Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Murine bagben explant model til undersøgelse af mekanobiologi af akillesseneimpingement

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65801
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

Summary

Vi præsenterer en brugerdefineret eksperimentel platform og vævskulturprotokol, der genskaber fibrocartilaginøs forandring drevet af impingement af akillesseneindsættelsen i murine bagekstremiteter med vedvarende cellelevedygtighed, hvilket giver en model, der er egnet til at udforske mekanobiologien af senepåvirkning.

Abstract

Senens påvirkning af knoglen genererer et multiaksialt mekanisk belastningsmiljø med markant forhøjet tværgående trykstamme, som fremkalder en lokaliseret fibrocartilagefænotype karakteriseret ved akkumulering af glycosaminoglycan (GAG) -rig matrix og ombygning af kollagennetværket. Mens fibrocartilage er et normalt træk i impinged regioner af sunde sener, overskydende GAG aflejring og disorganisering af kollagen netværk er kendetegnende træk ved tendinopati. Følgelig er impingement klinisk anerkendt som en vigtig ydre faktor i initiering og progression af tendinopati. Ikke desto mindre er mekanobiologien, der ligger til grund for senepåvirkning, stadig underundersøgt. Tidligere bestræbelser på at belyse det cellulære respons på senepåvirkning har anvendt uniaxial kompression på celler og udskåret seneeksplanter in vitro. Imidlertid mangler isolerede celler et tredimensionelt ekstracellulært miljø, der er afgørende for mekanorespons, og både in vitro og udskårne eksplantatundersøgelser undlader at rekapitulere det multiaksiale belastningsmiljø, der genereres af senepåvirkning in vivo, hvilket afhænger af anatomiske træk i det impingerede område. Desuden mangler in vivo-modeller af senepåvirkning kontrol over det mekaniske belastningsmiljø. For at overvinde disse begrænsninger præsenterer vi en ny murine bagbenseksplanteringsmodel, der er egnet til at studere mekanobiologien af akillessenepåvirkning. Denne model opretholder akillessenen in situ for at bevare lokal anatomi og reproducerer det multiaksiale belastningsmiljø, der genereres ved påvirkning af akillesseneindsættelsen på calcaneus under passivt påført ankeldorsiflexion, mens cellerne bevares i deres oprindelige miljø. Vi beskriver en vævskulturprotokol, der er integreret i denne model, og præsenterer data, der etablerer vedvarende eksplanteringslevedygtighed over 7 dage. De repræsentative resultater viser forbedret histologisk GAG-farvning og nedsat kollagenfiberjustering sekundært til impingement, hvilket tyder på forhøjet fibrocartilagedannelse. Denne model kan let tilpasses til at undersøge forskellige mekaniske belastningsregimer og giver mulighed for manipulation af molekylære veje af interesse for at identificere mekanismer, der medierer fænotypisk ændring i akillessenen som reaktion på impingement.

Introduction

Et væld af sener, herunder akillessenen og rotatormanchetsenerne, oplever knoglepåvirkning på grund af normal anatomisk positionering1,2,3,4. Senimpingement genererer trykbelastning rettet på tværs til den langsgående fiberakse5,6,7. Regioner af senepåvirkning demonstrerer en unik fibrocartilagefænotype, hvor krympede, runde celler (fibrochondrocytter) er indlejret i et uorganiseret kollagennetværk med markant øget glycosaminoglycan (GAG) indhold2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Tidligere undersøgelser tyder på, at det forskellige mekaniske miljø produceret af senepåvirkning opretholder denne GAG-rige matrix ved at drive aflejringen af store aggregerede proteoglycaner, især aggrecan, selvom de underliggende mekanismer er uklare1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Mens fibrocartilage er et normalt træk i impinged regioner af sunde sener, afvigende proteoglycan metabolisme forbundet med overdreven fibrocartilage dannelse er et kendetegnende træk ved tendinopati, en almindelig og invaliderende sygdom, der uforholdsmæssigt opstår i kronisk impinged sener1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Derfor er senepåvirkning klinisk anerkendt som en vigtig ydre faktor, der driver flere af de mest almindelige sendinopatier, herunder rotatormanchetsygdom og insertionel akillessendinopati (IAT)50,51,52. I øjeblikket er behandling af tendinopati ineffektiv. For eksempel kræver ca. 47% af patienterne med IAT kirurgisk indgreb efter mislykket konservativ behandling med variable postoperative resultater53,54,55,56. På trods af det tilsyneladende forhold mellem impingement og tendinopati er de mekanobiologiske mekanismer, hvormed celler i impinged senesans og reagerer på deres mekaniske miljø, dårligt beskrevet, hvilket slører forståelsen af tendinopatipatogenese og resulterer i utilstrækkelig behandling.

Explant modeller er nyttige værktøjer i undersøgelsen af senemekanobiologi57,58. Som et første skridt i retning af at forstå mekanobiologien af senepåvirkning har flere tidligere undersøgelser undersøgt cellulær respons efter anvendelse af simpel uniaxial kompression på celler eller udskåret seneeksplanter 27,29,30,31,32,33,34,39. Imidlertid mangler celler in vitro ekstracellulære og pericellulære matricer, der letter belastningsoverførsel, sekvestrerer vigtige vækstfaktorer og cytokiner frigivet ved mekanisk deformation og tilvejebringer substrat for fokale adhæsionskomplekser, der spiller en rolle i mekanotransduktion57,59. Derudover kan hverken in vitro- og exciserede eksplantationsundersøgelser rekapitulere det multiaksiale mekaniske belastningsmiljø, der genereres af senepåvirkning in vivo, hvilket afhænger af anatomiske træk i det impingerede område 5,6. I forbindelse med indsættelsen af den impingerede akillessene omfatter dette omgivende væv såsom retrocalcaneal bursa og Kagers fedtpude 60,61,62,63. Omvendt tillader in vivo-modeller af senepåvirkning 25,28,36,37,38,64,65,66 minimal kontrol over størrelsen og hyppigheden af belastning, der påføres direkte på senen, hvilket er en velkendt begrænsning af in vivo-modeller til undersøgelse af senemekanobiologi57,58,67,68,69,70. På grund af udfordringer med at måle senebelastning in vivo er det interne belastningsmiljø, der genereres i disse modeller, ofte dårligt karakteriseret.

I dette manuskript præsenterer vi en brugerdefineret eksperimentel platform, der genskaber impingement af akillesseneindsættelsen på calcaneus inden for hele murin bagbenseksplanter, der, når de parres med denne vævskulturprotokol, opretholder levedygtighed over 7 dage i explantagekultur og giver mulighed for undersøgelse af de biologiske følgevirkninger af senepåvirkning. Platformen er bygget på en 3D-printet polymælkesyrebase (PLA), der danner grundlaget for fastgørelsen af grebene og 3D-printet PLA-volumenreduktionsindsats. Grebene bruges til at klemme overbenet og knæet proksimalt til Achilles myotendinøse kryds med det kaudale aspekt af bagbenet opad, så akillessenen kan afbildes ovenfra ved hjælp af en ultralydssonde eller omvendt mikroskop (figur 1A). Volumenreduktionsindsatsen glider langs et spor på basen og reducerer det krævede volumen vævskulturmedier. En flettet linje viklet rundt om bagpoten føres ud af platformen ved hjælp af basisdesignet og et 3D-trykt PLA-klip. Ved at trække i snoren er bagpoten dorsiflexed, og akillesseneindsættelsen er stødt mod calcaneus, hvilket resulterer i forhøjet tværgående trykbelastning 5,6 (figur 1A). Platformen er indeholdt i et akrylbad, der opretholder bagbenet eksplanter nedsænket i vævskulturmedier. Fastgørelse af den stramme streng til ydersiden af badet med tape opretholder ankeldorsiflexion for at producere statisk impingement af akillesseneindsættelsen. CAD-filer til 3D-printede komponenter leveres i flere formater (supplerende fil 1), hvilket giver mulighed for import til en række kommercielle og gratis open source CAD-software til modifikation, der passer til eksperimentelle behov. Hvis adgang til 3D-printere ikke er tilgængelig til fremstilling, kan CAD-filer leveres til online 3D-udskrivningstjenester, der udskriver og sender delene til lave omkostninger.

Det er vigtigt, at triceps surae-Achilles musculotendinous kompleks spænder over både knæ- og ankelled 71,72,73. Derfor påvirkes trækbelastning i akillessenen af knæbøjning. Knæforlængelse placerer akillessenen under spænding, mens knæbøjning reducerer spændinger. Ved først at strække knæet ud og derefter passivt dorsiflexere anklen, kan trykbelastninger ved den impingerede indsættelse overlejres på trækstammer. Omvendt, ved passivt dorsiflexing anklen med knæet bøjet, reduceres trækbelastningen, og trykbelastningen forbliver. Den nuværende protokol undersøger tre sådanne betingelser. 1) Ved statisk påvirkning er foden dorsiflexet til < 110° i forhold til skinnebenet for at ramme indsættelsen, med knæet bøjet for at reducere spændingen. 2) For baseline-spændingsgruppen forlænges anklen over 145 ° dorsiflexion med knæet strakt ud, hvilket genererer overvejende trækbelastning ved indsættelsen. 3) For den ubelastede gruppe dyrkes eksplanter i en petriskål med knæ og ankel i neutrale positioner i fravær af eksternt påført belastning. De ovenfor nævnte vinkler måles fotografisk i forhold til et koordinatsystem, hvor foden og skinnebenet er parallelle i en vinkel på 180° og vinkelret i en vinkel på 90°.

De vigtigste trin i protokollen omfatter 1) dissektion af bagbenseksplanter og omhyggelig fjernelse af hud og planttaris sener; 2) eksplantekultur efter en 48 timers forbehandling af dexamethason; 3) vævssektionering og histologisk farvning; og 4) farvebilledanalyse for at vurdere fibrobruskdannelse. Efter dissektion forbehandles hver eksplantation af bagekstremiteter i 48 timer i dyrkningsmedier suppleret med dexamethason74. Kontralaterale lemmer fra hver mus tildeles separate eksperimentelle grupper til parvis sammenligning, hvilket hjælper med at kontrollere biologisk variabilitet. Efter forbehandling placeres eksplanter i platforme som beskrevet ovenfor og dyrkes i yderligere 7 dage (figur 1B). Yderligere sammenligninger foretages med en forbehandlet (dag 0) gruppe, hvor eksplantater fjernes umiddelbart efter 48 timers forbehandling.

