Bioengineering

מודל צמח הגפיים האחוריות של מורין לחקר המכנוביולוגיה של פגיעה בגיד אכילס

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65801

Brian C. Wise^1,2, Keshia E. Mora^1,2, Whasil Lee^1,2,3, Mark R. Buckley^1,2

¹Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, ²Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, ³Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

Summary

אנו מציגים פלטפורמה ניסיונית מותאמת אישית ופרוטוקול תרבית רקמה המשחזר שינוי פיברוקרטילגיני המונע על ידי פגיעה בהחדרת גיד אכילס בצמחי גפיים אחוריות מורין עם כדאיות תאים מתמשכת, ומספק מודל מתאים לחקר המכנוביולוגיה של פגיעה בגידים.

Abstract

פגיעה בגידים בעצם יוצרת סביבת מאמץ מכנית רב-צירית עם מתח דחיסה רוחבי מוגבר במידה ניכרת, המעורר פנוטיפ פיברו-סחוס מקומי המאופיין בהצטברות מטריצה עשירה בגליקוזאמינוגליקן (GAG) ועיצוב מחדש של רשת הקולגן. בעוד שסחוס פיברוקרטי הוא תכונה נורמלית באזורים פגועים של גידים בריאים, שקיעת GAG עודפת וחוסר ארגון של רשת הקולגן הם המאפיינים הבולטים של טנדינופתיה. בהתאם לכך, פגיעה מוכרת קלינית כגורם חיצוני חשוב בייזום והתקדמות של גידים. אף על פי כן, המכנוביולוגיה העומדת בבסיס הפגיעה בגידים עדיין לא נחקרה. מאמצים קודמים להבהיר את התגובה התאית לפגיעה בגידים החילו דחיסה חד-צירית על תאים וכריתת צמחי גידים במבחנה. עם זאת, תאים מבודדים חסרים סביבה חוץ-תאית תלת-ממדית החיונית לתגובת מכנו, והן מחקרי מבחנה והן מחקרי explant שנכרתו אינם מצליחים לשחזר את סביבת המאמץ הרב-צירית הנוצרת על ידי פגיעה בגידים in vivo, התלויה במאפיינים אנטומיים של האזור הפגוע. יתר על כן, מודלים in vivo של פגיעה בגידים חסרים שליטה על סביבת המאמץ המכאני. כדי להתגבר על מגבלות אלה, אנו מציגים מודל חדשני של צמח גפיים אחוריות של מורין המתאים לחקר המכנוביולוגיה של פגיעה בגיד אכילס. מודל זה שומר על גיד אכילס באתרו כדי לשמר אנטומיה מקומית ומשחזר את סביבת המאמץ הרב-צירית הנוצרת על ידי פגיעה בהחדרת גיד אכילס על הקלקניוס במהלך דורסיפלקסיה פסיבית של הקרסול תוך שמירה על תאים בסביבתם הטבעית. אנו מתארים פרוטוקול תרבית רקמה אינטגרלי למודל זה ומציגים נתונים המבססים כדאיות מתמשכת של צמחים במשך 7 ימים. התוצאות המייצגות הדגימו צביעת GAG היסטולוגית מוגברת וירידה ביישור סיבי הקולגן משני לפגיעה, מה שמרמז על היווצרות מוגברת של סחוס פיברו-סחוס. מודל זה ניתן להתאמה בקלות לחקר משטרי העמסה מכניים שונים ומאפשר מניפולציה של מסלולים מולקולריים בעלי עניין לזיהוי מנגנונים המתווכים שינוי פנוטיפי בגיד אכילס בתגובה לפגיעה.

Introduction

מספר רב של גידים, כולל גיד אכילס וגידי השרוול המסובב, חווים פגיעה גרמית עקב מיקום אנטומי תקין¹^,²^,³^,⁴. פגיעה בגידים יוצרת מתח דחיסה המופנה באופן רוחבי לציר הסיבים האורכי⁵^,⁶^,⁷. אזורים של פגיעה בגידים מדגימים פנוטיפ פיברוקרסחוס ייחודי שבו תאים עגולים מכווצים (פיברוכונדרוציטים) מוטמעים בתוך רשת קולגן לא מאורגנת עם תכולת גליקוזאמינוגליקן (GAG) מוגברת במידה ניכרת²^,³^,⁴^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴. מחקרים קודמים מצביעים על כך שהסביבה המכנית השונה הנוצרת על ידי פגיעה בגידים מקיימת מטריצה עשירה זו ב- GAG על ידי הנעת שקיעת פרוטאוגליקנים מצטברים גדולים, בעיקר אגרקנים, אם כי המנגנונים הבסיסיים אינם ברורים¹^,³^,¹²^,¹³^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^,³⁸^,³⁹. בעוד שסחוס פיברוקרטי הוא תכונה נורמלית באזורים פגועים של גידים בריאים, מטבוליזם פרוטאוגליקני חריג הקשור להיווצרות יתר של פיברו-סחוס הוא מאפיין מובהק של גידים, מחלה נפוצה ומתישה המופיעה באופן לא פרופורציונלי בגידים פגועים כרוניים¹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹. בהתאם לכך, פגיעה בגידים מוכרת קלינית כגורם חיצוני חשוב המניע כמה מהגידים הנפוצים ביותר, כולל מחלת השרוול המסובב וגיד אכילס החדרתי (IAT)⁵⁰^,⁵¹^,⁵². נכון לעכשיו, הטיפול בגידים אינו יעיל. לדוגמה, כ -47% מהמטופלים עם IAT זקוקים להתערבות כירורגית לאחר ניהול שמרני כושל, עם תוצאות משתנות לאחר הניתוח⁵³^,⁵⁴^,⁵⁵^,⁵⁶. למרות הקשר לכאורה בין פגיעה לגידים, המנגנונים המכנוביולוגיים שבאמצעותם תאים בחוש הגידים הפגוע מגיבים לסביבתם המכנית מתוארים בצורה גרועה, מה שמטשטש את ההבנה של פתוגנזה של טנדינופתיה ומביא לטיפול לקוי.

מודלים של Explant הם כלים שימושיים בחקר מכנוביולוגיה של גידים^57,58. כצעד ראשון לקראת הבנת המכנוביולוגיה של פגיעה בגידים, מספר מחקרים קודמים בחנו את התגובה התאית בעקבות יישום דחיסה חד-צירית פשוטה על תאים או צמחים בגידים שנכרתו 27,29,30,31,32,33,34,39. עם זאת, תאים במבחנה חסרים מטריצות חוץ-תאיות ופרי-תאיות המאפשרות העברת זנים, משחררות גורמי גדילה חשובים וציטוקינים המשתחררים על ידי דפורמציה מכנית, ומספקות מצע למתחמי הידבקות מוקדית הממלאים תפקיד במכנוטרנסדוקציה ^57,59. בנוסף, מחקרי explant במבחנה וכריתה אינם מצליחים לשחזר את סביבת המאמץ המכנית הרב-צירית הנוצרת על ידי פגיעה בגידים in vivo, התלויה בתכונות אנטומיות של האזור הפגוע ^5,6. בהקשר של החדרת גיד אכילס פגוע, זה כולל רקמות מסביב כגון בורסה retrocalcaneal וכרית שומן של Kager 60,61,62,63. לעומת זאת, מודלים in vivo של פגיעה בגידים 25,28,36,37,38,64,65,66 מאפשרים שליטה מינימלית על גודל ותדירות העומס המופעל ישירות על הגיד, שהיא מגבלה מוכרת היטב של מודלים in vivo לחקר מכנוביולוגיה של גידים^57,58^,67,68,69,70. בהתחשב באתגרים במדידת מתח הגידים in vivo, סביבת המאמץ הפנימית הנוצרת במודלים אלה מאופיינת לעתים קרובות בצורה גרועה.

בכתב יד זה, אנו מציגים פלטפורמה ניסיונית מותאמת אישית המשחזרת פגיעה בהחדרת גיד אכילס על הקלקניוס בתוך צמחי גפיים אחוריות שלמות, אשר בשילוב עם פרוטוקול תרבית רקמה זה, שומרת על כדאיות במשך 7 ימים בתרבית explant ומאפשרת לחקור את sequelae הביולוגי של פגיעה בגידים. הפלטפורמה בנויה על בסיס חומצה פולילקטית מודפסת בתלת ממד (PLA) המספקת את הבסיס לחיבור ידיות האחיזה ותוספת הפחתת נפח PLA מודפסת בתלת מימד. ידיות האחיזה משמשות להידוק הרגל העליונה והברך פרוקסימלית לצומת אכילס מיוטנדי כאשר האספקט הקאודלי של הגפה האחורית פונה כלפי מעלה, מה שמאפשר לצלם את גיד אכילס מלמעלה באמצעות בדיקת אולטרסאונד או מיקרוסקופ הפוך (איור 1A). הפחתת עוצמת הקול מוסיפה שקופיות לאורך מסילה בבסיס ומפחיתה את הנפח הנדרש של מדיית תרבית רקמות. קו קלוע הכרוך סביב הכף האחורית מנותב אל מחוץ לפלטפורמה תוך שימוש בעיצוב הבסיס ובקליפ PLA מודפס בתלת מימד. על-ידי משיכת החוט, הכף האחורית היא דורסיפלקסית, והחדרת גיד אכילס נפגעת כנגד הקלקנאוס, וכתוצאה מכך מתח דחיסה רוחבי מוגבר ^5,6 (איור 1A). הפלטפורמה כלולה בתוך אמבט אקרילי השומר על חצילי הגפה האחורית השקועים במצע תרבית רקמות. הצמדת החוט המתוח לחלק החיצוני של האמבטיה באמצעות סרט הדבקה שומרת על דורסיפלקסיה של הקרסול כדי לייצר פגיעה סטטית בהחדרת גיד אכילס. קובצי CAD עבור רכיבים מודפסים בתלת-ממד מסופקים בפורמטים מרובים (קובץ משלים 1), המאפשרים ייבוא למגוון תוכנות CAD מסחריות וחינמיות בקוד פתוח לשינוי בהתאם לצרכים ניסיוניים. אם הגישה למדפסות תלת-ממד אינה זמינה לייצור, ניתן לספק קובצי CAD לשירותי הדפסה תלת-ממדית מקוונים שידפיסו וישלחו את החלקים בעלות נמוכה.

חשוב לציין, קומפלקס השרירים triceps surae-Achilles משתרע הן על מפרקי הברך והן על מפרקי הקרסול 71,72,73. כתוצאה מכך, מתח מתיחה בגיד אכילס מושפע מכיפוף הברך. הארכת הברך מכניסה את גיד אכילס למתח, ואילו כיפוף הברך מפחית מתח. על ידי הארכה ראשונה של הברך ולאחר מכן באופן פסיבי דורסיפלקס של הקרסול, מתחים דחוסים בהחדרה הפוגענית יכולים להיות מופעלים על מתח מתיחה. לעומת זאת, על ידי דורסיפלקס פסיבי של הקרסול עם הברך מכופפת, מתח המתיחה מופחת, ומתח דחיסה נשאר. הפרוטוקול הנוכחי בוחן שלושה תנאים כאלה. 1) עבור פגיעה סטטית, כף הרגל היא dorsiflexed ל < 110° ביחס לטיביה כדי לפגוע בהחדרה, עם הברך מכופפת כדי להפחית את המתח. 2) עבור קבוצת המתח הבסיסית, הקרסול מוארך מעל 145° של dorsiflexion עם הברך מורחבת, מה שיוצר בעיקר מתח מתיחה בהחדרה. 3) עבור הקבוצה הפרוקה מתורבתים בצלחת פטרי כאשר הברך והקרסול בתנוחות ניטרליות בהיעדר עומס חיצוני. הזוויות הנזכרות לעיל נמדדות בצילום ביחס למערכת קואורדינטות שבה כף הרגל והשוקה מקבילות בזווית של 180° ובניצב בזווית של 90°.

