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Bioengineering

Maus-Hintergliedmaßen-Explantatmodell zur Untersuchung der Mechanobiologie des Achillessehnen-Impingements

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65801
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

Summary

Wir stellen eine maßgeschneiderte experimentelle Plattform und ein Gewebekulturprotokoll vor, das fibroknorpelige Veränderungen nachbildet, die durch das Impingement der Achillessehneninsertion in murinen Hintergliedmaßenexplantaten mit anhaltender Zelllebensfähigkeit verursacht werden, und so ein Modell für die Erforschung der Mechanobiologie des Sehnenimpingements bietet.

Abstract

Das Auftreffen der Sehne auf den Knochen erzeugt eine multiaxiale mechanische Dehnungsumgebung mit deutlich erhöhter transversaler Kompressionsdehnung, die einen lokalisierten Faserknorpelphänotyp hervorruft, der durch die Akkumulation von Glykosaminoglykan (GAG)-reicher Matrix und den Umbau des Kollagennetzwerks gekennzeichnet ist. Während Faserknorpel ein normales Merkmal in eingedrückten Regionen gesunder Sehnen ist, sind übermäßige GAG-Ablagerungen und Desorganisation des Kollagennetzwerks charakteristische Merkmale der Tendinopathie. Dementsprechend ist das Impingement klinisch als wichtiger extrinsischer Faktor bei der Initiierung und dem Fortschreiten der Tendinopathie anerkannt. Dennoch ist die Mechanobiologie, die dem Sehnenimpingement zugrunde liegt, noch wenig erforscht. Frühere Bemühungen, die zelluläre Reaktion auf Sehnenimpingement aufzuklären, haben die Zellen einachsig komprimiert und Sehnenexplantaten in vitro exzidiert. Isolierten Zellen fehlt jedoch eine dreidimensionale extrazelluläre Umgebung, die für die Mechanoreaktion entscheidend ist, und sowohl in vitro als auch in exzidierten Explantatsstudien ist es nicht möglich, die multiaxiale Belastungsumgebung zu rekapitulieren, die durch das Sehnenimpingement in vivo erzeugt wird, was von den anatomischen Merkmalen der impingierten Region abhängt. Darüber hinaus fehlt in vivo Modellen des Sehnenimpingements die Kontrolle über die mechanische Dehnungsumgebung. Um diese Einschränkungen zu überwinden, stellen wir ein neuartiges Maus-Explantatmodell der Hintergliedmaßen vor, das für die Untersuchung der Mechanobiologie des Achillessehnenimpingements geeignet ist. Dieses Modell hält die Achillessehne in situ , um die lokale Anatomie zu erhalten, und reproduziert die multiaxiale Belastungsumgebung, die durch das Auftreffen des Achillessehnenansatzes auf das Fersenbein während der passiv angelegten Knöcheldorsalflexion erzeugt wird, während die Zellen in ihrer natürlichen Umgebung erhalten bleiben. Wir beschreiben ein Gewebekulturprotokoll, das integraler Bestandteil dieses Modells ist, und präsentieren Daten, die eine anhaltende Explantatlebensfähigkeit über 7 Tage belegen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen eine verstärkte histologische GAG-Färbung und eine verminderte Kollagenfaserausrichtung als Folge des Impingements, was auf eine erhöhte Faserknorpelbildung hindeutet. Dieses Modell kann leicht angepasst werden, um verschiedene mechanische Belastungsregime zu untersuchen, und ermöglicht die Manipulation molekularer Signalwege von Interesse, um Mechanismen zu identifizieren, die phänotypische Veränderungen in der Achillessehne als Reaktion auf ein Impingement vermitteln.

Introduction

Eine Vielzahl von Sehnen, darunter die Achillessehne und die Sehnen der Rotatorenmanschette, erleiden aufgrund der normalen anatomischen Positionierung ein knöchernes Impingement1,2,3,4. Das Sehnenauftreffen erzeugt eine Druckdehnung, die quer zur Faserlängsachse gerichtet ist5,6,7. Die Regionen des Sehnenimpingements zeigen einen einzigartigen Faserknorpel-Phänotyp, bei dem geschrumpfte, runde Zellen (Fibrochondrozyten) in ein desorganisiertes Kollagennetzwerk mit deutlich erhöhtem Glykosaminoglykan-Gehalt (GAG) eingebettet sind2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die unterschiedliche mechanische Umgebung, die durch das Aufprallen der Sehne erzeugt wird, diese GAG-reiche Matrix aufrechterhält, indem sie die Ablagerung großer aggregierender Proteoglykane, vor allem Aggrecan, antreibt, obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen unklar sind1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Während Faserknorpel ein normales Merkmal in eingeklemmten Regionen gesunder Sehnen ist, ist ein aberranter Proteoglykanstoffwechsel, der mit einer übermäßigen Bildung von Faserknorpel einhergeht, ein charakteristisches Merkmal der Tendinopathie, einer häufigen und schwächenden Erkrankung, die überproportional häufig bei chronisch eingedrückten Sehnen auftritt1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Dementsprechend ist das Sehnenimpingement klinisch als wichtiger extrinsischer Faktor anerkannt, der mehrere der häufigsten Tendinopathien antreibt, darunter die Rotatorenmanschettenerkrankung und die insertionelle Achillessehnen-Tendinopathie (IAT)50,51,52. Derzeit ist die Behandlung der Tendinopathie ineffizient. Zum Beispiel benötigen etwa 47 % der Patienten mit IAT einen chirurgischen Eingriff nach einer fehlgeschlagenen konservativen Behandlung mit unterschiedlichen postoperativen Ergebnissen53,54,55,56. Trotz des offensichtlichen Zusammenhangs zwischen Impingement und Tendinopathie sind die mechanobiologischen Mechanismen, mit denen Zellen in eingeklemmten Sehnen ihre mechanische Umgebung wahrnehmen und darauf reagieren, nur unzureichend beschrieben, was das Verständnis der Pathogenese der Tendinopathie verdunkelt und zu einer unzureichenden Behandlung führt.

Explantatmodelle sind nützliche Werkzeuge bei der Untersuchung der Sehnenmechanobiologie 57,58. Als ersten Schritt zum Verständnis der Mechanobiologie des Sehnenimpingements haben mehrere frühere Studien die zelluläre Reaktion nach der Anwendung einer einfachen einachsigen Kompression auf Zellen oder exzidierten Sehnenexplantaten untersucht 27,29,30,31,32,33,34,39. In vitro fehlen den Zellen jedoch extrazelluläre und perizelluläre Matrizen, die den Stammtransfer erleichtern, wichtige Wachstumsfaktoren und Zytokine sequestrieren, die durch mechanische Verformung freigesetzt werden, und Substrat für fokale Adhäsionskomplexe liefern, die eine Rolle bei der Mechanotransduktion spielen57,59. Darüber hinaus ist es sowohl in vitro als auch in exzidierten Explantatsstudien nicht möglich, die multiaxiale mechanische Belastungsumgebung zu rekapitulieren, die durch das Sehnenimpingement in vivo erzeugt wird und von den anatomischen Merkmalen der impingierten Region abhängt 5,6. Im Zusammenhang mit dem eingeklemmten Achillessehnenansatz umfasst dies umliegende Gewebe wie den Schleimbeutel retrocalcaneus und das Kager'sche Fettpolster 60,61,62,63. Umgekehrt erlauben In-vivo-Modelle des Sehnenimpingements 25,28,36,37,38,64,65,66 eine minimale Kontrolle über das Ausmaß und die Häufigkeit der direkt auf die Sehne aufgebrachten Belastung, was eine anerkannte Einschränkung von In-vivo-Modellen zur Untersuchung der Sehnenmechanobiologie darstellt57,58,67,68,69,70. Angesichts der Herausforderungen bei der Messung der Sehnendehnung in vivo ist die in diesen Modellen erzeugte interne Dehnungsumgebung oft schlecht charakterisiert.

In diesem Manuskript stellen wir eine maßgeschneiderte experimentelle Plattform vor, die das Impingement des Ansatzes der Achillessehne auf das Fersenbein innerhalb ganzer muriner Hintergliedmaßen-Explantate nachbildet, die, wenn sie mit diesem Gewebekulturprotokoll gepaart wird, die Lebensfähigkeit über 7 Tage in Explantatskultur aufrechterhält und die Untersuchung der biologischen Folgen des Sehnenimpingements ermöglicht. Die Plattform basiert auf einer 3D-gedruckten Basis aus Polymilchsäure (PLA), die die Grundlage für die Befestigung der Griffe und des 3D-gedruckten PLA-Volumenreduzierungseinsatzes bildet. Die Griffe werden verwendet, um den Oberschenkel und das Knie proximal des myotendinösen Übergangs der Achillessehne mit dem kaudalen Aspekt der Hinterextremität nach oben zu klemmen, so dass die Achillessehne von oben mit einer Ultraschallsonde oder einem inversen Mikroskop abgebildet werden kann (Abbildung 1A). Der Volumenreduzierungseinsatz gleitet entlang einer Schiene auf der Basis und reduziert das benötigte Volumen der Gewebekulturmedien. Eine geflochtene Schnur, die um die Hinterpfote gewickelt ist, wird unter Verwendung des Basisdesigns und eines 3D-gedruckten PLA-Clips aus der Plattform geführt. Durch das Ziehen an der Sehne wird die Hinterpfote dorsalflexiert und der Achillessehnenansatz gegen das Fersenbein gedrückt, was zu einer erhöhten Querdruckbelastungführt 5,6 (Abbildung 1A). Die Plattform befindet sich in einem Acrylbad, das die Explantaten der Hintergliedmaßen in Gewebekulturmedien untergetaucht hält. Durch die Befestigung der gespannten Schnur an der Außenseite des Bades mit Klebeband wird die Dorsalflexion des Knöchels aufrechterhalten, um ein statisches Auftreffen des Achillessehnenansatzes zu erzeugen. CAD-Dateien für 3D-gedruckte Komponenten werden in mehreren Formaten zur Verfügung gestellt (Ergänzungsdatei 1), die den Import in eine Reihe von kommerzieller und kostenloser Open-Source-CAD-Software ermöglichen, um sie an experimentelle Anforderungen anzupassen. Wenn der Zugang zu 3D-Druckern für die Fertigung nicht verfügbar ist, können CAD-Dateien an Online-3D-Druckdienste weitergegeben werden, die die Teile kostengünstig drucken und versenden.

