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Bioengineering

アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジー研究のためのマウス後肢外植モデル

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65801
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

Summary

マウス後肢外植片におけるアキレス腱挿入のインピンジメントによって引き起こされる線維軟骨性変化を再現するカスタム実験プラットフォームと組織培養プロトコルを提示し、腱インピンジメントのメカノバイオロジーを探索するのに適したモデルを提供します。

Abstract

骨への腱の衝突は、横方向の圧縮ひずみが著しく上昇した多軸の機械的ひずみ環境を生成し、グリコサミノグリカン(GAG)に富むマトリックスの蓄積とコラーゲンネットワークのリモデリングを特徴とする局所的な線維軟骨表現型を誘発します。線維軟骨は健康な腱の侵食領域では正常な特徴ですが、過剰なGAG沈着とコラーゲンネットワークの混乱は腱鞘炎の特徴です。したがって、インピンジメントは、腱鞘炎の開始と進行における重要な外因性因子として臨床的に認識されています。それにもかかわらず、腱インピンジメントの根底にあるメカノバイオロジーは研究が不十分なままです。腱インピンジメントに対する細胞応答を解明するための以前の取り組みは、細胞に一軸圧迫を適用し、in vitroで腱外植片を切除しました。しかし、単離された細胞は、機械応答に重要な3次元の細胞外環境を欠いており、 in vitro および切除外植片研究の両方で、in vivoでの腱の衝突によって生成される多軸ひずみ環境を再現することができず、これは衝突領域の解剖学的特徴に依存します。さらに、腱インピンジメントの in vivo モデルでは、機械的ひずみ環境を制御できません。これらの限界を克服するために、アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジーを研究するのに適した新しいマウス後肢外植片モデルを提示します。このモデルは、アキレス腱を その場で 維持して局所的な解剖学的構造を維持し、受動的に加えられた足首背屈時にアキレス腱が踵骨に挿入されることによって発生する多軸ひずみ環境を再現し、細胞を本来の環境に保持します。このモデルに不可欠な組織培養プロトコルについて説明し、7日間にわたる持続的な外植片の生存率を確立するデータを提示します。代表的な結果は、組織学的GAG染色の亢進とインピンジメントに続発するコラーゲン線維のアライメントの低下を示しており、線維軟骨形成の上昇を示唆しています。このモデルは、さまざまな機械的負荷レジメンの調査に容易に適応でき、インピンジメントに応答してアキレス腱の表現型変化を媒介するメカニズムを特定するために、目的の分子経路を操作することができます。

Introduction

アキレス腱や回旋筋腱板腱を含む多くの腱は、正常な解剖学的位置により骨のインピンジメントを経験します1,2,3,4.腱の衝突は、縦方向の繊維軸に横方向に向けられた圧縮ひずみを生成します5,6,7.腱インピンジメントの領域は、グリコサミノグリカン(GAG)含量が著しく増加した無秩序なコラーゲンネットワーク内に、縮小した丸い細胞(線維軟骨細胞)が埋め込まれている独特の線維軟骨表現型を示します2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24.これまでの研究では、腱のインピンジメントによって生じる異種の機械的環境が、凝集したプロテオグリカン(特にアグリカン)の沈着を促進し、このGAGに富むマトリックスを維持していることが示唆されているが、その根底にあるメカニズムは不明である1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.線維軟骨は健康な腱の侵食領域では正常な特徴ですが、過剰な線維軟骨形成に関連する異常なプロテオグリカン代謝は、慢性的に侵迫した腱に不釣り合いに出現する一般的で衰弱性疾患である腱鞘炎の特徴です1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49.したがって、腱インピンジメントは、回旋筋腱板疾患や挿入性アキレス腱炎(IAT)など、最も一般的な腱鞘炎のいくつかを引き起こす重要な外因性要因として臨床的に認識されています50,51,52.現在、腱鞘炎の治療は非効率的です。例えば、IAT患者の約47%は、保存的管理に失敗した後に外科的介入を必要とし、術後の転帰はさまざまである53,54,55,56.インピンジメントと腱鞘炎の間には明らかな関係があるにもかかわらず、インピンジメントされた腱の細胞が機械的環境を感知して応答するメカノバイオロジカルメカニズムは十分に説明されておらず、腱鞘炎の病因の理解が曖昧になり、不十分な治療につながります。

外植モデルは、腱メカノバイオロジーの研究において有用なツールである57,58.腱インピンジメントのメカノバイオロジーを理解するための最初のステップとして、いくつかの先行研究は、細胞または腱外植片を切除した単純な一軸圧迫を適用した後の細胞応答を調査しています27,29,30,31,32,33,34,39。しかし、in vitroの細胞は、菌株伝達を促進し、機械的変形によって放出される重要な成長因子とサイトカインを隔離し、メカノトランスダクションに関与する焦点接着複合体の基質を提供する細胞外および細胞周囲マトリックスを欠いています57,59。さらに、in vitroおよび切除された外植片研究は、in vivoでの腱の衝突によって生成される多軸機械的ひずみ環境を再現することができず、これは衝突領域の解剖学的特徴に依存します5,6。インピンドされたアキレス腱挿入の文脈では、これには、踵骨後滑液包およびケーガー脂肪パッド60,61,62,63などの周囲組織が含まれる。逆に、腱インピンジメントのin vivoモデル25,28,36,37,38,64,65,66は、腱に直接加えられる荷重の大きさと周波数を最小限に制御することを可能にし、これは腱メカノバイオロジーを研究するためのin vivoモデルのよく知られた限界である57,58、67,68,69,70。in vivoでの腱のひずみ測定が困難なため、これらのモデル内で発生する内部ひずみ環境は、多くの場合、十分に特徴付けられていません。

この原稿では、マウス後肢外植片全体の踵骨へのアキレス腱挿入のインピンジメントを再現するカスタム実験プラットフォームを提示し、この組織培養プロトコルと組み合わせると、外植片培養で7日間にわたって生存率を維持し、腱インピンジメントの生物学的後遺症の研究を可能にします。このプラットフォームは、3Dプリントされたポリ乳酸(PLA)ベースに基づいて構築されており、グリップと3DプリントされたPLAボリュームリダクションインサートの取り付けの基礎を提供します。グリップは、後肢の尾側を上に向けて、上肢と膝をアキレス筋腱接合部に近位に固定するために使用され、超音波プローブまたは倒立顕微鏡を使用してアキレス腱を上から画像化できます(図1A)。減容インサートは、ベースのトラックに沿ってスライドし、組織培養培地の必要量を減らします。後ろ足に巻き付けられた編み込みラインは、ベースデザインと3DプリントされたPLAクリップを利用してプラットフォームからルーティングされます。紐を引っ張ることで、後足が背屈し、アキレス腱の挿入が踵骨に押し付けられ、横方向の圧縮歪みが上昇します5,6(図1A)。プラットフォームは、組織培養培地に浸された後肢の外植片を維持するアクリル浴内に含まれています。ピンと張った紐を粘着テープで浴槽の外側に固定すると、足首の背屈が維持され、アキレス腱挿入の静的インピンジメントが発生します。3DプリントされたコンポーネントのCADファイルは、複数のフォーマット(補足ファイル1)で提供されており、実験のニーズに合わせて変更するために、さまざまな商用および無料のオープンソースCADソフトウェアにインポートできます。製造に3Dプリンターを利用できない場合は、CADファイルをオンライン3Dプリントサービスに提供して、低コストで部品をプリントして出荷することができます。