השלבים העיקריים של הפרוטוקול כוללים: 1) דיסקציה של עציצים בגפיים האחוריות והסרה זהירה של העור וגיד הפלנטריס; 2) תרבית צמחים לאחר טיפול מקדים dexamethasone 48 שעות; 3) חתך רקמות וצביעה היסטולוגית; ו-4) ניתוח תמונת צבע להערכת היווצרות פיברו-סחוס. לאחר נתיחה, כל חציל גפיים אחוריות מטופל במשך 48 שעות במדיה תרבית בתוספת dexamethasone⁷⁴. גפיים נגדיות מכל עכבר מוקצות לקבוצות ניסוי נפרדות להשוואה זוגית, המסייעת לשלוט בשונות הביולוגית. לאחר טיפול מקדים, צמחים ממוקמים בפלטפורמות כפי שתואר לעיל ומתורבתים במשך 7 ימים נוספים (איור 1B). השוואות נוספות נעשות לקבוצה שטופלה מראש (יום 0) שבה מוציאים צמחים מיד לאחר הטיפול המקדים של 48 שעות.

לאחר תרבית explant, הגפיים האחוריות נחתכות כלפי מטה, פורמלין קבוע, מסויד ומשובץ בפרפין. חתך טורי בכיוון סגיטלי מספק הדמיה של גיד אכילס מהצומת המיוטנדי ועד החדרת הקלקניאל תוך שהוא מאפשר מעקב אחר עומק החתך לאורך הגיד כולו. תיוג dUTP X-nick (TUNEL) בתיווך dUTP X-nick (TUNEL) משמש להמחשת נזק לדנ"א משני לאפופטוזיס ולהערכת כדאיות. היסטולוגיה כחולה של Toluidine וניתוח תמונות צבע מותאמות אישית מבוצעים כדי לכמת שינויים בצביעת GAG. לאחר מכן מקטעי רקמה מוכתמים בצבע כחול טולוידין משמשים להדמיית SHG כדי לאפיין שינויים בארגון סיבי הקולאז' (איור 1B).

התוצאות המייצגות שסופקו מצביעות על שינוי בצביעה היסטולוגית של מטריצה עשירה ב- GAG וחוסר ארגון של רשת הקולגן החוץ תאי שנוצר על ידי 7 ימים של פגיעה סטטית בתוך המודל. מודל זה יכול לשמש לחקר מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס שינוי פיברוקרטילגיני מונע פגיעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל עבודת בעלי החיים אושרה על ידי הוועדה למשאבי בעלי חיים של אוניברסיטת רוצ'סטר.

1. הכנת מדיה של תרבית רקמות

תרבית כל הצמחים במדיום הנשר המעובד של דולבקו (1x DMEM) עם 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין ו-200 מיקרומטר חומצה L-אסקורבית באינקובטור ב-37°C ו-5% CO₂. עבור הטיפול המקדים הראשוני של 48 שעות, תרבית כל צמח ב 70 מ"ל של מדיה תרבותית בתוספת 100 ננומטר dexamethasone⁷⁴. לאחר טיפול מקדים, תרבית גפיים במשך 7 ימים נוספים ללא dexamethasone, החלפת מדיה כל 48-72 שעות.
הערה: הוספת סרום, כגון נסיוב בקר עוברי, לתקשורת התרבית אינה מומלצת בהתאם להמלצות שסופקו על ידי Wunderli, Blache ו- Snedeker⁵⁷. בקצרה, תנאים נטולי סרום מייצגים טוב יותר את המיקרו-סביבה האווסקולרית והדלה בחומרים מזינים בגידים הקיימת in vivo. יתר על כן, תוספת סרום יכולה לקדם השפלה של רקמות בתנאי תרבית מסוימים⁷⁵ ולעורר שגשוג תאים ונדידה אל מחוץ לרקמה, שני מאפיינים של פתולוגיה של גידים⁵⁷.
עבור הקבוצה שנפרקה, תרבית כל צמח ב 70 מ"ל של מדיה. עבור קבוצות המתח הבסיסי והפגיעה הסטטית, כל פלטפורמה דורשת כ-125 מ"ל של מדיה תרבותית כדי לשמור על הגפה שקועה במים. נפח זה יכול להשתנות בהתאם למיקום הרגל העליונה בידיות האחיזה ובפרמטרים של הדפסה תלת-ממדית, בעיקר צפיפות המילוי.

2. דיסקציה של צמחים וטיפול מקדים בדקסמטזון

יש להרדים עכברים באמצעות שאיפת_CO2 ונקע משני של צוואר הרחם, או בהתאם להנחיות המוסדיות. פרוטוקול זה משתמש בעכברי C57BL/6 בני פחות משנה. גודל הגפיים האחוריות יגדל עם הגיל ועשוי להיות מאתגר להתאים לאחיזות.
לפני הנתיחה, יש להעביר 70 מ"ל של תרבית מחוממת מראש (37°C) לצלחת פטרי בגודל 100 מ"מ (קוטר) x 25 מ"מ (גובה) בארון בטיחות ביולוגי סטרילי (BSC). הוסף dexamethasone כדי להשיג ריכוז עבודה 100 ננומטר.
ניתן לבצע דיסקציות על הספסל באמצעות רפידות תחתונות סופגות, לעבוד במהירות דרך הדיסקציה לפני העברת צמחים בגפיים האחוריות לתוך BSC. להרכיב את הכלים הכירורגיים הדרושים לדיסקציה זו הכוללים מלקחיים חלקים, ישרים ועדינים; מלקחיים ישרים, עדינים עם שיניים משוננות; ומספריים ישרים, חדים ועדינים.
לדיסקציה של עציצים בגפה האחורית, הניחו את העכבר במצב שכיבה וזהו את מפרק הירך. בעזרת מספריים עדינים, בצע חתך קטן (5-10 מ"מ) דרך העור המכסה את האספקט הפרוקסימלי והקדמי (גולגולתי) של הרגל העליונה.
פרקו את החתך כדי להתרחב, צבטו את הרגל העליונה החשופה באמצעות אצבעות, ומשכו בזהירות את העור כדי להוריד את הגפה האחורית לגובה הקרסול. מכניסים בעדינות להב מספריים אחד מתחת לעור לאורך האספקט הגבי של כף הרגל ומבצעים חתך הנמשך עד אצבעות הרגליים. המשך למשוך את העור באופן מרוחק כדי להסיר לחלוטין.
מקם את העכבר כדי להמחיש את החדרת גיד אכילס על האספקט האחורי (קאודלי) של הקלקנאוס, ליד הקרסול. פרוקסימלי להחדרת גיד אכילס, גיד הפלנטריס צמוד ישירות לגבול המדיאלי של גיד אכילס ומשתרע באופן מרוחק לכיוון האספקט הפלנטרי של כף הרגל, עובר מעל האספקט האחורי של הקלקניאוס.
כדי להסיר את גיד הפלנטריס יש להכניס בזהירות קצה אחד של המלקחיים החלקים והעדינים בין שני הגידים ולהאריך את הקצה העובר מדיאלית מתחת לגיד הפלנטרי. ציירו את הקצה בסמיכות וקרעו דרך שריר הפלנטריס. בעזרת קצה דק, מלקחיים משוננים, תופסים את הקצה הפרוקסימלי המנותק של גיד הפלנטריס ומושכים בצורה דיסטריאלית להסרה.
במפרק הירך, השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך דרך האגן ולבודד את הגפה האחורית. השתמש במספריים כדי לחטט באגן שנותר ולחשוף את ראש עצם הירך.
מעבירים את החציל של הגפה האחורית ל-BSC ולצלחת המכילה מדיה של תרבית תאים עם דקסמתזון. מעבירים את המנה לאינקובטור ומטפלים במשך 48 שעות.

3. תרבית Explant ופלטפורמות טעינה

כפי שמסתיים הטיפול המקדים של 48 שעות, מחממים מראש נפחים מספיקים של מדיה תרבותית (סעיף 1). מכאן ואילך לא יתווסף דקסמתזון לתקשורת התרבות. בשלב זה, ניתן לתקן, לפרק ולהטמיע גפיים מהקבוצה שטופלה מראש (יום 0) בפרפין לצורך חתך, צביעה וניתוח עתידיים.
עבור הקבוצה שנפרקה, שאפו מדיה טרום טיפול והעבירו עציצים לצלחות פטרי טריות, הוסיפו 70 מ"ל של מדיה תרבותית כל אחת, וחזרו לחממה.
עבור קבוצות המתח הבסיסי והפגיעה הסטטית, הכינו פלטפורמות explant. חתכו חתיכות נייר זכוכית הדומות בגודלן ללוחות האחיזה. עבור קבוצת הפגיעה הסטטית, חתכו חתיכות של קו קלוע באורך של כ -18 אינץ 'וקשרו מראש קשר רופף באמצע הדרך לאורך הקו. קרעו חתיכות של רדיד אלומיניום כדי לכסות כל אמבטיה אקרילית ורססו באתנול 70% (EtOH). העברת ההכנות ל- BSC.
כל פלטפורמה כוללת אמבטיה אקרילית, בסיס, תוספת הפחתת נפח, תפס וידיות. כל ידית אחיזה כוללת שתי פלטות ושלושה סוגים שונים של ברגים, כולל בורג אחד M5 x 0.8 מ"מ x בורג באורך 10 מ"מ המחבר את ידיות האחיזה לבסיס; שני ברגים באורך M6 x 1 מ"מ x 20 מ"מ המאריכים את הצלחות כדי להדק את האחיזות; וארבעה ברגי חוט M3 x 0.5 מ"מ x 14 מ"מ אורך, אשר בשילוב עם ארבעה קפיצי דחיסה, מושכים את הלוחות כדי לפתוח את ידיות האחיזה.
מקם את כל הרכיבים במיכלים משניים המסוגלים ללכוד את כל מדיה תרבותית במקרה של דליפה. יש לטבול בתמיסת אקונומיקה 10% ≥ ולהשרות למשך שעה לפחות. יש לשטוף את תמיסת האקונומיקה במי ברז (אוטוקלאבה לפי הצורך) ולעבור ל-BSC.
הערה: לפתרון בעיות זיהום, שקול לבצע אוטוקלאבינג של כל מי הברז או להשתמש במים מטוהרים. עיין בדיון לקבלת טיפים נוספים לטיפול בזיהום.
השתמש בברגי M3 ובקפיצי דחיסה כדי לחבר פלטות לידיות האחיזה, חבר את ידיות האחיזה לבסיס באמצעות בורג M5, והכנס את ברגי M6 עד שהם מתחברים לפלטות. השתמש בסרט דו-צדדי כדי להצמיד נייר זכוכית ללוחות, ולאחר מכן סגור את ידיות האחיזה כדי לקדם הדבקה של נייר הזכוכית ללוחות. חזור על הפעולה עבור כל הפלטפורמות.
כאשר אתם מוכנים להעמיס פלטפורמה, פתחו את ידיות האחיזה במלואן והשתמשו במלקחיים, הניחו את הרגל העליונה והברך בין הפלטות כאשר המשטח השטחי של גיד אכילס פונה כלפי מעלה (איור 1A). סגור באופן רופף את ידיות האחיזה כדי להחזיק בעדינות במקומן.
השתמש במלקחיים כדי לתפוס את ראש הירך החשוף או כף הרגל ולתפעל את זווית כיפוף הברך כשאתה סוגר בהדרגה את האחיזות כדי להבטיח את מקומן. עבור קבוצת המתח הבסיסית, האריכו את מפרק הברך כפי שתואר קודם לכן. כאשר האחיזות מתהדקות עם הברך מורחבת, הקרסול אמור להתרחב באופן טבעי. עבור קבוצת הפגיעה הסטטית, כופפו את מפרק הברך בין האחיזות כפי שתואר קודם לכן.
עבור קבוצת הפגיעה הסטטית, מניחים את הקשר העילי של המיתר סביב הכף הדיסטלית ומהדקים. מנתבים את החוט דרך חריץ בבסיס הממוקם מתחת לאקספלנט ודרך חור הקליפ. הניחו את הבסיס לתוך האמבטיה האקרילית והדקו את האטב לקצה העליון של האמבטיה (איור 1A).
משוך את החוט כדי לסמן את כף הרגל ל-110° לפחות ביחס לשוקה, והשתמש בטוש קבוע כדי לסמן את המיתר כשהוא יוצא מהקליפס. צלמו את האקספלנט במיקום הזה כדי לכמת מאוחר יותר את זווית הדורסיפלקסיה (איור 1A).
הסר את הבסיס וחבר את תוספת הפחתת עוצמת הקול על-ידי החלקה לאורך מסילה בבסיס. החזירו את הבסיס (המחובר כעת לתוספת הפחתת הנפח) לאמבטיה האקרילית ומקמו מחדש את האטב בקצה העליון. משוך את החוט כדי לחזור לזווית הדורסיפלקסיה המקורית באמצעות המיתר המסומן כקו מנחה וחבר את החוט לחלק החיצוני של האמבטיה באמצעות סרט דבק כדי לשמור על דורסיפלקסיה סטטית.
עבור קבוצת המתח הבסיסית, פשוט מקם את הבסיס עם הכנסת הפחתת נפח לתוך האמבטיה האקרילית ברגע שהחציל ממוקם בין ידיות האחיזה וצלם תמונה לכימות זווית הדורסיפלקסיה.
הוסף 125 מ"ל של מדיה תרבית מחוממת מראש (37 ° C) לכל פלטפורמה כדי לטבול explant. מכסים את החלק העליון של האמבטיה ברדיד אלומיניום, מניחים במיכל משני ועוברים לאינקובטור. תרבות במשך 7 ימים נוספים, החלפת מדיה כל 48-72 שעות.
הערה: סרט הדבקה המונח לאורך החלק העליון של האמבטיה יכול למנוע מחלקי PLA לצוף.