Wichtig ist, dass der Trizeps-Surae-Achilles-Muskelkomplex sowohl das Knie- als auch das Sprunggelenk umfasst 71,72,73. Folglich wird die Zugbelastung in der Achillessehne durch die Kniebeugung beeinflusst. Die Kniestreckung setzt die Achillessehne unter Spannung, während die Kniebeugung die Spannung reduziert. Durch die Streckung des Knies und die anschließende passive Dorsalflexion des Sprunggelenks können die Zugbelastungen am auftreffenden Ansatz mit den Zugbelastungen überlagert werden. Umgekehrt wird durch passives Dorsalflexieren des Knöchels mit gebeugtem Knie die Zugbelastung reduziert und die Druckbelastung bleibt bestehen. Das derzeitige Protokoll untersucht drei solcher Bedingungen. 1) Für ein statisches Impingement wird der Fuß auf < 110° in Bezug auf das Schienbein dorsalflexiert, um den Ansatz zu berühren, wobei das Knie gebeugt wird, um die Spannung zu reduzieren. 2) Bei der Baseline-Spannungsgruppe wird der Knöchel bei gestrecktem Knie über 145° Dorsalflexion gestreckt, wodurch beim Einsetzen überwiegend Zugdehnung erzeugt wird. 3) Für die unbelastete Gruppe werden die Explantate in einer Petrischale kultiviert, wobei sich Knie und Knöchel in neutraler Position befinden, ohne dass eine von außen aufgebrachte Last erfolgt. Die oben genannten Winkel werden fotografisch relativ zu einem Koordinatensystem gemessen, in dem Fuß und Schienbein in einem Winkel von 180° parallel und in einem Winkel von 90° senkrecht stehen.

Zu den wichtigsten Schritten des Protokolls gehören: 1) die Präparation der Explantaten der Hintergliedmaßen und die sorgfältige Entfernung der Haut und der Plantarissehne; 2) Explantatkultur nach einer 48-stündigen Dexamethason-Vorbehandlung; 3) Gewebeschnitt und histologische Färbung; und 4) Farbbildanalyse zur Beurteilung der Faserknorpelbildung. Nach der Sektion wird jedes Explantat der Hintergliedmaßen für 48 Stunden in Nährmedien vorbehandelt, die mit Dexamethason74 ergänzt wurden. Die kontralateralen Gliedmaßen jeder Maus werden für den paarweisen Vergleich in separate Versuchsgruppen eingeteilt, was zur Kontrolle der biologischen Variabilität beiträgt. Nach der Vorbehandlung werden die Explantaten wie oben beschrieben in Plattformen positioniert und für weitere 7 Tage kultiviert (Abbildung 1B). Zusätzliche Vergleiche werden mit einer vorbehandelten Gruppe (Tag 0) angestellt, in der die Explantaten unmittelbar nach der 48-stündigen Vorbehandlung entfernt werden.

Nach der Explantatkultur werden die Hintergliedmaßen beschnitten, Formalin fixiert, entkalkt und in Paraffin eingebettet. Der serielle Schnitt in sagittaler Ausrichtung ermöglicht die Visualisierung der Achillessehne vom myotendinösen Übergang bis zum Fersenbeinansatz und ermöglicht die Verfolgung der Schnitttiefe durch die gesamte Sehne. Die terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT)-vermittelte dUTP-X-Nick-Markierung (TUNEL) wird verwendet, um DNA-Schäden als Folge der Apoptose sichtbar zu machen und die Lebensfähigkeit zu beurteilen. Toluidinblau-Histologie und benutzerdefinierte Farbbildanalyse werden durchgeführt, um Veränderungen in der GAG-Färbung zu quantifizieren. Toluidinblau gefärbte Gewebeschnitte werden dann für die SHG-Bildgebung verwendet, um Veränderungen in der Organisation der Kollagenfasern zu charakterisieren (Abbildung 1B).

Die vorgelegten repräsentativen Ergebnisse deuten auf eine veränderte histologische Färbung der GAG-reichen Matrix und eine Desorganisation des extrazellulären Kollagennetzwerks hin, die durch 7-tägiges statisches Impingement innerhalb des Modells erzeugt wurde. Dieses Modell kann verwendet werden, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die der Impingement-getriebenen fibroknorpeligen Veränderung zugrunde liegen.

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Protocol

Alle Tierarbeiten wurden vom Komitee für Tierressourcen der Universität Rochester genehmigt.

1. Herstellung von Gewebekulturmedien

  1. Kultivieren Sie alle Explantate in Dulbecco's Modified Eagle Medium (1x DMEM) mit 1 % v/v Penicillin-Streptomycin und 200 μM L-Ascorbinsäure in einem Inkubator bei 37 °C und 5 %CO2. Für die anfängliche 48-stündige Vorbehandlung wird jedes Explantat in 70 ml Nährmedien kultiviert, die mit 100 nM Dexamethason74 ergänzt wurden. Nach der Vorbehandlung werden die Gliedmaßen für weitere 7 Tage ohne Dexamethason kultiviert, wobei das Medium alle 48-72 Stunden gewechselt wird.
    HINWEIS: Die Zugabe von Serum, wie z. B. fötalem Rinderserum, zu den Nährmedien wird in Übereinstimmung mit den Empfehlungen von Wunderli, Blache und Snedeker57 nicht empfohlen. Kurz gesagt, serumfreie Bedingungen repräsentieren besser die avaskuläre, nährstoffarme Sehnenmikroumgebung, die in vivo existiert. Darüber hinaus kann eine Serumsupplementierung den Gewebeabbau unter bestimmten Kulturbedingungen fördern75 und die Zellproliferation und -migration aus dem Gewebe stimulieren, beides Merkmale der Sehnenpathologie57.
  2. Für die unbelastete Gruppe wird jedes Explantat in 70 ml Medien kultiviert. Für die Basislinien-Spannungs- und statischen Impingement-Gruppen benötigt jede Plattform etwa 125 ml Nährmedien, um die Gliedmaße unter Wasser zu halten. Dieses Volumen kann je nach Positionierung des Oberschenkels in den Griffen und 3D-Druckparametern, vor allem der Fülldichte, variieren.

2. Explantat-Dissektion und Dexamethason-Vorbehandlung

  1. Euthanasie von Mäusen durch CO2 - Inhalation und sekundäre Zervixluxation oder gemäß den institutionellen Richtlinien. Dieses Protokoll verwendet C57BL/6-Mäuse, die weniger als 1 Jahr alt sind. Die Größe der hinteren Gliedmaßen nimmt mit zunehmendem Alter zu und es kann schwierig werden, in die Griffe zu passen.
  2. Vor der Präparation werden 70 ml vorgewärmtes (37 °C) Nährmedium in eine Petrischale mit 100 mm (Durchmesser) x 25 mm (Höhe) in eine sterile biologische Sicherheitswerkbank (BSC) überführt. Fügen Sie Dexamethason hinzu, um eine Arbeitskonzentration von 100 nM zu erreichen.
  3. Die Dissektionen können auf dem Labortisch mit saugfähigen Unterlagen durchgeführt werden, wobei die Dissektion zügig durchlaufen wird, bevor die Explantaten der Hintergliedmaßen in die BSC übertragen werden. Stellen Sie die chirurgischen Instrumente zusammen, die für diese Sektion erforderlich sind, darunter eine glatte, gerade Pinzette mit feiner Spitze; gerade, feine Pinzette mit gezackten Zähnen; und eine gerade, scharfe, feine Schere.
  4. Für die Dissektion der Explantaten der Hintergliedmaßen wird die Maus in Rückenlage gelegt und das Hüftgelenk identifiziert. Machen Sie mit einer feinen Schere einen kleinen (5-10 mm) Schnitt durch die Haut, der den proximalen und vorderen (kranialen) Aspekt des Oberschenkels überlagert.
  5. Ziehen Sie den Schnitt auseinander, um sich auszudehnen, kneifen Sie den freiliegenden Oberschenkel mit den Fingern zusammen und ziehen Sie die Haut vorsichtig nach distal, um die Hintergliedmaße auf Höhe des Knöchels zu enthandschuhen. Führen Sie vorsichtig ein Scherenblatt entlang der dorsalen Seite des Fußes unter die Haut ein und machen Sie einen Schnitt, der sich bis zu den Zehen erstreckt. Ziehen Sie die Haut weiter distal, um sie vollständig zu entfernen.
  6. Positionieren Sie die Maus, um den Ansatz der Achillessehne auf der hinteren (kaudalen) Seite des Fersenbeins in der Nähe des Knöchels zu visualisieren. Proximal des Ansatzes der Achillessehne liegt die Plantarissehne direkt neben dem medialen Rand der Achillessehne und erstreckt sich distal in Richtung der plantaren Seite des Fußes, über die hintere Seite des Fersenbeins.
  7. Um die Plantarissehne zu entfernen, führen Sie vorsichtig eine Spitze der glatten, feinen Spitzenzange zwischen die beiden Sehnen ein und verlängern Sie die Spitze medial unter der Plantarissehne. Ziehen Sie die Spitze proximal und reißen Sie den Plantaris-Muskel durch. Greifen Sie mit einer feinen Spitze, gezackten Pinzette, greifen Sie das abgetrennte proximale Ende der Plantarissehne und ziehen Sie distal, um es zu entfernen.
  8. Am Hüftgelenk schneidest du mit einer feinen Schere durch das Becken und isolierst die Hintergliedmaße. Heble mit der Schere das verbleibende Becken ab und lege den Hüftkopf frei.
  9. Die Explantation der Hintergliedmaßen wird in die BSC und in die Schale mit den Zellkulturmedien mit Dexamethason überführt. Schieben Sie die Schale in den Inkubator und behandeln Sie sie für 48 Stunden.