重要なことに、上腕三頭筋-アキレス腱複合体は、膝関節と足首関節の両方にまたがっています71,72,73。その結果、アキレス腱の引張ひずみは膝の屈曲の影響を受けます。膝の伸展はアキレス腱に緊張をかけますが、膝の屈曲は緊張を軽減します。最初に膝を伸ばし、次に足首を受動的に背屈させることで、衝突した挿入時の圧縮ひずみを引張ひずみに重ね合わせることができます。逆に、膝を屈曲させた状態で足首を受動的に背屈させることで、引張ひずみが軽減され、圧縮ひずみが残ります。現在のプロトコルでは、そのような 3 つの条件が検討されています。1)静的インピンジメントの場合、足を脛骨に対して110°<に背屈させて挿入をインピンディングし、膝を曲げて緊張を軽減します。2)ベースラインテンショングループでは、膝を伸ばした状態で足首を背屈145°以上に伸ばし、挿入時に主に引張緊張を発生させます。3)無負荷群の場合、外植片は、外部から負荷がかからない状態で、膝と足首を中立位置にしてペトリ皿で培養します。上記の角度は、足と脛骨が180°の角度で平行で、90°の角度で垂直である座標系に対して写真で測定されます。

プロトコルの主なステップには、1)後肢の外植片の解剖と皮膚と足底腱の慎重な除去が含まれます。2)48時間のデキサメタゾン前処理後の外植片培養。3)組織切片および組織学的染色;4)線維軟骨形成を評価するためのカラー画像解析。解剖後、各後肢外植片をデキサメタゾン74を添加した培地中で48時間前処理する。各マウスの対側肢は、ペアワイズ比較のために別々の実験グループに割り当てられ、生物学的変動を制御するのに役立ちます。前処理後、外植片を上記のようにプラットフォームに配置し、さらに7日間培養します(図1B)。48時間の前処理の直後に外植片を除去する前処理(0日目)グループへの追加の比較が行われます。

外植片培養後、後肢を切り落とし、ホルマリンを固定し、脱灰し、パラフィンに包埋します。矢状方向の連続切片は、筋腱接合部から踵骨挿入までのアキレス腱を視覚化し、腱全体を切片の深さを追跡することができます。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)を介したdUTP X-nickラベリング(TUNEL)は、アポトーシスに続発するDNA損傷を可視化し、生存率を評価するために使用されます。トルイジンブルーの組織学とカスタムカラー画像解析を行い、GAG染色の変化を定量化します。次に、トルイジンブルーで染色した組織切片をSHGイメージングに使用し、コラージュ線維組織の変化を特徴付けます(図1B)。

提供された代表的な結果は、GAGリッチマトリックスの組織学的染色の変化と、モデル内の7日間の静的衝突によって生成された細胞外コラーゲンネットワークの混乱を示唆しています。このモデルは、インピンジメントによる線維軟骨性変化の根底にある分子メカニズムを探るために利用することができます。

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Protocol

すべての動物実験は、ロチェスター大学動物資源委員会によって承認されました。

1. 組織培養培地の調製

  1. すべての外植片を、1% v/v ペニシリン-ストレプトマイシンと 200 μM L-アスコルビン酸を含む Dulbecco Modified Eagle 培地 (1x DMEM) で、37 °C および 5% CO2 のインキュベーターで培養します。最初の48時間前処理では、100 nMのデキサメタゾン74を添加した70 mLの培地で各外植片を培養します。前処理後、デキサメタゾンなしでさらに7日間培養手足を培養し、48〜72時間ごとに培地を交換します。
    注:ウシ胎児血清などの血清を培地に添加することは、Wunderli、Blache、およびSnedeker57によって提供された推奨事項と一致して推奨されません。簡単に言うと、無血清条件は、 生体内に存在する無血管性で栄養価の低い腱微小環境をよりよく表しています。さらに、血清補給は、特定の培養条件下で組織の分解を促進し75 、腱の病理学57の両方の特徴である細胞増殖および組織外への遊走を刺激することができる。
  2. 荷降ろし群の場合、各外植片を70 mLの培地で培養します。ベースライン張力および静的インピンジメントグループの場合、各プラットフォームでは、四肢を水没させ続けるために約125 mLの培地が必要です。この体積は、グリップにおける上腿の位置と3Dプリントパラメータ(主にインフィル密度)によって変化します。

2.外植片の解剖とデキサメタゾンの前処理

  1. CO2吸入と二次子宮頸部脱臼によって、または施設のガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。このプロトコルは、1歳未満のC57BL/6マウスを利用します。後肢のサイズは年齢とともに大きくなり、グリップに収まるのが難しくなる可能性があります。
  2. 解剖前に、予熱した(37°C)培地70 mLを、滅菌生物学的安全キャビネット(BSC)内の100 mm(直径)x 25 mm(高さ)のシャーレに移します。デキサメタゾンを添加して、100 nMの使用濃度を達成します。
  3. 解剖は、吸収性のアンダーパッドを使用してベンチトップで行うことができ、後肢の外植をBSCに移す前に、解剖を迅速に行うことができます。この解剖に必要な手術器具を組み立てます 滑らかでまっすぐで細い先端鉗子を含む。鋸歯状の歯を備えたまっすぐで細い先端鉗子。そしてまっすぐで、鋭く、細かいはさみ。
  4. 後肢外植片の解剖では、マウスを仰臥位に置き、股関節を特定します。細いハサミを使用して、上肢の近位部と前部(頭蓋部)をオーバーレイする皮膚を小さく(5〜10 mm)切開します。
  5. 切開部を引き離して拡大し、露出した上肢を指でつまみ、皮膚を遠位に慎重に引っ張って、後肢を足首の高さまで手袋を外します。足の背側に沿って皮膚の下に1枚のハサミの刃をそっと挿入し、つま先まで切開します。皮膚を遠位に引っ張り続けて、完全に取り除きます。
  6. マウスを配置して、足首近くの踵骨の後部(尾側)へのアキレス腱の挿入を視覚化します。アキレス腱挿入の近位にある足底腱は、アキレス腱の内側境界に直接隣接し、足の足底側に向かって遠位に伸び、踵骨の後側を通過します。
  7. 足底腱を除去するには、滑らかで細い先端鉗子の1つの先端を2つの腱の間に慎重に挿入し、足底腱の下を通る先端を内側に伸ばします。先端を近位に描き、足底筋を引き裂きます。細い先端の鋸歯状の鉗子を使用して、足底腱の切り離された近位端をつかみ、遠位に引っ張って取り外します。
  8. 股関節では、細いハサミを使用して骨盤を切り裂き、後肢を分離します。ハサミを使って残りの骨盤をこじ開け、大腿骨頭を露出させます。
  9. 後肢外植片をBSCに移し、デキサメタゾンを含む細胞培養培地を含むディッシュに移します。皿をインキュベーターに移し、48時間前処理します。