4. קיבוע, הסתיידות והטבעה פרפין

לאחר תרבית אקספלנט, השתמשו במספריים כדי לקצץ ציפורניים / בהונות דיסטליות ולחתוך את הרגל העליונה פרוקסימלית לצומת אכילס מיוטנידי. הכניסו כל מפרק קרסול גזוז לקסטת עיבוד מרופדת ברפידות ביופסיה מוקצפות. דחפו את הקרסול לפינת הקלטת כדי למקם את הקרסול בטמפרטורה של כ-90° dorsiflexion וסגרו את הקלטת כדי להישאר במקומה.
יש לתקן למשך 3 ימים ב-10% פורמלין חוצץ נייטרלי (NBF) ולהסתייד למשך שבועיים בחומצה אתילאנדימנטטראאצטית (EDTA) המומסת במים מזוקקים (diH₂O) עם pH מותאם ל-7.4-7.6 עם חומצה אצטית קרחונית.
כדי להסיר מלחים, יש לשטוף ביסודיות את הדגימות שלוש פעמים במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS) ולאחר מכן diH₂O, 5 דקות כל אחת. בצע עיבוד דגימה שגרתי עבור היסטולוגיה פרפין: להתייבש באמצעות סדרה מדורגת של EtOH, ברור ב xylene, לחדור עם שעוות פרפין. לכוון ולהטמיע דגימות בפרפין כדי לקבל קטעי רקמת קשת דרך גיד אכילס בהתקדמות מדיאלית לצדדית כמתואר בסעיף 5 להלן (איור 1B).

5. חתך רקמות

בעזרת מיקרוטום, חותכים בזהירות לתוך הדגימה עד שמקטעים מקבילים לפני הבלוק. חיתוך גס לתוך הקרסול מהאספקט המדיאלי של המפרק, עצירה לפני הגעה לגבול המדיאלי של החדרת גיד אכילס.
העבירו את הדגימה לגוש קרח כדי להתאים את הטמפרטורה וההידרציה, והחליפו להבים (או העבירו לחלק חדש של הלהב הנוכחי). המשך חתך לתוך הדגימה בעובי 10 מיקרומטר וזהה בזהירות כניסה להחדרת גיד אכילס במיקרוסקופ שדה בהיר. לאחר הזיהוי, בצע חתך טורי מעקב אחר מספר המקטע (כלומר, עומק הרקמה) דרך כל החדרת גיד אכילס.

6. דה-פרפיניזציה/התייבשות ובחירת שקופיות

עבור כל בדיקה להלן, בחר קטעי רקמה תואמים ברמה מכל זוג גפיים נגדיות. לפני הצביעה, הניחו על מדף שקופיות ועברו 3 שינויים של קסילן, 2 שינויים של 100% EtOH, 2 שינויים של 95% EtOH ושינוי אחד של 70% EtOH, 5 דקות כל אחד. סיים את ההתייבשות ב- diH₂O.

7. TUNEL להערכת כדאיות גיד אכילס

לסימון TUNEL, יש לצבוע בהתאם לפרוטוקול היצרן. יש לדגור בפרוטאינאז K של 20 מיקרוגרם/מ"ל למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף ב-diH₂O. לדגור ב-50 מיקרוליטר של תמיסת כתמים TUNEL (תמיסת אנזים 5 μL, תמיסת תווית 45 μL) למשך שעה אחת ב-37°C. יש לשטוף ב-diH₂O. Mount עם מגיב נוגד דהייה המכיל DAPI ו-coverslip.
דמיינו את החדרת גיד אכילס באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם עדשה אובייקטיבית 4x. כלול ערוץ DAPI (אורכי גל עירור/פליטה = 360/460 ננומטר) כדי להמחיש את כל הגרעינים, ערוץ TUNEL (TMR Red) (אורכי גל עירור/פליטה = 540/580 ננומטר) כדי להמחיש גרעינים אפופטוטיים, ואם אפשר, ערוץ שדה בהיר.
לניתוח תמונות, יש לייבא תמונות לתוכנת ניתוח תמונות המתאימה לעיבוד מבוסס ROI, כגון FIJI/ImageJ או MATLAB. הגדירו אזור מעניין (ROI) המתאר את כל גיד אכילס (איור 2A), למעט תאים באפיטנון שרגישים מאוד למוות שנגרם על-ידי דיסקציה ושינוי פתאומי בתנאי הסביבה כאשר הם מוכנסים לתרבית.
לשם כך, בצעו בחירת ROI ב- MATLAB על ידי ייבוא תמונת שדה הבהירות ושימוש בפונקציה drawpolygon() כדי לעקוב אחר גבולות הגיד ולהקיף אותם. MATLAB יוצרת אובייקט מצולע עבור החזר ההשקעה, אותו ניתן להחיל לאחר מכן על תמונות בערוצי DAPI ו-TUNEL כדי להסוות נתוני עוצמת פיקסלים מחוץ ל-ROI באמצעות createMask() כדי לנתח רק גרעינים בתוך גיד אכילס.
ייבא את תמונות ערוצי DAPI ו- TUNEL וזהה סף עוצמת פלואורסצנטיות להגדרת גרעינים אפופטוטיים (TUNEL+) על ידי נרמול לעוצמה הפלואורסצנטית המרבית של גרעינים אפופטוטיים ברקמות שאינן בנות קיימא כגון עצם, שריר או שומן שנלכדות במקרה באזור הרקמה. לאחר מיסוך התמונות, חשבו את שבר הגרעינים האפופטוטיים (גרעיני TUNEL+/DAPI) בתוך גיד אכילס.

8. היסטולוגיה כחולה טולוידין לאפיון היווצרות סחוס פיברוקרטי

לאחר התייבשות מחדש (סעיף 6), העבר את מדף השקופיות עם קטעי רקמות תואמים ברמה מזוגות נגדיים של חצילים ל- 0.4% w / v Toluidine כחול O במאגר נתרן אצטט 0.1 M עם pH מותאם ל 4.0 באמצעות חומצה אצטית קרחונית. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף 3x ב diH₂O במשך 30 שניות כל אחד.
התייבש באמצעות שלושה שינויים של 95% EtOH ושני שינויים של 100% EtOH, 30 שניות כל אחד. נקה באמצעות שלושה שינויים של xylene, 1 דקה כל אחד. כיסויים עם אמצעי הרכבה מבוססי קסילן.
קבל תמונות צבע אדום-כחול-ירוק (RGB) של 24 סיביות של החדרת גיד אכילס. לדוגמה, עבור פרוטוקול זה השתמש במתאם כדי לממשק מצלמה צבעונית דיגיטלית לעינית של מיקרוסקופ שדה בהיר פשוט עם מטרה 4x.
כדי לכמת את ההבדלים בצביעה הכחולה של טולוידין בתוך הסחוס הפיברוקרטי של הגיד הדחוס (CTF)¹⁶ בהחדרת גיד אכילס (איור 3A,B), ייבאו תמונות RGB לתוכנת ניתוח תמונות המסוגלת להגדיר ולנהל ROI מרובים. האפשרויות כוללות את הבחירות וכלי ניהול החזר ההשקעה ב-FIJI/ImageJ או את ארגז הכלים לעיבוד תמונה ב-MATLAB. התחל בהגדרת קנה המידה של הפיקסל/אורך.
הערה: בחירת התוכנה נתונה לשיקול דעתו של החוקר ובוודאי שאינה מוגבלת ל-MATLAB או FIJI/ImageJ. המחברים סיפקו קוד MATLAB (קובץ משלים 2), תיעוד המתאר את היישום (קובץ משלים 3) ותמונה לדוגמה (קובץ משלים 4). אנו מעודדים חוקרים לתרגם קוד זה לשפות תכנות חלופיות לשימוש בתוכנות אחרות לפי הצורך או העדפה.
עם התמונה המוצגת בתוכנה הנבחרת, זהה את ההצטלבות של גבול הגיד העמוק עם הקלקניאוס. מכאן, עקבו בסמיכות 800 מיקרומטר לאורך גבול הגיד העמוק כדי לקבוע את הגבול העמוק של CTF. לדוגמה, השתמשו בפונקציה drawpolyline() ב- MATLAB כדי לצייר קו פוליליין באופן אינטראקטיבי על תמונת RGB. MATLAB יוצרת אובייקט פוליליין המכיל את קודקודי הקו, אותו ניתן לעבד ולקצץ לאורך של 800 מיקרומטר.
ממיקום זה, צור את הגבול הפרוקסימלי של CTF על ידי שרטוט קטע קו המתחבר לגבול הגיד השטחי המאונך לכיוון הסיב המקומי.
חזרו להצטלבות גבול הגיד העמוק והקלקניוס והגדירו את הגבול הדיסטלי של ה-CTF על ידי שרטוט קטע קו המתחבר לגבול הגיד השטחי לאורך סימן הגאות המובהק המפריד בין ה-CTF לבין אזור החיבור פיברו-סחוס (AZF)¹⁶ (איור 3A,B). לבסוף, צור את הגבול השטחי של CTF על ידי מעקב אחר גבול הגיד השטחי כדי להקיף.
כדי לתאר שינויים מרחביים בצביעת GAG לאורך ההחדרה, חלקו את ה-CTF הכולל ל-4 רבעים (איור 3A,B). חבר את נקודת האמצע של גבולות CTF העמוקים והשטחיים עם קטע קו ליצירת גבול דיסטלי/פרוקסימלי. עוברים דרך נקודת האמצע של גבול זה, מחברים את נקודות האמצע של גבולות CTF הדיסטליים והפרוקסימליים לאורך כיוון הסיב כדי ליצור גבול שטחי/עמוק.
6 גבולות אלה מספקים מידע שניתן להשתמש בו כדי להגדיר את החזר ההשקעה המייצג את CTF כולו, אך גם 4 רבעים המחלקים את CTF. ב- MATLAB, לדוגמה, הידור קודקודים המגדירים את הגבולות של כל ROI בודד (CTF, רבעים 1-4) לווקטורים והשתמש ב- images.roi.Polygon() כדי ליצור אובייקטי מצולע סגורים עבור כל החזר השקעה.
לאחר הגדרת החזר השקעה, המירו נתוני פיקסלים RGB למרחב הצבעים גוון-רוויה-ערך (HSV) באמצעות תוסף שנאי הצבעים בפיג'י, הפונקציה rgb2hsv() ב- MATLAB או תוכנה אחרת המחילה את משוואות ההמרה המתאימות⁷⁶. לאחר מכן ניתן להקרין נתוני HSV לתוך מרחב רוויית הגוון הדו-ממדי, שבו כל שילוב של גוון ורוויה מקודד צבע ייחודי (איור 3C).
בתוך כל החזר השקעה, חשב את הגוון הממוצע והרוויה המתארים את צבע הכתם הממוצע בהחזר ההשקעה. ניתן להשיג זאת ב- MATLAB, לדוגמה, על ידי שימוש באובייקטי מצולע המגדירים כל החזר השקעה כדי להסוות את התמונה באמצעות createMask() על מנת לנתח נתוני פיקסלים רוויי גוון באופן ספציפי בתוך כל החזר השקעה.
הגדירו החזר השקעה קטן נוסף בתוך הסחוס הפיברוקרטלי הפריאוסטאלי (PF)¹⁶ (איור 3A, B) וחשבו את הגוון והרוויה הממוצעים. לאחר מכן, חשבו את המרחק האוקלידי המפריד בין הצבע הממוצע בכל החזר השקעה של CTF לזה של PF (איור 3C).