Efter explant-kultur trimmes bagbenene ned, formalin fikseres, afkalkes og indlejres i paraffin. Seriel sektionering i sagittal orientering giver visualisering af akillessenen fra det myotendinøse kryds til calcaneal indsættelse, samtidig med at sektionsdybden kan spores gennem hele senen. Terminal deoxynukleotidyltransferase (TdT)-medieret dUTP X-nick-mærkning (TUNEL) bruges til at visualisere DNA-skade sekundært til apoptose og vurdere levedygtighed. Toluidinblå histologi og brugerdefineret farvebilledanalyse udføres for at kvantificere ændringer i GAG-farvning. Toluidinblå farvede vævssektioner bruges derefter til SHG-billeddannelse til at karakterisere ændringer i collagefiberorganisation (figur 1B).

De fremlagte repræsentative resultater tyder på ændret histologisk farvning af den GAG-rige matrix og disorganisering af det ekstracellulære kollagennetværk genereret af 7 dages statisk impingement i modellen. Denne model kan bruges til at udforske molekylære mekanismer, der ligger til grund for impingement-drevet fibrocartilaginøs ændring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt dyrearbejde blev godkendt af University of Rochester Committee on Animal Resources.

1. Fremstilling af vævskulturmedier

  1. Kultur alle eksplanter i Dulbeccos modificerede ørnemedium (1x DMEM) med 1% v / v penicillin-streptomycin og 200 μM L-ascorbinsyre i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Til den indledende 48 timers forbehandling dyrkes hver enkelt i 70 ml dyrkningsmedier suppleret med 100 nM dexamethason74. Efter forbehandling lemmer kulturen i yderligere 7 dage uden dexamethason, skiftende medier hver 48-72 timer.
    BEMÆRK: Tilsætning af serum, såsom føtalt kvægserum, til kulturmediet anbefales ikke i overensstemmelse med anbefalingerne fra Wunderli, Blache og Snedeker57. Kort sagt repræsenterer serumfrie forhold bedre det avascular, næringsfattige senemikromiljø, der findes in vivo. Desuden kan serumtilskud fremme vævsnedbrydning under visse dyrkningsbetingelser75 og stimulere celleproliferation og migration ud af væv, begge træk ved senepatologi57.
  2. For den ubelastede gruppe dyrkes hver enkelt i 70 ml medier. For baseline-spændings- og statiske impingementgrupper kræver hver platform ca. 125 ml kulturmedier for at holde lemmen nedsænket. Denne volumen kan variere afhængigt af overbenets placering i grebene og 3D-printparametrene, primært udfyldningstætheden.

2. Eksplantatdissektion og forbehandling af dexamethason

  1. Aflive mus via CO2 indånding og sekundær cervikal dislokation eller i henhold til institutionelle retningslinjer. Denne protokol anvender C57BL/6-mus, der er mindre end 1 år gamle. Bagbenets størrelse vil stige med alderen og kan blive udfordrende at passe ind i grebene.
  2. Før dissektion overføres 70 ml forvarmede (37 °C) kulturmedier til en 100 mm (diameter) x 25 mm (højde) petriskål i et sterilt biologisk sikkerhedsskab (BSC). Tilsæt dexamethason for at opnå 100 nM arbejdskoncentration.
  3. Dissektioner kan udføres på bordpladen ved hjælp af absorberende underpuder, der arbejder hurtigt gennem dissektionen, før bagbenet eksplanter overføres til BSC. Saml de kirurgiske værktøjer, der kræves til denne dissektion, som omfatter glatte, lige, fine spidspincet; lige, fine spidstang med takkede tænder; og lige, skarp, fin saks.
  4. Til dissektion af bagbenseksplanter skal du placere musen i liggende stilling og identificere hofteleddet. Brug en fin saks til at lave et lille (5-10 mm) snit gennem huden, der ligger over det proksimale og forreste (kraniale) aspekt af overbenet.
  5. Træk snittet fra hinanden for at udvide dig, klem det blottede overben ved hjælp af fingrene, og træk forsigtigt huden distalt for at deglove bagbenet til ankelniveauet. Indsæt forsigtigt et sakseblad under huden langs fodens dorsale aspekt og lav et snit, der strækker sig til tæerne. Fortsæt med at trække huden distalt for at fjerne den helt.
  6. Placer musen for at visualisere indsættelsen af akillessenen på det bageste (kaudale) aspekt af calcaneus, nær anklen. Proksimal til indsættelsen af akillessenen ligger plantarissenen direkte ved siden af den mediale grænse af akillessenen og strækker sig distalt mod plantaraspektet af foden og passerer over det bageste aspekt af calcaneus.
  7. For at fjerne plantarissenen skal du forsigtigt indsætte en spids af den glatte, fine spidstang mellem de to sener og forlænge spidsen medialt under plantarissenen. Tegn spidsen proximally og rive gennem plantaris muskel. Brug fin spids, savtakket tang, tag fat i den løsrevne proksimale ende af plantaris senen og træk distalt for at fjerne.
  8. Ved hofteleddet skal du bruge en fin saks til at skære gennem bækkenet og isolere bagbenet. Brug saksen til at lirke det resterende bækken af og blotte lårbenshovedet.
  9. Overfør bagbenet eksplantat til BSC og ind i skålen, der indeholder cellekulturmedier med dexamethason. Flyt skålen ind i inkubatoren og forbehandle i 48 timer.

3. Eksplantatkultur og læsseplatforme

  1. Som forbehandlingen på 48 timer afsluttes, forvarmes tilstrækkelige mængder kulturmedier (afsnit 1). Fra dette tidspunkt vil der ikke blive tilføjet dexamethason til kulturmedier. På dette tidspunkt kan lemmer fra den forbehandlede (dag 0) gruppe fikseres, afkalkes og indlejres i paraffin til fremtidig sektionering, farvning og analyse.
  2. For den lossede gruppe, aspirer forbehandlingsmedier og overfører explants til friske petriskåle, tilsættes 70 ml kulturmedier hver og vender tilbage til inkubatoren.
  3. For baseline-spændingen og statiske impingementgrupper skal du forberede explant-platforme. Skær stykker sandpapir, der ligner grebpladerne. For den statiske impingementgruppe skal du skære stykker af flettet linje ca. 18 tommer i længden og binde en løs overhåndsknude halvvejs langs linjens længde. Riv stykker aluminiumsfolie til at dække hvert akrylbad og spray med 70% ethanol (EtOH). Overfør forberedelser til BSC.
  4. Hver platform inkluderer et akrylbad, base, volumenreduktionsindsats, klip og greb. Hvert greb inkluderer to plader og tre forskellige typer skruer, herunder en M5 x 0,8 mm gevind x 10 mm lang skrue, der fastgør grebene til bunden; to M6 x 1 mm gevind x 20 mm lange skruer, der forlænger pladerne for at fastspænde grebene; og fire M3 x 0,5 mm gevind x 14 mm lange skruer, der i kombination med fire kompressionsfjedre trækker pladerne tilbage for at åbne grebene.
  5. Anbring alle komponenter i sekundære beholdere, der er i stand til at fange alle kulturmedier i tilfælde af lækage. Nedsænk i ≥ 10% blegemiddelopløsning og blød i mindst 1 time. Skyl blegemiddelopløsningen af med ledningsvand (autoklave efter behov) og flyt ind i BSC.
    BEMÆRK: For fejlfinding af forurening skal du overveje at autoklavere alt ledningsvand eller bruge renset vand. Se diskussionen for yderligere tip, når du håndterer forurening.
  6. Brug M3-skruerne og kompressionsfjedrene til at fastgøre pladerne til grebene, fastgør grebene til bunden ved hjælp af M5-skruen, og indsæt M6-skruerne, indtil de går i indgreb med pladerne. Brug dobbeltklæbende tape til at fastgøre sandpapir til pladerne, og luk derefter grebene for at fremme sandpapirets vedhæftning til pladerne. Gentag for alle platforme.
  7. Når du er klar til at læsse en platform, skal du åbne grebene helt og placere overbenet og knæet mellem pladerne med den overfladiske overflade af akillessenen opad (figur 1A). Luk grebene løst for forsigtigt at holde dem på plads.
  8. Brug tang til at gribe fat i det blottede lårbenshoved eller fod og manipulere knæbøjningsvinklen, når du gradvist lukker grebene for at sikre på plads. For baseline-spændingsgruppen forlænges knæleddet som beskrevet tidligere. Når grebene strammes med knæet strakt, skal anklen naturligvis strække sig. For gruppen med statisk impingement bøjes knæleddet mellem grebene som beskrevet tidligere.
  9. For den statiske impingementgruppe skal du placere strengens overhåndsknude omkring den distale pote og stramme. Før snoren gennem en åbning i bunden placeret under eksplantatet og gennem klemmehullet. Placer basen i akrylbadet, og fastgør klemmen til badets øverste kant (figur 1A).
  10. Træk i snoren for at dorsiflex foden til mindst 110° i forhold til skinnebenet, og brug en permanent markør til at markere snoren, når den kommer ud af klemmen. Tag et fotografi af eksplantatet i denne position for senere at kvantificere dorsiflexionvinklen (figur 1A).
  11. Fjern basen, og fastgør volumenreduktionsindsatsen ved at glide langs et spor på basen. Placer basen (nu fastgjort til volumenreduktionsindsatsen) tilbage i akrylbadet, og flyt clipsen på den øverste kant. Træk i snoren for at vende tilbage til den oprindelige dorsiflexionvinkel ved hjælp af den markerede streng som rettesnor, og fastgør snoren til ydersiden af badet med tape for at opretholde statisk dorsiflexion.
  12. For baseline-spændingsgruppen skal du blot placere basen med volumenreduktionsindsats i akrylbadet, når eksplantet er placeret mellem grebene, og tage et fotografi til kvantificering af dorsiflexionvinklen.
  13. Tilføj 125 ml forvarmede (37 °C) kulturmedier til hver platform for at nedsænke eksplanter. Dæk toppen af badet med aluminiumsfolie, læg i en sekundær beholder og flyt ind i inkubatoren. Kultur i yderligere 7 dage, skift af medier hver 48-72 timer.
    BEMÆRK: Tape placeret på tværs af toppen af badet kan forhindre PLA-dele i at flyde.