3. 外植片の文化およびローディングのプラットホーム

  1. 48時間の前処理が終了したら、十分な量の培地を予温します(セクション1)。この時点から、培地にデキサメタゾンは添加されません。この時点で、前処理(0日目)群の四肢を固定、脱灰し、パラフィンに包埋して、将来の切片化、染色、分析を行うことができます。
  2. 荷を下ろしたグループについては、前処理培地を吸引し、外植片を新鮮なペトリ皿に移し、それぞれ70 mLの培地を加えてインキュベーターに戻します。
  3. ベースライン張力および静的インピンジメントグループについては、外植片プラットフォームを準備します。グリッププラテンと同じ大きさのサンドペーパーをカットします。静的インピンジメントグループの場合、編組ラインの長さを約18インチカットし、ラインの長さの半分に緩いオーバーハンドノットを事前に結びます。アルミホイルをちぎって各アクリル浴を覆い、70%エタノール(EtOH)をスプレーします。準備をBSCに移します。
  4. 各プラットフォームには、アクリルバス、ベース、ボリュームリダクションインサート、クリップ、グリップが含まれています。各グリップには、2つのプラテンと、グリップをベースに取り付けるM5 x 0.8 mmのネジ x 長さ10 mmのネジ1本を含む3種類のネジが含まれています。2本のM6 x 1 mmネジ x 20 mmの長さのネジで、プラテンを伸ばしてグリップをクランプします。4本のM3 x 0.5 mmネジ x 長さ14 mmのネジは、4つの圧縮スプリングと組み合わせて、プラテンを引っ込めてグリップを開きます。
  5. すべての成分を、漏れが発生した場合にすべての培地を捕捉できる二次容器に入れます。10%漂白剤溶液≥浸し、少なくとも1時間浸します。漂白剤溶液を水道水(必要に応じてオートクレーブ)で洗い流し、BSCに移動します。
    注意: 汚染のトラブルシューティングについては、すべての水道水をオートクレーブ滅菌するか、精製水を使用することを検討してください。コンタミネーションに対処する際の追加のヒントについては、 ディスカッション を参照してください。
  6. M3ネジと圧縮スプリングを使用してプラテンをグリップに取り付け、M5ネジを使用してグリップをベースに固定し、プラテンにかみ合うまでM6ネジを挿入します。両面テープでサンドペーパーをプラテンに貼り付け、グリップを閉じてサンドペーパーのプラテンへの接着を促進します。すべてのプラットフォームに対して繰り返します。
  7. プラットフォームをロードする準備ができたら、グリップを完全に開き、鉗子を使用して、アキレス腱の表層面を上に向けて、上肢と膝をプラテンの間に置きます(図1A)。グリップをゆるく閉じて、ゆっくりと固定します。
  8. 鉗子を使用して露出した大腿骨頭または足をつかみ、膝の屈曲角度を操作しながら、グリップを徐々に閉じて所定の位置に固定します。ベースライン張力グループでは、前述のように膝関節を伸ばします。膝を伸ばしてグリップが締まると、足首も自然に伸びます。静的インピンジメントグループの場合、前述のようにグリップ間の膝関節を曲げます。
  9. 静的インピンジメントグループの場合は、ストリングのオーバーハンドノットを遠位足の周りに置き、締めます。外植片の下にあるベースのスロットに弦を通し、クリップ穴に通します。ベースをアクリルバスに入れ、クリップをバスの上端に固定します(図1A)。
  10. 紐を引いて脛骨に対して足を少なくとも110°に屈させ、クリップから出るときに油性マーカーを使用して紐に印を付けます。この位置で外植片の写真を撮り、後で背屈角度を定量化します(図1A)。
  11. ベースを取り外し、ベースのトラックに沿ってスライドさせてボリュームリダクションインサートを取り付けます。ベース(ボリュームリダクションインサートに取り付けられている)をアクリルバスに戻し、クリップを上端に再配置します。印を付けた紐を目安に紐を引っ張って元の背屈角度に戻し、紐をテープでお風呂の外側に固定して静的な背屈を維持します。
  12. ベースラインテンショングループの場合、外植片がグリップの間に配置されたら、ボリュームリダクションインサート付きのベースをアクリルバスに入れ、背屈角度を定量化するための写真を撮るだけです。
  13. 予熱した(37°C)培地125 mLを各プラットフォームに加え、外植片を浸します。浴槽の上部をアルミホイルで覆い、二次容器に入れ、インキュベーターに移動します。さらに7日間培養し、48〜72時間ごとに培地を交換します。
    注意: 浴槽の上部にテープを貼ると、PLA部品が浮くのを防ぐことができます。

4.固定、脱灰、パラフィン包埋

  1. 外植片培養後、ハサミを使用して足指の爪/遠位足指を切り取り、アキレス筋腱接合部に近位の上肢を切り取ります。トリミングされた各足首関節を、フォーム生検パッドで裏打ちされた処理カセットに入れます。足首をカセットの隅に押し込んで足首を約90°の背屈に置き、カセットを閉じて所定の位置に保持します。
  2. 10%中性緩衝ホルマリン(NBF)で3日間固定し、氷酢酸でpHを7.4〜7.6に調整した蒸留水(diH2O)に溶解した14%エチレンジアメン四酢酸(EDTA)で2週間脱灰します。
  3. 塩分を除去するには、サンプルを 1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の両方で 3 回、続いてジH2O でそれぞれ 5 分間徹底的にすすぎます。パラフィン組織学のルーチンサンプル処理:段階的な一連のEtOHで脱水し、キシレンで透明にし、パラフィンワックスを浸透させます。サンプルをパラフィンに配向して包埋し、以下のセクション5(図1B)で説明するように、アキレス腱を介して矢状組織切片を内側から外側に進行させて取得します。