3. Explantatkultur und Verladeplattformen

  1. Nach Abschluss der 48-stündigen Vorbehandlung ausreichende Mengen an Nährmedien vorwärmen (Abschnitt 1). Ab diesem Zeitpunkt wird den Nährmedien kein Dexamethason mehr zugesetzt. Zu diesem Zeitpunkt können Gliedmaßen aus der vorbehandelten Gruppe (Tag 0) fixiert, entkalkt und in Paraffin eingebettet werden, um sie später zu schneiden, zu färben und zu analysieren.
  2. Für die entladene Gruppe wird das Vorbehandlungsmedium abgesaugt und die Explantaten in frische Petrischalen übertragen, jeweils 70 ml Nährmedien hinzugefügt und in den Inkubator zurückgeführt.
  3. Für die Basislinien-Spannungs- und statischen Impingement-Gruppen sind Explantatsplattformen vorzubereiten. Schneiden Sie Schleifpapierstücke in ähnlicher Größe wie die Griffplatten zu. Schneiden Sie für die statische Aufprallgruppe Stücke einer geflochtenen Schnur mit einer Länge von etwa 18 Zoll ab und binden Sie einen losen Überhandknoten auf halber Höhe der Schnurlänge vor. Reißen Sie Stücke der Aluminiumfolie ab, um jedes Acrylbad abzudecken, und besprühen Sie es mit 70% Ethanol (EtOH). Übertragen Sie die Vorbereitungen auf die BSC.
  4. Jede Plattform enthält ein Acrylbad, einen Sockel, einen Einsatz zur Volumenreduzierung, einen Clip und Griffe. Jeder Griff enthält zwei Platten und drei verschiedene Arten von Schrauben, darunter eine M5 x 0,8 mm Gewinde x 10 mm lange Schraube, die die Griffe an der Basis befestigt; zwei M6 x 1 mm Gewinde x 20 mm lange Schrauben, die die Platten verlängern, um die Griffe zu klemmen; und vier M3 x 0,5 mm Gewinde x 14 mm lange Schrauben, die in Kombination mit vier Druckfedern die Platten zurückziehen, um die Griffe zu öffnen.
  5. Legen Sie alle Komponenten in sekundäre Behälter, die im Falle eines Lecks alle Nährmedien auffangen können. In ≥ 10%ige Bleichlösung eintauchen und mindestens 1 Stunde einweichen. Spülen Sie die Bleichlösung mit Leitungswasser ab (bei Bedarf autoklavieren) und begeben Sie sich in die BSC.
    HINWEIS: Um Kontaminationen zu beheben, sollten Sie das gesamte Leitungswasser autoklavieren oder gereinigtes Wasser verwenden. In der Diskussion finden Sie weitere Tipps zum Umgang mit Kontaminationen.
  6. Verwenden Sie die M3-Schrauben und Druckfedern, um die Platten an den Griffen zu befestigen, befestigen Sie die Griffe mit der M5-Schraube an der Basis und setzen Sie die M6-Schrauben ein, bis sie in die Platten eingreifen. Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um Schleifpapier auf den Platten zu befestigen, und schließen Sie dann die Griffe, um die Haftung des Schleifpapiers auf den Platten zu fördern. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Plattformen.
  7. Wenn Sie bereit sind, eine Plattform zu laden, öffnen Sie die Griffe vollständig und legen Sie mit einer Pinzette den Oberschenkel und das Knie zwischen die Platten, wobei die oberflächliche Oberfläche der Achillessehne nach oben zeigt (Abbildung 1A). Schließen Sie die Griffe locker, um sie vorsichtig an Ort und Stelle zu halten.
  8. Verwende eine Pinzette, um den freiliegenden Hüftkopf oder -fuß zu greifen, und manipuliere den Kniebeugewinkel, während du die Griffe allmählich schließt, um sie zu fixieren. Für die Basislinien-Spannungsgruppe dehnen Sie das Kniegelenk wie zuvor beschrieben. Wenn sich die Griffe bei gestrecktem Knie straffen, sollte sich der Knöchel auf natürliche Weise strecken. Für die statische Impingementgruppe beugen Sie das Kniegelenk zwischen den Griffen wie zuvor beschrieben.
  9. Für die statische Impingementgruppe legen Sie den Überhandknoten der Schnur um die distale Pfote und ziehen ihn fest. Führen Sie die Schnur durch einen Schlitz in der Basis, der sich unter dem Explantat befindet, und durch das Cliploch. Setzen Sie den Sockel in die Acrylwanne ein und befestigen Sie den Clip an der Oberkante der Badewanne (Abbildung 1A).
  10. Ziehen Sie die Schnur, um den Fuß auf mindestens 110° in Bezug auf das Schienbein zu beugen, und markieren Sie die Schnur mit einem Permanentmarker, wenn sie aus dem Clip austritt. Machen Sie ein Foto des Explantats in dieser Position, um später den Dorsalflexionswinkel zu quantifizieren (Abbildung 1A).
  11. Entfernen Sie den Sockel und befestigen Sie den Volumenreduzierungseinsatz, indem Sie entlang einer Schiene auf dem Sockel schieben. Setzen Sie den Sockel (jetzt am Volumenreduziereinsatz befestigt) wieder in das Acrylbad ein und positionieren Sie den Clip wieder an der oberen Kante. Ziehen Sie an der Schnur, um zum ursprünglichen Dorsalflexionswinkel zurückzukehren, indem Sie die markierte Schnur als Führung verwenden, und befestigen Sie die Schnur mit Klebeband an der Außenseite der Wanne, um die statische Dorsalflexion aufrechtzuerhalten.
  12. Für die Basislinien-Spannungsgruppe legen Sie einfach die Basis mit dem Volumenreduzierungseinsatz in das Acrylbad, sobald das Explantat zwischen den Griffen positioniert ist, und machen Sie ein Foto zur Quantifizierung des Dorsalflexionswinkels.
  13. Geben Sie 125 ml vorgewärmte (37 °C) Nährmedien zu jeder Plattform, um Explantaten einzutauchen. Decken Sie die Oberseite des Bades mit Aluminiumfolie ab, legen Sie sie in einen sekundären Behälter und gehen Sie in den Inkubator. Kultur für 7 zusätzliche Tage, Medienwechsel alle 48-72 h.
    HINWEIS: Klebeband, das über die Oberseite der Badewanne gelegt wird, kann verhindern, dass PLA-Teile schwimmen.

4. Fixierung, Entkalkung und Paraffineinbettung

  1. Im Anschluss an die Explantatskultur werden die Zehennägel/distalen Zehen mit einer Schere gekürzt und der Oberschenkel proximal des myotendinösen Übergangs der Achillessehne abgeschnitten. Legen Sie jedes getrimmte Sprunggelenk in eine Verarbeitungskassette, die mit Schaumstoff-Biopsiepads ausgekleidet ist. Drücken Sie den Knöchel in die Kassettenecke, um den Knöchel in einem Winkel von ca. 90° Dorsalflexion zu positionieren, und schließen Sie die Kassette, um sie an Ort und Stelle zu halten.
  2. 3 Tage lang in 10 % neutralem gepuffertem Formalin (NBF) fixieren und 2 Wochen lang in 14%iger Ethylendiamentetraessigsäure (EDTA) entkalken, gelöst in destilliertem Wasser (diH2O) mit pH-Wert von 7,4-7,6 mit Eisessig.
  3. Um Salze zu entfernen, spülen Sie die Proben dreimal gründlich in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von diH2O, jeweils 5 Minuten. Führen Sie eine routinemäßige Probenverarbeitung für die Paraffinhistologie durch: Dehydrieren Sie durch eine abgestufte Reihe von EtOH, klären Sie es in Xylol und infiltrieren Sie es mit Paraffinwachs. Orientieren und betten Sie die Proben in Paraffin ein, um sagittale Gewebeschnitte durch die Achillessehne bei medialer zu lateraler Progression zu erhalten, wie in Abschnitt 5 unten beschrieben (Abbildung 1B).