4. Fiksering, afkalkning og paraffinindlejring

  1. Efter explant kultur, brug saks til at trimme tånegle / distale tæer og skære væk overbenet proksimalt til Achilles myotendinous krydset. Placer hvert trimmet ankelled i en behandlingskassette foret med skumbiopsipuder. Skub anklen ind i kassettehjørnet for at placere anklen på ca. 90 ° dorsiflexion, og luk kassetten for at holde den på plads.
  2. Fastgør i 3 dage i 10% neutralt bufret formalin (NBF) og afkalk i 2 uger i 14% ethylendiamentetraeddikesyre (EDTA) opløst i destilleret vand (diH2O) med pH justeret til 7,4-7,6 med iseddike.
  3. For at fjerne salte skylles prøverne grundigt tre gange i begge 1x fosfatbufret saltvand (PBS) efterfulgt af diH2O, 5 minutter hver. Udfør rutinemæssig prøvebehandling for paraffinhistologi: dehydrer gennem en gradueret serie EtOH, klar i xylen og infiltrer med paraffinvoks. Orienter og indlejr prøver i paraffin for at opnå sagittale vævssektioner gennem akillessenen i medial til lateral progression som beskrevet i afsnit 5 nedenfor (figur 1B).

5. Vævssektionering

  1. Med et mikrotomt trimmes forsigtigt ind i prøven, indtil sektionerne er parallelle med blokfladen. Trim groft ind i anklen fra det mediale aspekt af leddet, og stop, før du når den mediale grænse for indsættelsen af akillessenen.
  2. Overfør prøven til en isblok for at justere temperatur og hydrering, og skift klinger (eller skift til en frisk del af det aktuelle blad). Fortsæt med at snitte i prøven med en tykkelse på 10 μm og identificer omhyggeligt indgangen til indsættelsen af akillessenen med et brightfieldmikroskop. Når det er identificeret, skal du udføre sektionsnummer til seriel sektionssporing (dvs. vævsdybde) gennem hele indsættelsen af akillessenen.

6. Deparaffinisering / rehydrering og valg af dias

  1. For hvert assay nedenfor skal du vælge niveaumatchede vævssektioner fra hvert par kontralaterale lemmer. Før farvning placeres på et glidestativ og bevæger sig gennem 3 skift af xylen, 2 ændringer på 100% EtOH, 2 ændringer på 95% EtOH og 1 ændring på 70% EtOH, 5 minutter hver. Rehydrering afsluttes i diH2O.

7. TUNEL til vurdering af akillessenens levedygtighed

  1. Til TUNEL-mærkning skal du plette i henhold til producentens protokol. Der inkuberes i 20 μg/ml proteinase K i 20 minutter ved stuetemperatur og skylles i diH2O. Der inkuberes i 50 μL TUNEL pletopløsning (5 μL enzymopløsning, 45 μL etiketopløsning) i 1 time ved 37 °C. Skyl i diH2O. Monter med antifade reagens indeholdende DAPI og dæksel.
  2. Forestil dig indsættelsen af akillessenen ved hjælp af et fluorescensmikroskop med en 4x objektiv linse. Inkluder en DAPI-kanal (excitations-/emissionsbølgelængder = 360/460 nm) til visualisering af alle kerner, en TUNEL (TMR Red) kanal (excitations-/emissionsbølgelængder = 540/580 nm) til visualisering af apoptotiske kerner og om muligt en brightfield-kanal.
  3. Til billedanalyse skal du importere billeder til en billedanalysesoftware, der er egnet til ROI-baseret behandling, såsom FIJI / ImageJ eller MATLAB. Definer en region af interesse (ROI), der skitserer hele akillessenen i betragtning (figur 2A), eksklusive celler i epitenonen, der er meget modtagelige for død induceret af dissektion og pludselig ændring i miljøforhold, når de placeres i kultur.
  4. For at gøre dette skal du udføre ROI-valg i MATLAB ved at importere brightfield-billedet og bruge drawpolygon()-funktionen til at spore og omslutte senens grænser. MATLAB opretter et Polygon-objekt til ROI, som derefter kan anvendes på DAPI- og TUNEL-kanalbillederne for at maskere pixelintensitetsdata uden for ROI ved hjælp af createMask() for kun at analysere kerner i akillessenen.
  5. Importer DAPI- og TUNEL-kanalbillederne, og identificer en fluorescensintensitetstærskel til definition af apoptotiske (TUNEL+) kerner ved at normalisere til den maksimale fluorescensintensitet af apoptotiske kerner i ikke-levedygtige væv såsom knogler, muskler eller fedt, der tilfældigvis er fanget i vævssektionen. Når billederne er maskeret, skal du beregne brøkdelen af apoptotiske kerner (TUNEL + kerner / DAPI-kerner) inden for akillessenen.

8. Toluidinblå histologi til karakterisering af fibrobruskdannelse

  1. Når den er rehydreret (afsnit 6), overføres glidestativ med niveaumatchede vævssektioner fra kontralaterale eksplantatpar til 0,4% w/v toluidinblåt O i 0,1 M natriumacetatbuffer med pH justeret til 4,0 ved anvendelse af iseddike. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur, skyl derefter 3x i diH2O i 30 s hver.
  2. Dehydrer gennem tre ændringer på 95% EtOH og to ændringer på 100% EtOH, 30 s hver. Ryd gennem tre skift af xylen, 1 min hver. Dæksel med xylenbaseret monteringsmedium.
  3. Få 24-bit rød-blå-grøn (RGB) farvebilleder af indsættelsen af akillessenen. For eksempel skal du bruge en adapter til at interface et digitalt farvekamera til okularet i et simpelt brightfield-mikroskop med et 4x mål.
  4. For at kvantificere forskelle i toluidinblå farvning inden for kompressionssenfibrobrusk (CTF)16 ved indsættelse af akillessenen (figur 3A, B) skal du importere RGB-billeder til en billedanalysesoftware, der er i stand til at definere og styre flere ROI'er. Valgmulighederne omfatter valg- og ROI-styringsværktøjerne i FIJI/ImageJ eller billedbehandlingsværktøjskassen i MATLAB. Begynd med at indstille pixel/længdeskalaen.
    BEMÆRK: Softwarevalg overlades til forskerens skøn og er bestemt ikke begrænset til MATLAB eller FIJI / ImageJ. Forfatterne har leveret MATLAB-kode (supplerende fil 2), dokumentation, der beskriver implementering (supplerende fil 3) og et eksempelbillede (supplerende fil 4). Vi opfordrer forskere til at oversætte denne kode til alternative programmeringssprog til brug i anden software efter behov eller præference.
  5. Med billedet, der vises i den valgte software, skal du identificere skæringspunktet mellem den dybe senegrænse og calcaneus. Herfra spores proximalt 800 μm langs den dybe senegrænse for at etablere CTF's dybe grænse. Du kan f.eks. bruge funktionen drawpolyline() i MATLAB til interaktivt at tegne en polylinje over RGB-billedet. MATLAB opretter et Polyline-objekt, der indeholder linjens hjørner, som kan behandles og trimmes til en længde på 800 μm.
  6. Fra denne position skal du oprette CTF's proksimale grænse ved at tegne et linjesegment, der forbinder den overfladiske senegrænse, der er vinkelret på den lokale fiberorientering.
  7. Gå tilbage til skæringspunktet mellem den dybe senegrænse og calcaneus, og definer CTF'ens distale grænse ved at tegne et linjesegment, der forbinder til den overfladiske senegrænse langs det særskilte tidevandsmærke, der adskiller CTF fra fastgørelseszonen fibrocartilage (AZF)16 (figur 3A, B). Til sidst skal du generere CTF'ens overfladiske grænse ved at spore den overfladiske senegrænse, der skal omsluttes.
  8. For at beskrive rumlige variationer i GAG-farvning på tværs af indsættelsen divideres den samlede CTF i 4 kvadranter (figur 3A, B). Forbind midtpunktet af de dybe og overfladiske CTF-grænser med et linjesegment for at skabe en distal / proksimal grænse. Når du passerer gennem midtpunktet af denne grænse, skal du forbinde midtpunkterne i de distale og proksimale CTF-grænser langs fiberorienteringen for at skabe en overfladisk / dyb grænse.
  9. Disse 6 grænser giver information, der kan bruges til at definere ROI, der repræsenterer hele CTF, men også 4 kvadranter, der underinddeler CTF. I MATLAB skal du for eksempel kompilere hjørner, der definerer grænserne for hver enkelt ROI (CTF, kvadranter 1-4) i vektorer og bruge images.roi.Polygon() til at generere lukkede Polygon-objekter for hvert ROI.
  10. Når ROI'er er defineret, skal du omdanne RGB-pixeldata til farverummet Hue-Saturation-Value (HSV) ved hjælp af farvetransformator-plugin'et i FIJI, rgb2hsv()-funktionen i MATLAB eller anden software, der anvender de relevante transformationsligninger76. HSV-data kan derefter projiceres ind i 2D-farvetonemætningsrummet, hvor hver kombination af nuance og mætning koder for en unik farve (figur 3C).
  11. Inden for hvert investeringsafkast skal du beregne den gennemsnitlige nuance og mætning, der beskriver den gennemsnitlige pletfarve i ROI. Dette kan opnås i MATLAB, for eksempel ved at bruge Polygon-objekterne, der definerer hvert investeringsafkast, til at maskere billedet ved hjælp af createMask() for at analysere pixeldata om farvetonemætning specifikt inden for hvert investeringsafkast.
  12. Definer en anden lille ROI inden for periosteal fibrocartilage (PF)16 (figur 3A, B) og beregn gennemsnitlig nuance og mætning. Beregn derefter den euklidiske afstand, der adskiller den gennemsnitlige farve i hvert ROI for CTF til PF (figur 3C).
    Equation 1
    BEMÆRK: Den euklidiske afstandsberegning beskriver graden af lighed mellem den gennemsnitlige farve af ROI til PF, et kendetegnende fibrocartilaginøst væv 16,17,77. En mindre euklidisk afstand indikerer en ROI-farve, der er mere fibrocartilaginøs i udseende.
  13. Brug denne afstand til at beregne fibrokartilagescore, som antager en maksimumværdi på 1, hvis ROI-farven er identisk med PF-farven, og en minimumsværdi på -1, hvis ROI- og PF-farven når maksimal adskillelse inden for farvetonemætningsfarverummet.
    Equation 2
  14. Gennemsnitlige data for nuance, mætning og fibrocartilage score inden for hver ROI på tværs af vævssektioner fra hvert lem. Udfør parrede statistiske sammenligninger mellem grupper af kontralaterale lemmer.