5. 組織切片化

  1. ミクロトームを使用して、切片がブロック面と平行になるまでサンプルを慎重にトリミングします。関節の内側から足首に大きくトリミングし、アキレス腱挿入の内側境界に達する前に停止します。
  2. サンプルを氷の塊に移して温度と水分を調整し、ブレードを交換します(または現在のブレードの新しいセクションにシフトします)。10 μmの厚さでサンプルの切片化を続け、明視野顕微鏡でアキレス腱挿入部への入口を注意深く特定します。特定されたら、アキレス腱の挿入全体を通してセクション番号(つまり、組織の深さ)を連続して追跡します。

6. 脱パラフィン/再水和とスライドの選択

  1. 以下の各アッセイでは、対側肢の各ペアからレベルが一致した組織切片を選択します。染色する前に、スライドラックに置き、キシレンを3回、100%EtOHを2回、95%EtOHを2回、70%EtOHを1回、それぞれ5分間移動させます。diH2Oで水分補給を終了します。

7.アキレス腱の生存率を評価するためのTUNEL

  1. TUNELラベリングの場合は、メーカーのプロトコルに従って染色してください。20 μg/mL プロテイナーゼ K 中で室温で 20 分間インキュベートし、diH2O ですすぎ、50 μL の TUNEL 染色液 (5 μL 酵素溶液、45 μL 標識溶液) 中で 37 °C で 1 時間インキュベートします。 DIHPIとカバーガラスを含む褪色防止剤でdiH2O.マウントをすすぎます。
  2. アキレス腱の挿入を4倍の対物レンズ付き蛍光顕微鏡で撮影します。すべての原子核を可視化するためのDAPIチャンネル(励起/発光波長 = 360/460 nm)、アポトーシス核を可視化するためのTUNEL(TMR Red)チャンネル(励起/発光波長 = 540/580 nm)、および可能であれば明視野チャンネルを含めます。
  3. 画像解析の場合は、FIJI/ImageJ や MATLAB などの ROI ベースの処理に適した画像解析ソフトウェアに画像をインポートします。アキレス腱全体の概要を示す関心領域(ROI)を定義し(図2A)、解剖や培養時の環境条件の急激な変化によって死に至りやすい上膜の細胞を除外します。
  4. これを行うには、明視野イメージをインポートし、関数 drawpolygon() を使用して腱の境界をトレースして囲むことで、MATLAB で ROI 選択を実行します。MATLAB は ROI の Polygon オブジェクトを作成し、それを DAPI および TUNEL チャネル イメージに適用して、アキレス腱内の核のみを解析するために createMask() を使用して ROI の外側のピクセル強度データをマスクできます。
  5. DAPIおよびTUNELチャンネルの画像をインポートし、骨、筋肉、脂肪などの非生存組織におけるアポトーシス核の最大蛍光強度に正規化することにより、アポトーシス(TUNEL+)核を定義するための蛍光強度閾値を特定します。画像がマスクされたら、アキレス腱内のアポトーシス核(TUNEL+核/DAPI核)の割合を計算します。

8.線維軟骨形成を特徴付けるトルイジンブルー組織学

  1. 再水和したら(セクション6)、外植片の対側の組織切片をレベルマッチしたスライドラックを、氷酢酸を使用してpHを4.0に調整した0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液中の0.4%w/vトルイジンブルーOに移します。室温で10分間インキュベートした後、ジH2Oでそれぞれ30秒間3回すすぎます。
  2. 95% EtOH を 3 回、100% EtOH を 2 回、それぞれ 30 秒ずつ変更して脱水します。キシレンを1分ずつ3回交換してクリアします。キシレンベースの封入剤を使用したカバーガラス。
  3. アキレス腱挿入の 24 ビット赤青緑 (RGB) カラー画像を取得します。たとえば、このプロトコルでは、アダプタを使用して、デジタルカラーカメラを4倍対物レンズを備えた単純な明視野顕微鏡の接眼レンズにインターフェースします。
  4. アキレス腱挿入時の圧縮性腱線維軟骨(CTF)16 内のトルイジンブルー染色の違いを定量化するには(図3A、B)、RGB画像を複数のROIを定義および管理できる画像解析ソフトウェアにインポートします。オプションには、FIJI/ImageJ の選択ツールと ROI マネージャー ツール、MATLAB の画像処理ツールボックスなどがあります。まず、ピクセル/長さのスケールを設定します。
    注:ソフトウェアの選択は研究者の裁量に委ねられており、MATLABやFIJI/ImageJに限定されるものではありません。著者は、MATLAB コード (補足ファイル 2)、実装を説明するドキュメント (補足ファイル 3)、およびサンプル画像 (補足ファイル 4) を提供しています。研究者には、必要に応じて、または必要に応じて、このコードを他のソフトウェアで使用するために代替プログラミング言語に変換することをお勧めします。
  5. 選択したソフトウェアに表示された画像を使用して、深部腱の境界と踵骨の交点を特定します。ここから、深部腱境界に沿って近位800μmをトレースし、CTFの深部境界を確立します。たとえば、MATLAB の関数 drawpolyline() を使用して、RGB イメージ上にポリラインを対話的に描画します。MATLAB は、ラインの頂点を含む Polyline オブジェクトを作成し、このオブジェクトを処理して 800 μm の長さにトリミングできます。
  6. この位置から、局所繊維配向に垂直な表面腱境界に接続する線分を描画して、CTFの近位境界を作成します。
  7. 深部腱縁と踵骨の交点に戻り、CTFと付着部線維軟骨(AZF)16 を隔てる明確な潮汐マークに沿って表在性腱縁に接続する線分を引いて、CTFの遠位境界を定義します(図3A、B)。最後に、表在性腱境界をなぞって囲むことにより、CTFの表在境界を生成します。
  8. 挿入部におけるGAG染色の空間的変動を説明するために、総CTFを4象限に分割します(図3A、B)。深いCTF境界と表面CTF境界の中間点を線分で接続して、遠位/近位境界を作成します。この境界の中点を通過して、遠位CTF境界と近位CTF境界の中点を繊維配向に沿って接続し、表面/深部境界を作成します。
  9. これらの 6 つの境界は、CTF 全体を表す ROI を定義するために使用できる情報を提供しますが、CTF を細分化する 4 つの象限も定義します。たとえば、MATLAB では、個々の ROI (CTF、象限 1 から 4) の境界を定義する頂点をベクトルにコンパイルし、images.roi.Polygon() を使用して各 ROI の囲まれた Polygon オブジェクトを生成します。
  10. ROIを定義したら、FIJIのカラートランスフォーマープラグイン、MATLABのrgb2hsv()関数、または適切な変換方程式76を適用する他のソフトウェアを使用して、RGBピクセルデータを色相-彩度-値(HSV)色空間に変換する。その後、HSVデータを2Dの色相彩度空間に投影し、色相と彩度の各組み合わせが一意の色をエンコードします(図3C)。
  11. 各 ROI 内で、ROI の平均染色を表す平均色相と彩度を計算します。これは、たとえば、各 ROI を定義する Polygon オブジェクトを使用して、createMask() を使用してイメージをマスクし、各 ROI 内の色相彩度ピクセル データを具体的に分析することで実現できます。
  12. 骨膜線維軟骨(PF)16 内に別の小さなROIを定義し(図3A、B)、平均色相と彩度を計算します。次に、CTFの各ROIの平均色をPFの平均色に分離するユークリッド距離を計算します(図3C)。
    Equation 1
    注:ユークリッド距離の計算は、ROIの平均色と典型的な線維軟骨組織であるPFの平均色との類似度を表します16,17,77。ユークリッド距離が小さいほど、ROIの色は外観がより線維軟骨性であることを示します。
  13. この距離を使用して線維軟骨スコアを計算し、ROI 色が PF 色と同一の場合は最大値を 1 とし、ROI 色と PF 色が色相彩度色空間内で最大間隔に達する場合は最小値を -1 とします。
    Equation 2
  14. 色相、彩度、および線維軟骨スコアの平均データは、各四肢の組織切片にわたる各 ROI 内にあります。対側肢のグループ間で対応のある統計的比較を実行します。