5. Gewebe schneiden

  1. Schneiden Sie mit einem Mikrotom vorsichtig in die Probe ein, bis die Abschnitte parallel zur Blockfläche verlaufen. Schneiden Sie den Knöchel von der medialen Seite des Gelenks aus grob ab und stoppen Sie, bevor Sie die mediale Grenze des Achillessehnenansatzes erreichen.
  2. Übertragen Sie die Probe auf einen Eisblock, um Temperatur und Hydratation anzupassen, und wechseln Sie die Klingen (oder wechseln Sie zu einem neuen Abschnitt der aktuellen Klinge). Fahren Sie mit dem Schnitt in die Probe mit einer Dicke von 10 μm fort und identifizieren Sie vorsichtig den Eintritt in den Achillessehnenansatz mit einem Hellfeldmikroskop. Nach der Identifizierung führen Sie eine serielle Schnittverfolgung durch, die die Abschnittsnummer (d. h. die Gewebetiefe) durch den gesamten Achillessehnenansatz verfolgt.

6. Entparaffinierung/Rehydrierung und Objektträgerauswahl

  1. Wählen Sie für jeden der folgenden Assays Gewebeschnitte aus jedem Paar kontralateraler Gliedmaßen aus. Vor dem Färben auf ein Objektträgergestell legen und jeweils 5 Minuten durch 3 Wechsel von Xylol, 2 Wechsel von 100 % EtOH, 2 Wechsel von 95 % EtOH und 1 Wechsel von 70 % EtOH führen. Beenden Sie die Rehydrierung in diH2O.

7. TUNEL zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Achillessehne

  1. Für die TUNEL-Etikettierung nach dem Protokoll des Herstellers beizen. In 20 μg/ml Proteinase K für 20 min bei Raumtemperatur inkubieren und indiH2O spülen. In 50 μl TUNEL-Färbelösung (5 μl Enzymlösung, 45 μl Markierungslösung) für 1 h bei 37 °C inkubieren. Spülen Sie in diH2O. Montieren Sie es mit einem Antifade-Reagenz, das DAPI und Deckglas enthält.
  2. Fotografieren Sie den Achillessehnenansatz mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einer 4-fach-Objektivlinse. Fügen Sie einen DAPI-Kanal (Anregungs-/Emissionswellenlängen = 360/460 nm) zur Visualisierung aller Kerne, einen TUNEL-Kanal (TMR Red) (Anregungs-/Emissionswellenlängen = 540/580 nm) zur Visualisierung apoptotischer Kerne und, wenn möglich, einen Hellfeldkanal hinzu.
  3. Importieren Sie Bilder für die Bildanalyse in eine Bildanalysesoftware, die für die ROI-basierte Verarbeitung geeignet ist, z. B. FIJI/ImageJ oder MATLAB. Definieren Sie eine Region of Interest (ROI), die die gesamte Achillessehne in der Ansicht umreißt (Abbildung 2A), wobei Zellen im Epitenon ausgeschlossen werden, die sehr anfällig für den Tod sind, der durch Dissektion und plötzliche Änderung der Umweltbedingungen verursacht wird, wenn sie in Kultur gegeben werden.
  4. Führen Sie dazu eine ROI-Auswahl in MATLAB durch, indem Sie das Hellfeldbild importieren und die Funktion drawpolygon() verwenden, um die Grenzen des Spannglieds zu verfolgen und einzuschließen. MATLAB erstellt ein Polygon-Objekt für den ROI, das dann auf die DAPI- und TUNEL-Kanalbilder angewendet werden kann, um Pixelintensitätsdaten außerhalb des ROI mit createMask() auszublenden, um nur Kerne innerhalb der Achillessehne zu analysieren.
  5. Importieren Sie die DAPI- und TUNEL-Kanalbilder und identifizieren Sie eine Fluoreszenzintensitätsschwelle für die Definition von apoptotischen (TUNEL+) Kernen, indem Sie auf die maximale Fluoreszenzintensität apoptotischer Kerne in nicht lebensfähigen Geweben wie Knochen, Muskeln oder Fett normalisieren, die zufällig im Gewebeschnitt erfasst werden. Sobald die Bilder maskiert sind, berechnen Sie den Anteil der apoptotischen Kerne (TUNEL+-Kerne/DAPI-Kerne) innerhalb der Achillessehne.

8. Toluidinblau-Histologie zur Charakterisierung der Faserknorpelbildung

  1. Nach der Rehydrierung (Abschnitt 6) wird das Objektträgergestell mit den auf das Niveau abgestimmten Gewebeschnitten von kontralateralen Explantagenpaaren auf 0,4 Gew.-% Toluidinblau O in 0,1 M Natriumacetatpuffer mit pH-Wert von 4,0 unter Verwendung von Eisessig übertragen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren, dann 3x in diH2O für jeweils 30 s spülen.
  2. Dehydrieren Sie durch drei Wechsel von 95 % EtOH und zwei Wechsel von 100 % EtOH, jeweils 30 s. Klären Sie durch drei Wechsel von Xylol, jeweils 1 Minute. Deckglas mit Eindeckmedium auf Xylolbasis.
  3. Erhalten Sie 24-Bit-RGB-Farbbilder (Rot-Blau-Grün) des Achillessehnenansatzes. Verwenden Sie für dieses Protokoll beispielsweise einen Adapter, um eine digitale Farbkamera an das Okular eines einfachen Hellfeldmikroskops mit einem 4-fach-Objektiv anzuschließen.
  4. Um Unterschiede in der Toluidinblau-Färbung innerhalb des kompressiven Sehnenfaserknorpels (CTF)16 am Achillessehnenansatz zu quantifizieren (Abbildung 3A,B), importieren Sie RGB-Bilder in eine Bildanalysesoftware, die in der Lage ist, mehrere ROIs zu definieren und zu verwalten. Zu den Optionen gehören die Auswahl- und ROI-Manager-Tools in FIJI/ImageJ oder die Bildverarbeitungs-Toolbox in MATLAB. Beginnen Sie mit dem Festlegen der Pixel-/Längenskala.
    HINWEIS: Die Wahl der Software liegt im Ermessen des Forschers und ist sicherlich nicht auf MATLAB oder FIJI/ImageJ beschränkt. Die Autoren haben MATLAB-Code (Ergänzungsdatei 2), eine Dokumentation zur Beschreibung der Implementierung (Ergänzungsdatei 3) und ein Beispielbild (Ergänzungsdatei 4) bereitgestellt. Wir ermutigen Forscher, diesen Code in alternative Programmiersprachen zu übersetzen, um ihn bei Bedarf oder bevorzugt in anderer Software zu verwenden.
  5. Identifizieren Sie anhand des Bildes, das in der Software Ihrer Wahl angezeigt wird, den Schnittpunkt der tiefen Sehnengrenze mit dem Fersenbein. Von hier aus wird proximal 800 μm entlang der tiefen Sehnengrenze nachgezogen, um die tiefe Grenze der CTF zu ermitteln. Verwenden Sie beispielsweise die Funktion drawpolyline() in MATLAB, um interaktiv eine Polylinie über das RGB-Bild zu zeichnen. MATLAB erstellt ein Polylinienobjekt, das die Scheitelpunkte der Linie enthält, die verarbeitet und auf eine Länge von 800 μm getrimmt werden können.
  6. Erstellen Sie von dieser Position aus die proximale Begrenzung der CTF, indem Sie ein Liniensegment zeichnen, das mit der oberflächlichen Sehnengrenze verbunden ist, die senkrecht zur lokalen Faserausrichtung verläuft.
  7. Gehen Sie zurück zum Schnittpunkt der tiefen Sehnengrenze und des Fersenbeins und definieren Sie die distale Grenze der CTF, indem Sie ein Liniensegment zeichnen, das mit der oberflächlichen Sehnengrenze entlang der deutlichen Gezeitenmarke, die die CTF von der Ansatzzone Faserknorpel (AZF) trennt, verbunden ist (Abbildung 3A,B). Generieren Sie schließlich die oberflächliche Begrenzung des CTF, indem Sie die oberflächliche Sehnengrenze nachzeichnen, um sie einzuschließen.
  8. Um räumliche Variationen in der GAG-Färbung über die Insertion hinweg zu beschreiben, unterteilen Sie die gesamte CTF in 4 Quadranten (Abbildung 3A,B). Verbinden Sie den Mittelpunkt der tiefen und oberflächlichen CTF-Grenzen mit einem Liniensegment, um eine distale/proximale Begrenzung zu erstellen. Verbinden Sie durch den Mittelpunkt dieser Begrenzung die Mittelpunkte der distalen und proximalen CTF-Grenzen entlang der Faserorientierung, um eine oberflächliche/tiefe Grenze zu erstellen.
  9. Diese 6 Grenzen liefern Informationen, die verwendet werden können, um den ROI zu definieren, der den gesamten CTF darstellt, aber auch 4 Quadranten, die den CTF unterteilen. Kompilieren Sie z. B. in MATLAB Scheitelpunkte, die die Grenzen jedes einzelnen ROI (CTF, Quadranten 1-4) definieren, in Vektoren und verwenden Sie images.roi.Polygon(), um eingeschlossene Polygonobjekte für jeden ROI zu generieren.
  10. Wenn die ROIs definiert sind, transformieren Sie RGB-Pixeldaten in den Farbraum Hue-Saturation-Value (HSV) mit dem Farbtransformer-Plugin in FIJI, der Funktion rgb2hsv() in MATLAB oder einer anderen Software, die die entsprechenden Transformationsgleichungenanwendet 76. HSV-Daten können dann in den 2D-Farbtonsättigungsraum projiziert werden, wobei jede Kombination aus Farbton und Sättigung eine eindeutige Farbe kodiert (Abbildung 3C).
  11. Berechnen Sie innerhalb jedes ROI den durchschnittlichen Farbton und die Sättigung, die die durchschnittliche Farbe der Beize im ROI beschreiben. Dies kann z. B. in MATLAB erreicht werden, indem die Polygon-Objekte, die jede ROI definieren, verwendet werden, um das Bild mit createMask() zu maskieren, um Farbtonsättigungspixeldaten speziell innerhalb jeder ROI zu analysieren.
  12. Definieren Sie einen weiteren kleinen ROI innerhalb des periostalen Faserknorpels (PF)16 (Abbildung 3A, B) und berechnen Sie den durchschnittlichen Farbton und die Sättigung. Berechnen Sie dann den euklidischen Abstand, der die durchschnittliche Farbe in jedem ROI des CTF mit der des PF trennt (Abbildung 3C).
    Equation 1
    ANMERKUNG: Die euklidische Abstandsberechnung beschreibt den Grad der Ähnlichkeit zwischen der durchschnittlichen Farbe des ROI und der des PF, einem typischen faserknorpeligen Gewebe 16,17,77. Ein kleinerer euklidischer Abstand weist auf eine ROI-Farbe hin, die faserknorpeliger aussieht.
  13. Verwenden Sie diesen Abstand, um den Faserknorpel-Score zu berechnen, der von einem Maximalwert von 1 ausgeht, wenn die ROI-Farbe mit der PF-Farbe identisch ist, und einem Minimalwert von -1, wenn ROI und PF-Farbe die maximale Trennung innerhalb des Farbraums mit Farbtonsättigung erreichen.
    Equation 2
  14. Durchschnittliche Daten für Farbton, Sättigung und Faserknorpel-Score innerhalb jedes ROI über Gewebeschnitte von jeder Gliedmaße. Führen Sie paarweise statistische Vergleiche zwischen Gruppen kontralateraler Gliedmaßen durch.