הערה: חישוב המרחק האוקלידי מתאר את מידת הדמיון בין הצבע הממוצע של החזר ההשקעה לזה של ה- PF, רקמה פיברוקרטילגית מובהקת 16,17,77. מרחק אוקלידי קטן יותר מציין צבע ROI שהוא פיברוקרטילגיני יותר במראה.
השתמש במרחק זה כדי לחשב את הניקוד של פיברו-סחוס, המניח ערך מרבי של 1 אם צבע החזר ההשקעה זהה לצבע PF וערך מינימלי של -1 אם צבע החזר ההשקעה וצבע PF מגיעים להפרדה מרבית בתוך מרחב הצבעים של רוויית הגוון.
נתונים ממוצעים עבור גוון, רוויה וציון פיברו-סחוס בתוך כל החזר השקעה על פני חלקי רקמה מכל גפה. בצע השוואות סטטיסטיות זוגיות בין קבוצות של גפיים נגדיות.

9. הדמיית SHG לחקר שינוי בארגון רשת הקולגן

בצע הדמיית SHG של החלקים המוכתמים בכחול טולוידין באמצעות מערכת מיקרוסקופ בעלת יכולת עם עדשת אובייקט 20x. רכשו ערימות z דרך עובי החתך ובצעו סריקת אריחים לפי הצורך כדי ללכוד באופן מלא את החדרת גיד אכילס.
ייבא תמונות SHG לתוכנת ניתוח תמונה מועדפת והגדר החזר השקעה המקיף ומחלק את ה- CTF בהחדרת גיד אכילס כמתואר בניתוח התמונה הכחולה של טולוידין בסעיף 8 (איור 4A,B).
אם תמונות SHG מיובאות ל- MATLAB, השתמשו בגישה להגדרת החזר השקעה של CTF ב- MATLAB כמתואר בסעיף 8. לאחר הגדרת החזר השקעה, העבר קואורדינטות ROI לפיג'י על ידי ייצוא קודקודי ROI מ- MATLAB כקבצי .txt וייבוא ל- FIJI באמצעות קואורדינטות File > Import >- XY. שכבת על הבחירה ושלח למנהל החזר ההשקעה לניתוח.
כדי לכמת את ארגון הקולגן, השתמשו בתוסף Directionality בפיג'י, המבצע ניתוח ספקטרום פורייה כדי לחשב התפלגות כיווני סיבים על פני חלונות קטנים המשתרעים על החזר השקעה. ההתפשטות של התפלגות זו, המכונה פיזור, קשורה ביחס הפוך ליישור סיבים.
הערה: סיבי קולגן עשויים להניח כיוונים משתנים בחלונות שונים על פני CTF עקב עקמומיות גסה של הגיד ולא היעדר יישור/ארגון. כדי להבחין טוב יותר בין שינויים בארגון הקולגן לבין עקמומיות גסה של הגיד בעת החדרתו, יש צורך להגדיר ROI קטנים יותר.
ייבאו תמונות SHG לפיג'י והגדירו את קנה המידה של הפיקסלים/אורך. הקרן נתונים בעוצמה מרבית של פיקסלים בתמונה דו-ממדית ללא הפרדות צבע והוסף ROI למנהל החזר ההשקעה. שכב ברצף כל החזר השקעה של CTF על התמונה וצייר 10 תת-ROI קטנים בגודל עקבי בתוך החזר ההשקעה, תוך הוספת החזר ההשקעה למנהל החזר ההשקעה.
בתוך כל תת-החזר השקעה, הפעל את תוסף הכיווניות בפיג'י כדי לחשב פיזור סיבים. נתוני פיזור ממוצעים בין תת-ROI בתוך כל החזר השקעה של CTF, ונתוני פיזור ממוצעים בתוך כל החזר השקעה של CTF על פני מקטעים מכל explant. בצע השוואות סטטיסטיות זוגיות בין קבוצות של גפיים נגדיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תמונות מייצגות של קטעי רקמה מוכתמים בטונל מדגימות גרעינים אפופטוטיים מינימליים בגוף גיד אכילס לאחר 7 ימים של תרבית צמחים בקבוצות ניסוי (איור 2A). כימות התמונות האלה מספק ראיות לכך שפרוטוקול תרבית הרקמה שומר על כדאיות של עד 78% בממוצע בתוך גיד אכילס לאחר 7 ימים של תרבית חצילים בתנאי העמסה (איור 2B).

מבחינה איכותית, צביעה כחולה משופרת של טולוידין מוערכת לאחר 7 ימים של פגיעה סטטית בהשוואה לבקרות שנפרקו (איור 3A,B), במיוחד ברבעים עמוקים הסמוכים לקלקניאוס, שם מדדנו בעבר זן דחיסה רוחבי מרבי ^5,6. כימות של חלקי הרקמה המוכתמת בכחול טולוידין מצביע על שינוי משמעותי בגוון (איור 3D), ברוויה (איור 3E) ובניקוד הסחוס הפיברוקרטלי (איור 3F) לאחר 7 ימים של פגיעה סטטית בהשוואה לצמחים שנפרקו קונטרה-לטרליים. שינוי זה בצביעת GAG מייצג ככל הנראה היווצרות פיברו-סחוס משנית לפגיעה סטטית במודל זה. הבדלים מובהקים סטטיסטית בניקוד הרוויה והפיברוקרטיון התגלו רק ברביע 1 לאחר 7 ימים של מתח בסיסי (איור 3E,F). יתר על כן, דירוג הרוויה והסחוס הפיברוקרטי ירד ביחס לגידים פרוקים קונטרלטרליים, מגמה הפוכה בהשוואה לפגיעה סטטית. נתונים אלה עשויים לתמוך בהשערה כי עומס מתיחה יכול להחליש או להפוך היווצרות פיברו-סחוס מונע פגיעה ומצדיק חקירה נוספת בעתיד.

כימות של הדמיית SHG מצביע על שינוי עדין אך משמעותי בכיוון סיבי הקולגן לאחר 7 ימים של פגיעה סטטית, שוב באזור העמוק והדיסטלי הסמוך לקלקנאוס, כפי שמצוין על ידי הבדלים משמעותיים בפיזור (איור 4C).