9. コラーゲンネットワーク構造の変化を調べるためのSHGイメージング

  1. 20倍の対物レンズを備えた有能な顕微鏡システムを使用して、トルイジンの青色染色切片のSHGイメージングを実行します。切片の厚さからzスタックを取得し、必要に応じてタイルスキャンを実行して、アキレス腱の挿入を完全にキャプチャします。
  2. SHG画像を任意の画像解析ソフトウェアにインポートし、セクション8のトルイジンブルー画像解析で説明したように、アキレス腱挿入時のCTFを包含および細分化するROIを定義します(図4A、B)。
  3. SHG イメージを MATLAB にインポートする場合は、セクション 8 で概説されているように、MATLAB で CTF ROI を定義する方法を使用します。ROI を定義した後、MATLAB から ROI 頂点を .txt ファイルとしてエクスポートし、[ ファイル > インポート > XY 座標] を使用して FIJI にインポートすることで、ROI 座標を FIJI に転送します。選択範囲をオーバーレイし、分析のためにROIマネージャーに送信します。
  4. コラーゲン組織を定量化するには、フーリエスペクトル解析を実行して、ROIにまたがる小さなウィンドウにわたる繊維配向の分布を計算するFIJIのDirectionalityプラグインを使用します。分散と呼ばれるこの分布の広がりは、ファイバーのアライメントに反比例します。
    注:コラーゲン繊維は、アライメント/組織化の欠如ではなく、腱の総湾曲により、CTF全体のさまざまなウィンドウでさまざまな配向をとる場合があります。挿入時の腱の総湾曲とコラーゲン組織の変化をよりよく区別するには、より小さなROIを定義する必要があります。
  5. SHG画像をFIJIにインポートし、ピクセル/長さのスケールを設定します。最大ピクセル強度データを 2D 合成イメージに投影し、ROI マネージャーに ROI を追加します。各CTF ROIを画像に順次オーバーレイし、ROI内に一貫したサイズの10個の小さなサブROIを描画して、サブROIをROIマネージャーに追加します。
  6. 各サブROI内で、フィジーで方向性プラグインを実行して、ファイバー分散を計算します。各 CTF ROI 内のサブ ROI 間の平均分散データ、および各エクスプラントのセクションにわたる各 CTF ROI 内の平均分散データ。対側肢のグループ間で対応のある統計的比較を実行します。

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Representative Results

TUNELで染色した組織切片の代表的な画像は、実験グループ全体で7日間の外植片培養後のアキレス腱の体内のアポトーシス核が最小であることを示しています(図2A)。これらの画像の定量化により、組織培養プロトコルは、ロード条件全体で 7 日間の外植片培養後、アキレス腱内で平均最大 78% の生存率を維持するという証拠が得られます(図 2B)。

定性的には、強化されたトルイジンブルー染色は、無負荷のコントロールと比較して7日間の静的衝突後に高く評価され(図3A、B)、特に踵骨に隣接する深い象限で、以前に最大横圧縮ひずみを測定しました5,6。これらのトルイジンブルー染色組織切片の定量化は、対側の非負荷外植片と比較して、静的インピンジメントの7日後の色相(図3D)、彩度(図3E)、および線維軟骨スコア(図3F)の有意な変化を示しています。このGAG染色の変化は、このモデル内の静的衝突に続発する線維軟骨形成を表している可能性があります。飽和度と線維軟骨スコアの統計的に有意な差は、ベースライン張力の7日後に第1象限でのみ検出されました(図3E、F)。さらに、飽和度と線維軟骨スコアは、対側の負荷がかからない腱と比較して低下し、静的インピンジメントとは逆の傾向を示しました。このデータは、引張荷重が衝突による線維軟骨形成を減衰または逆転させる可能性があるという仮説を支持する可能性があり、将来的に追加の調査が必要です。

SHGイメージングの定量化は、分散の有意な違いによって示されるように、踵骨に隣接する深部および遠位領域において、静的衝突の7日後にコラーゲン繊維配向に微妙ではあるが有意な変化があることを示唆しています(図4C)。

Figure 1
図1:Explantプラットフォームと実験計画。 (A)Explantプラットフォームの写真および概略図。(トップ)マウスの後肢の外植片全体をプラットフォームに装填した写真で、重要なコンポーネントにラベルが付けられています。(下)この外植モデルで受動的に適用された足首の背屈によって誘発される挿入アキレス腱のインピンジメントを描いた概略図。(B)研究デザインと外植片培養の概略図。後肢外植片は、100 nM デキサメタゾンで 48 時間74 時間前処理されます。次に、各マウスから、1つの後肢外植片をアンロードされた皿で7日間培養し、反対側のリムを実験プラットフォームにロードして、アキレス腱をベースライン張力または静的インピンジメント下に7日間置きます。四肢の対側のペアからの連続組織切片は、GAGに富む組織を視覚化するためにトルイジンブルーで染色するか、TUNEL染色に使用されます。次に、トルイジンブルー染色切片をSHGイメージングに使用し、コラーゲン組織を評価します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:外植片の生存率。 (A)前処理済み(0日目)の外植片(左上)、負荷がかからない腱(右上)、ベースライン張力を維持した腱(左下)、および静的に衝突した腱(右下)のTUNEL染色切片の代表的な画像。アキレス腱は白い破線で輪郭を描き、ATとラベル付けされていますが、踵骨は黄色の実線で囲まれ、Cとラベル付けされています。 アポトーシス核は赤く(TUNEL)、すべての核は青く見えます(DAPI)。(B)死細胞画分の定量は、無負荷群、ベースライン張力群、および静的衝突群で平均22%未満でした。データは標準偏差±平均を表します。これらのデータセットには、細胞死率が50%を超える異常値が存在し、これは不十分な解剖技術によって引き起こされる腱の損傷に起因する可能性があります。統計的外れ値を除去した平均死細胞分率は、すべてのグループで15%未満です。細胞死において、無負荷、ベースライン張力群、静的インピンジメント群の間で統計学的に有意な差は認められなかった(p < 0.05)。0日目のコントロール:n = 8。無負荷:n = 18。ベースライン張力:n = 8。静的インピンジメント:n = 12。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:トルイジンブルーの組織型。 (A)アキレス腱挿入部の圧縮性腱線維軟骨(CTF)、付着帯線維軟骨(AZF)、および骨膜線維軟骨(PF)を描いた7日間の無負荷培養後の代表的なトルイジン青色染色16。CTFを捕捉するC.ROIとラベル付けされた踵骨は赤で囲まれ、さらに4つの象限に細分化されて追加の空間情報を提供します。(B)CTFの染色が強化された7日間の静的衝突後の代表的なトルイジン青色染色、特に以前に最大横圧縮ひずみを測定した象限1で5,6。(C)カラー画像解析に用いる色相彩度色空間の模式図。色は、色相(0°-360°)と彩度(0-255)の組み合わせで表される76。各ROIにおける平均色は、PFにおける色から各ROIにおける色を分離するユークリッド距離を計算することによってPFの平均色に正規化され、正規化された線維軟骨スコアが得られる。(D-F)対側の負荷がかからない腱と比較した、7日間の静的インピンジメント(上)およびベースライン張力(下)後のトルイジンブルー染色の変化。データは標準偏差±平均を表します。(D)色相の定量化は、反対側の負荷がかかっていない腱と比較して、7日間の静的衝突後のすべての領域の平均色相に有意差があることを示しています。対側の負荷がかからない腱と比較して、ベースライン張力の7日後に同様の傾向は検出されませんでした。.(E)飽和度の定量化、CTF全体および7日間の静的衝突後の象限1〜3内の平均飽和度の有意な変化を伴う、反対側の無負荷腱と比較して。逆に、有意差は、ベースライン張力の7日後に第1象限でのみ検出され、反対側の負荷がかかっていない腱と比較して飽和度が低下しました。(F)線維軟骨スコアの定量化、対側の負荷がかかっていない腱と比較して、7日間の静的インピンジメント後のすべての領域で線維軟骨スコアに有意な変化がありました。逆に、有意差は、ベースライン張力の7日後に第1象限でのみ検出され、線維軟骨スコアは反対側の負荷がかかっていない腱と比較して低下しました。データは、線維軟骨形成の増加を示す静的インピンジメントによって引き起こされるGAG染色の強化を示唆しています。合計CTFを記述するデータは、Wilcoxonマッチドペア符号付き順位検定を使用して比較されました。象限データは、反復測定の二元配置分散分析とŠídákの多重比較検定を用いて比較された。*p < 0.05です。**p < 0.01 です。p < 0.005 です。p < 0.001 です。ベースライン張力対無負荷:n = 6ペア。静的衝突と無負荷:n = 8ペア。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:SHGイメージング。 (A)無負荷培養の7日後と(B)静的衝突の7日後の代表的なSHG画像。CTF は赤で囲まれ、ラベル付けされたとおりに 4 つの象限に分けられており、上記のトルイジン青色分析の ROI と一致しています。(C)各象限内で、フーリエスペクトル解析は、フィジーのDirectionalityプラグインを使用して、移動するサブウィンドウで実行されました。各サブウィンドウ内の繊維配向の分布の広がりは分散(°)と呼ばれ、繊維配向に反比例します。分散 = 0°は、繊維が完全に平行に整列していることを表します。分散が増加すると、コラーゲン繊維のアライメントが低下します。データは標準偏差±平均を表します。静的衝突の7日後の第1象限では、反対側の負荷がかからない腱と比較して、分散に統計的に有意な差が検出され、コラーゲンの解体が増加したことを示唆しています。象限データは、反復測定の二元配置分散分析とŠídákの多重比較検定を用いて比較された。* p < 0.05。静的衝突対無負荷:n = 5ペア。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:CADファイル。 複数のファイル形式でコンパイルされたこれらのCADファイルを使用して、プラットフォームベース、ボリュームリダクションインサート、およびクリップを3Dプリントできます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:MATLABファイル。 コンパイルされたMATLABファイルにより、プロトコルのセクション8に記載されているように、トルイジンブルーの組織型を定量化して、アキレス腱挿入時のGAG染色の空間的変化を通じて線維軟骨の形成を評価できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 3: MATLAB コードを実装するためのガイドライン。 このドキュメントでは、提供されたMATLABコードを使用したToluidine blue組織型の画像解析により、アキレス腱挿入時のGAG染色の変化を定量化するパイプラインについて説明します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル4:トルイジンブルー組織学のサンプル画像。 このトルイジンブルーの組織型のRGBカラー画像を使用して、提供されたMATLABコードを実行できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

この研究で説明した組織培養プロトコルと組み合わせた実験的なマウス後肢外植片プラットフォームは、アキレス腱挿入時のインピンジメント駆動線維軟骨形成のメカノバイオロジーを研究するための適切なモデルを提供します。この外植片モデルの有用性は、7日間の静的衝突後のトルイジン青色染色の有意かつ空間的に不均一な変化に伴う細胞生存率の維持を示す代表的な結果によって実証されています。これらの発見は、他のモデルおよび臨床研究と一致する、機械的衝突に続発するGAGに富むマトリックス分子の代謝の変化を示唆しています3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 、36、37、38、44、49。さらに、7日間の静的インピンジメント後にSHGイメージングを介してコラーゲン組織に微妙でありながら有意な変化が検出され、インピンジメント関連腱炎の臨床的特徴および腱インピンジメントのin vivoモデルと一致しました28、37、38、43、44、49、64。

腱インピンジメントの生物学的後遺症を調査する以前の取り組みは、単離された腱細胞に単純な圧迫を適用してきました27,29。目的のメカノバイオロジカルメカニズムが特定されると、これらのモデルは、外植片モデルと比較して優れた治療スクリーニングプラットフォームを提供します。しかし、in vitroで培養された単離細胞は、機械応答に影響を与える3次元の細胞外環境を欠いているため、これらの研究の結果は慎重に解釈する必要があります57,59。さらに、他のコラーゲン組織(例えば、軟骨)から単離された細胞は、細胞外環境の非存在下でin vitroで機械的に挑戦すると、機械感受性イオンチャネル活性の変化を示す78,79。提示されたモデルは、生存可能な外植片内のin situ腱細胞を生理学的に関連する負荷条件にさらすためのプラットフォームを提供することにより、これらの制限に対処します。