9. SHG-Bildgebung zur Untersuchung der Veränderung der Kollagennetzwerkorganisation

  1. Führen Sie eine SHG-Bildgebung der mit Toluidinblau gefärbten Abschnitte mit einem leistungsfähigen Mikroskopsystem mit einer 20-fachen Objektlinse durch. Erfassen Sie Z-Stapel über die Querschnittsdicke und führen Sie bei Bedarf Kachelscans durch, um den Achillessehnenansatz vollständig zu erfassen.
  2. Importieren Sie SHG-Bilder in eine bevorzugte Bildanalysesoftware und definieren Sie ROIs, die die CTF am Achillessehnenansatz umfassen und unterteilen, wie für die Toluidinblau-Bildanalyse in Abschnitt 8 beschrieben (Abbildung 4A,B).
  3. Wenn SHG-Bilder in MATLAB importiert werden, verwenden Sie den in Abschnitt 8 beschriebenen Ansatz zum Definieren von CTF-ROIs in MATLAB. Nachdem Sie ROIs definiert haben, übertragen Sie ROI-Koordinaten in Fidschi, indem Sie ROI-Scheitelpunkte aus MATLAB als .txt-Dateien exportieren und mithilfe von File > Import > XY-Koordinaten in FIJI importieren. Überlagern Sie die Auswahl und senden Sie sie zur Analyse an den ROI-Manager.
  4. Um die Kollagenorganisation zu quantifizieren, verwenden Sie das Direktionalitäts-Plugin in FIJI, das eine Fourier-Spektrum-Analyse durchführt, um Verteilungen der Faserorientierungen über kleine Fenster zu berechnen, die einen ROI umfassen. Die Ausbreitung dieser Verteilung, die als Dispersion bezeichnet wird, steht in umgekehrtem Verhältnis zur Faserausrichtung.
    HINWEIS: Kollagenfasern können in verschiedenen Fenstern im CTF aufgrund der groben Krümmung der Sehne und nicht aufgrund des Fehlens einer Ausrichtung/Organisation unterschiedliche Orientierungen annehmen. Um Veränderungen in der Kollagenorganisation besser von der groben Krümmung der Sehne am Ansatz unterscheiden zu können, ist es notwendig, kleinere ROIs zu definieren.
  5. Importieren Sie SHG-Bilder in FIJI und legen Sie die Pixel-/Längenskala fest. Projizieren Sie Daten mit maximaler Pixelintensität in ein 2D-Composite-Bild und fügen Sie dem ROI-Manager ROIs hinzu. Überlagern Sie nacheinander jeden CTF-ROI mit dem Bild und zeichnen Sie 10 kleine Sub-ROIs von konsistenter Größe innerhalb des ROI, indem Sie die Sub-ROIs zum ROI-Manager hinzufügen.
  6. Führen Sie innerhalb jedes Sub-ROI das Direktionalitäts-Plugin in FIJI aus, um die Faserdispersion zu berechnen. Durchschnittliche Dispersionsdaten über Sub-ROIs innerhalb jedes CTF-ROI und durchschnittliche Dispersionsdaten innerhalb jedes CTF-ROI über Abschnitte aus jedem Explantat. Führen Sie paarweise statistische Vergleiche zwischen Gruppen kontralateraler Gliedmaßen durch.

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Representative Results

Repräsentative Bilder von TUNEL-gefärbten Gewebeschnitten zeigen minimale apoptotische Kerne im Körper der Achillessehne nach 7 Tagen Explantatskultur in verschiedenen Experimentalgruppen (Abbildung 2A). Die Quantifizierung dieser Bilder liefert Hinweise darauf, dass das Gewebekulturprotokoll nach 7 Tagen Explantatskultur unter allen Belastungsbedingungen eine durchschnittliche Lebensfähigkeit von bis zu 78 % in der Achillessehne aufrechterhält (Abbildung 2B).

Qualitativ wird eine verbesserte Toluidinblau-Färbung nach 7 Tagen statischem Aufprall im Vergleich zu unbelasteten Kontrollen festgestellt (Abbildung 3A,B), insbesondere in tiefen Quadranten neben dem Fersenbein, wo wir zuvor die maximale transversale Druckdehnung gemessen haben 5,6. Die Quantifizierung dieser mit Toluidinblau gefärbten Gewebeschnitte zeigt eine signifikante Veränderung des Farbtons (Abbildung 3D), der Sättigung (Abbildung 3E) und des Faserknorpel-Scores (Abbildung 3F) nach 7 Tagen statischem Impingement im Vergleich zu kontralateralen unbelasteten Explantaten. Diese veränderte GAG-Färbung stellt in diesem Modell wahrscheinlich eine Faserknorpelbildung als Folge eines statischen Impingements dar. Statistisch signifikante Unterschiede in der Sättigung und im Faserknorpel-Score wurden erst in Quadrant 1 nach 7 Tagen Ausgangsspannung festgestellt (Abbildung 3E,F). Darüber hinaus nahmen die Sättigung und der Faserknorpel-Score im Vergleich zu kontralateralen unbelasteten Sehnen ab, ein entgegengesetzter Trend im Vergleich zum statischen Impingement. Diese Daten könnten die Hypothese stützen, dass Zugbelastung die durch Impingement verursachte Faserknorpelbildung abschwächen oder umkehren kann, und rechtfertigen weitere Untersuchungen in der Zukunft.

Die Quantifizierung der SHG-Bildgebung deutet auf eine subtile, aber signifikante Veränderung der Kollagenfaserorientierung nach 7 Tagen statischem Impingement hin, wiederum in der tiefen und distalen Region neben dem Fersenbein, was durch signifikante Unterschiede in der Dispersion angezeigt wird (Abbildung 4C).