איור 1: פלטפורמת Explant ועיצוב ניסויי. (A) ייצוג צילומי וסכמטי של פלטפורמת explant. (למעלה) תצלום של עציץ שלם של גפה אחורית מורין טעון לתוך הרציף, עם רכיבים קריטיים מסומנים. (למטה) סכמטי המתאר פגיעה בגיד אכילס החדרתי הנגרמת על ידי דורסיפלקסיה פסיבית של הקרסול במודל אקספלנט זה. (ב) סכמטיות של עיצוב המחקר ותרבות העציץ. חצילים בגפיים האחוריות מטופלים מראש ב 100 ננומטר dexamethasone במשך 48 שעות⁷⁴. מכל עכבר, צמח גפה אחורי אחד מתורבת לאחר מכן בצלחת שנפרקה במשך 7 ימים, בעוד הגפה הנגדית נטענת לתוך פלטפורמת הניסוי כדי למקם את גיד אכילס תחת מתח בסיסי או פגיעה סטטית במשך 7 ימים. קטעי רקמה טוריים מזוגות גפיים קונטרה-לטרליים מוכתמים בכחול טולוידין כדי להמחיש רקמות עשירות ב- GAG או משמשים לצביעת טונל. חלקים מוכתמים בכחול טולוידין משמשים לאחר מכן להדמיית SHG כדי להעריך את ארגון הקולגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: כדאיות Explant. (A) תמונות מייצגות של חתכים מוכתמים בטונל מ-explants שטופלו מראש (יום 0), explants (למעלה משמאל), גידים פרוקים (למעלה מימין), גידים שנשמרו במתח בסיסי (למטה משמאל), וגידים עם פגיעה סטטית (למטה מימין). גיד אכילס משורטט בקו לבן מקווקו ומסומן AT, בעוד הקלקניוס מסומן בקו צהוב אחיד ומסומן C. גרעינים אפופטוטיים מופיעים באדום (TUNEL), כל הגרעינים מופיעים בכחול (DAPI). (B) הכימות של שבר התא המת היה בממוצע פחות מ-22% עבור קבוצות הפריקה, המתח הבסיסי והפגיעה הסטטית. הנתונים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן. חריגים נמצאים במערכי נתונים אלה עם יותר מ -50% מוות תאי, אשר ניתן לייחס נזק לגיד שנגרם על ידי טכניקת דיסקציה גרועה. החלק הממוצע של תאים מתים עם חריגים סטטיסטיים מוסרים הוא פחות מ -15% עבור כל הקבוצות. לא נמצא הבדל מובהק סטטיסטית במוות תאי בין קבוצות של מתח בסיסי פרוק לבין קבוצות פגיעה סטטית (p < 0.05). בקרת יום 0: n = 8. נפרק: n = 18. מתח בסיסי: n = 8. פגיעה סטטית: n=12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: היסטולוגיה כחולה של טולוידין. (A) נציג טולוידין כתם כחול לאחר 7 ימים של תרבית פרוקה המתארת את הסחוס הפיברוקרטי של הגיד הדחוס (CTF), פיברוקרטיוס אזור החיבור (AZF) והפיברוקרטיוס הפריאוסטיאלי (PF) בהחדרת אכילס¹⁶. Calcaneus המסומן C. ROI לכידת CTF מסומן באדום והוא מחולק עוד יותר ל 4 רבעים כדי לספק מידע מרחבי נוסף. (B) כתם כחול מייצג טולוידין לאחר 7 ימים של פגיעה סטטית, עם צביעה מוגברת של CTF, במיוחד ברביע 1 שבו מדדנו בעבר זנים דחיסה רוחביים מרביים ^5,6. (C) סכמה של מרחב הצבע רוויית הגוון המשמש לניתוח תמונות צבע. צבע מתואר על ידי שילוב של גוון (0°-360°) ורוויה (0-255)⁷⁶. הצבע הממוצע בכל החזר השקעה מנורמל לצבע הממוצע של ה- PF על ידי חישוב המרחק האוקלידי המפריד בין הצבעים בכל החזר השקעה לבין הצבע ב- PF, המספק ציון פיברו-סחוס מנורמל. (ד-ו) שינויים בכתם הכחול טולוידין לאחר 7 ימים של פגיעה סטטית (למעלה) ומתח בסיסי (למטה) בהשוואה לגידים פרוקים קונטרלטרליים. הנתונים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן. (D) כימות הגוון מצביע על הבדלים משמעותיים בגוון הממוצע בכל האזורים לאחר 7 ימים של פגיעה סטטית בהשוואה לגידים פרוקים קונטרלטרליים. לא זוהתה מגמה דומה לאחר 7 ימים של מתח בקו הבסיס בהשוואה לגידים פרוקים קונטרלטרליים. (E) כימות הרוויה, עם שינויים משמעותיים ברוויה הממוצעת על פני כל CTF ובתוך רבעים 1-3 לאחר 7 ימים של פגיעה סטטית בהשוואה לגידים פרוקים קונטרלטרליים. לעומת זאת, הבדלים משמעותיים התגלו רק ברביע 1 לאחר 7 ימים של מתח בסיסי, שבו הרוויה ירדה בהשוואה לגידים פרוקים קונטרלטרליים. (F) כימות של ציון פיברו-סחוס, עם שינויים משמעותיים בניקוד הפיברו-סחוס בכל האזורים לאחר 7 ימים של פגיעה סטטית בהשוואה לגידים פרוקים קונטרה-לטרליים. לעומת זאת, הבדלים משמעותיים התגלו רק ברביע 1 לאחר 7 ימים של מתח בסיסי, שבו ציון הסחוס הפיברוקרטלי ירד בהשוואה לגידים פרוקים קונטרלטרליים. הנתונים מצביעים על כתם GAG מוגבר הנגרם על ידי פגיעה סטטית המעידה על היווצרות מוגברת של פיברו-סחוס. נתונים המתארים את סך כל ה-CTF הושוו באמצעות מבחני דירוג חתומים לזוגות תואמים של Wilcoxon. נתוני הרביע הושוו באמצעות מדדים חוזרים ונשנים ANOVA דו-כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של שידק. *P < 0.05. **P < 0.01. עמ' < 0.005. עמ' < 0.001. מתח בסיסי לעומת פריקה: n = 6 זוגות. פגיעה סטטית לעומת פריקה: n = 8 זוגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הדמיית SHG. (A) תמונת SHG מייצגת לאחר 7 ימים של תרבית פריקה לעומת (B) 7 ימים של פגיעה סטטית. CTF מסומן באדום ומחולק ל-4 רבעים כפי שמסומן, בהתאם ל-ROI בניתוח כחול טולוידין לעיל. (C) בתוך כל רביע, ניתוח ספקטרום פורייה בוצע בתת-חלון נע באמצעות תוסף כיווניות בפיג'י. התפשטות כיווני הסיבים בתוך כל תת-חלון נקראת פיזור (°) והיא ביחס הפוך ליישור הסיבים. פיזור = 0° מייצג יישור מקבילי מושלם של סיבים. פיזור מוגבר מייצג ירידה ביישור סיבי הקולגן. הנתונים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן. הבדלים מובהקים סטטיסטית בפיזור התגלו ברביע 1 לאחר 7 ימים של פגיעה סטטית בהשוואה לגידים פרוקים קונטרלטרליים, דבר המצביע על חוסר ארגון מוגבר של קולגן. נתוני הרביע הושוו באמצעות מדדים חוזרים ונשנים ANOVA דו-כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של שידק. * עמ' < 0.05. פגיעה סטטית לעומת פריקה: n = 5 זוגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: קבצי CAD. קבצי CAD אלה, שעברו הידור בפורמטים מרובים של קבצים, יכולים לשמש להדפסה תלת-ממדית של בסיס הפלטפורמה, הוספת הפחתת נפח וקליפ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: קבצי MATLAB. קבצי MATLAB שנאספו מאפשרים לכמת את ההיסטולוגיה הכחולה של טולוידין כמתואר בסעיף 8 של הפרוטוקול להערכת היווצרות סחוס פיברוקרטי באמצעות שינוי מרחבי בצביעת GAG בהחדרת גיד אכילס. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: הנחיות להטמעת קוד MATLAB. מסמך זה מתאר צינור לכימות שינויים בצביעת GAG בהחדרת גיד אכילס באמצעות ניתוח תמונה של היסטולוגיה כחולה טולוידין באמצעות קוד MATLAB שסופק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 4: תמונה לדוגמה של היסטולוגיה כחולה טולוידין. ניתן להשתמש בתמונת צבע RGB זו של היסטולוגיה כחולה טולוידין כדי להפעיל את קוד MATLAB שסופק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פלטפורמת ההשתלה הניסיונית של הגפיים האחוריות בשילוב עם פרוטוקול תרבית הרקמה המתואר במחקר זה מספקים מודל מתאים לחקר המכנוביולוגיה של היווצרות פיברו-סחוס מונע פגיעה בהחדרת גיד אכילס. התועלת של מודל explant זה מודגמת על ידי התוצאות המייצגות, המצביעות על שמירה על כדאיות התא במקביל לשינוי משמעותי והטרוגני מבחינה מרחבית בכתמים הכחולים של טולוידין לאחר 7 ימים של פגיעה סטטית. ממצאים אלה מצביעים על שינויים בחילוף החומרים של מולקולות מטריצה עשירות ב- GAG משני לפגיעה מכנית, בהתאם למודלים אחרים ומחקרים קליניים 3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 ^,36,37,38,44,49. בנוסף, שינויים עדינים אך משמעותיים זוהו בארגון הקולגן באמצעות הדמיית SHG לאחר 7 ימים של פגיעה סטטית, בהתאם למאפיינים קליניים של טנדינופתיה הקשורה לפגיעה ומודלים in vivo של פגיעה בגידים 28,37,38,43,44,49,64.

מאמצים קודמים לחקור את sequelae ביולוגי של פגיעה בגידים החילו דחיסה פשוטה על תאי גידים מבודדים^27,29. לאחר שזוהה מנגנון מכנוביולוגי בעל עניין, מודלים אלה מספקים פלטפורמות סינון טיפוליות טובות יותר בהשוואה למודל explant שלנו. עם זאת, יש לפרש את ממצאי מחקרים אלה בזהירות, שכן תאים מבודדים בתרבית חוץ גופית חסרים סביבה חוץ-תאית תלת-ממדית המשפיעה על תגובת מכנו^57,59. בנוסף, תאים שבודדו מרקמות קולגן אחרות (למשל, סחוס) מפגינים שינוי בפעילות תעלות יונים רגישות למכנו כאשר הם מאותגרים מכנית במבחנה בהיעדר סביבה חוץ-תאית ^78,79. המודל שהוצג מתמודד עם מגבלות אלה על ידי מתן פלטפורמה להכפיף תאי גידים באתרם בתוך צמחים ברי קיימא לתנאי העמסה רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.

מודלים של Explant הם מערכות ניסוי פופולריות לחקר ביולוגיה ופיזיולוגיה של גידים^57,58. בהקשר הספציפי של פגיעה בגידים, מספר מחקרים קודמים השתמשו בצמחים חלקיים ושלמים של גידים כדי לחקור את תגובת תאי הגידים לדחיסה מלאכותית חד-צירית^{30,31,32,33,34,39}. בעוד שמחקרים אלה הדגימו קשר ישיר בין דחיסה חד-צירית לבין היווצרות פיברו-סחוס, סביבת המאמץ המכנית in vivo הנוצרת על ידי פגיעה בגידים היא רב-צירית ותלויה בתכונות אנטומיות של האזור הפגוע ^5,6. לדוגמה, סביבת המאמץ הנוצרת כתוצאה מפגיעה של הקלקניוס בגיד אכילס במהלך דורסיפלקסיה בקרסול מושפעת מזווית החדרה, אזור החיבור ונוכחות הרקמות הרכות הסובבות 60,61,62,63,80,81 . פלטפורמת explant שלנו משמרת מבנים חיצוניים אלה ומשחזרת את סביבת הזן הרב-צירית הנוצרת על ידי פגיעה תוך שמירה על תאים בסביבתם הטבעית⁶.

מודלים של בעלי חיים היו יסודיים בביסוס הקשר המיידי בין פגיעה מכנית לבין התכונות המובהקות של פיברוקרטיו-סחוס ופתולוגיה של גידים, החולקים פנוטיפים מקבילים 1,25,28,37,64,65,66. בעשורים האחרונים, רוב המחקר in vivo impingement השתמש במודלים של מכרסמים כדי לחקור את מחלת השרוול המסובב באמצעות צמצום כירורגי של החלל התת-אקרומי כדי לפגוע באופן מלאכותי בגידים של השרוול המסובב. מודלים אלה של בעלי חיים שימשו לתיאור הפתוגנזה התאית והמולקולרית של מגיד הפגיעה in vivo וניתן להרחיב אותם כדי להעריך אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לקידום תרגום קליני של מחקר פגיעה 36,37,38,66,82,83,84,85.