9. SHG-billeddannelse for at undersøge ændring i kollagennetværksorganisation

  1. Udfør SHG-billeddannelse af Tolutidins blå farvede sektioner ved hjælp af et kapabelt mikroskopsystem med en 20x objektlinse. Få z-stakke gennem sektionstykkelsen, og udfør flisescanning efter behov for fuldt ud at fange indsættelsen af akillessen.
  2. Importer SHG-billeder til en foretrukken billedanalysesoftware, og definer ROI'er, der omfatter og underinddeler CTF ved indsættelse af akillessenen som beskrevet for toluidinblå billedanalyse i afsnit 8 (figur 4A, B).
  3. Hvis SHG-billeder importeres til MATLAB, skal du bruge fremgangsmåden til at definere CTF-ROI'er i MATLAB som beskrevet i afsnit 8. Når du har defineret ROI'er, skal du overføre ROI-koordinater til FIJI ved at eksportere ROI-hjørner fra MATLAB som .txt-filer og importere til FIJI ved hjælp af File > Import > XY-koordinater. Overlejr markeringen, og send den til ROI-manageren til analyse.
  4. For at kvantificere kollagenorganisation skal du bruge Directionality-pluginet i FIJI, som udfører Fourier-spektrumanalyse for at beregne fordelinger af fiberorienteringer på tværs af små vinduer, der spænder over et ROI. Spredningen af denne fordeling, kaldet dispersion, er omvendt relateret til fiberjustering.
    BEMÆRK: Kollagenfibre kan antage variable orienteringer i forskellige vinduer på tværs af CTF på grund af senens bruttokrumning snarere end fraværet af justering / organisation. For bedre at skelne ændringer i kollagenorganisationen fra senens bruttokrumning ved indsættelsen er det nødvendigt at definere mindre ROI'er.
  5. Importer SHG-billeder til FIJI, og indstil pixel / længdeskalaen. Projicer data om maksimal pixelintensitet i et sammensat 2D-billede, og føj investeringsafkast til ROI Manager. Overlejr sekventielt hvert CTF-investeringsafkast på billedet, og tegn 10 små under-ROI'er af ensartet størrelse inden for ROI'et, og tilføj under-ROI'erne til ROI-manageren.
  6. Inden for hver sub-ROI skal du køre retningsbestemt plugin i FIJI for at beregne fiberspredning. Gennemsnitlige spredningsdata på tværs af sub-ROI'er inden for hver CTF-ROI og gennemsnitlige spredningsdata inden for hver CTF-ROI på tværs af sektioner fra hver explant. Udfør parrede statistiske sammenligninger mellem grupper af kontralaterale lemmer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative billeder af TUNEL farvede vævssektioner viser minimale apoptotiske kerner i kroppen af akillessenen efter 7 dages eksplantatkultur på tværs af eksperimentelle grupper (figur 2A). Kvantificering af disse billeder giver bevis for, at vævskulturprotokollen opretholder op til 78% levedygtighed i gennemsnit inden for akillessenen efter 7 dages eksplantatkultur under belastningsforhold (figur 2B).

Kvalitativt værdsættes forbedret toluidinblå farvning efter 7 dages statisk impingement sammenlignet med ubelastede kontroller (figur 3A, B), især i dybe kvadranter ved siden af calcaneus, hvor vi tidligere har målt maksimal tværgående trykbelastning 5,6. Kvantificering af disse toluidinblåfarvede vævssektioner indikerer signifikant ændring i nuance (figur 3D), mætning (figur 3E) og fibrocartilage score (figur 3F) efter 7 dages statisk impingement sammenlignet med kontralaterale ubelastede eksplanter. Denne ændrede GAG-farvning repræsenterer sandsynligvis fibrocartilagedannelse sekundært til statisk impingement inden for denne model. Statistisk signifikante forskelle i mætning og fibrocartilage score blev først påvist i kvadrant 1 efter 7 dages baselinespænding (figur 3E,F). Desuden faldt mætning og fibrocartilage score i forhold til kontralaterale ubelastede sener, en modsat tendens sammenlignet med statisk impingement. Disse data kan understøtte hypotesen om, at trækbelastning kan dæmpe eller vende impingementdrevet fibrocartilagedannelse og berettiger yderligere undersøgelse i fremtiden.

Kvantificering af SHG-billeddannelse antyder subtil, men signifikant ændring i kollagenfiberorientering efter 7 dages statisk impingement, igen i det dybe og distale område ved siden af calcaneus, som angivet ved signifikante forskelle i dispersion (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Explant platform og eksperimentelt design. (A) Fotografisk og skematisk gengivelse af explant-platformen. (Øverst) Fotografi af en hel murin bagben eksplant lastet ind i platformen, med kritiske komponenter mærket. (Nederst) Skematisk afbildning af insertionel akillesseneimpingement fremkaldt af passivt påført ankeldorsiflexion i denne explant-model. (B) Skematisk oversigt over studiedesign og eksplantatkultur. Hind lemmer explants forbehandles i 100 nM dexamethason i 48 timer74. Fra hver mus dyrkes en bagbenseksplante derefter i en skål, der aflæses i 7 dage, mens det kontralaterale lem lægges i den eksperimentelle platform for at placere akillessenen under enten baselinespænding eller statisk impingement i 7 dage. Serielle vævssektioner fra kontralaterale par lemmer farves enten med toluidinblå for at visualisere GAG-rigt væv eller bruges til TUNEL-farvning. Toluidin blå farvede sektioner bruges derefter til SHG-billeddannelse til vurdering af kollagenorganisation. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Eksplanteringslevedygtighed. (A) Repræsentative billeder af TUNEL-farvede sektioner fra forbehandlede (dag 0) eksplantater (øverst til venstre), ubelastede sener (øverst til højre), sener, der opretholdes ved baselinespænding (nederst til venstre) og statisk påvirkede sener (nederst til højre). Akillessenen er skitseret i en stiplet hvid linje og mærket AT, mens calcaneus er skitseret i en solid gul linje og mærket C. Apoptotiske kerner vises røde (TUNEL), alle kerner vises blå (DAPI). (B) Kvantificeringen af døde cellefraktioner var i gennemsnit mindre end 22% for grupperne med ubelastet, baselinespænding og statisk impingement. Data repræsenterer gennemsnitlig ± standardafvigelse. Outliers er til stede i disse datasæt med mere end 50% celledød, hvilket kan tilskrives seneskader induceret af dårlig dissektionsteknik. Den gennemsnitlige døde cellefraktion med statistisk outliers fjernet er mindre end 15% for alle grupper. Der blev ikke fundet nogen statistisk signifikant forskel i celledød mellem ubelastede, baseline-spændinger og statiske impingementgrupper (p < 0,05). Dag 0 kontrol: n = 8. Losset: n=18. Baseline spænding: n = 8. Statisk impingement: n = 12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Toluidinblå histologi. (A) Repræsentativ toluidinblå plet efter 7 dages ubelastet kultur, der viser den komprimerende senefibrocartilage (CTF), fastgørelseszone fibrocartilage (AZF) og periosteal fibrocartilage (PF) ved akillessition16. Calcaneus mærket C. ROI, der fanger CTF, er skitseret med rødt og er yderligere opdelt i 4 kvadranter for at give yderligere rumlig information. (B) Repræsentativ toluidinblå plet efter 7 dages statisk impingement med forbedret farvning af CTF, især i kvadrant 1, hvor vi tidligere har målt maksimale tværgående trykstammer 5,6. (C) Skematisk oversigt over farvetonemætningsfarverummet, der bruges til farvebilledanalyse. Farven beskrives ved en kombination af farvetone (0°-360°) og mætning (0-255)76. Den gennemsnitlige farve i hver ROI normaliseres til den gennemsnitlige farve på PF ved at beregne euklidisk afstand, der adskiller farver i hver ROI fra farven i PF, hvilket giver en normaliseret fibrocartilage score. (D-F) Ændringer i toluidinblå plet efter 7 dages statisk impingement (øverst) og baseline spænding (bund) sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. Data repræsenterer gennemsnitlig ± standardafvigelse. (D) Kvantificering af farvetone indikerer signifikante forskelle i gennemsnitlig farvetone på tværs af alle regioner efter 7 dages statisk påvirkning sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. Der blev ikke påvist nogen lignende tendens efter 7 dages baselinespænding sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. E) Kvantificering af mætning med signifikante ændringer i gennemsnitlig mætning på tværs af hele CTF og inden for kvadrant 1-3 efter 7 dages statisk impingement sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. Omvendt blev signifikante forskelle først påvist i kvadrant 1 efter 7 dages baselinespænding, hvor mætningen faldt sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. (F) Kvantificering af fibrocartilage score, med signifikante ændringer i fibrocartilage score på tværs af alle regioner efter 7 dages statisk impingement sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. Omvendt blev signifikante forskelle først påvist i kvadrant 1 efter 7 dages baselinespænding, hvor fibrocartilage score faldt sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. Dataene tyder på forbedret GAG-plet forårsaget af statisk impingement, der indikerer øget fibrocartilagedannelse. Data, der beskriver den samlede CTF, blev sammenlignet ved hjælp af Wilcoxon matched-pairs signerede rangtest. Kvadrantdata blev sammenlignet ved hjælp af gentagne målinger tovejs ANOVA med Šídáks multiple sammenligningstest. *p < 0,05. **p < 0,01. p < 0,005. p < 0,001. Baseline spænding vs. ubelastet: n = 6 par. Statisk impingement vs. losset: n = 8 par. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: SHG-billeddannelse. (A) Repræsentativt SHG-billede efter 7 dages losset kultur sammenlignet med (B) 7 dages statisk påvirkning. CTF er skitseret med rødt og opdelt i 4 kvadranter som mærket, i overensstemmelse med ROI'er i toluidinblå analyse ovenfor. (C) Inden for hver kvadrant blev Fourier-spektrumanalyse udført i et bevægeligt undervindue ved hjælp af Directionality-pluginet i FIJI. Spredningen af fordelingen af fiberorienteringer inden for hvert undervindue kaldes dispersion (°) og er omvendt relateret til fiberjustering. Dispersion = 0° repræsenterer perfekt parallel justering af fibre. Stigende dispersion repræsenterer faldende kollagenfiberjustering. Data repræsenterer middelværdien ± standardafvigelsen. Statistisk signifikante forskelle i dispersion blev påvist i kvadrant 1 efter 7 dages statisk impingement sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener, hvilket tyder på øget kollagendisorganisering. Kvadrantdata blev sammenlignet ved hjælp af gentagne målinger tovejs ANOVA med Šídáks multiple sammenligningstest. * p < 0,05. Statisk impingement vs losset: n = 5 par. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: CAD-filer. Disse CAD-filer, der er kompileret i flere filformater, kan bruges til at 3D-udskrive platformbasen, volumenreduktionsindsatsen og klippet. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: MATLAB-filer. De kompilerede MATLAB-filer muliggør kvantificering af toluidinblå histologi som beskrevet i afsnit 8 i protokollen for at vurdere fibrocartilagedannelse gennem rumlig ændring i GAG-farvning ved indsættelsen af akillessenen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Retningslinjer for implementering af MATLAB-kode. Dette dokument beskriver en pipeline til kvantificering af ændringer i GAG-farvning ved indsættelse af akillessenen via billedanalyse af toluidinblå histologi ved hjælp af den medfølgende MATLAB-kode. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: Eksempel på billede af toluidinblå histologi. Dette RGB-farvebillede af toluidinblå histologi kan bruges til at udføre den medfølgende MATLAB-kode. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den eksperimentelle murine bagbenseksplantatplatform parret med vævskulturprotokollen beskrevet i denne undersøgelse giver en passende model til undersøgelse af mekanobiologien af impingementdrevet fibrocartilagedannelse ved indsættelsen af akillessenen. Nytten af denne explant-model demonstreres af de repræsentative resultater, som indikerer vedligeholdelse af cellelevedygtighed samtidig med signifikant og rumligt heterogen ændring i toluidinblå farvning efter 7 dages statisk impingement. Disse resultater tyder på ændret metabolisme af GAG-rige matrixmolekyler sekundært til mekanisk impingement, i overensstemmelse med andre modeller og kliniske undersøgelser 3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,44,49. Derudover blev subtile, men signifikante ændringer påvist i kollagenorganisation via SHG-billeddannelse efter 7 dages statisk impingement, i overensstemmelse med kliniske træk ved impingementassocieret tendinopati og in vivo-modeller af seneimpingement 28,37,38,43,44,49,64.