Figure 1
Abbildung 1: Explantat-Plattform und Versuchsplanung. (A) Fotografische und schematische Darstellung der Explantat-Plattform. (Nach oben) Foto eines ganzen Explantats der Hintergliedmaßen von Mäusen, das in die Plattform geladen wurde, mit kritischen Komponenten, die beschriftet sind. (Unten) Schematische Darstellung des insertionellen Achillessehnenimpingements, hervorgerufen durch passiv angelegte Knöcheldorsalflexion in diesem Explantatmodell. (B) Schematische Darstellung des Studiendesigns und der Explantatkultur. Explantate der Hintergliedmaßen werden in 100 nM Dexamethason für 48 hvorbehandelt. Von jeder Maus wird dann ein Explantat der Hintergliedmaßen in einer Schale kultiviert, die 7 Tage lang entladen wurde, während die kontralaterale Gliedmaße in die Versuchsplattform geladen wird, um die Achillessehne 7 Tage lang entweder unter Grundlinienspannung oder statischem Impingement zu platzieren. Serielle Gewebeschnitte von kontralateralen Gliedmaßenpaaren werden entweder mit Toluidinblau gefärbt, um GAG-reiches Gewebe sichtbar zu machen, oder für die TUNEL-Färbung verwendet. Toluidinblau gefärbte Schnitte werden dann für die SHG-Bildgebung verwendet, um die Kollagenorganisation zu beurteilen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Explantat-Viabilität. (A) Repräsentative Bilder von TUNEL-gefärbten Schnitten von vorbehandelten (Tag 0) Explantaten (oben links), unbelasteten Sehnen (oben rechts), Sehnen, die auf Grundlinienspannung gehalten wurden (unten links) und statisch auftreffenden Sehnen (unten rechts). Die Achillessehne ist mit einer gestrichelten weißen Linie umrandet und mit AT beschriftet, während das Fersenbein mit einer durchgezogenen gelben Linie umrandet und mit C beschriftet ist. (B) Die Quantifizierung des Anteils toter Zellen betrug im Durchschnitt weniger als 22 % für die unbelasteten, Ausgangsspannungs- und statischen Impingement-Gruppen. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar. In diesen Datensätzen sind Ausreißer mit mehr als 50% Zelltod vorhanden, was auf Sehnenschäden zurückzuführen ist, die durch eine schlechte Dissektionstechnik verursacht wurden. Der durchschnittliche Anteil toter Zellen mit entfernten statistischen Ausreißern beträgt weniger als 15 % für alle Gruppen. Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied im Zelltod zwischen unbelasteten, Ausgangsspannungs- und statischen Impingement-Gruppen gefunden (p < 0,05). Tag 0 Kontrolle: n=8. Unbeladen: n=18. Grundlinien-Spannung: n=8. Statisches Impingement: n=12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Toluidinblau-Histologie. (A) Repräsentative Toluidinblau-Färbung nach 7 Tagen unbelasteter Kultur, die den Kompressionssehnen-Faserknorpel (CTF), den Ansatzzonen-Faserknorpel (AZF) und den Periost-Faserknorpel (PF) am Achillessehnenansatzdarstellt 16. Calcaneus mit der Bezeichnung C. ROI, der den CTF erfasst, ist rot umrandet und weiter in 4 Quadranten unterteilt, um zusätzliche räumliche Informationen zu liefern. (B) Repräsentative Toluidin-Blaufärbung nach 7 Tagen statischer Aufprall, mit verstärkter Färbung der CTF, insbesondere in Quadrant 1, wo wir zuvor die maximalen transversalen Druckdehnungengemessen haben 5,6. (C) Schematische Darstellung des Farbraums mit Farbtonsättigung, der für die Farbbildanalyse verwendet wird. Die Farbe wird durch eine Kombination aus Farbton (0°-360°) und Sättigung (0-255) beschrieben76. Die durchschnittliche Farbe in jedem ROI wird auf die durchschnittliche Farbe des PF normalisiert, indem der euklidische Abstand zwischen den Farben in jedem ROI und der Farbe im PF berechnet wird, was einen normalisierten Faserknorpelwert liefert. (D-F) Veränderungen der Toluidinblaufärbung nach 7 Tagen statischem Impingement (oben) und Ausgangsspannung (unten) im Vergleich zu kontralateralen unbelasteten Sehnen. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar. (D) Die Quantifizierung des Farbtons zeigt signifikante Unterschiede im durchschnittlichen Farbton in allen Regionen nach 7 Tagen statischem Aufprall im Vergleich zu kontralateralen unbelasteten Sehnen. Nach 7 Tagen Ausgangsspannung konnte kein ähnlicher Trend im Vergleich zu kontralateralen unbelasteten Sehnen festgestellt werden. (E) Quantifizierung der Sättigung mit signifikanten Veränderungen der durchschnittlichen Sättigung über die gesamte CTF und innerhalb der Quadranten 1-3 nach 7 Tagen statischer Aufprall im Vergleich zu kontralateralen unbelasteten Sehnen. Umgekehrt wurden signifikante Unterschiede erst in Quadrant 1 nach 7 Tagen Ausgangsspannung festgestellt, wo die Sättigung im Vergleich zu kontralateralen unbelasteten Sehnen abnahm. (F) Quantifizierung des Faserknorpel-Scores mit signifikanten Veränderungen des Faserknorpel-Scores in allen Regionen nach 7 Tagen statischem Impingement im Vergleich zu kontralateralen unbelasteten Sehnen. Umgekehrt wurden signifikante Unterschiede erst in Quadrant 1 nach 7 Tagen Ausgangsspannung festgestellt, wo der Faserknorpel-Score im Vergleich zu kontralateralen unbelasteten Sehnen abnahm. Die Daten deuten auf eine verstärkte GAG-Färbung hin, die durch statisches Impingement hervorgerufen wird, was auf eine erhöhte Faserknorpelbildung hinweist. Daten, die die Gesamt-CTF beschreiben, wurden mit Hilfe von Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rank-Tests verglichen. Die Quadrantendaten wurden mit Hilfe der Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen mit dem Mehrfachvergleichstest nach Šídák verglichen. *p < 0,05. **p < 0,01. p < 0,005. p < 0,001. Grundspannung vs. unbelastet: n = 6 Paare. Statisches Impingement vs. Unbelastet: n = 8 Paare. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: SHG-Bildgebung. (A) Repräsentatives SHG-Bild nach 7 Tagen unbelasteter Kultur im Vergleich zu (B) 7 Tagen statischem Impingement. CTF ist rot umrandet und wie beschriftet in 4 Quadranten unterteilt, was mit den ROIs in der obigen Toluidinblau-Analyse übereinstimmt. (C) Innerhalb jedes Quadranten wurde die Fourier-Spektrum-Analyse in einem beweglichen Unterfenster mit dem Direktionalitäts-Plugin in FIJI durchgeführt. Die Ausbreitung der Verteilung der Faserorientierungen innerhalb jedes Teilfensters wird als Dispersion (°) bezeichnet und steht in umgekehrtem Verhältnis zur Faserausrichtung. Dispersion = 0° steht für eine perfekte parallele Ausrichtung der Fasern. Eine zunehmende Dispersion stellt eine abnehmende Ausrichtung der Kollagenfasern dar. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar. Statistisch signifikante Unterschiede in der Dispersion wurden in Quadrant 1 nach 7 Tagen statischem Impingement im Vergleich zu kontralateralen unbelasteten Sehnen festgestellt, was auf eine erhöhte Kollagendesorganisation hindeutet. Die Quadrantendaten wurden mit Hilfe der Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen mit dem Mehrfachvergleichstest nach Šídák verglichen. * p < 0,05. Statisches Impingement vs. unbelastet: n = 5 Paare. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzungsdatei 1: CAD-Dateien. Diese CAD-Dateien, die in mehreren Dateiformaten kompiliert wurden, können für den 3D-Druck der Plattformbasis, des Volumenreduzierungseinsatzes und des Clips verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 2: MATLAB-Dateien. Die kompilierten MATLAB-Dateien ermöglichen die Quantifizierung der Toluidinblau-Histologie, wie in Abschnitt 8 des Protokolls beschrieben, um die Faserknorpelbildung durch räumliche Änderung der GAG-Färbung am Achillessehnenansatz zu bewerten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: Richtlinien für die Implementierung von MATLAB-Code. Dieses Dokument beschreibt eine Pipeline zur Quantifizierung von Veränderungen in der GAG-Färbung am Achillessehnenansatz durch Bildanalyse der Toluidinblau-Histologie unter Verwendung des bereitgestellten MATLAB-Codes. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 4: Beispielbild der Toluidinblau-Histologie. Dieses RGB-Farbbild der Toluidinblau-Histologie kann verwendet werden, um den bereitgestellten MATLAB-Code auszuführen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die experimentelle Explantatplattform der Hintergliedmaßen der Maus gepaart mit dem in dieser Studie beschriebenen Gewebekulturprotokoll stellt ein geeignetes Modell dar, um die Mechanobiologie der impingement-getriebenen Faserknorpelbildung am Achillessehnenansatz zu untersuchen. Die Nützlichkeit dieses Explantatmodells wird durch die repräsentativen Ergebnisse demonstriert, die auf eine Aufrechterhaltung der Zellviabilität bei gleichzeitiger signifikanter und räumlich heterogener Veränderung der Toluidinblau-Färbung nach 7 Tagen statischem Impingement hindeuten. Diese Ergebnisse deuten auf einen veränderten Metabolismus von GAG-reichen Matrixmolekülen als Folge des mechanischen Impingements hin, was mit anderen Modellen und klinischen Studien übereinstimmt 3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,44,49. Darüber hinaus wurden subtile, aber signifikante Veränderungen in der Kollagenorganisation mittels SHG-Bildgebung nach 7 Tagen statischem Impingement festgestellt, die mit den klinischen Merkmalen der impingementassoziierten Tendinopathie und den in vivo Modellen des Sehnenimpingements übereinstimmen 28,37,38,43,44,49,64.

Frühere Bemühungen, die biologischen Folgen des Sehnenimpingements zu erforschen, haben eine einfache Kompression auf isolierte Sehnenzellen angewendet27,29. Sobald ein mechanobiologischer Mechanismus von Interesse identifiziert wurde, bieten diese Modelle im Vergleich zu unserem Explantat-Modell überlegene therapeutische Screening-Plattformen. Die Ergebnisse dieser Studien müssen jedoch mit Vorsicht interpretiert werden, da isolierten Zellen, die in vitro kultiviert wurden, eine dreidimensionale extrazelluläre Umgebung fehlt, die die Mechanoreaktion beeinflusst57,59. Darüber hinaus zeigen Zellen, die aus anderen kollagenen Geweben (z. B. Knorpel) isoliert wurden, eine veränderte mechanosensitive Ionenkanalaktivität, wenn sie in vitro in Abwesenheit einer extrazellulären Umgebung mechanisch angegriffen werden78,79. Das vorgestellte Modell adressiert diese Einschränkungen, indem es eine Plattform bietet, um in situ Sehnenzellen innerhalb lebensfähiger Explantate physiologisch relevanten Belastungsbedingungen auszusetzen.