外植片モデルは、腱の生物学と生理学を調べるための一般的な実験システムです57,58。腱インピンジメントの特定の状況では、いくつかの以前の研究が部分的および全体の腱外植片を使用して、人工的な一軸圧迫に対する腱細胞の応答を調査しています30,31,32,33,34,39。これらの研究は、一軸圧縮と線維軟骨形成の直接的な関連性を実証したが、腱の衝突によって生成される生体内の機械的ひずみ環境は多軸であり、衝突領域の解剖学的特徴に依存する5,6。例えば、足首背屈時の踵骨のアキレス腱への踵骨の衝突によって生じるひずみ環境は、挿入角度、付着面積、および周囲の軟部組織の存在によって影響を受ける60,61,62,63,80,81.私たちの外植片プラットフォームは、これらの外部構造を保存し、細胞を本来の環境内に維持しながら、衝突によって発生する多軸ひずみ環境を再現します6。

動物モデルは、機械的インピンジメントと、類似の表現型を共有する腱線維軟骨および病理学の典型的な特徴との間の直接的な関係を実証する上で基本的でした1,25,28,37,64,65,66。ここ数十年、in vivoインピンジメント研究の大部分は、げっ歯類モデルを利用して、肩峰下腔を外科的に縮小して回旋筋腱板腱に人工的に衝突させることにより、回旋筋腱板疾患を研究してきました。これらの動物モデルは、in vivoでのインピンジメント腱鞘炎の細胞および分子病因を説明するために使用されており、インピンジメント研究の臨床翻訳を促進するための新しい治療戦略を評価するために拡張することができます36、37、38、66、82、83、84、85。

しかし、腱インピンジメントのin vivoモデルが確立されているが、メカノバイオロジーの研究にはいくつかの重要な限界がある57,58。これらのモデルは、腱インピンジメントの外部原因を外科的に導入または除去し、身体活動(フリーケージ活動、強制トレッドミルランニングなど)を再開します。このアプローチでは、実験期間中、腱に直接加えられる力の大きさ、向き、周波数を制御できません。生体内での組織ひずみの測定が困難であることを考えると、これらのモデルでは、インピンジメントに応答して腱内に生成される機械的環境の制御や特性評価が制限されています。この限界は、腱メカノバイオロジー研究57,58,67,68,69,70の分野でよく認識されています。他の場所では、高度な実験プラットフォームが、麻酔下でin vivoで腱に直接制御された機械的過負荷(疲労)を適用するように設計されています67,68,69。これらのモデルは、麻酔下での短期間の機械的刺激の適用を制御し、動物が機械的過負荷後数日から数週間通常のケージ活動を再開するため、実験の残りの部分を通じて負荷履歴を制御することはできません。このプロトコルで記述されているexplantモデルは、アキレス腱インピンジメントの制御された処方を提供し、組織ひずみ6の測定可能で十分に記述されたパターンを生成し、インピンジメントメカノバイオロジーの厳密な研究を可能にします。ただし、この外植片モデルは、腱インピンジメントのin vivo調査の必要性を排除するものではなく、むしろ、これらの不可欠な動物モデルから得られたデータを充実させるための補助ツールとして機能することに注意する必要があります。この外植片モデルを用いてインピンジメント力学に関連して定義された細胞および分子経路は、メカノバイオロジー研究の臨床的翻訳を強化するための補完的なアプローチで、in vivoで特性評価し、動物モデルを使用して治療標的として評価することができます。この統合戦略の力は、腱メカノバイオロジー研究の他の領域でも利用されており58,86,87,88、この外植モデルは、腱インピンジメントへの応用を授けています。

外植モデルには制限がないわけではありません。すべての外植片モデルと同様に、メカノバイオロジーは、組織が生存可能なままである間、比較的短い時間スケールでのみ研究することができます57,89。このモデルは、機械的インピンジメントに対する細胞の即時応答を研究するための強力なツールですが、インピンジメントに関連する慢性腱疾患の研究には適していません。さらに、このモデルでは、血液供給と神経伝達が維持されないため、全身反応と組織のクロストークを説明することができません。それにもかかわらず、このモデルは、機械的衝突に対する内因性腱細胞の本質的な応答を描写するためのプラットフォームを提供します。このモデルのさらなる限界は、先行研究32,90,91,92によると、多くの大きなGAGリッチプロテオグリカンが、外植片培養の前処理および初期の時点で腱外に拡散すると予想され、特に凝集したプロテオグリカンの断片が地上マトリックスに固定されていないことです。したがって、モデル内のインピンジメントに続発するGAG染色の変化は、まだ異化されておらず、細胞外マトリックス内に固定されたままで、新たに合成されたGAGリッチ高分子の変化を反映している可能性があります。これらのGAGに富むプロテオグリカンが細胞周囲空間に局在することを考えると22,30,93,94,95、外植片モデルは、腱インピンジメントに続発するPCMリモデリングの調査を容易にする可能性がある。

このプロトコルで記述されているマウスの後肢のexplantsの解剖は練習を要求するが、堪能な技術はすぐに達成することができる。完全な脱毛(皮膚の除去)は、特に後足の指の周りでは難しい場合があります。足の指の周りの皮膚を完全に除去する必要はありませんが、細菌が皮膚や毛皮に存在するため、培養全体を通して無菌性を強化します。

解剖の最も困難な側面は、アキレス腱の内側にある足底腱を近位に除去し、アキレス腱に表在的に遠位に通過させることです。足底筋腱ユニットは、上腕三頭筋とアキレス腱と密接に関連して膝関節と足首関節にまたがっています81,96,97,98,99。受動的な足関節背屈時に足首の後部に伝達される機械的負荷は、足底腱とアキレス腱の間に分散され、足底腱は生体内で高い応力を受けることが知られている100,101。さらに、ヒト足底の解剖学的変動はよく説明されており96,102,103、この変動はげっ歯類ではあまり一般的ではありませんが97、アキレス腱内の機械的環境に影響を与える傾向があります。アキレス腱をその場で測定するために使用された以前の技術と一致して6,104、足底腱を除去して、外部から加えられた腱の衝突によって生成される内部ひずみ環境を制御する必要があります。

アキレス腱の解剖誘発性細胞死を避けるためには、足底を慎重に除去する必要があり、データ(図2B)に存在する細胞アポトーシスの変動は、解剖技術の不備による解剖誘発性損傷を反映している可能性があります。足底腱の除去は、細い先端鉗子が足底をアキレス腱から慎重に分離し、足底筋腱複合体を近位に解放するための利点があります。鋸歯状の鉗子は、足底腱の近位自由端をつかんで、遠位、踵骨の周り、足の指に向かって引っ張り、完全に除去するのに役立ちます。LeeとElliottは、ラットの足底腱とアキレス腱、および関連する筋肉組織についての有用な解剖学的説明を提供している97。

この研究で説明した解剖技術は無菌性を確保するのに十分であることがわかりましたが、無菌性の維持が困難であることが証明されている設定では、必要に応じてプロトコルを調整または変更することができます。手術器具はオートクレーブ滅菌することができ、ベタジン溶液は皮膚に局所的に塗布することができ、解剖は生物学的安全キャビネットで実施することができる。迅速で効率的な卓上解剖が重要であり、皮膚によって提供される無菌境界が破られた後、解剖された手足を生物学的安全キャビネット内の滅菌培地に迅速に移すことを可能にすることがわかりました。

コンタミネーションのトラブルシューティングのもう一つの主要なターゲットは、プラットフォームコンポーネントの滅菌に使用される技術です。私たちの手では、オートクレーブなしで水道水で適切にすすぐ≥、10%漂白剤溶液に浸すだけで一貫して成功を収めています。必要に応じて、70%エタノールを使用した追加の滅菌を適用できますが、PLAで3DプリントされたコンポーネントはEtOHと互換性がなく、歪むことに注意してください。さらに、アクリル槽と3DプリントされたPLAコンポーネントを除くプラットフォームのすべての部品をオートクレーブ滅菌することができ、10%漂白剤溶液に浸≥コンポーネントはオートクレーブまたは精製水ですすぐことができます。錆びないように、各実験の直後にすべての金属部品を洗い、手乾燥することをお勧めします。

このプロトコルに記載されている線維軟骨の形成を特徴付けるためにトルイジンブルー染色を定量化するための方法論は、腱の研究に幅広いアプリケーションを提供する革新的なカスタムカラー画像分析を採用しています。画素データをRGBからHSV色空間76に変換することによって、重要な利点が提供される。ここで、色相は主波長を0°〜360°の特徴的な色としてコード化し、彩度は0〜255の各色相の純度を定義します。逆に、値は色の明るさを表すため、HSV 配色は明るさ (値) と色 (色相、彩度) を分離します。組織学的分析の文脈では、HSVピクセルデータは、顕微鏡検査中の光透過率の変化および組織切片の厚さの変動に対してより頑健である76。さらに、HSV色空間での作業は、組織学的染色76に応じて、例えば、トルイジン青色染色のための240°前後の色相など、関心のある特定の波長の描写(色相を介して)を可能にする。

この研究で提示されたトルイジンブルー画像分析の革新的な側面は、線維軟骨スコアであり、各ROIの色を骨膜線維軟骨の色に分離するユークリッド距離に関連する指標です。骨膜線維軟骨は出生直後に二次軟骨として出現するが、圧縮腱線維軟骨は出生後に存在せず、他の種子状線維軟骨と同様に、腱の圧迫が上昇した領域における機械的需要によって調節されているようである16,17,28,77.実験群間で線維軟骨スコアを比較することにより、トルイジンの青色染色がインピンジメントに続発して変化しているかどうかだけでなく、この変化が線維軟骨に近い外観をもたらすかどうかを判断できます。この分析は、骨膜線維軟骨に類似した対照組織が存在する限り、アルシアンブルーやサフラニンOなどの他の一般的なGAG染色剤や、腱線維軟骨や線維軟骨性腱膜の他の領域にも拡張できます。例えば、膝の腱や靭帯のGAG染色の変化は、線維軟骨スコアを介して線維軟骨半月板の染色に正常化することができます。

このプロトコルの重大な面はセクション深さの追跡のためのアキレス腱の挿入への記入項目の反復可能なパラフィンの埋め込みそして綿密な同一証明を要求するアキレス腱を通るセクションレベルを分ける連続ティッシュおよび追跡である。この切片化および染色プロトコルは、間違いなく練習と改良が必要ですが、凍結切片に拡張することができます。

この原稿で説明されている組織学的アプローチは、免疫組織化学または免疫蛍光法に容易に拡張できます。この点に関して、上記の実験計画の重要な側面は、各マウスからの対側肢のペアワイズ比較である。ここでは、すべての統計的比較は、異なる実験グループに割り当てられた同じマウスの対側肢のアキレス腱を介して、比較可能な切片レベルで組織切片間で引き出されます。この戦略は、生物学的変動を制御するのに役立ちます。さらに、対側組織切片のレベルマッチしたペアを、すべての試薬、バッファー、および抗体溶液に同一の作業溶液を使用して、同じスライドラックで同時に染色(組織学)または同時にスライド上で染色し(免疫染色)、組織学および免疫標識に固有の染色間のばらつき、および切片のレベル、位置、および向きに依存する解剖学的不均一性を制御するのに役立ちます。

この原稿に記載されているプロトコルに対する他のいくつかの変更は、追加の研究課題のさらなる研究のために実装される可能性があります。例えば、ここで紹介する代表的なデータは7日間の静的衝突に焦点を当てていますが、このアプローチは、後足に巻き付けられたストリングをクリップを介してシリンジポンプなどの機械的アクチュエータに結合させることで、断続的または周期的な衝突の生物学的後遺症を調査するために適応させることができます。さらに、このプラットフォームは、培地に低分子アゴニスト/アンタゴニストを添加したり、トランスジェニックマウス株から後肢外植片を使用したりすることで、目的の分子メカニズムを調べる機会を提供します。

結論として、アキレス腱インピンジメントの根底にあるメカノバイオロジーを研究するための新しいマウス後肢外植片モデルを提示しました。これは、7日間にわたってローディング条件で細胞の生存率を維持する組織培養プロトコルによってもたらされます。このモデルは、他のモデルシステムや変性腱疾患で説明されているように、インピンジメントによる線維軟骨の形成とコラーゲンの変化を再現します。この実験プラットフォームは、機械的ひずみパターンの制御された適用と定量化を可能にするため、衝突メカノバイオロジーの厳密な研究のための優れたモデルを提供します。このモデルは、挿入性腱鞘炎の治療における潜在的な治療標的を特定するために、関心のある分子メカニズムを調べるために適用できます。

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Disclosures

著者は何も開示していません。

Acknowledgments

著者らは、P30AR06965ロチェスター大学筋骨格研究センターの組織学、生化学、分子イメージング(HBMI)コアのJeff Fox氏とVidya Venkatramani氏による支援と支援に感謝しています。さらに、著者らは、多光子顕微鏡法の支援について、ロチェスター大学医療センターの光学顕微鏡およびナノスコピーセンター(CALMN)に感謝します。この研究は、R01 AR070765 と R01 AR070765-04S1、および 1R35GM147054 と 1R01AR082349 から資金提供を受けました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox - Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining

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