Tidligere bestræbelser på at udforske de biologiske følgevirkninger af senepåvirkning har anvendt simpel kompression på isolerede seneceller27,29. Når en mekanobiologisk interessemekanisme er blevet identificeret, giver disse modeller overlegne terapeutiske screeningsplatforme sammenlignet med vores explant-model. Resultaterne af disse undersøgelser skal dog fortolkes med forsigtighed, da isolerede celler dyrket in vitro mangler et tredimensionelt ekstracellulært miljø, der påvirker mekanorespons57,59. Derudover viser celler isoleret fra andre kollagenøse væv (f.eks. brusk) ændret mekanofølsom ionkanalaktivitet, når de udfordres mekanisk in vitro i fravær af et ekstracellulært miljø78,79. Den præsenterede model adresserer disse begrænsninger ved at give en platform til at udsætte in situ seneceller inden for levedygtige eksplantater til fysiologisk relevante belastningsforhold.

Explant modeller er populære eksperimentelle systemer til sondering af senebiologi og fysiologi57,58. I den specifikke sammenhæng med senepåvirkning har flere tidligere undersøgelser anvendt delvise og hele seneeksplanter til at udforske senecellerespons på kunstig uniaxial kompression 30,31,32,33,34,39. Mens disse undersøgelser viste en direkte forbindelse mellem uniaxial kompression og fibrocartilagedannelse, er det in vivo mekaniske belastningsmiljø, der genereres af senepåvirkning, multiaksialt og afhænger af anatomiske træk i det impingerede område 5,6. For eksempel påvirkes belastningsmiljøet skabt ved påvirkning af calcaneus på akillessenen under ankeldorsiflexion af indsættelsesvinklen, fastgørelsesområdet og tilstedeværelsen af omgivende blødt væv 60,61,62,63,80,81. Vores explant-platform bevarer disse eksterne strukturer og gengiver det multiaksiale belastningsmiljø, der genereres af impingement, samtidig med at cellerne opretholdes i deres oprindelige miljø6.

Dyremodeller har været grundlæggende for at underbygge et umiddelbart forhold mellem mekanisk impingement og de vigtigste træk ved senefibrobrusk og patologi, som deler analoge fænotyper 1,25,28,37,64,65,66. I de seneste årtier har størstedelen af in vivo-impingementforskning brugt gnavermodeller til at studere rotatormanchetsygdom gennem kirurgisk reduktion af det subakromiale rum for kunstigt at påvirke rotatormanchetsenerne. Disse dyremodeller er blevet brugt til at beskrive den cellulære og molekylære patogenese af impingement tendinopati in vivo og kan udvides til at evaluere nye terapeutiske strategier til fremme af klinisk oversættelse af impingement forskning 36,37,38,66,82,83,84,85.

Etablerede in vivo-modeller af senepåvirkning har imidlertid flere vigtige begrænsninger i studiet af mekanobiologi57,58. Disse modeller introducerer eller fjerner kirurgisk en ekstern kilde til senepåvirkning og genoptager fysisk aktivitet (fri buraktivitet, tvungen løbebånd osv.) Denne fremgangsmåde mangler kontrol over størrelsen, orienteringen og hyppigheden af kraft, der påføres direkte på senen i hele eksperimentets varighed. På grund af vanskeligheden ved at måle vævsstamme in vivo tilbyder disse modeller begrænset kontrol over eller karakterisering af det mekaniske miljø, der genereres i senen som reaktion på impingement. Denne begrænsning er velkendt inden for senemekanobiologisk forskning 57,58,67,68,69,70. Andre steder er sofistikerede eksperimentelle platforme designet til at anvende kontrolleret mekanisk overbelastning (træthed) direkte på sener in vivo under anæstesi 67,68,69. Disse modeller styrer anvendelsen af mekaniske stimuli i korte perioder under anæstesi og giver ingen kontrol over belastningshistorikken gennem resten af eksperimentet, da dyrene genoptager normal buraktivitet i dage til uger efter mekanisk overbelastning. Explant-modellen beskrevet i denne protokol tilbyder kontrolleret recept på akillessenepåvirkning for at generere målbare og velbeskrevne mønstre af vævsstamme6, hvilket giver mulighed for streng undersøgelse af impingement mekanobiologi. Det skal dog bemærkes, at denne explant-model ikke overflødiggør in vivo-undersøgelse af senepåvirkning, men snarere tjener som et supplerende værktøj til at berige data afledt af disse uundværlige dyremodeller. Cellulære og molekylære veje defineret i forhold til impingementmekanik ved hjælp af denne explant-model kan karakteriseres in vivo og evalueres som terapeutiske mål ved hjælp af dyremodeller i en komplementær tilgang til forbedring af klinisk oversættelse af mekanobiologisk forskning. Kraften i denne integrerede strategi udnyttes i andre områder af senemekanobiologisk forskning 58,86,87,88, og denne explant-model giver sin anvendelse til senepåvirkning.

Explant-modellen er ikke uden begrænsninger. Som med alle explant-modeller kan mekanobiologi kun studeres over relativt korte tidsskalaer, mens vævet forbliver levedygtigt57,89. Mens modellen er et kraftfuldt værktøj til at studere den umiddelbare cellulære reaktion på mekanisk impingement, er den ikke egnet til at studere kronisk senesygdom forbundet med impingement. Derudover er modellen ikke i stand til at redegøre for systemisk respons og vævskrydstale, da blodforsyning og neural kommunikation ikke opretholdes. Ikke desto mindre giver modellen en platform til at afgrænse endogene senecellers indre respons på mekanisk påvirkning. En yderligere begrænsning af modellen er, at ifølge tidligere forskning 32,90,91,92 forventer vi, at mange store GAG-rige proteoglycaner diffunderer ud af senen under forbehandling og tidlige tidspunkter for eksplantatkultur, især fragmenter af aggregerede proteoglycaner, der ikke er forankret til jordmatrixen. Derfor vil ændringer i GAG-plet sekundært til impingement i modellen sandsynligvis afspejle ændringer i nyligt syntetiserede GAG-rige makromolekyler, der endnu ikke er blevet kataboliseret og forbliver forankret i den ekstracellulære matrix. I betragtning af at disse GAG-rige proteoglycaner lokaliserer til det pericellulære rum 22,30,93,94,95, kan explant-modellen lette undersøgelsen af PCM-remodellering sekundært til senepåvirkning.