עם זאת, מודלים מבוססים in vivo של פגיעה בגידים, יש כמה מגבלות חשובות בלימוד מכנוביולוגיה^57,58. מודלים אלה מכניסים או מסירים בניתוח מקור חיצוני של פגיעה בגידים ומחדשים את הפעילות הגופנית (פעילות חופשית בכלוב, ריצת הליכון מאולצת וכו'). גישה זו חסרה שליטה על הגודל, הכיוון והתדירות של הכוח המופעל ישירות על הגיד לאורך כל תקופת הניסוי. בהתחשב בקושי למדוד את המאמץ הרקמתי in vivo, מודלים אלה מציעים שליטה מוגבלת או אפיון הסביבה המכנית הנוצרת בתוך הגיד בתגובה לפגיעה. מגבלה זו מוכרת היטב בתחום מחקר מכנוביולוגיה של גידים 57,58,67,68,69,70. במקומות אחרים, פלטפורמות ניסוי מתוחכמות תוכננו להפעיל עומס מכני מבוקר (עייפות) ישירות על גידים in vivo תחת הרדמה 67,68,69. מודלים אלה שולטים ביישום גירויים מכניים לפרקי זמן קצרים תחת הרדמה ואינם מציעים שליטה על היסטוריית ההעמסה לאורך שארית הניסוי כאשר החיות חוזרות לפעילות רגילה בכלוב למשך ימים עד שבועות לאחר עומס מכני. מודל explant המתואר בפרוטוקול זה מציע מרשם מבוקר של פגיעה בגיד אכילס כדי ליצור דפוסים מדידים ומתוארים היטב של זן רקמה⁶, המאפשר מחקר קפדני של מכנוביולוגיה impingement. יש לציין, עם זאת, כי מודל אקספלנט זה אינו מייתר את הצורך בחקירה in vivo של פגיעה בגידים, אלא משמש כלי משלים להעשרת נתונים הנגזרים ממודלים חיוניים אלה של בעלי חיים. מסלולים תאיים ומולקולריים המוגדרים ביחס למכניקת הפגיעה באמצעות מודל explant זה יכולים להיות מאופיינים in vivo ולהעריך אותם כמטרות טיפוליות באמצעות מודלים של בעלי חיים בגישה משלימה לשיפור התרגום הקליני של מחקר מכנוביולוגיה. כוחה של אסטרטגיה משולבת זו מנוצל בתחומים אחרים של מחקר מכנוביולוגיה של גידים 58,86,87,88, ומודל אקספלנט זה מעניק את יישומו לפגיעה בגידים.

מודל explant אינו נטול מגבלות. כמו בכל המודלים של אקספלנט, ניתן לחקור מכנוביולוגיה רק בסקאלות זמן קצרות יחסית, בעוד הרקמה נשארת בת קיימא^57,89. בעוד שהמודל הוא כלי רב עוצמה לחקר התגובה התאית המיידית לפגיעה מכנית, הוא אינו מתאים לחקר מחלת גידים כרונית הקשורה לפגיעה. בנוסף, המודל אינו מסוגל להסביר תגובה מערכתית ודיבור בין רקמות מכיוון שאספקת הדם והתקשורת העצבית אינן נשמרות. עם זאת, המודל מספק פלטפורמה לשרטוט התגובה הפנימית של תאי גידים אנדוגניים לפגיעה מכנית. מגבלה נוספת של המודל היא שעל פי מחקר קודם 32,90,91,92, אנו צופים שפרוטאוגליקנים גדולים רבים עשירים ב- GAG יתפזרו מחוץ לגיד במהלך טיפול מקדים ונקודות זמן מוקדמות של תרבית אקספלנט, במיוחד מקטעים של פרוטאוגליקנים מצטברים שאינם מעוגנים למטריצה הקרקעית. לכן, שינויים בכתם GAG משני לפגיעה במודל עשויים לשקף שינויים במאקרומולקולות חדשות עשירות ב- GAG שעדיין לא עברו קטבוליזציה ונותרו מעוגנות בתוך המטריצה החוץ תאית. בהתחשב בכך שפרוטאוגליקנים עשירים ב- GAG אלה ממוקמים בחלל הפריתאי 22,30,93,94,95, מודל explant עשוי להקל על חקירת עיצוב מחדש של PCM משני לפגיעה בגידים.

הדיסקציה של צמחי הגפיים האחוריות המתוארת בפרוטוקול זה דורשת תרגול, אך ניתן להשיג טכניקה מיומנת במהירות. הסרת כפפות מלאה (כלומר, הסרת עור) יכולה להיות מאתגרת, במיוחד סביב הספרות של הכף האחורית. בעוד העור סביב אצבעות הרגליים לא צריך להיות מוסר לחלוטין, זה מחזק סטריליות לאורך כל התרבית כמו חיידקים נוכחים על העור והפרווה.

ההיבט הקשה ביותר של הדיסקציה הוא הסרה של גיד הפלנטריס מדיאלי לגיד אכילס בסמיכות ומעבר שטחי לגיד אכילס באופן דיסטלי. יחידת שריר-גיד פלנטריס משתרעת על מפרקי הברך והקרסול בקשר הדוק עם triceps surae וגיד אכילס 81,96,97,98,99. עומסים מכניים המועברים על פני האספקט האחורי של הקרסול במהלך דורסיפלקסיה פסיבית של הקרסול מתחלקים בין גידי הפלנטריס ואכילס, וגיד הפלנטריס ידוע כנושא מתח גבוה in vivo^100,101. בנוסף, השונות האנטומית בפלנטריס האנושי מתוארת היטב ^96,102,103 ובעוד שונות זו שכיחה פחות במכרסמים⁹⁷, יש לה נטייה להשפיע על הסביבה המכנית בתוך גיד אכילס באתרו. בהתאם לטכניקות קודמות ששימשו למדידת מתח בתוך גיד אכילס באתרו ^6,104, יש להסיר את גיד הפלנטריס כדי לשלוט בסביבת המאמץ הפנימית הנוצרת על ידי פגיעה חיצונית בגיד.

הסרה זהירה של הפלנטריס נחוצה כדי למנוע מוות תאי כתוצאה מדיסקציה בגיד אכילס, והשונות באפופטוזיס התא הקיימת בנתונים (איור 2B) עשויה לשקף נזק שנגרם כתוצאה מדיסקציה עקב טכניקת דיסקציה לקויה. הסרת גיד הפלנטריס נעזרת במלקחיים עדינים כדי להפריד בזהירות את הפלנטריס מהאכילס ולשחרר את קומפלקס שריר-גיד הפלנטריס בסמיכות. מלקחיים משוננים מסייעים לאחוז בקצה החופשי הפרוקסימלי של גיד הפלנטריס כדי למשוך בצורה דיסטלית, סביב הקלקניוס ולכיוון ספרות הכף להסרה מלאה. לי ואליוט מספקים תיאור אנטומי מועיל של גידי החולדה פלנטריס ואכילס והשרירים הקשורים אליהם⁹⁷.

בעוד שמצאנו שטכניקת הדיסקציה המתוארת במחקר זה מספיקה כדי להבטיח סטריליות, ניתן להתאים או לשנות את הפרוטוקול לפי הצורך בהגדרות שבהן שמירה על סטריליות מתגלה כמאתגרת. כלים כירורגיים יכולים להיות autoclaved, פתרון betadine ניתן ליישם באופן מקומי על העור, דיסקציה יכולה להתבצע בארון בטיחות ביולוגי. מצאנו כי דיסקציה מהירה ויעילה של ספסל היא קריטית ומאפשרת להעביר במהירות גפיים מנותחות למדיה סטרילית בארון בטיחות ביולוגי לאחר פריצת הגבול הסטרילי שמספק העור.

יעד עיקרי נוסף לפתרון בעיות זיהום הוא הטכניקה המשמשת לעיקור רכיבי פלטפורמה. בידינו, זכינו להצלחה עקבית עם השריות פשוטות בתמיסת אקונומיקה 10% ≥ עם שטיפה נאותה במי ברז ללא אוטוקלאבינג. ניתן ליישם עיקור נוסף באמצעות אתנול 70% לפי הצורך, אך שימו לב שכל רכיב תלת ממדי המודפס עם PLA אינו תואם ל- EtOH ויתעקם. בנוסף, כל חלקי הפלטפורמה מלבד האמבטיה האקרילית ורכיבי PLA מודפסים בתלת-ממד ניתנים לשטיפה אוטומטית, וניתן לשטוף רכיבים ספוגים בתמיסת אקונומיקה 10% ≥ במים אוטוקלאביים או מטוהרים. כדי למנוע חלודה, מומלץ לשטוף, ולייבש ביד את כל רכיבי המתכת מיד לאחר כל ניסוי.

המתודולוגיה לכימות צביעה כחולה טולוידין לאפיון היווצרות סחוס פיברוקרטי המתוארת בפרוטוקול זה משתמשת בניתוח תמונות צבע חדשני בהתאמה אישית המציע יישום רחב לחקר גידים. יתרונות משמעותיים מסופקים על ידי המרת נתוני פיקסלים מ- RGB למרחב הצבעים HSV⁷⁶. כאן, הגוון מקודד אורך גל דומיננטי כצבע אופייני בין 0°-360°, ואילו הרוויה מגדירה את הטוהר של כל גוון בין 0°-255. ערך, לעומת זאת, מתאר בהירות של צבע וככזה, ערכת הצבעים HSV מפרידה בהירות (ערך) מצבע (גוון, רוויה). בהקשר של ניתוחים היסטולוגיים, נתוני פיקסלים HSV עמידים יותר לשינויים בהעברת האור במהלך מיקרוסקופיה ולשינויים בעובי חתך הרקמה⁷⁶. בנוסף, עבודה במרחב הצבעים HSV מאפשרת תיחום של אורכי גל ספציפיים בעלי עניין (באמצעות גוון) בהתאם לכתם ההיסטולוגי⁷⁶, למשל, גוונים סביב 240° עבור צביעה כחולה טולוידין.

היבט חדשני של ניתוח התמונה הכחולה של טולוידין המוצג במחקר זה הוא ציון הסחוס הפיברוקרטלי, מדד הקשור למרחק האוקלידי המפריד בין הצבע של כל ROI לצבע של הסחוס הפיברוסטיאלי. הסחוס הפיברוקרטלי הפריאוסטיאלי מופיע כסחוס משני מיד לאחר הלידה, בעוד שהסחוס הפיברוקרטלי של הגיד הדחוס נעדר לאחר הלידה, ובדומה לססמואידים פיברוקרטיומים אחרים, נראה כי הוא מווסת על ידי ביקוש מכני באזורים של דחיסת גידים מוגברת 16,17,28,77. על ידי השוואת ציוני הסחוס הפיברוקרטי בין קבוצות הניסוי, אנו יכולים לקבוע לא רק אם צבע הכתם הכחול טולוידין משתנה משני לפגיעה, אלא אם שינוי זה גורם למראה קרוב יותר לסחוס פיברוקרקטי. ניתן להרחיב ניתוח זה לכתמי GAG פופולריים אחרים כגון Alcian blue ו- Safranin O, כמו גם לאזורים אחרים של סחוס פיברוקרטילגי ותזות גידים פיברוקרטילגיות, כל עוד קיימת רקמת בקרה הדומה לסחוס הפיברוקרטיאלי הפריאוסטיאלי. לדוגמה, שינויים בצביעת GAG בגידים וברצועות של הברך יכולים להיות מנורמלים באמצעות ציון fibrocartilage לכתמים במניסקי fibrocartilaginous.

היבט מכריע של פרוטוקול זה הוא חתך רקמות סדרתי ומעקב אחר רמת החתך דרך גיד אכילס, הדורש הטבעה חוזרת של פרפין וזיהוי בדיקה של הכניסה להחדרת גיד אכילס לצורך מעקב אחר עומק המקטע. פרוטוקול חתך וצביעה זה ללא ספק דורש תרגול ועידון, אך ניתן להרחיב אותו להקפאה.

הגישה ההיסטולוגית המתוארת בכתב יד זה יכולה בקלות להתרחב לאימונוהיסטוכימיה או לאימונופלואורסצנציה. בהקשר זה, היבט חשוב של העיצוב הניסויי לעיל הוא השוואה זוגית של איברים נגדיים מכל עכבר. כאן, כל ההשוואות הסטטיסטיות נערכות בין קטעי רקמה ברמת חתך דומה דרך גיד אכילס מגפיים נגדיות מאותו עכבר שהוקצה לקבוצות ניסוי שונות. אסטרטגיה זו מסייעת לשלוט בשונות הביולוגית. בנוסף, זוגות תואמים ברמה של מקטעי רקמה נגדית מוכתמים על אותו מדף שקופיות בו זמנית (היסטולוגיה) או על החלקה בו זמנית באמצעות פתרונות עבודה זהים עבור כל הריאגנטים, המאגרים ותמיסות הנוגדנים (immunostaining) כדי לסייע בבקרה על השתנות מתם לכתם הטבועה בהיסטולוגיה ובתיוג חיסוני, כמו גם הטרוגניות אנטומית התלויה ברמת המקטע, במיקום ובאוריינטציה.

מספר שינויים נוספים בפרוטוקול המתואר בכתב יד זה עשויים להיות מיושמים לצורך לימוד נוסף של שאלות מחקר נוספות. לדוגמה, בעוד הנתונים המייצגים המסופקים כאן מתמקדים ב -7 ימים של פגיעה סטטית, גישה זו יכולה להיות מותאמת כדי לחקור את sequelae ביולוגי של פגיעה לסירוגין או מחזורית על ידי צימוד החוט כרוך סביב הכף האחורית דרך קליפס למפעיל מכני כגון משאבת מזרק. בנוסף, הפלטפורמה מספקת הזדמנות לחקור מנגנונים מולקולריים בעלי עניין על ידי השלמת אמצעי התרבית עם אגוניסטים / אנטגוניסטים של מולקולות קטנות, או על ידי שימוש בעציצים בגפיים האחוריות מזני עכברים טרנסגניים.

לסיכום, הצגנו מודל חדשני של צמחיית גפיים אחוריות לחקר מכנוביולוגיה העומדת בבסיס פגיעה בגיד אכילס. זה ניחן על ידי פרוטוקול תרבית רקמה השומר על כדאיות התא על פני תנאי העמסה במשך 7 ימים. מודל זה משחזר היווצרות פיברו-סחוס מונע פגיעה ושינוי קולגן כמתואר במערכות מודל אחרות, כמו גם במחלת גידים ניוונית. הפלטפורמה הניסויית מאפשרת יישום וכימות מבוקרים של דפוסי מאמץ מכניים, ולכן מספקת מודל מצוין למחקר קפדני של מכנוביולוגיה של פגיעה. מודל זה יכול להיות מיושם כדי לחקור מנגנונים מולקולריים בעלי עניין כדי לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות בטיפול בגידים החדרתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים אסירי תודה על התמיכה והסיוע שניתנו על ידי ג'ף פוקס ווידיה ונקטריני ממרכז רוצ'סטר לחקר השלד והשרירים של אוניברסיטת רוצ'סטר, הממומן בחלקו על ידי P30AR06965. בנוסף, המחברים רוצים להודות למרכז למיקרוסקופ אור וננוסקופיה (CALMN) במרכז הרפואי של אוניברסיטת רוצ'סטר על הסיוע במיקרוסקופ מולטיפוטונים. מחקר זה מומן על ידי R01 AR070765 ו- R01 AR070765-04S1, כמו גם 1R35GM147054 ו- 1R01AR082349.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	-	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Cook, J. L., Purdam, C. Is compressive load a factor in the development of tendinopathy. Br J Sports Med. 46 (3), 163-168 (2012).
Benjamin, M., Qin, S., Ralphs, J. R. Fibrocartilage associated with human tendons and their pulleys. J Anat. 187 (Pt 3), 625-633 (1995).
Benjamin, M., Ralphs, J. R. Fibrocartilage in tendons and ligaments - an adaptation to compressive load. J Anat. 193 (4), 481-494 (1998).
Benjamin, M., Theobald, P., Suzuki, D., Toumi, H. The anatomy of the Achilles tendon. The Achilles Tendon. 3, 5-16 (2007).
Chimenti, R. L., et al. Insertional achilles tendinopathy associated with altered transverse compressive and axial tensile strain during ankle dorsiflexion. J Orthop Res. 35 (4), 910-915 (2017).
Mora, K. E., et al. Ultrasound strain mapping of the mouse Achilles tendon during passive dorsiflexion. J Biomech. 132, 110920 (2022).
Pringels, L., et al. Intratendinous pressure changes in the Achilles tendon during stretching and eccentric loading: Implications for Achilles tendinopathy. Scand J Med Sci Sports. 33 (5), 619-630 (2023).
Koob, T. J., Vogel, K. G. Site-related variations in glycosaminoglycan content and swelling properties of bovine flexor tendon. J Orthop Res. 5 (3), 414-424 (1987).
Vogel, K. G., Koob, T. J. Structural specialization in tendons under compression. Int Rev Cytol. 115, 267-293 (1989).
Vogel, K. G., Ordög, A., Pogány, G., Oláh, J. Proteoglycans in the compressed region of human tibialis posterior tendon and in ligaments. J Orthop Res. 11 (1), 68-77 (1993).
Vogel, K. G., Sandy, J. D., Pogány, G., Robbins, J. R. Aggrecan in bovine tendon. Matrix Biol. 14 (2), 171-179 (1994).
Robbins, J. R., Vogel, K. G. Regional expression of mRNA for proteoglycans and collagen in tendon. Eur J Cell Biol. 64 (2), 264-270 (1994).
Vogel, K. Repetitive motion disorders of the upper extremity. Gordon, S. I., Blair, S. J., Fine, L. J. , American Academy of Orthopedic Surgeons, Michigan. (1995).
Benjamin, M., Tyers, R. N., Ralphs, J. R. Age-related changes in tendon fibrocartilage. J Anat. 179, 127-136 (1991).
Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: a structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anat Rec. 231 (2), 167-177 (1991).
Rufai, A., Benjamin, M., Ralphs, J. R. Development and ageing of phenotypically distinct fibrocartilages associated with the rat Achilles tendon. Anat Embryol (Berl). 186 (6), 611-618 (1992).
Rufai, A., Ralphs, J. R., Benjamin, M. Ultrastructure of fibrocartilages at the insertion of the rat Achilles tendon. J Anat. 189 (Pt 1), 185-191 (1996).
Waggett, A. D., Ralphs, J. R., Kwan, A. P. L., Woodnutt, D., Benjamin, M. Characterization of collagens and proteoglycans at the insertion of the human achilles tendon. Matrix Biol. 16 (8), 457-470 (1998).
Ralphs, J., et al. Regional differences in cell shape and gap junction expression in rat Achilles tendon: relation to fibrocartilage differentiation. J Anat. 193 (pt 2), 215-222 (1998).
Milz, S., et al. Three-dimensional reconstructions of the Achilles tendon insertion in man. J Anat. 200 (Pt 2), 145-152 (2002).
Tischer, T., Milz, S., Maier, M., Schieker, M., Benjamin, M. An immunohistochemical study of the rabbit suprapatella, a sesamoid fibrocartilage in the quadriceps tendon containing aggrecan. J Histochem Cytochem. 50 (7), 955-960 (2002).
Esquisatto, M. A., Joazeiro, P. P., Pimentel, E. R., Gomes, L. The effect of age on the structure and composition of rat tendon fibrocartilage. Cell Biol Int. 31 (6), 570-577 (2007).
Matuszewski, P. E., et al. Regional variation in human supraspinatus tendon proteoglycans: Decorin, biglycan, and aggrecan. Connect Tissue Res. 53 (5), 343-348 (2012).
Buckley, M. R., Huffman, G. R., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. The location-specific role of proteoglycans in the flexor carpi ulnaris tendon. Connect Tissue Res. 54 (6), 367-373 (2013).
Gillard, G. C., Reilly, H. C., Bell-Booth, P. G., Flint, M. H. The influence of mechanical forces on the glycosaminoglycan content of the rabbit flexor digitorum profundus tendon. Connect Tissue Res. 7 (1), 37-46 (1979).
Giori, N. J., Beaupre, G. S., Carter, D. R. Cellular shape and pressure may mediate mechanical control of tissue composition in tendons. J Orthop Res. 11 (4), 581-591 (1993).
Wren, T. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanobiology of tendon adaptation to compressive loading through fibrocartilaginous metaplasia. J Rehabil Res Dev. 37 (2), 135-143 (2000).
Malaviya, P., et al. An in vivo model for load-modulated remodeling in the rabbit flexor tendon. J Orthop Res. 18 (1), 116-125 (2000).
Shim, J. W., Elder, S. H. Influence of Cyclic Hydrostatic Pressure on Fibrocartilaginous Metaplasia of Achilles Tendon Fibroblasts. Biomech Model Mechanobiol. 5 (4), 247-252 (2006).
Koob, T. J., Clark, P. E., Hernandez, D. J., Thurmond, F. A., Vogel, K. G. Compression loading in vitro regulates proteoglycan synthesis by tendon fibrocartilage. Arch Biochem Biophys. 298 (1), 303-312 (1992).
Evanko, S. P., Vogel, K. G. Proteoglycan Synthesis in Fetal Tendon Is Differentially Regulated by Cyclic Compression in Vitro. Arch Biochem Biophys. 307 (1), 153-164 (1993).
Vogel, K. G. The effect of compressive loading on proteoglycan turnover in cultured fetal tendon. Connect Tissue Res. 34 (3), 227-237 (1996).
Thornton, G. M., et al. Changes in mechanical loading lead to tendon specific alterations in MMP and TIMP expression: influence of stress deprivation and intermittent cyclic hydrostatic compression on rat supraspinatus and Achilles tendons. Br J Sports Med. 44 (10), 698-703 (2010).
Robbins, J. R., Evanko, S. P., Vogel, K. G. Mechanical Loading and TGF-β Regulate Proteoglycan Synthesis in Tendon. Arch Biochem Biophys. 342 (2), 203-211 (1997).
Docking, S., Samiric, T., Scase, E., Purdam, C., Cook, J. Relationship between compressive loading and ECM changes in tendons. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (1), 7-11 (2013).
Wang, X., et al. Aberrant TGF-β activation in bone tendon insertion induces enthesopathy-like disease. J Clin Invest. 128 (2), 846-860 (2018).
Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. J Orthop Res. 36 (10), 2780-2788 (2018).
Liu, Y., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: development and analysis of a novel rat model. J Shoulder Elbow Surg. 31 (9), 1898-1908 (2022).
Majima, T., et al. Compressive compared with tensile loading of medial collateral ligament scar in vitro uniquely influences mRNA levels for aggrecan, collagen type II, and collagenase. J Orthop Res. 18 (4), 524-531 (2000).
Hopkins, C., et al. Critical review on the socio-economic impact of tendinopathy. Asia Pac J Sports Med, Arthrosc, Rehabil Technol. 4, 9-20 (2016).
Scott, A., Ashe, M. C. Common tendinopathies in the upper and lower extremities. Curr Sports Med Rep. 5 (5), 233-241 (2006).
Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin Sports Med. 22 (4), 675-692 (2003).
Bah, I., et al. Tensile mechanical changes in the Achilles tendon due to Insertional Achilles tendinopathy. J Mech Behav Biomed Mater. 112, 104031 (2020).
Chondral Metaplasia in Calcific Insertional Tendinopathy of the Achilles Tendon. Clin J Sport Med. Maffulli, N., Reaper, J., Ewen, S. W. B., Waterston, S. W., Barrass, V. 16 (4), 329-334 (2006).
Corps, A. N., et al. Increased expression of aggrecan and biglycan mRNA in Achilles tendinopathy. Rheumatology (Oxford). 45 (3), 291-294 (2006).
Scott, A., et al. Increased versican content is associated with tendinosis pathology in the patellar tendon of athletes with jumper's knee. Scand J Med Sci Sports. 18 (4), 427-435 (2008).
Attia, M., et al. Greater glycosaminoglycan content in human patellar tendon biopsies is associated with more pain and a lower VISA score. Br J Sports Med. 48 (6), 469-475 (2014).
Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative Incidence of Achilles Tendon Rupture and Tendinopathy in Male Former Elite Athletes. Clin J Sport Med. 15 (3), 133-135 (2005).
Corps, A. N., et al. Changes in matrix protein biochemistry and the expression of mRNA encoding matrix proteins and metalloproteinases in posterior tibialis tendinopathy. Ann Rheum Dis. 71 (5), 746-752 (2012).
Neer, C. S. 2nd Anterior acromioplasty for the chronic impingement syndrome in the shoulder: a preliminary report. J Bone Joint Surg Am. 54 (1), 41-50 (1972).
Bigliani, L. U., Ticker, J. B., Flatow, E. L., Soslowsky, L. J., Mow, V. C. The relationship of acromial architecture to rotator cuff disease. Clin Sports Med. 10 (4), 823-838 (1991).
Chimenti, R. L., Cychosz, C. C., Hall, M. M., Phisitkul, P. Current Concepts Review Update Insertional Achilles Tendinopathy. Foot Ankle Int. 38 (10), 1160-1169 (2017).
Nicholson, C. W., Berlet, G. C., Lee, T. H. Prediction of the Success of Nonoperative Treatment of Insertional Achilles Tendinosis Based on MRI. Foot Ankle Int. 28 (4), 472-477 (2007).
Lohrer, H., David, S., Nauck, T. Surgical treatment for achilles tendinopathy - a systematic review. BMC musculoskelet disord. 17 (1), 207 (2016).
McGarvey, W. C., Palumbo, R. C., Baxter, D. E., Leibman, B. D. Insertional Achilles Tendinosis: Surgical Treatment Through a Central Tendon Splitting Approach. Foot Ankle Int. 23 (1), 19-25 (2002).
Maffulli, N., et al. Surgery for chronic Achilles tendinopathy produces worse results in women. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1714-1720 (1714).
Wunderli, S. L., Blache, U., Snedeker, J. G. Tendon explant models for physiologically relevant in vitro study of tissue biology - a perspective. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 262-277 (2020).
Dyment, N. A., et al. A brief history of tendon and ligament bioreactors: Impact and future prospects. J Orthop Res. 38 (11), 2318-2330 (2020).
Screen, H. R. C., Berk, D. E., Kadler, K. E., Ramirez, F., Young, M. F. Tendon Functional Extracellular Matrix. J Orthop Res. 33 (6), 793-799 (2015).
Theobald, P., et al. The functional anatomy of Kager's fat pad in relation to retrocalcaneal problems and other hindfoot disorders. J Anat. 208 (1), 91-97 (2006).
Ghazzawi, A., Theobald, P., Pugh, N., Byrne, C., Nokes, L. Quantifying the motion of Kager's fat pad. J Orthop Res. 27 (11), 1457-1460 (2009).
Malagelada, F., et al. Pressure changes in the Kager fat pad at the extremes of ankle motion suggest a potential role in Achilles tendinopathy. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 28 (1), 148-154 (2020).
Shaw, H. M., Benjamin, M. Structure-function relationships of entheses in relation to mechanical load and exercise. Scand J Med Sci Sports. 17 (4), 303-315 (2007).
Soslowsky, L. J., et al. Rotator cuff tendinosis in an animal model: role of extrinsic and overuse factors. Ann Biomed Eng. 30 (8), 1057-1063 (2002).
Schneeberger, A. G., Nyffeler, R. W., Gerber, C. Structural changes of the rotator cuff caused by experimental subacromial impingement in the rat. J Shoulder Elbow Surg. 7 (4), 375-380 (1998).
Croen, B. J., et al. Chronic subacromial impingement leads to supraspinatus muscle functional and morphological changes: Evaluation in a murine model. J Orthop Res. 39 (10), 2243-2251 (2021).
Andarawis-Puri, N., Flatow, E. L. Tendon fatigue in response to mechanical loading. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 106-114 (2011).
Gains, C. C., Giannapoulos, A., Zamboulis, D. E., Lopez-Tremoleda, J., Screen, H. R. C. Development and application of a novel in vivo overload model of the Achilles tendon in rat. J Biomech. 151, 111546 (2023).
Williamson, P. M., et al. A passive ankle dorsiflexion testing system to assess mechanobiological and structural response to cyclic loading in rat Achilles tendon. J Biomech. 156, 111664 (2023).
Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A Novel, Open-Source, Low-Cost Bioreactor for Load-Controlled Cyclic Loading of Tendon Explants. J Biomech Eng. 144 (8), 084505 (2022).
Orishimo, K. F., et al. Effect of Knee Flexion Angle on Achilles Tendon Force and Ankle Joint Plantarflexion Moment During Passive Dorsiflexion. J Foot Ankle Surg. 47 (1), 34-39 (2008).
Liu, C. L., et al. Influence of different knee and ankle ranges of motion on the elasticity of triceps surae muscles, Achilles tendon, and plantar fascia. Sci Rep. 10 (1), 6643 (2020).
Cruz-Montecinos, C., et al. Soleus muscle and Achilles tendon compressive stiffness is related to knee and ankle positioning. J Electromyogr Kinesiol. 66, 102698 (2022).
Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Lose-dose administration of dexamethasone is beneficial in preventing secondary tendon damage in a stress-deprived joint injury explant model. J Orthop Res. 38 (1), 139-149 (2020).
Wunderli, S. L., et al. Tendon response to matrix unloading is determined by the patho-physiological niche. Matrix Biol. 89, 11-26 (2020).
Yabusaki, K., et al. A Novel Quantitative Approach for Eliminating Sample-To-Sample Variation Using a Hue Saturation Value Analysis Program. PloS one. 9 (3), e89627 (2014).
Gao, J., Messner, K., Ralphs, J. R., Benjamin, M. An immunohistochemical study of enthesis development in the medial collateral ligament of the rat knee joint. Anat Embryol. 194 (4), 399-406 (1996).
Han, S. K., Wouters, W. A. J., Clark, A., Herzog, W. Mechanically induced calcium signaling in chondrocytes in situ. J Orthop Res. 30 (3), 475-481 (2012).
Han, W., et al. Impact of cellular microenvironment and mechanical perturbation on calcium signalling in meniscus fibrochondrocytes. Eur Cell Mater. 27, 321-331 (2014).
Rossetti, L., et al. The microstructure and micromechanics of the tendon-bone insertion. Nat Mater. 16 (6), 664-670 (2017).
Sartori, J., Köhring, S., Witte, H., Fischer, M. S., Löffler, M. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
Eliasberg, C. D., et al. Identification of Inflammatory Mediators in Tendinopathy Using a Murine Subacromial Impingement Model. J Orthop Res. 37 (12), 2575-2582 (2019).
Zhang, Y., et al. Expression of alarmins in a murine rotator cuff tendinopathy model. J Orthop Res. 38 (11), 2513-2520 (2020).
Zhang, X., et al. Assessment of Mitochondrial Dysfunction in a Murine Model of Supraspinatus Tendinopathy. J Bone Joint Surg. Am. 103 (2), 174-183 (2021).
Liu, Y., et al. The role of Indian Hedgehog Signaling in tendon response to subacromial impingement: evaluation using a mouse model. Am J Sports Med. 50 (2), 362-370 (2022).
Wang, T., et al. Load-induced regulation of tendon homeostasis by SPARC, a genetic predisposition factor for tendon and ligament injuries. Sci Transl Med. 13 (582), eabe5738 (2021).
Passini, F. S., et al. Shear-stress sensing by PIEZO1 regulates tendon stiffness in rodents and influences jumping performance in humans. Nat Biomed Eng. 5 (12), 1457-1471 (2021).
Jones, D. L., et al. Mechanoepigenetic regulation of extracellular matrix homeostasis via Yap and Taz. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (22), e2211947120 (2023).
Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Release of pro-inflammatory cytokines from muscle and bone causes tenocyte death in a novel rotator cuff in vitro explant culture model. Connect Tissue Res. 59 (5), 423-436 (2018).
Rees, S. G., et al. Catabolism of aggrecan, decorin and biglycan in tendon. Biochem J. 350 (Pt 1), 181-188 (2000).
Samiric, T., Ilic, M. Z., Handley, C. J. Large aggregating and small leucine-rich proteoglycans are degraded by different pathways and at different rates in tendon. Eur J Biochem. 271 (17), 3612-3620 (2004).
Rees, S. G., Curtis, C. L., Dent, C. M., Caterson, B. Catabolism of aggrecan proteoglycan aggregate components in short-term explant cultures of tendon. Matrix Biol. 24 (3), 219-231 (2005).
Taye, N., Karoulias, S. Z., Hubmacher, D. The "other" 15-40%: The Role of Non-Collagenous Extracellular Matrix Proteins and Minor Collagens in Tendon. J Orthop Res. 38 (1), 23-35 (2020).
Carvalho, H. F., Felisbino, S. L. The development of the pressure-bearing tendon of the bullfrog, Rana catesbeiana. Anat Embryol. 200 (1), 55-64 (1999).
Carvalho, H. F., Felisbino, S. L., Covizi, D. Z., Della Colleta, H. H., Gomes, L. Structure and proteoglycan composition of specialized regions of the elastic tendon of the chicken wing. Cell Tissue Res. 300 (3), 435-446 (2000).
van Sterkenburg, M. N., Kerkhoffs, G. M., Kleipool, R. P., Niek van Dijk, C. The plantaris tendon and a potential role in mid-portion Achilles tendinopathy: an observational anatomical study. J Anat. 218 (3), 336-341 (2011).
Lee, A. H., Elliott, D. M. Comparative multi-scale hierarchical structure of the tail, plantaris, and Achilles tendons in the rat. J Anat. 234 (2), 252-262 (2019).
Lee, A. H., Elliott, D. M. Multi-Scale Loading and Damage Mechanisms of Plantaris and Rat Tail Tendons. J Orthop Res. 37 (8), 1827-1837 (2019).
Fan, H. M., Shrestha, L., Guo, Y., Tao, H. R., Sun, Y. L. The twisted structure of the rat Achilles tendon. J Anat. 239 (5), 1134-1140 (2021).
Cutlip, R. G., Stauber, W. T., Willison, R. H., McIntosh, T. A., Means, K. H. Dynamometer for rat plantar flexor muscles in vivo. Med Biol Eng Comput. 35 (5), 540-543 (1997).
Rijkelijkhuizen, J. M., Baan, G. C., de Haan, A., de Ruiter, C. J., Huijing, P. A. Extramuscular myofascial force transmission for in situ rat medial gastrocnemius and plantaris muscles in progressive stages of dissection. J Exp Biol. 208 (Pt 1), 129-140 (2005).
Saxena, A., Bareither, D. Magnetic Resonance and Cadaveric Findings of the Incidence of Plantaris Tendon. Foot Ankle Int. 21 (7), 570-572 (2000).
dos Santos, M. A., Bertelli, J. A., Kechele, P. R., Duarte, H. Anatomical study of the plantaris tendon: reliability as a tendo-osseous graft. Surg Radiol Anat. 31 (1), 59-61 (2009).
Sartori, J., Köhring, S., Bruns, S., Moosmann, J., Hammel, J. U. Gaining Insight into the Deformation of Achilles Tendon Entheses in Mice. Adv Eng Mater. 23 (11), 2100085 (2021).

Bioengineering

מודל צמח הגפיים האחוריות של מורין לחקר המכנוביולוגיה של פגיעה בגיד אכילס

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.