Explantatmodelle sind beliebte experimentelle Systeme zur Untersuchung der Biologie und Physiologie von Sehnen57,58. Im spezifischen Kontext des Sehnenimpingements wurden in mehreren früheren Studien Teil- und Ganzsehnenexplanate eingesetzt, um die Sehnenzellantwort auf künstliche uniaxiale Kompression zu untersuchen 30,31,32,33,34,39. Während diese Studien einen direkten Zusammenhang zwischen uniaxialer Kompression und Faserknorpelbildung zeigten, ist die in vivo mechanische Belastungsumgebung, die durch das Sehnenimpingement erzeugt wird, multiaxial und hängt von den anatomischen Merkmalen der impingierten Region ab 5,6. Zum Beispiel wird die Belastungsumgebung, die durch das Auftreffen des Fersenbeins auf die Achillessehne während der Knöcheldorsalflexion entsteht, durch den Einstiegswinkel, den Ansatzbereich und das Vorhandensein von umgebendem Weichgewebe beeinflusst 60,61,62,63,80,81. Unsere Explantat-Plattform bewahrt diese externen Strukturen und reproduziert die multiaxiale Dehnungsumgebung, die durch das Impingement erzeugt wird, während die Zellen in ihrer nativen Umgebung erhaltenbleiben 6.

Tiermodelle waren von grundlegender Bedeutung, um einen unmittelbaren Zusammenhang zwischen mechanischem Impingement und den wesentlichen Merkmalen des Sehnenfaserknorpels und der Pathologie zu belegen, die analoge Phänotypen aufweisen 1,25,28,37,64,65,66. In den letzten Jahrzehnten wurden in der meisten In-vivo-Impingement-Forschung Nagetiermodelle verwendet, um die Rotatorenmanschettenerkrankung durch chirurgische Verkleinerung des subacromialen Raumes zu untersuchen, um die Sehnen der Rotatorenmanschette künstlich zu berühren. Diese Tiermodelle wurden verwendet, um die zelluläre und molekulare Pathogenese der Impingement-Tendinopathie in vivo zu beschreiben, und können erweitert werden, um neue therapeutische Strategien zur Förderung der klinischen Translation der Impingement-Forschung zu evaluieren 36,37,38,66,82,83,84,85.

Etablierte In-vivo-Modelle des Sehnenimpingements weisen jedoch einige wichtige Einschränkungen bei der Untersuchung der Mechanobiologie auf57,58. Diese Modelle führen chirurgisch eine externe Quelle des Sehnenimpingements ein oder entfernen sie und nehmen die körperliche Aktivität wieder auf (Aktivität im freien Käfig, erzwungenes Laufen auf dem Laufband usw.). Bei diesem Ansatz fehlt die Kontrolle über die Größe, Ausrichtung und Häufigkeit der Kraft, die während der gesamten Dauer des Experiments direkt auf die Sehne ausgeübt wird. Da es schwierig ist, die Gewebedehnung in vivo zu messen, bieten diese Modelle nur eine begrenzte Kontrolle oder Charakterisierung der mechanischen Umgebung, die innerhalb der Sehne als Reaktion auf das Impingement erzeugt wird. Diese Einschränkung ist auf dem Gebiet der Sehnenmechanobiologie-Forschung allgemein anerkannt 57,58,67,68,69,70. An anderer Stelle wurden ausgeklügelte experimentelle Plattformen entwickelt, um eine kontrollierte mechanische Überlastung (Ermüdung) direkt auf Sehnen in vivo unter Narkose anzuwenden 67,68,69. Diese Modelle kontrollieren die Anwendung mechanischer Reize für kurze Zeiträume unter Narkose und bieten keine Kontrolle über die Belastungshistorie während des restlichen Versuchs, da die Tiere nach mechanischer Überlastung noch Tage bis Wochen lang ihre normale Käfigaktivität wieder aufnehmen. Das in diesem Protokoll beschriebene Explantatmodell bietet eine kontrollierte Verschreibung des Achillessehnen-Impingements, um messbare und gut beschriebene Muster der Gewebebelastung6 zu generieren, was eine rigorose Untersuchung der Impingement-Mechanobiologie ermöglicht. Es sollte jedoch beachtet werden, dass dieses Explantatmodell die Notwendigkeit einer In-vivo-Untersuchung des Sehnenimpingements nicht überflüssig macht, sondern vielmehr als ergänzendes Werkzeug zur Anreicherung von Daten dient, die aus diesen unverzichtbaren Tiermodellen abgeleitet wurden. Zelluläre und molekulare Signalwege, die in Bezug auf die Impingement-Mechanik mit diesem Explantat-Modell definiert wurden, können in vivo charakterisiert und als therapeutische Ziele unter Verwendung von Tiermodellen in einem komplementären Ansatz evaluiert werden, um die klinische Translation der mechanobiologischen Forschung zu verbessern. Die Leistungsfähigkeit dieser integrierten Strategie wird in anderen Bereichen der Sehnenmechanobiologie-Forschung genutzt 58,86,87,88, und dieses Explantatmodell verleiht seine Anwendung auf das Sehnenimpingement.

Das Explantat-Modell ist nicht ohne Einschränkungen. Wie bei allen Explantatmodellen kann die Mechanobiologie nur über relativ kurze Zeitskalen untersucht werden, während das Gewebe lebensfähig bleibt57,89. Während das Modell ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der unmittelbaren zellulären Reaktion auf mechanisches Impingement ist, ist es nicht für die Untersuchung chronischer Sehnenerkrankungen im Zusammenhang mit Impingement geeignet. Darüber hinaus ist das Modell nicht in der Lage, systemische Reaktionen und Gewebeüberschneidungen zu berücksichtigen, da die Blutversorgung und die neuronale Kommunikation nicht aufrechterhalten werden. Nichtsdestotrotz bietet das Modell eine Plattform, um die intrinsische Reaktion endogener Sehnenzellen auf mechanisches Impingement zu beschreiben. Eine weitere Einschränkung des Modells besteht darin, dass wir nach früheren Untersuchungen 32,90,91,92 erwarten, dass viele große GAG-reiche Proteoglykane während der Vorbehandlung und zu frühen Zeitpunkten der Explantatkultur aus der Sehne diffundieren, insbesondere Fragmente aggregierender Proteoglykane, die nicht in der Grundmatrix verankert sind. Daher ist es wahrscheinlich, dass Veränderungen der GAG-Färbung als Folge des Impingements im Modell Veränderungen in neu synthetisierten GAG-reichen Makromolekülen widerspiegeln, die noch nicht katabolisiert wurden und in der extrazellulären Matrix verankert bleiben. Angesichts der Tatsache, dass diese GAG-reichen Proteoglykane im perizellulären Raumlokalisieren 22,30,93,94,95, könnte das Explantatmodell die Untersuchung des PCM-Umbaus als Folge eines Sehnenimpingements erleichtern.

Die in diesem Protokoll beschriebene Präparation von Explantaten der Hintergliedmaßen von Mäusen erfordert Übung, aber eine kompetente Technik kann schnell erreicht werden. Eine vollständige Enthandschuhung (d. h. Hautentfernung) kann sich als schwierig erweisen, insbesondere im Bereich der Finger der Hinterpfote. Während die Haut um die Zehen nicht vollständig entfernt werden muss, verstärkt sie die Sterilität während der gesamten Kultur, da Bakterien auf der Haut und dem Fell vorhanden sind.

Der schwierigste Aspekt der Dissektion ist die Entfernung der Plantarissehne medial der Achillessehne proximal und die Entfernung der Achillessehne durch die Achillessehne nach distal. Die Plantaris-Muskel-Sehnen-Einheit überspannt die Knie- und Sprunggelenke in enger Verbindung mit dem Trizeps surae und der Achillessehne 81,96,97,98,99. Mechanische Belastungen, die während der passiven Knöcheldorsalflexion über die hintere Seite des Knöchels übertragen werden, sind zwischen der Plantaris und der Achillessehne verteilt, und es ist bekannt, dass die Plantarissehne in vivo eine hohe Belastung aushält 100,101. Darüber hinaus ist die anatomische Variabilität im menschlichen Plantaris gut beschrieben 96,102,103 und während diese Variabilität bei Nagetieren weniger verbreitet ist97, hat sie die Tendenz, das mechanische Milieu innerhalb der Achillessehne in situ zu beeinflussen. In Übereinstimmung mit früheren Techniken, die zur Messung der Dehnung innerhalb der Achillessehne in situ 6.104 verwendet wurden, sollte die Plantarissehne entfernt werden, um die interne Dehnungsumgebung zu kontrollieren, die durch extern angelegtes Sehnenimpingement erzeugt wird.

Eine sorgfältige Entfernung des Plantaris ist notwendig, um einen dissektionsinduzierten Zelltod in der Achillessehne zu vermeiden, und die in den Daten vorhandene Variabilität der Zellapoptose (Abbildung 2B) kann eine dissektionsinduzierte Schädigung aufgrund einer schlechten Dissektionstechnik widerspiegeln. Die Entfernung der Plantarissehne profitiert von einer feinen Pinzette, um die Plantaris vorsichtig von der Achillessehne zu trennen und den Plantaris-Muskel-Sehnen-Komplex proximal zu befreien. Eine gezackte Pinzette hilft, das proximale freie Ende der Plantarissehne zu greifen, um distal um den Fersenbein herum und in Richtung der Finger der Pfote zu ziehen, um sie vollständig zu entfernen. Lee und Elliott liefern eine hilfreiche anatomische Beschreibung der Ratten-Plantaris und der Achillessehne und der damit verbundenen Muskulatur97.