Dissektionen af murine bagbenseksplanter beskrevet i denne protokol kræver øvelse, men dygtig teknik kan opnås hurtigt. Komplet degloving (dvs. hudfjerning) kan vise sig at være udfordrende, især omkring cifrene i bagpoten. Mens huden omkring tæerne ikke behøver at blive fjernet helt, forstærker den sterilitet gennem hele kulturen, da bakterier er til stede på huden og pelsen.

Det sværeste aspekt af dissektionen er fjernelse af plantaris senen medial til akillessenen proximalt og passerer overfladisk til akillessenen distalt. Plantaris muskel-sene enhed spænder over knæ og ankel leddene i tæt forbindelse med triceps surae og akillessenen 81,96,97,98,99. Mekaniske belastninger, der overføres over det bageste aspekt af anklen under passiv ankeldorsiflexion, fordeles mellem plantaris og akillessener, og plantarissenen er kendt for at bære høj belastning in vivo100,101. Derudover er anatomisk variabilitet i den menneskelige plantaris velbeskrevet 96.102.103, og mens denne variabilitet er mindre udbredt hos gnavere97, har den tilbøjelighed til at påvirke det mekaniske miljø inden for akillessenen in situ. I overensstemmelse med tidligere teknikker, der er anvendt til at måle belastning i akillessenen in situ 6,104, bør plantarissenen fjernes for at kontrollere det indre belastningsmiljø, der genereres af eksternt påført senepåvirkning.

Omhyggelig fjernelse af plantaris er nødvendig for at undgå dissektionsinduceret celledød i akillessenen, og variabiliteten i celleapoptose, der er til stede i dataene (figur 2B), kan afspejle dissektionsinduceret skade på grund af dårlig dissektionsteknik. Fjernelse af plantaris senen drager fordel af fine spids tang til omhyggeligt at adskille plantaris fra Achilles og frigøre plantaris muskel-sene kompleks nært. Serrated tang hjælper med at gribe den proksimale frie ende af plantaris senen for at trække distalt rundt om calcaneus og mod potens cifre for fuldstændig fjernelse. Lee og Elliott giver en nyttig anatomisk beskrivelse af rotteplantaris og akillessener og tilhørende muskulatur97.

Mens vi fandt, at dissektionsteknikken beskrevet i denne undersøgelse var tilstrækkelig til at sikre sterilitet, kan protokollen justeres eller ændres efter behov i indstillinger, hvor opretholdelse af sterilitet viser sig udfordrende. Kirurgiske værktøjer kan autoklaveres, betadinopløsning kan påføres topisk på huden, og dissektion kan udføres i et biologisk sikkerhedsskab. Vi har fundet ud af, at hurtig og effektiv benchtop dissektion er kritisk og gør det muligt hurtigt at overføre dissekerede lemmer til sterile medier i et biologisk sikkerhedsskab, efter at den sterile grænse, som huden giver, er overskredet.

Et andet primært mål for fejlfinding af forurening er den teknik, der anvendes til sterilisering af platformkomponenter. I vores hænder har vi haft konsekvent succes med enkle blødgør i ≥ 10% blegemiddelopløsning med tilstrækkelig skylning i ledningsvand uden autoklavering. Yderligere sterilisering ved hjælp af 70% ethanol kan påføres efter behov, men vær opmærksom på, at enhver komponent 3D-printet med PLA er uforenelig med EtOH og vil fordreje. Derudover kan alle dele af platformen bortset fra akrylbadet og 3D-printede PLA-komponenter autoklaveres, og komponenter gennemblødt i ≥ 10% blegemiddelopløsning kan skylles med autoklaveret eller renset vand. For at undgå rust opfordres det til at vaske og håndtørre alle metalkomponenter umiddelbart efter hvert forsøg.

Metoden til kvantificering af toluidinblå farvning for at karakterisere fibrocartilagedannelse beskrevet i denne protokol anvender en innovativ brugerdefineret farvebilledanalyse, der tilbyder bred anvendelse til seneforskning. Væsentlige fordele opnås ved at konvertere pixeldata fra RGB til HSV-farverum76. Her koder nuance for en dominerende bølgelængde som en karakteristisk farve fra 0°-360°, mens mætning definerer renheden af hver nuance fra 0-255. Værdi beskriver omvendt farvens lysstyrke, og som sådan adskiller HSV-farveskemaet lysstyrke (værdi) fra farve (nuance, mætning). I forbindelse med histologiske analyser er HSV-pixeldata mere robuste over for ændringer i lystransmission under mikroskopi og variationer i vævssnittykkelse76. Derudover giver arbejde i HSV-farverummet mulighed for afgrænsning af specifikke bølgelængder af interesse (via nuance) afhængigt af den histologiske plet76, f.eks. nuancer omkring 240 ° for toluidinblå farvning.

Et innovativt aspekt af toluidinblå billedanalyse, der præsenteres i denne undersøgelse, er fibrocartilage score, en metrik, der er relateret til den euklidiske afstand, der adskiller farven på hver ROI til farven på periosteal fibrocartilage. Den periosteale fibrocartilage fremstår som en sekundær brusk umiddelbart efter fødslen, mens den kompressionsformede senefibrocartilage er fraværende postnatalt og ligesom andre sesamoid fibrocartilages synes at være reguleret af mekanisk efterspørgsel i regioner med forhøjet senekompression 16,17,28,77. Ved at sammenligne fibrocartilage score mellem eksperimentelle grupper, kan vi bestemme ikke kun om Toluidin blå pletfarve ændrer sig sekundært til impingement, men om denne ændring resulterer i et udseende tættere på fibrocartilage. Denne analyse kan udvides til andre populære GAG-pletter såsom Alcian blå og Safranin O, såvel som andre regioner af senefibrocartilage og fibrocartilaginous seneenthese, så længe et kontrolvæv er til stede beslægtet med periosteal fibrocartilage. For eksempel kan ændringer i GAG-farvning i knæets sener og ledbånd normaliseres via fibrocartilage score til farvning i fibrocartilaginous menisci.

Et afgørende aspekt af denne protokol er seriel vævssektionering og sporing af sektionsniveau gennem akillessenen, hvilket kræver gentagelig paraffinindlejring og omhyggelig identifikation af indtræden i akillesseneindsættelsen til sporing af sektionsdybde. Denne sektions- og farvningsprotokol kræver utvivlsomt øvelse og forfining, men kan udvides til kryosektion.

Den histologiske tilgang, der er beskrevet i dette manuskript, kan let udvides til immunhistokemi eller immunofluorescens. I denne henseende er et vigtigt aspekt af ovennævnte eksperimentelle design den parvise sammenligning af kontralaterale lemmer fra hver mus. Her trækkes alle statistiske sammenligninger mellem vævssektioner på sammenligneligt sektionsniveau gennem akillessenen fra kontralaterale lemmer fra den samme mus tildelt forskellige eksperimentelle grupper. Denne strategi hjælper med at kontrollere biologisk variabilitet. Derudover farves niveaumatchede par kontralaterale vævssektioner på det samme diasstativ samtidigt (histologi) eller på glide samtidigt ved hjælp af identiske arbejdsløsninger til alle reagenser, buffere og antistofopløsninger (immunfarvning) for at hjælpe med at kontrollere for plet-til-plet-variabilitet, der er forbundet med histologi og immunmærkning, samt anatomisk heterogenitet afhængigt af sektionsniveau, placering og orientering.

Flere andre ændringer af protokollen beskrevet i dette manuskript kan implementeres for yderligere undersøgelse af yderligere forskningsspørgsmål. For eksempel, mens de repræsentative data, der leveres her, er fokuseret på 7 dages statisk impingement, kan denne tilgang tilpasses til at undersøge de biologiske følgevirkninger af intermitterende eller cyklisk impingement ved at koble strengen viklet rundt om bagpoten gennem klemmen til en mekanisk aktuator såsom en sprøjtepumpe. Derudover giver platformen mulighed for at forhøre molekylære mekanismer af interesse ved at supplere kulturmediet med små molekyleagonister/antagonister eller ved at bruge bagekstremiteter fra transgene musestammer.

