células epiteliales escamosas cornificadas y leucocitos) en las muestras de frotis vaginal, de la siguiente manera:
      1. Se clasifican como celo en función de la presencia casi exclusiva de grupos de células epiteliales nucleadas redondas y bien formadas.
      2. Se clasifican como estro en función de la presencia predominante de grupos densamente empaquetados de células epiteliales escamosas cornificadas.
      3. Se clasifican como metestro en función de la presencia predominante de pequeños leucocitos teñidos de oscuro y la presencia menor de células epiteliales escamosas cornificadas.
      4. Se clasifican como diestros en función de la presencia altamente predominante de pequeños leucocitos teñidos de oscuro y células epiteliales escamosas córneas raras junto con la posible aparición de células epiteliales nucleadas.
        NOTA: Al evaluar la enfermedad en ambos sexos, es importante verificar la variabilidad en las hembras debido al ciclo estral. Sugerimos centrarse en la evaluación del ciclo estral, especialmente entre la primera y la segunda semana post-inmunización (es decir, durante la fase aguda de la EAE). Se ha demostrado previamente que el procedimiento de inmunización provoca las alteraciones más pronunciadas del ciclo estral dentro de esta fase25. Además, es importante tener en cuenta que la realización del frotis cuando el animal alcanza una puntuación clínica alta (especialmente >3) es difícil debido a la paresia posterior y a la falta de tono en las extremidades posteriores.
  3. Puntuación clínica
    1. Haga que un investigador ciego evalúe diariamente la puntuación clínica de los animales. Asigne a cada animal una puntuación de 0 a 5 (véase la Tabla 2) para evaluar el curso de la enfermedad26 según lo descrito por Racke7.
      NOTA: Al igual que la disminución del peso corporal, también es necesario un criterio de valoración humanitario para el aumento de las puntuaciones clínicas, de acuerdo con las directrices del comité institucional y de ética para el cuidado de los animales. En general, si un animal ya no es capaz de alimentarse por sí mismo de forma autónoma (esto suele ocurrir cuando un animal alcanza al menos la puntuación de 4, según la escala que utilicemos), debe ser sacrificado como aplicación del criterio de valoración humanitario.
  4. Evaluación del rendimiento del motor mediante prueba de rotarod
    NOTA: La evaluación de la progresión de la EAE se suele realizar mediante la asignación diaria de la puntuación clínica, que es realizada por un investigador ciego totalmente entrenado. Sin embargo, podría ser útil complementarlo con una evaluación más cuantitativa y objetiva de la progresión de la enfermedad. En un estudio previo26, se utilizó la prueba de rotarod para medir el rendimiento motor de los animales inmunizados. Como describen van den Berg et al.27, para tener una evaluación clínica más cuantitativa y precisa del curso de la enfermedad, la evaluación del rendimiento motor mediante la prueba de rotarod puede apoyar la evaluación de la puntuación clínica. Para una descripción detallada, véase van den Berg et al.27.
    1. Deje que los ratones se sometan a sesiones de rotarod diariamente, a partir de 1 ppp hasta el sacrificio (es decir, 28 ppp). Cada sesión consiste en una sola sesión de 300 s durante la cual la velocidad de la varilla debe aumentarse linealmente de 4 a 40 rpm.
    2. Registra la puntuación del animal. Cuando el mouse no es capaz de mantener el equilibrio y se cae del dispositivo, cae al suelo y activa un sensor, y se registra el tiempo (s). Por lo tanto, el rendimiento se puntúa como latencia para caer(es).

Grado Signo clínico Descripción
0 Sano No se observó ningún signo clínico. El animal muestra un tono normal y movimiento de la cola. Camina sin tropezar.
0.5 Puerta deteriorada El animal tropieza mientras camina sobre una parrilla.
1 Cola flácida Cuando el animal es recogido por la base de la cola, la cola se cae (cola flácida).
1.5 Cola flácida y puerta dañada El animal muestra una cola flácida y tropieza mientras camina sobre una parrilla.
2 Ataxia El animal muestra dificultades para ponerse de pie una vez que se le ha dado la vuelta.
2.5 Ataxia y paresia de la extremidad posterior El animal no puede ponerse de pie una vez que se ha volteado sobre su espalda, y pierde el tono de una de sus extremidades traseras.
3 Parálisis de las extremidades posteriores El animal pierde el tono de ambas extremidades posteriores.
3.5 Parálisis de las extremidades posteriores y/o paresia de las extremidades anteriores El animal pierde el tono de ambas extremidades posteriores y parcialmente de las extremidades anteriores. De hecho, muestra una pérdida de fuerza en el agarre de las extremidades anteriores.
4 Tetra paresia El animal pierde por completo el tono de sus extremidades.
4.5 Tetra paresia y disminución de la temperatura corporal El animal pierde por completo el tono de sus extremidades, y muestra una disminución de la temperatura corporal (hace frío).
5 Moribundo o muerto El animal está moribundo (no responde a ningún estímulo) o muerto.

Tabla 2: Sistema de puntuación clínica utilizado para evaluar la evolución de la EAE.

4. Evaluación de los signos histopatológicos inducidos por EAE a nivel medular

NOTA: A continuación, informamos brevemente el procedimiento para sacrificar a los animales y recolectar la médula espinal para realizar análisis histopatológicos; Para una descripción detallada, consulte estas referencias 10,26,28,29.

  1. Fijación y toma de muestras de tejidos
    NOTA: Para una descripción detallada, consulte estas referencias 10,26.
    1. Sacrificar los animales a 28 dpi durante la fase crónica de la enfermedad.
      1. Anestesiar a los ratones mediante anestesia profunda irreversible (inyección intraperitoneal de Zolazepam y Tiletamina 80 mg/kg / Xilacina 10 mg/kg).
      2. Perfundir transcardialmente a los ratones con una solución salina seguida de una solución de paraformaldehído (PFA) al 4%.
        NOTA: Preste atención al usar PFA: como es tóxico, evite la inhalación, la ingestión y el contacto con la piel y los ojos utilizando el equipo de protección personal adecuado. Pesar el polvo, preparar la solución y realizar la perfusión bajo la campana.
    2. Retire la médula espinal de la columna vertebral30.
    3. Almacenar la médula espinal en una solución de PFA al 4% durante 24 h.
    4. Realizar varios lavados en tampón de fosfato salino (PBS) 0,01 M.
    5. Incrustar la médula espinal en bloques de parafina30.
  2. Procedimientos histológicos
    NOTA: Para una descripción detallada, véase Montarolo et al.10.
    1. Utilice un micrótomo para cortar secciones transversales de la médula espinal de 10 μm de grosor y recogerlas en portaobjetos recubiertos de gelatina. Oriente el plano de seccionamiento para que coincida con los dibujos correspondientes a las secciones transversales del atlas31 de la médula espinal del ratón.
    2. Realizar la desparafinación de los incisos32.
    3. Teñir la sección con hematoxilina y eosina32.
    4. Deshidratar las secciones32.
    5. Cubra las secciones con un medio de montaje y déjelas secar a temperatura ambiente bajo una cubierta química.
      NOTA: La tinción con hematoxilina-eosina permite detectar la presencia de infiltrados inflamatorios perivasculares (PvIIs)26, lo que se evalúa como signo de la enfermedad28.
  3. Análisis cuantitativo de secciones de la médula espinal
    1. Adquiera imágenes de las secciones teñidas con un microscopio óptico conectado a una cámara digital con un objetivo 20x29.
    2. Analice la imagen adquirida para obtener el número de PvIIs, expresado como el número de infiltrados por mm2.
      NOTA: Para el análisis de las imágenes adquiridas, es útil aprovechar el software de análisis de imágenes. Los hallazgos neuropatológicos presentados en este trabajo se cuantifican en 10 cortes transversales completos de la médula espinal por ratón (n = 8/grupo) representativos de los niveles de toda la médula espinal.

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Representative Results

Seguimiento de EAE tras la inmunización
Esto se evaluó como se describe a continuación.