Während wir festgestellt haben, dass die in dieser Studie beschriebene Dissektionstechnik ausreicht, um die Sterilität zu gewährleisten, kann das Protokoll bei Bedarf angepasst oder modifiziert werden, wenn sich die Aufrechterhaltung der Sterilität als schwierig erweist. Chirurgische Instrumente können autoklaviert, Betadinlösung topisch auf die Haut aufgetragen und die Dissektion in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Wir haben festgestellt, dass eine schnelle und effiziente Benchtop-Dissektion von entscheidender Bedeutung ist und es ermöglicht, präparierte Gliedmaßen schnell in sterile Medien in einer biologischen Sicherheitswerkbank zu überführen, nachdem die sterile Grenze, die durch die Haut geschaffen wurde, durchbrochen wurde.

Ein weiteres Hauptziel für die Fehlerbehebung bei Kontaminationen ist die Technik, die zur Sterilisation von Plattformkomponenten verwendet wird. In unseren Händen hatten wir beständigen Erfolg mit einfachen Einweichen in ≥ 10%igen Bleichlösung mit ausreichendem Spülen in Leitungswasser ohne Autoklavieren. Bei Bedarf kann eine zusätzliche Sterilisation mit 70 % Ethanol durchgeführt werden, aber beachten Sie, dass jede Komponente, die mit PLA 3D-gedruckt wird, nicht mit EtOH kompatibel ist und sich verzieht. Darüber hinaus können alle Teile der Plattform mit Ausnahme des Acrylbades und der 3D-gedruckten PLA-Komponenten autoklaviert werden, und Komponenten, die in ≥ 10%igen Bleichlösung getränkt sind, können mit autoklaviertem oder gereinigtem Wasser gespült werden. Um Rost zu vermeiden, wird empfohlen, alle Metallkomponenten unmittelbar nach jedem Experiment zu waschen und von Hand zu trocknen.

Die in diesem Protokoll beschriebene Methodik zur Quantifizierung der Toluidinblau-Färbung zur Charakterisierung der Faserknorpelbildung verwendet eine innovative, kundenspezifische Farbbildanalyse, die eine breite Anwendung in der Sehnenforschung bietet. Wesentliche Vorteile ergeben sich durch die Konvertierung von Pixeldaten aus dem RGB- in den HSV-Farbraum76. Hier kodiert der Farbton eine dominante Wellenlänge als charakteristische Farbe von 0°-360°, während die Sättigung die Reinheit jedes Farbtons von 0-255 definiert. Der Wert hingegen beschreibt die Helligkeit der Farbe, und als solcher trennt das HSV-Farbschema Helligkeit (Wert) von Farbe (Farbton, Sättigung). Im Rahmen histologischer Analysen sind HSV-Pixeldaten robuster gegenüber Änderungen der Lichtdurchlässigkeit während der Mikroskopie und Variationen in der Gewebeschnittdicke76. Darüber hinaus ermöglicht die Arbeit im HSV-Farbraum die Abgrenzung spezifischer Wellenlängen von Interesse (über Farbton) in Abhängigkeit von der histologischen Färbung76, z. B. Farbtöne um 240° für die Toluidinblau-Färbung.

Ein innovativer Aspekt der in dieser Studie vorgestellten Toluidinblau-Bildanalyse ist der Faserknorpel-Score, eine Metrik, die sich auf den euklidischen Abstand zwischen der Farbe jedes ROI und der Farbe des periostalen Faserknorpels bezieht. Der periostale Faserknorpel entsteht unmittelbar nach der Geburt als sekundärer Knorpel, während der Kompressionssehnen-Faserknorpel postnatal fehlt und wie andere Sesamfaserknorpel in Regionen erhöhter Sehnenkompression durch mechanischen Bedarf reguliert zu werdenscheint 16,17,28,77 . Durch den Vergleich der Faserknorpelwerte zwischen den Versuchsgruppen können wir nicht nur feststellen, ob sich die Farbe der Toluidinblaufärbung infolge des Impingements ändert, sondern auch, ob diese Änderung zu einem Erscheinungsbild führt, das näher am Faserknorpel liegt. Diese Analyse kann auf andere beliebte GAG-Färbungen wie Alcianblau und Safranin O sowie auf andere Regionen von Sehnenfaserknorpel und faserknorpeligen Sehnenthesen ausgeweitet werden, sofern ein Kontrollgewebe vorhanden ist, das dem periostalen Faserknorpel ähnelt. So konnten beispielsweise Veränderungen der GAG-Färbung in den Sehnen und Bändern des Knies über den Faserknorpel-Score auf die Färbung in den Faserknorpelmenisken normalisiert werden.

Ein entscheidender Aspekt dieses Protokolls ist die serielle Gewebeschnittung und die Verfolgung der Schnittebene durch die Achillessehne, was eine wiederholbare Paraffineinbettung und eine sorgfältige Identifizierung des Eintritts in die Achillessehnenansatz erfordert, um die Schnitttiefe zu verfolgen. Dieses Schnitt- und Färbeprotokoll erfordert zweifellos Übung und Verfeinerung, kann aber auf die Kryosektion ausgeweitet werden.

Der in diesem Manuskript beschriebene histologische Ansatz lässt sich leicht auf die Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz ausweiten. In diesem Zusammenhang ist ein wichtiger Aspekt des obigen Versuchsdesigns der paarweise Vergleich der kontralateralen Gliedmaßen jeder Maus. Hier werden alle statistischen Vergleiche zwischen Gewebeschnitten auf vergleichbarer Schnittebene durch die Achillessehne von kontralateralen Gliedmaßen derselben Maus gezogen, die verschiedenen Versuchsgruppen zugeordnet sind. Diese Strategie hilft, die biologische Variabilität zu kontrollieren. Darüber hinaus werden auf die Ebene abgestimmte Paare kontralateraler Gewebeschnitte gleichzeitig auf demselben Objektträgergestell (Histologie) oder gleichzeitig auf Objektträgern gefärbt, wobei identische Arbeitslösungen für alle Reagenzien, Puffer und Antikörperlösungen (Immunfärbung) verwendet werden, um die Variabilität von Färbung zu Färbung zu kontrollieren, die der Histologie und Immunmarkierung innewohnt, sowie die anatomische Heterogenität in Abhängigkeit von der Schnittebene, -lage und -ausrichtung.

Mehrere andere Modifikationen des Protokolls, die in diesem Manuskript beschrieben sind, können für die weitere Untersuchung zusätzlicher Forschungsfragen implementiert werden. Während sich die hier bereitgestellten repräsentativen Daten beispielsweise auf 7 Tage statisches Impingement konzentrieren, kann dieser Ansatz angepasst werden, um die biologischen Folgen eines intermittierenden oder zyklischen Impingements zu untersuchen, indem die um die Hinterpfote gewickelte Schnur durch den Clip an einen mechanischen Aktuator wie eine Spritzenpumpe gekoppelt wird. Darüber hinaus bietet die Plattform die Möglichkeit, molekulare Mechanismen von Interesse zu untersuchen, indem die Nährmedien mit niedermolekularen Agonisten/Antagonisten ergänzt oder Hintergliedmaßen-Explantaten aus transgenen Mausstämmen verwendet werden.

Zusammenfassend haben wir ein neuartiges Maus-Explantatmodell der Hintergliedmaßen vorgestellt, um die Mechanobiologie zu untersuchen, die dem Achillessehnenimpingement zugrunde liegt. Dies wird durch ein Gewebekulturprotokoll ermöglicht, das die Lebensfähigkeit der Zellen unter allen Beladungsbedingungen über 7 Tage aufrechterhält. Dieses Modell rekapituliert die impingement-getriebene Faserknorpelbildung und kollagene Veränderung, wie sie in anderen Modellsystemen sowie bei degenerativen Sehnenerkrankungen beschrieben sind. Die experimentelle Plattform ermöglicht die kontrollierte Anwendung und Quantifizierung mechanischer Dehnungsmuster und bietet daher ein hervorragendes Modell für die rigorose Untersuchung der Impingement-Mechanobiologie. Dieses Modell kann angewendet werden, um molekulare Mechanismen von Interesse zu untersuchen, um potenzielle therapeutische Ziele bei der Behandlung von insertionellen Tendinopathien zu identifizieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren sind dankbar für die Unterstützung und Hilfe von Jeff Fox und Vidya Venkatramani vom Center for Musculoskeletal Research's Histology, Biochemistry, and Molecular Imaging (HBMI) Core, der teilweise von P30AR06965 finanziert wird. Darüber hinaus danken die Autoren dem Center for Light Microscopy and Nanoscopy (CALMN) am University of Rochester Medical Center für die Unterstützung bei der Multiphotonenmikroskopie. Diese Studie wurde durch R01 AR070765 und R01 AR070765-04S1 sowie 1R35GM147054 und 1R01AR082349 finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox - Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining

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Bioengineering Ausgabe 202
Maus-Hintergliedmaßen-Explantatmodell zur Untersuchung der Mechanobiologie des Achillessehnen-Impingements
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Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W., Buckley, M. R. Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement. J. Vis. Exp. (202), e65801, doi:10.3791/65801 (2023).

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