Afslutningsvis har vi præsenteret en ny murine bagben explant model til undersøgelse af mekanobiologi underliggende akillesseneimpingement. Dette er udstyret med en vævskulturprotokol, der opretholder cellelevedygtighed på tværs af belastningsforhold over 7 dage. Denne model rekapitulerer impingement-drevet fibrocartilage dannelse og kollagenøs ændring som beskrevet i andre modelsystemer samt i degenerativ senesygdom. Den eksperimentelle platform muliggør kontrolleret anvendelse og kvantificering af mekaniske belastningsmønstre og giver derfor en fremragende model til streng undersøgelse af impingement mekanobiologi. Denne model kan anvendes til at forhøre molekylære mekanismer af interesse for at identificere potentielle terapeutiske mål i behandlingen af insertionelle sendinopatier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige for støtte og hjælp fra Jeff Fox og Vidya Venkatramani fra University of Rochester Center for Muskuloskeletal Research's Histology, Biochemistry, and Molecular Imaging (HBMI) Core, delvist finansieret af P30AR06965. Derudover vil forfatterne gerne takke Center for Light Microscopy and Nanoscopy (CALMN) ved University of Rochester Medical Center for hjælp med multifotonmikroskopi. Denne undersøgelse blev finansieret af R01 AR070765 og R01 AR070765-04S1 samt 1R35GM147054 og 1R01AR082349.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox - Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cook, J. L., Purdam, C. Is compressive load a factor in the development of tendinopathy. Br J Sports Med. 46 (3), 163-168 (2012).
  2. Benjamin, M., Qin, S., Ralphs, J. R. Fibrocartilage associated with human tendons and their pulleys. J Anat. 187 (Pt 3), 625-633 (1995).
  3. Benjamin, M., Ralphs, J. R. Fibrocartilage in tendons and ligaments - an adaptation to compressive load. J Anat. 193 (4), 481-494 (1998).
  4. Benjamin, M., Theobald, P., Suzuki, D., Toumi, H. The anatomy of the Achilles tendon. The Achilles Tendon. 3, 5-16 (2007).
  5. Chimenti, R. L., et al. Insertional achilles tendinopathy associated with altered transverse compressive and axial tensile strain during ankle dorsiflexion. J Orthop Res. 35 (4), 910-915 (2017).
  6. Mora, K. E., et al. Ultrasound strain mapping of the mouse Achilles tendon during passive dorsiflexion. J Biomech. 132, 110920 (2022).
  7. Pringels, L., et al. Intratendinous pressure changes in the Achilles tendon during stretching and eccentric loading: Implications for Achilles tendinopathy. Scand J Med Sci Sports. 33 (5), 619-630 (2023).
  8. Koob, T. J., Vogel, K. G. Site-related variations in glycosaminoglycan content and swelling properties of bovine flexor tendon. J Orthop Res. 5 (3), 414-424 (1987).
  9. Vogel, K. G., Koob, T. J. Structural specialization in tendons under compression. Int Rev Cytol. 115, 267-293 (1989).
  10. Vogel, K. G., Ordög, A., Pogány, G., Oláh, J. Proteoglycans in the compressed region of human tibialis posterior tendon and in ligaments. J Orthop Res. 11 (1), 68-77 (1993).
  11. Vogel, K. G., Sandy, J. D., Pogány, G., Robbins, J. R. Aggrecan in bovine tendon. Matrix Biol. 14 (2), 171-179 (1994).
  12. Robbins, J. R., Vogel, K. G. Regional expression of mRNA for proteoglycans and collagen in tendon. Eur J Cell Biol. 64 (2), 264-270 (1994).
  13. Vogel, K. Repetitive motion disorders of the upper extremity. Gordon, S. I., Blair, S. J., Fine, L. J. , American Academy of Orthopedic Surgeons, Michigan. (1995).
  14. Benjamin, M., Tyers, R. N., Ralphs, J. R. Age-related changes in tendon fibrocartilage. J Anat. 179, 127-136 (1991).
  15. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: a structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anat Rec. 231 (2), 167-177 (1991).
  16. Rufai, A., Benjamin, M., Ralphs, J. R. Development and ageing of phenotypically distinct fibrocartilages associated with the rat Achilles tendon. Anat Embryol (Berl). 186 (6), 611-618 (1992).
  17. Rufai, A., Ralphs, J. R., Benjamin, M. Ultrastructure of fibrocartilages at the insertion of the rat Achilles tendon. J Anat. 189 (Pt 1), 185-191 (1996).
  18. Waggett, A. D., Ralphs, J. R., Kwan, A. P. L., Woodnutt, D., Benjamin, M. Characterization of collagens and proteoglycans at the insertion of the human achilles tendon. Matrix Biol. 16 (8), 457-470 (1998).
  19. Ralphs, J., et al. Regional differences in cell shape and gap junction expression in rat Achilles tendon: relation to fibrocartilage differentiation. J Anat. 193 (pt 2), 215-222 (1998).
  20. Milz, S., et al. Three-dimensional reconstructions of the Achilles tendon insertion in man. J Anat. 200 (Pt 2), 145-152 (2002).
  21. Tischer, T., Milz, S., Maier, M., Schieker, M., Benjamin, M. An immunohistochemical study of the rabbit suprapatella, a sesamoid fibrocartilage in the quadriceps tendon containing aggrecan. J Histochem Cytochem. 50 (7), 955-960 (2002).
  22. Esquisatto, M. A., Joazeiro, P. P., Pimentel, E. R., Gomes, L. The effect of age on the structure and composition of rat tendon fibrocartilage. Cell Biol Int. 31 (6), 570-577 (2007).
  23. Matuszewski, P. E., et al. Regional variation in human supraspinatus tendon proteoglycans: Decorin, biglycan, and aggrecan. Connect Tissue Res. 53 (5), 343-348 (2012).
  24. Buckley, M. R., Huffman, G. R., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. The location-specific role of proteoglycans in the flexor carpi ulnaris tendon. Connect Tissue Res. 54 (6), 367-373 (2013).
  25. Gillard, G. C., Reilly, H. C., Bell-Booth, P. G., Flint, M. H. The influence of mechanical forces on the glycosaminoglycan content of the rabbit flexor digitorum profundus tendon. Connect Tissue Res. 7 (1), 37-46 (1979).
  26. Giori, N. J., Beaupre, G. S., Carter, D. R. Cellular shape and pressure may mediate mechanical control of tissue composition in tendons. J Orthop Res. 11 (4), 581-591 (1993).
  27. Wren, T. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanobiology of tendon adaptation to compressive loading through fibrocartilaginous metaplasia. J Rehabil Res Dev. 37 (2), 135-143 (2000).
  28. Malaviya, P., et al. An in vivo model for load-modulated remodeling in the rabbit flexor tendon. J Orthop Res. 18 (1), 116-125 (2000).
  29. Shim, J. W., Elder, S. H. Influence of Cyclic Hydrostatic Pressure on Fibrocartilaginous Metaplasia of Achilles Tendon Fibroblasts. Biomech Model Mechanobiol. 5 (4), 247-252 (2006).
  30. Koob, T. J., Clark, P. E., Hernandez, D. J., Thurmond, F. A., Vogel, K. G. Compression loading in vitro regulates proteoglycan synthesis by tendon fibrocartilage. Arch Biochem Biophys. 298 (1), 303-312 (1992).
  31. Evanko, S. P., Vogel, K. G. Proteoglycan Synthesis in Fetal Tendon Is Differentially Regulated by Cyclic Compression in Vitro. Arch Biochem Biophys. 307 (1), 153-164 (1993).
  32. Vogel, K. G. The effect of compressive loading on proteoglycan turnover in cultured fetal tendon. Connect Tissue Res. 34 (3), 227-237 (1996).
  33. Thornton, G. M., et al. Changes in mechanical loading lead to tendon specific alterations in MMP and TIMP expression: influence of stress deprivation and intermittent cyclic hydrostatic compression on rat supraspinatus and Achilles tendons. Br J Sports Med. 44 (10), 698-703 (2010).
  34. Robbins, J. R., Evanko, S. P., Vogel, K. G. Mechanical Loading and TGF-β Regulate Proteoglycan Synthesis in Tendon. Arch Biochem Biophys. 342 (2), 203-211 (1997).
  35. Docking, S., Samiric, T., Scase, E., Purdam, C., Cook, J. Relationship between compressive loading and ECM changes in tendons. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (1), 7-11 (2013).
  36. Wang, X., et al. Aberrant TGF-β activation in bone tendon insertion induces enthesopathy-like disease. J Clin Invest. 128 (2), 846-860 (2018).
  37. Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. J Orthop Res. 36 (10), 2780-2788 (2018).
  38. Liu, Y., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: development and analysis of a novel rat model. J Shoulder Elbow Surg. 31 (9), 1898-1908 (2022).
  39. Majima, T., et al. Compressive compared with tensile loading of medial collateral ligament scar in vitro uniquely influences mRNA levels for aggrecan, collagen type II, and collagenase. J Orthop Res. 18 (4), 524-531 (2000).
  40. Hopkins, C., et al. Critical review on the socio-economic impact of tendinopathy. Asia Pac J Sports Med, Arthrosc, Rehabil Technol. 4, 9-20 (2016).
  41. Scott, A., Ashe, M. C. Common tendinopathies in the upper and lower extremities. Curr Sports Med Rep. 5 (5), 233-241 (2006).
  42. Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin Sports Med. 22 (4), 675-692 (2003).
  43. Bah, I., et al. Tensile mechanical changes in the Achilles tendon due to Insertional Achilles tendinopathy. J Mech Behav Biomed Mater. 112, 104031 (2020).
  44. Chondral Metaplasia in Calcific Insertional Tendinopathy of the Achilles Tendon. Clin J Sport Med. Maffulli, N., Reaper, J., Ewen, S. W. B., Waterston, S. W., Barrass, V. 16 (4), 329-334 (2006).
  45. Corps, A. N., et al. Increased expression of aggrecan and biglycan mRNA in Achilles tendinopathy. Rheumatology (Oxford). 45 (3), 291-294 (2006).
  46. Scott, A., et al. Increased versican content is associated with tendinosis pathology in the patellar tendon of athletes with jumper's knee. Scand J Med Sci Sports. 18 (4), 427-435 (2008).
  47. Attia, M., et al. Greater glycosaminoglycan content in human patellar tendon biopsies is associated with more pain and a lower VISA score. Br J Sports Med. 48 (6), 469-475 (2014).
  48. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative Incidence of Achilles Tendon Rupture and Tendinopathy in Male Former Elite Athletes. Clin J Sport Med. 15 (3), 133-135 (2005).
  49. Corps, A. N., et al. Changes in matrix protein biochemistry and the expression of mRNA encoding matrix proteins and metalloproteinases in posterior tibialis tendinopathy. Ann Rheum Dis. 71 (5), 746-752 (2012).
  50. Neer, C. S. 2nd Anterior acromioplasty for the chronic impingement syndrome in the shoulder: a preliminary report. J Bone Joint Surg Am. 54 (1), 41-50 (1972).