Peso corporal e ingesta de alimentos
El análisis de varianza de dos vías (ANOVA) (sexo y tiempo como variables independientes) muestra una disminución del peso corporal de los animales EAE de ambos sexos, especialmente dentro de la segunda semana post inducción (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figura 2A). Sin embargo, el dimorfismo sexual en el peso corporal siempre se mantiene (Figura 2A). En cuanto al porcentaje de peso corporal (F(1,57) = 23,935, p < 0,001; Figura 2B), tanto los machos como las hembras muestran una gran pérdida entre los 12 dpi y los 17 dpi (p < 0,001) en comparación con el peso corporal inicial, pero nunca superan una pérdida total del 20% (Figura 2B). Así, aunque la pérdida de peso corporal comienza antes de la aparición de la enfermedad, alcanza su máximo durante la fase aguda de la EAE (Figura 2A,B). No hay diferencias entre los sexos en cuanto a la pérdida de peso corporal. Sin embargo, las mujeres tienden a perder más peso antes y a recuperarse menos durante la fase crónica (tercera-cuarta semana después de la inducción) (Figura 2B).

Por otra parte, el ANOVA de dos vías (sexo y tiempo como variables independientes) también muestra una disminución significativa de la IF (F(9, 39) = 6,682, p < 0,001; Figura 2C) en ambos sexos, especialmente durante la segunda semana post-inmunización, como consecuencia del aumento de la severidad de la EAE, lo que dificultó el acceso del animal al alimento colocado en el envase superior de la jaula. Como sugerimos, la comida se colocó posteriormente en el suelo de la jaula para reducir aún más el estrés de los animales. Esto permitió que el FI volviera a los niveles iniciales (Figura 2C) y que el BW se recuperara parcialmente (Figura 2A,B).

Evaluación del ciclo estral en las hembras
La comparación entre el tiempo empleado en las diferentes fases del estral se realizó mediante la prueba t de Student. El análisis muestra diferencias en el tiempo empleado en las fases estrales (i.e., proestro y estro) en comparación con el pasado en la fase no estral (i.e., metestro y diestro) entre la fase asintomática (previa al inicio de la EAE) y la fase sintomática (tras la aparición de la EAE) (p = 0,042; Figura 2D), debido principalmente a un aumento del tiempo de permanencia en diestro durante las fases sintomáticas (p = 0,017) y a una tendencia a la reducción del tiempo de permanencia en proestro (p = 0,08).

Ya se ha descrito que el procedimiento de inducción conduce a una alteración del ciclo estral en las hembras, afectando particularmente al proestro25. Durante esta fase, se sabe que el aumento de los niveles de estrógenos ejerce efectos antiinflamatorios y neuroprotectores16 y, por lo tanto, posiblemente sean responsables del papel protector de esas hormonas durante la fase presintomática. Sin embargo, cuando el nivel de estrógenos desciende, como vemos en la fase post inicio, sus efectos protectores también terminan.

Puntuación clínica y rendimiento de rotarod
El ANOVA de dos vías (sexo y tiempo como variables independientes) muestra un aumento significativo del tiempo en la puntuación clínica (CS) tanto de hombres como de mujeres (F(56-813) = 27,951, p < 0,001; Figura 3A). En particular, a partir de los 10 dpi, ambos sexos muestran un aumento significativo del CS (p < 0,001), que se mantiene hasta el punto final (28 dpi) (Figura 3A). Las hembras muestran, aunque no significativamente (p = 0,156), un CS mayor que los machos (Figura 3A). En cuanto al inicio de la enfermedad, se produce generalmente alrededor de los 10 dpi, con tendencia a un inicio más temprano en las mujeres que en los hombres (Figura 3B). Además, las mujeres muestran un CS acumulado significativamente mayor en comparación con los hombres (p = 0,017; Figura 3C).

El curso de rendimiento de rotarod se asemeja a las evaluaciones clínicas (Figura 2D). A partir del inicio de la enfermedad, esta disminuye, alcanzando el rendimiento mínimo durante la segunda semana post inmunización, en la fase aguda de EAE. El ANOVA de dos vías (sexo y tiempo como variables independientes) muestra una disminución significativa en el tiempo en el rendimiento de rotarod tanto de machos como de hembras (F(46-673) = 5,365, p < 0,001; Figura 3D). En particular, los machos muestran el rendimiento mínimo a 16 dpi (p = 0,022) mientras que las hembras a 17 dpi (p < 0,001). Los machos tienden a tener un mejor rendimiento que las hembras, especialmente durante la fase crónica de la enfermedad (21-28 dpi), posiblemente como consecuencia de un menor CS (Figura 3A,D).

Evaluación histopatológica de la médula espinal
El ANOVA de un factor (sexo como variable independiente) de las PvII en los cortes de la médula espinal pone de manifiesto una clara diferencia entre hombres y mujeres (Figura 4A). Las mujeres presentan un número significativamente mayor de PvII que los hombres (F(1,14)= 63,107, p < 0,001; Figura 4B). Estos datos posiblemente reflejan el mayor CS acumulado, el peor rendimiento del rotarod y la enfermedad más agresiva observada en las hembras, especialmente durante la fase crónica de EAE.

Estos datos también reflejan el hecho de que los ratones hembra muestran una mayor susceptibilidad al desarrollo de EAE más agresivos en comparación con los machos14, lo cual es una de las principales diferencias entre este modelo de enfermedad y la EM que se presenta en humanos. Las mujeres presentan un inicio más temprano de la enfermedad, tienen una prevalencia moderadamente menor de formas progresivas primarias y muestran en general una menor progresión de la discapacidad que los hombres 2,33,34.

Figure 1
Figura 1: Representación temporal esquemática de los procedimientos experimentales. Creado con BioRender.com. Abreviaturas: i.v. = intravenoso; s.c. = subcutáneo; MOG35-55 = péptido glicoproteico de oligodendrocitos de mielina 35-55; = DPI = día después de la inmunización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Evaluación de los efectos de la EAE sobre el peso corporal, la ingesta de alimentos en ratones machos y hembras, y el ciclo estral en ratones hembra. Desde el día de la inmunización (0 dpi) hasta el día del sacrificio (28 dpi), los gráficos muestran (A) el peso corporal diario, (B) el porcentaje del peso corporal y (C) la evaluación semanal de la ingesta de alimentos en los animales de ambos sexos (n = 15/grupo). (D) Tiempo empleado (expresado como porcentaje medio de tiempo) en las diferentes fases del ciclo estral, evaluado mediante citología vaginal, durante la fase asintomática (pre-inicio, columna izquierda del gráfico) o la fase sintomática (post-inicio, columna derecha del gráfico) en ratones hembra. Los datos se presentan como media ± SEM. El análisis estadístico reveló un efecto significativo para p≤ 0,05 (# = hombres vs. mujeres; * = comparación entre diferentes puntos temporales). Abreviaturas: EAE = encefalomielitis autoinmune experimental; Peso corporal = peso corporal; FI = ingesta de alimentos; DPI = día después de la inmunización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación de la puntuación clínica y del rendimiento de rotarod en ratones macho y hembra afectados por EAE. (A) Evaluación de la puntuación clínica diaria (de 0 a 28 dpi) en los animales de ambos sexos (n = 15/grupo). (B) Día de inicio de la enfermedad (dpi) medio en ratones machos (columna izquierda) y hembras (columna derecha) afectados por EAE. (C) Puntuación clínica media acumulada alcanzada por ratones machos (columna izquierda) y hembras (columna derecha) afectados por EAE. (D) Evaluación del rendimiento diario del rotarod (medido como latencia de caída) de 6 a 28 ppp (el 0 representa los valores basales obtenidos dentro de los primeros 5 días de la prueba) en los animales de ambos sexos. Los datos se presentan como media ± SEM. El análisis estadístico reveló un efecto significativo para p≤ 0.05 (# = hombres vs. mujeres; * = comparación entre diferentes puntos temporales). Abreviaturas: EAE = encefalomielitis autoinmune experimental; CS = puntuación clínica; Cum CS = puntuación clínica acumulada; DPI = día después de la inmunización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis de la inflamación en la médula espinal de ratones afectados por EAE de ambos sexos. (A) Las imágenes representativas de secciones transversales de la médula espinal teñidas con hematoxilina-eosina resaltan la presencia de PvII (flechas) en ratones machos (imagen superior) y hembras (imagen inferior). (B) Medida de la presencia de PvIIs en la médula espinal de ratones afectados por EAE de ambos sexos (n = 8/grupo). Los datos se presentan como media ± SEM. El análisis estadístico reveló un efecto significativo para p ≤ 0,05 (# = hombres vs. mujeres). Barra de escala = 200 μm (aumento de 10x). Abreviaturas: EAE = encefalomielitis autoinmune experimental; * = canal central; PvIIs = infiltrados inflamatorios perivasculares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo EAE inducido por MOG35-55 que describimos condujo al desarrollo de una forma crónica de EM en ratones C57BL/6J 7,8,13. En estos resultados representativos, reportamos que los animales de ambos sexos que se sometieron al procedimiento de inmunización desarrollaron una forma crónica de la enfermedad (es decir, no se recuperan completamente después del inicio de la enfermedad, acumulan déficits y mantienen un CS de al menos 1,5 en la fase crónica).

A pesar de que muchos estudios no reportan diferencias entre hombres y mujeres en este modelo14, solo unos pocos estudios consideran ambos sexos. Sin embargo, dados los dimorfismos sexuales sustanciales que se muestran en el EM2, debería ser de importancia primordial estudiar el resultado de la enfermedad en los dos sexos. Gracias a estudios más recientes que incluyen ambos sexos, también se ha descrito la presencia de cierto dimorfismo sexual en el EAE35-55 inducido por MOG35-55. Observamos principalmente que en las hembras, la EAE inducida por MOG35-55 es generalmente más agresiva (dada la mayor susceptibilidad de los ratones hembra con este modelo)36, ya que tienden a tener un inicio más temprano y puntuaciones clínicas acumuladas más altas, lo que refleja una mayor inflamación a nivel de la médula espinal que la observada en los machos. Una de las principales conclusiones es que este protocolo puede inducir EAE tanto en ratones machos como hembras, pero los investigadores deben recordar que algunos aspectos de la enfermedad podrían diferir entre los dos sexos. Por lo tanto, es fundamental considerar adecuadamente la principal cuestión experimental que debe abordarse, elegir el modelo animal más favorable y evaluar la necesidad de incluir uno o ambos sexos.

Pasos críticos y posible solución de problemas
Dado que los diferentes modelos de EM producen algunos aspectos específicos de la enfermedad, pero no todoslos 6, el primer paso fundamental es elegir el modelo correcto teniendo en cuenta las necesidades experimentales específicas y las cuestiones científicas a abordar. En segundo lugar, el procedimiento de inmunización debe ser realizado por un experto para garantizar que se realiza correctamente y evitar errores o variabilidad debido a procedimientos imprecisos. Además, el investigador debe conocer las normas de bienestar animal adoptadas por la institución de acogida.

En tercer lugar, la emulsión debe estandarizarse en el experimento. Cabe señalar que todos los ratones muestran una susceptibilidad típica a la inducción y, por lo tanto, algunos animales podrían desarrollar una enfermedad menos agresiva o no desarrollarla en absoluto. En ese caso, la incidencia y la gravedad de la enfermedad se pueden optimizar ajustando la cantidad de MOG35-55 administrada a los ratones. En cuarto lugar, aunque la inyección de PT es ampliamente utilizada para facilitar la inducción de EAE en ratones 35,36, no es necesaria para todos los protocolos37,38. En ausencia de TP, los ratones suelen desarrollar una forma menos grave y más variable de EAE39. Además, la variabilidad adicional puede deberse a las diferentes formas de administración de la TP (p. ej., intravenosa frente a intraperitoneal) y a que se ha descrito que la potencia de la TP varía entre los lotes. Para superar este problema, es importante ajustar el volumen de acuerdo con la potencia de cada lote utilizado y preparar adecuadamente la solución de TP40,41. Teniendo en cuenta los objetivos experimentales, las habilidades técnicas de los investigadores y la optimización de la investigación con animales, es fundamental elegir el protocolo de inducción más adecuado.

En quinto lugar, para recopilar datos de una manera más objetiva, se recomienda encarecidamente la puntuación ciega de los síntomas de la enfermedad. Además, sugerimos una puntuación clínica con una evaluación más cuantitativa y objetiva del curso de la enfermedad, como la evaluación del rendimiento del rotarod. Por último, la correcta selección de grupos experimentales adecuadamente numerosos es fundamental para obtener datos fiables y comparables (ver sección 2 del protocolo). Se deben realizar cálculos del tamaño de la muestra para obtener los tamaños de grupo necesarios, dependiendo del tamaño del efecto esperado.

Principales limitaciones
En primer lugar, este protocolo de inducción podría dar lugar a resultados muy variables en los animales inmunizados, especialmente si el tamaño de los grupos no es lo suficientemente grande o si el procedimiento no se lleva a cabo correctamente. En segundo lugar, la EAE inducida por MOG35-55, como cualquier otro modelo disponible de EM, tiene algunas limitaciones (es decir, proporciona muy poca información sobre la progresión de la EM, el papel de las células B en la enfermedad, los mecanismos de adentro hacia afuera o las dificultades en el estudio de la remielinización)4,6. Por lo tanto, una vez más, es fundamental elegir adecuadamente el modelo de EM necesario para abordar la cuestión científica específica. Por último, el sitio primario del daño está representado por la médula espinal, y la patología conduce a la aparición de signos histopatológicos de forma caudal-craneal (es decir, partiendo de la médula espinal y subiendo hasta el cerebro). Esto es lo contrario de lo que ocurre en los humanos y puede representar una limitación considerable del modelo. Sin embargo, también es posible apreciar algunas alteraciones en el cerebro, considerando objetivos específicos.

Ventajas
En primer lugar, este modelo puede contribuir significativamente a la comprensión de los mecanismos inmunomediados periféricos y a evaluar los procesos neuroinflamatorios y, parcialmente, desmielinizantes en el SNC. A continuación, este modelo podría aplicarse en algunas cepas específicas de ratones transgénicos para estudiar los resultados de la EM relacionados con alteraciones genéticas específicas.

Otra ventaja es tener una evaluación clínica basada en dos métodos: la evaluación de la puntuación clínica y la prueba de rotarod. Esto conduce a una evaluación clínica más cuantitativa, menos subjetiva y más precisa del curso de la enfermedad. Además, como señalaron van den Berg et al., la evaluación basada en rotarod está fuertemente correlacionada con el área superficial de lesiones inflamatorias en los sistemas motores de la médula espinal27.

Como hemos comentado anteriormente, aunque este modelo no reproduce íntegramente el dimorfismo sexual de la EM, creemos que esto es una ventaja. La combinación de la inducción con otros posibles factores de riesgo, especialmente los ambientales, puede ayudar a comprender los efectos específicos de dichos factores e identificar su papel específico en la aparición de algunos aspectos sexualmente dimórficos de la EM. Finalmente, este modelo ha sido ampliamente utilizado para desarrollar y probar una amplia gama de fármacos terapéuticos y, por lo tanto, tiene potencial para ayudar a desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para esta enfermedad 4,6.

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Disclosures

Ninguno de los autores tiene ningún conflicto de intereses que declarar con respecto a la investigación, autoría y/o publicación de este artículo.

Acknowledgments

Este trabajo ha sido apoyado por el Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR proyecto Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 y 2023-2027 al Departamento de Neurociencia Rita Levi Montalcini; Fundación Cavalieri-Ottolenghi, Orbassano, Italia. BB fue becario de INFRA-P, Región de Piamonte (n.378-35) (2022-2023) y PRIN 2020 - 20203AMKTW. Agradecemos a la Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) por el apoyo. Las cuotas de publicación han sido financiadas por la amable donación del Distretto Rotaract 2031 y, en particular, del Club Rotaract Torino Nord-Est. Agradecemos a Elaine Miller por la revisión de nuestro manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic

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References

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Neuroscience Número 200 Encefalomielitis Autoinmune Experimental Inducida por MOG35-55 Enfermedad Inflamatoria Autoinmune Crónica Sistema Nervioso Central (SNC) Prevalencia en Sexos Formas Agresivas Aspectos Clínicos Características Radiológicas Características Patológicas Modelos Animales Experimentales Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE) Ratones C57BL/6J Machos y Hembras Péptido de Glicoproteína de Oligodendrocitos de Mielina 35-55 (MOG35-55) Inmunización Forma Crónica De La Enfermedad Puntuación Clínica Diaria Motor Rendimiento Análisis Histológico Médula Espinal

Erratum

Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

Modelización de la esclerosis múltiple en los dos sexos: encefalomielitis autoinmune experimental inducida por MOG<sub>35-55</sub>
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Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo,… More

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).

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