  51. Bigliani, L. U., Ticker, J. B., Flatow, E. L., Soslowsky, L. J., Mow, V. C. The relationship of acromial architecture to rotator cuff disease. Clin Sports Med. 10 (4), 823-838 (1991).
  52. Chimenti, R. L., Cychosz, C. C., Hall, M. M., Phisitkul, P. Current Concepts Review Update Insertional Achilles Tendinopathy. Foot Ankle Int. 38 (10), 1160-1169 (2017).
  53. Nicholson, C. W., Berlet, G. C., Lee, T. H. Prediction of the Success of Nonoperative Treatment of Insertional Achilles Tendinosis Based on MRI. Foot Ankle Int. 28 (4), 472-477 (2007).
  54. Lohrer, H., David, S., Nauck, T. Surgical treatment for achilles tendinopathy - a systematic review. BMC musculoskelet disord. 17 (1), 207 (2016).
  55. McGarvey, W. C., Palumbo, R. C., Baxter, D. E., Leibman, B. D. Insertional Achilles Tendinosis: Surgical Treatment Through a Central Tendon Splitting Approach. Foot Ankle Int. 23 (1), 19-25 (2002).
  56. Maffulli, N., et al. Surgery for chronic Achilles tendinopathy produces worse results in women. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1714-1720 (1714).
  57. Wunderli, S. L., Blache, U., Snedeker, J. G. Tendon explant models for physiologically relevant in vitro study of tissue biology - a perspective. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 262-277 (2020).
  58. Dyment, N. A., et al. A brief history of tendon and ligament bioreactors: Impact and future prospects. J Orthop Res. 38 (11), 2318-2330 (2020).
  59. Screen, H. R. C., Berk, D. E., Kadler, K. E., Ramirez, F., Young, M. F. Tendon Functional Extracellular Matrix. J Orthop Res. 33 (6), 793-799 (2015).
  60. Theobald, P., et al. The functional anatomy of Kager's fat pad in relation to retrocalcaneal problems and other hindfoot disorders. J Anat. 208 (1), 91-97 (2006).
  61. Ghazzawi, A., Theobald, P., Pugh, N., Byrne, C., Nokes, L. Quantifying the motion of Kager's fat pad. J Orthop Res. 27 (11), 1457-1460 (2009).
  62. Malagelada, F., et al. Pressure changes in the Kager fat pad at the extremes of ankle motion suggest a potential role in Achilles tendinopathy. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 28 (1), 148-154 (2020).
  63. Shaw, H. M., Benjamin, M. Structure-function relationships of entheses in relation to mechanical load and exercise. Scand J Med Sci Sports. 17 (4), 303-315 (2007).
  64. Soslowsky, L. J., et al. Rotator cuff tendinosis in an animal model: role of extrinsic and overuse factors. Ann Biomed Eng. 30 (8), 1057-1063 (2002).
  65. Schneeberger, A. G., Nyffeler, R. W., Gerber, C. Structural changes of the rotator cuff caused by experimental subacromial impingement in the rat. J Shoulder Elbow Surg. 7 (4), 375-380 (1998).
  66. Croen, B. J., et al. Chronic subacromial impingement leads to supraspinatus muscle functional and morphological changes: Evaluation in a murine model. J Orthop Res. 39 (10), 2243-2251 (2021).
  67. Andarawis-Puri, N., Flatow, E. L. Tendon fatigue in response to mechanical loading. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 106-114 (2011).
  68. Gains, C. C., Giannapoulos, A., Zamboulis, D. E., Lopez-Tremoleda, J., Screen, H. R. C. Development and application of a novel in vivo overload model of the Achilles tendon in rat. J Biomech. 151, 111546 (2023).
  69. Williamson, P. M., et al. A passive ankle dorsiflexion testing system to assess mechanobiological and structural response to cyclic loading in rat Achilles tendon. J Biomech. 156, 111664 (2023).
  70. Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A Novel, Open-Source, Low-Cost Bioreactor for Load-Controlled Cyclic Loading of Tendon Explants. J Biomech Eng. 144 (8), 084505 (2022).
  71. Orishimo, K. F., et al. Effect of Knee Flexion Angle on Achilles Tendon Force and Ankle Joint Plantarflexion Moment During Passive Dorsiflexion. J Foot Ankle Surg. 47 (1), 34-39 (2008).
  72. Liu, C. L., et al. Influence of different knee and ankle ranges of motion on the elasticity of triceps surae muscles, Achilles tendon, and plantar fascia. Sci Rep. 10 (1), 6643 (2020).
  73. Cruz-Montecinos, C., et al. Soleus muscle and Achilles tendon compressive stiffness is related to knee and ankle positioning. J Electromyogr Kinesiol. 66, 102698 (2022).
  74. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Lose-dose administration of dexamethasone is beneficial in preventing secondary tendon damage in a stress-deprived joint injury explant model. J Orthop Res. 38 (1), 139-149 (2020).
  75. Wunderli, S. L., et al. Tendon response to matrix unloading is determined by the patho-physiological niche. Matrix Biol. 89, 11-26 (2020).
  76. Yabusaki, K., et al. A Novel Quantitative Approach for Eliminating Sample-To-Sample Variation Using a Hue Saturation Value Analysis Program. PloS one. 9 (3), e89627 (2014).
  77. Gao, J., Messner, K., Ralphs, J. R., Benjamin, M. An immunohistochemical study of enthesis development in the medial collateral ligament of the rat knee joint. Anat Embryol. 194 (4), 399-406 (1996).
  78. Han, S. K., Wouters, W. A. J., Clark, A., Herzog, W. Mechanically induced calcium signaling in chondrocytes in situ. J Orthop Res. 30 (3), 475-481 (2012).
  79. Han, W., et al. Impact of cellular microenvironment and mechanical perturbation on calcium signalling in meniscus fibrochondrocytes. Eur Cell Mater. 27, 321-331 (2014).
  80. Rossetti, L., et al. The microstructure and micromechanics of the tendon-bone insertion. Nat Mater. 16 (6), 664-670 (2017).
  81. Sartori, J., Köhring, S., Witte, H., Fischer, M. S., Löffler, M. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
  82. Eliasberg, C. D., et al. Identification of Inflammatory Mediators in Tendinopathy Using a Murine Subacromial Impingement Model. J Orthop Res. 37 (12), 2575-2582 (2019).
  83. Zhang, Y., et al. Expression of alarmins in a murine rotator cuff tendinopathy model. J Orthop Res. 38 (11), 2513-2520 (2020).
  84. Zhang, X., et al. Assessment of Mitochondrial Dysfunction in a Murine Model of Supraspinatus Tendinopathy. J Bone Joint Surg. Am. 103 (2), 174-183 (2021).
  85. Liu, Y., et al. The role of Indian Hedgehog Signaling in tendon response to subacromial impingement: evaluation using a mouse model. Am J Sports Med. 50 (2), 362-370 (2022).
  86. Wang, T., et al. Load-induced regulation of tendon homeostasis by SPARC, a genetic predisposition factor for tendon and ligament injuries. Sci Transl Med. 13 (582), eabe5738 (2021).
  87. Passini, F. S., et al. Shear-stress sensing by PIEZO1 regulates tendon stiffness in rodents and influences jumping performance in humans. Nat Biomed Eng. 5 (12), 1457-1471 (2021).
  88. Jones, D. L., et al. Mechanoepigenetic regulation of extracellular matrix homeostasis via Yap and Taz. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (22), e2211947120 (2023).
  89. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Release of pro-inflammatory cytokines from muscle and bone causes tenocyte death in a novel rotator cuff in vitro explant culture model. Connect Tissue Res. 59 (5), 423-436 (2018).
  90. Rees, S. G., et al. Catabolism of aggrecan, decorin and biglycan in tendon. Biochem J. 350 (Pt 1), 181-188 (2000).
  91. Samiric, T., Ilic, M. Z., Handley, C. J. Large aggregating and small leucine-rich proteoglycans are degraded by different pathways and at different rates in tendon. Eur J Biochem. 271 (17), 3612-3620 (2004).
  92. Rees, S. G., Curtis, C. L., Dent, C. M., Caterson, B. Catabolism of aggrecan proteoglycan aggregate components in short-term explant cultures of tendon. Matrix Biol. 24 (3), 219-231 (2005).
  93. Taye, N., Karoulias, S. Z., Hubmacher, D. The "other" 15-40%: The Role of Non-Collagenous Extracellular Matrix Proteins and Minor Collagens in Tendon. J Orthop Res. 38 (1), 23-35 (2020).
  94. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L. The development of the pressure-bearing tendon of the bullfrog, Rana catesbeiana. Anat Embryol. 200 (1), 55-64 (1999).
  95. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L., Covizi, D. Z., Della Colleta, H. H., Gomes, L. Structure and proteoglycan composition of specialized regions of the elastic tendon of the chicken wing. Cell Tissue Res. 300 (3), 435-446 (2000).
  96. van Sterkenburg, M. N., Kerkhoffs, G. M., Kleipool, R. P., Niek van Dijk, C. The plantaris tendon and a potential role in mid-portion Achilles tendinopathy: an observational anatomical study. J Anat. 218 (3), 336-341 (2011).
  97. Lee, A. H., Elliott, D. M. Comparative multi-scale hierarchical structure of the tail, plantaris, and Achilles tendons in the rat. J Anat. 234 (2), 252-262 (2019).
  98. Lee, A. H., Elliott, D. M. Multi-Scale Loading and Damage Mechanisms of Plantaris and Rat Tail Tendons. J Orthop Res. 37 (8), 1827-1837 (2019).
  99. Fan, H. M., Shrestha, L., Guo, Y., Tao, H. R., Sun, Y. L. The twisted structure of the rat Achilles tendon. J Anat. 239 (5), 1134-1140 (2021).
  100. Cutlip, R. G., Stauber, W. T., Willison, R. H., McIntosh, T. A., Means, K. H. Dynamometer for rat plantar flexor muscles in vivo. Med Biol Eng Comput. 35 (5), 540-543 (1997).
  101. Rijkelijkhuizen, J. M., Baan, G. C., de Haan, A., de Ruiter, C. J., Huijing, P. A. Extramuscular myofascial force transmission for in situ rat medial gastrocnemius and plantaris muscles in progressive stages of dissection. J Exp Biol. 208 (Pt 1), 129-140 (2005).
  102. Saxena, A., Bareither, D. Magnetic Resonance and Cadaveric Findings of the Incidence of Plantaris Tendon. Foot Ankle Int. 21 (7), 570-572 (2000).
  103. dos Santos, M. A., Bertelli, J. A., Kechele, P. R., Duarte, H. Anatomical study of the plantaris tendon: reliability as a tendo-osseous graft. Surg Radiol Anat. 31 (1), 59-61 (2009).
  104. Sartori, J., Köhring, S., Bruns, S., Moosmann, J., Hammel, J. U. Gaining Insight into the Deformation of Achilles Tendon Entheses in Mice. Adv Eng Mater. 23 (11), 2100085 (2021).

Tags

Bioengineering nr. 202
Murine bagben explant model til undersøgelse af mekanobiologi af akillesseneimpingement
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W.,… More

Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W., Buckley, M. R. Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement. J. Vis. Exp. (202), e65801, doi:10.3791/65801 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter