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Bioengineering

Modelo de Explante de Membro Posterior Murino para Estudo da Mecanobiologia do Impacto do Tendão de Aquiles

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65801
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

Summary

Apresentamos uma plataforma experimental personalizada e um protocolo de cultura de tecidos que recria a alteração fibrocartilaginosa impulsionada pelo impacto da inserção do tendão de Aquiles em explantes murinos de membros posteriores com viabilidade celular sustentada, fornecendo um modelo adequado para explorar a mecanobiologia do impacto tendíneo.

Abstract

O impacto tendíneo sobre o osso gera um ambiente de deformação mecânica multiaxial com tensão compressiva transversal acentuadamente elevada, que provoca um fenótipo de fibrocartilagem localizada caracterizado pelo acúmulo de matriz rica em glicosaminoglicanos (GAG) e remodelamento da rede de colágeno. Enquanto a fibrocartilagem é uma característica normal em regiões impactadas de tendões saudáveis, a deposição excessiva de GAG e a desorganização da rede de colágeno são características marcantes da tendinopatia. Assim, o impacto é reconhecido clinicamente como um importante fator extrínseco no início e progressão da tendinopatia. No entanto, a mecanobiologia subjacente ao impacto tendíneo permanece pouco estudada. Esforços anteriores para elucidar a resposta celular ao impacto tendíneo aplicaram compressão uniaxial às células e excisaram explantes tendinosos in vitro. No entanto, as células isoladas carecem de um ambiente extracelular tridimensional crucial para a mecanorresposta, e tanto os estudos de explantes in vitro quanto os excisados não conseguem recapitular o ambiente de deformação multiaxial gerado pelo impacto tendíneo in vivo, que depende das características anatômicas da região impactada. Além disso, os modelos in vivo de impacto tendíneo carecem de controle sobre o ambiente de deformação mecânica. Para superar essas limitações, apresentamos um novo modelo de explante de membro posterior murino adequado para o estudo da mecanobiologia do impacto do tendão de Aquiles. Este modelo mantém o tendão de Aquiles in situ para preservar a anatomia local e reproduz o ambiente de deformação multiaxial gerado pelo impacto da inserção do tendão de Aquiles sobre o calcâneo durante a dorsiflexão do tornozelo aplicada passivamente, retendo as células em seu ambiente nativo. Descrevemos um protocolo de cultura de tecidos integrado a este modelo e apresentamos dados que estabelecem a viabilidade sustentada do explante ao longo de 7 dias. Os resultados representativos demonstram aumento da coloração histológica de GAG e diminuição do alinhamento das fibras colágenas secundárias ao impacto, sugerindo elevada formação de fibrocartilagem. Este modelo pode ser facilmente adaptado para investigar diferentes regimes de carregamento mecânico e permite a manipulação de vias moleculares de interesse para identificar mecanismos mediadores de alterações fenotípicas no tendão de Aquiles em resposta ao impacto.

Introduction

Uma infinidade de tendões, incluindo o tendão de Aquiles e os tendões do manguito rotador, experimentam impacto ósseo devido ao posicionamento anatômico normal1,2,3,4. O impacto tendíneo gera deformação compressiva direcionada transversalmente ao eixo longitudinal das fibras5,6,7. Regiões de impacto tendíneo demonstram um fenótipo único de fibrocartilagem no qual células arredondadas e encolhidas (fibrocondrócitos) estão embutidas em uma rede de colágeno desorganizada com conteúdo de glicosaminoglicanos (GAG) acentuadamente aumentado2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Estudos anteriores sugerem que o ambiente mecânico díspar produzido pelo impacto tendíneo sustenta essa matriz rica em GAG impulsionando a deposição de grandes proteoglicanos agregadores, mais notavelmente agrecan, embora os mecanismos subjacentes não sejam claros1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Enquanto a fibrocartilagem é uma característica normal em regiões impactadas de tendões saudáveis, o metabolismo aberrante de proteoglicanos associado à formação excessiva de fibrocartilagem é uma característica marcante da tendinopatia, uma doença comum e debilitante que surge desproporcionalmente em tendões cronicamente impactados1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Assim, o impacto tendíneo é reconhecido clinicamente como um importante fator extrínseco que conduz várias das tendinopatias mais comuns, incluindo a doença do manguito rotador e a tendinopatia de Aquiles insercional (TIA)50,51,52. Atualmente, o tratamento da tendinopatia é ineficiente. Por exemplo, aproximadamente 47% dos pacientes com IAT necessitam de intervenção cirúrgica após falha no manejo conservador, com resultados pós-operatórios variáveis53,54,55,56. Apesar da aparente relação entre impacto e tendinopatia, os mecanismos mecanobiológicos pelos quais as células do tendão impactado sentem e respondem ao seu ambiente mecânico são pouco descritos, o que obscurece o entendimento da patogênese da tendinopatia e resulta em tratamento inadequado.

Modelos de explantes são ferramentas úteis no estudo da mecanobiologia tendínea57,58. Como primeiro passo para o entendimento da mecanobiologia do impacto tendíneo, vários estudos prévios exploraram a resposta celular após a aplicação de compressão uniaxial simples em células ou explantes tendinosos excisados27,29,30,31,32,33,34,39. Entretanto, as células in vitro carecem de matrizes extracelulares e pericelulares que facilitem a transferência de deformação, sequestrem importantes fatores de crescimento e citocinas liberadas por deformação mecânica e forneçam substrato para complexos de adesão focal que desempenham um papel na mecanotransdução57,59. Além disso, tanto os estudos in vitro quanto os excisantes excisados não conseguem recapitular o ambiente de deformação mecânica multiaxial gerado pelo impacto tendíneo in vivo, que depende das características anatômicas da região impactada5,6. No contexto da inserção do tendão de Aquiles impactado, isso inclui tecidos circunvizinhos, como a bursa retrocalcânea e o coxim gorduroso de Kager 60,61,62,63. Por outro lado, modelos in vivo de impacto tendíneo25,28,36,37,38,64,65,66 permitem controle mínimo sobre a magnitude e frequência da carga aplicada diretamente ao tendão, o que é uma limitação bem reconhecida dos modelos in vivo para o estudo da mecanobiologia tendínea57,58 67,68,69,70. Diante dos desafios na mensuração in vivo da deformação tendínea, o ambiente interno de deformação gerado nesses modelos é frequentemente pouco caracterizado.

Neste manuscrito, apresentamos uma plataforma experimental personalizada que recria o impacto da inserção do tendão de Aquiles sobre o calcâneo dentro de explantes de membros posteriores murinos inteiros que, quando pareados com este protocolo de cultura de tecidos, mantém a viabilidade por 7 dias em cultura de explantes e permite o estudo das sequelas biológicas do impacto tendíneo. A plataforma é construída sobre uma base de ácido polilático (PLA) impressa em 3D que fornece a base para a fixação das alças e inserção de redução de volume PLA impressa em 3D. As pegas são usadas para pinçar a perna e o joelho proximal à junção miotendínea de Aquiles com a face caudal do membro posterior voltada para cima, permitindo que o tendão de Aquiles seja visualizado de cima usando uma sonda de ultrassom ou microscópio invertido (Figura 1A). A inserção de redução de volume desliza ao longo de uma trilha na base e reduz o volume necessário de meios de cultura de tecidos. Uma linha trançada enrolada ao redor da pata traseira é roteada para fora da plataforma utilizando o design de base e um clipe PLA impresso em 3D. Ao puxar a corda, a pata traseira é dorsiflexionada e a inserção do tendão de Aquiles é impingida contra o calcâneo, resultando em elevada deformação compressiva transversa 5,6 (Figura 1A). A plataforma está contida dentro de um banho de acrílico que mantém os explantes do membro posterior submersos em meios de cultura de tecidos. A fixação da corda tensa na parte externa do banho com fita adesiva mantém a dorsiflexão do tornozelo para produzir impacto estático da inserção do tendão de Aquiles. Os arquivos CAD para componentes impressos em 3D são fornecidos em vários formatos (Arquivo Suplementar 1), permitindo a importação para uma variedade de softwares CAD comerciais e gratuitos de código aberto para modificação para atender às necessidades experimentais. Se o acesso a impressoras 3D não estiver disponível para fabricação, os arquivos CAD podem ser fornecidos aos serviços de impressão 3D on-line que imprimirão e enviarão as peças a baixo custo.

É importante ressaltar que o complexo músculo-tenculotendíneo tríceps sural abrange as articulações do joelho e tornozelo 71,72,73. Consequentemente, o estiramento tênsil no tendão de Aquiles é influenciado pela flexão do joelho. A extensão do joelho coloca o tendão de Aquiles sob tensão, enquanto a flexão do joelho reduz a tensão. Estendendo primeiro o joelho e, em seguida, dorsiflexando passivamente o tornozelo, as tensões compressivas na inserção impactada podem ser sobrepostas às tensões de tração. Por outro lado, ao dorsiflexar passivamente o tornozelo com o joelho flexionado, a tensão de tração é reduzida e a tensão compressiva permanece. O protocolo atual explora três dessas condições. 1) Para impacto estático, o pé é dorsiflexionado a < 110° em relação à tíbia para impactar a inserção, com o joelho fletido para reduzir a tensão. 2) Para o grupo tensão basal, o tornozelo é estendido acima de 145° de dorsiflexão com o joelho estendido, gerando tensão tracional predominante na inserção. 3) Para o grupo descarregado, os explantes são cultivados em placa de Petri com joelho e tornozelo em posição neutra na ausência de carga aplicada externamente. Os ângulos acima referidos são medidos fotograficamente em relação a um sistema de coordenadas onde o pé e a tíbia são paralelos num ângulo de 180° e perpendiculares num ângulo de 90°.

As principais etapas do protocolo incluem: 1) dissecção dos explantes dos membros posteriores e remoção cuidadosa da pele e do tendão plantar; 2) cultura de explantes após pré-tratamento com dexametasona 48 h; 3) corte tecidual e coloração histológica; e 4) análise de imagens coloridas para avaliar a formação de fibrocartilagem. Após a dissecção, cada explante de membro posterior é pré-tratado por 48 h em meios de cultura suplementados com dexametasona74. Os membros contralaterais de cada camundongo são alocados em grupos experimentais separados para comparação pareada, o que ajuda a controlar a variabilidade biológica. Após o pré-tratamento, os explantes são posicionados em plataformas como descrito acima e cultivados por mais 7 dias (Figura 1B). Comparações adicionais são feitas com um grupo pré-tratado (dia 0) no qual os explantes são removidos imediatamente após o pré-tratamento de 48 h.

Após a cultura do explante, os membros posteriores são aparados, fixados em formalina, descalcificados e incluídos em parafina. A secção seriada em orientação sagital proporciona a visualização do tendão de Aquiles desde a junção miotendínea até a inserção do calcâneo, permitindo que a profundidade da secção seja rastreada através de todo o tendão. A marcação dUTP X-nick mediada pela desoxinucleotidiltransferase terminal (TdT) (TUNEL) é usada para visualizar danos ao DNA secundários à apoptose e avaliar a viabilidade. A histologia do azul de toluidina e a análise de imagens coloridas personalizadas são realizadas para quantificar as alterações na coloração GAG. Cortes de tecido corados com azul de toluidina são então usados para imagens de SHG para caracterizar alterações na organização das fibras de colagem (Figura 1B).

Os resultados representativos fornecidos sugerem coloração histológica alterada da matriz rica em GAG e desorganização da rede de colágeno extracelular gerada por 7 dias de impacto estático dentro do modelo. Este modelo pode ser utilizado para explorar mecanismos moleculares subjacentes à alteração fibrocartilaginosa impulsionada pelo impacto.

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Protocol

Todo o trabalho com animais foi aprovado pelo Comitê de Recursos Animais da Universidade de Rochester.

1. Preparo dos meios de cultura de tecidos

  1. Cultivar todos os explantes em meio Dulbecco's Modified Eagle (1x DMEM) com 1% v/v de penicilina-estreptomicina e 200 μM de ácido L-ascórbico em estufa a 37 °C e 5% de CO2. Para o pré-tratamento inicial de 48 h, cada explante foi cultivado em 70 mL de meio de cultura suplementado com 100 nM de dexametasona74. Após o pré-tratamento, cultivar os membros por mais 7 dias sem dexametasona, trocando de meio a cada 48-72 h.
    NOTA: A adição de soro, como o soro fetal bovino, aos meios de cultura não é recomendada de acordo com as recomendações de Wunderli, Blache e Snedeker57. Em resumo, as condições livres de soro representam melhor o microambiente tendíneo avascular, pobre em nutrientes, existente in vivo. Além disso, a suplementação sérica pode promover degradação tecidual em determinadas condições de cultura75 e estimular a proliferação e migração celular para fora do tecido, ambas características da patologia tendínea57.
  2. Para o grupo descarregado, cultivar cada explante em 70 mL de meio. Para os grupos tensão basal e impacto estático, cada plataforma requer aproximadamente 125 mL de meios de cultura para manter o membro submerso. Esse volume pode variar dependendo do posicionamento da perna superior nas alças e dos parâmetros de impressão 3D, principalmente a densidade de preenchimento.

2. Dissecção de explantes e pré-tratamento com dexametasona

  1. Eutanásia de camundongos via inalação de CO2 e luxação cervical secundária, ou de acordo com diretrizes institucionais. Este protocolo utiliza camundongos C57BL/6 com menos de 1 ano de idade. O tamanho dos membros posteriores aumentará com a idade e pode se tornar difícil de encaixar dentro das pegadas.
  2. Antes da dissecção, transferir 70 mL de meio de cultura pré-aquecido (37 °C) para uma placa de Petri de 100 mm (diâmetro) x 25 mm (altura) em uma cabine de segurança biológica estéril (BSC). Adicione dexametasona para atingir 100 nM de concentração de trabalho.
  3. As dissecções podem ser realizadas na bancada com o uso de absorventes inferiores, trabalhando rapidamente através da dissecção antes de transferir os explantes dos membros posteriores para o BSC. Montar as ferramentas cirúrgicas necessárias para esta dissecção, que incluem pinças lisas, retas e de ponta fina; pinças de ponta reta e fina com dentes serrilhados; e tesoura reta, afiada e fina.
  4. Para dissecção dos explantes dos membros posteriores, coloque o camundongo em decúbito dorsal e identifique a articulação do quadril. Usando uma tesoura fina, faça uma pequena incisão (5-10 mm) através da pele sobrepondo o aspecto proximal e anterior (cranial) da parte superior da perna.
  5. Puxe a incisão para expandir, aperte a perna exposta usando os dedos e puxe cuidadosamente a pele distalmente para desenluvar o membro posterior até o nível do tornozelo. Insira suavemente uma lâmina tesoura sob a pele ao longo da face dorsal do pé e faça uma incisão estendendo-se até os dedos dos pés. Continue a puxar a pele distalmente para remover completamente.
  6. Posicione o mouse para visualizar a inserção do tendão de Aquiles na face posterior (caudal) do calcâneo, próximo ao tornozelo. Proximal à inserção do tendão de Aquiles, o tendão plantar encontra-se diretamente adjacente à borda medial do tendão de Aquiles e estende-se distalmente em direção à face plantar do pé, passando sobre a face posterior do calcâneo.
  7. Para remover o tendão plantar, insira cuidadosamente uma ponta da pinça de ponta lisa e fina entre os dois tendões e estenda a ponta medialmente passando por baixo do tendão plantar. Desenhe a ponta proximalmente e rasgue o músculo plantar. Usando pinça fina e serrilhada, agarre a extremidade proximal descolada do tendão plantar e puxe distalmente para remover.
  8. Na articulação do quadril, use uma tesoura fina para cortar a pelve e isolar o membro posterior. Use a tesoura para arrancar a pelve restante e expor a cabeça femoral.
  9. Transferir o explante do membro posterior para o BSC e para a placa contendo meios de cultura celular com dexametasona. Mova o prato para a incubadora e faça o pré-tratamento por 48 h.

3. Plataformas de cultura e carregamento de explantes

  1. À medida que o pré-tratamento de 48 h termina, pré-aquecer volumes suficientes de meios de cultura (secção 1). A partir deste ponto, nenhuma dexametasona será adicionada aos meios de cultura. Nesse momento, os membros do grupo pré-tratado (dia 0) podem ser fixados, descalcificados e incluídos em parafina para posterior secção, coloração e análise.
  2. Para o grupo descarregado, aspirar o meio de pré-tratamento e transferir os explantes para placas de Petri frescas, adicionar 70 mL de meios de cultura cada e retornar à incubadora.
  3. Para os grupos de tensão basal e impacto estático, preparar plataformas de explante. Corte pedaços de lixa de tamanho semelhante às placas de aderência. Para o grupo de impacto estático, corte pedaços de linha trançada de aproximadamente 18 polegadas de comprimento e pré-amarre um nó overhand solto no meio do comprimento da linha. Rasgue pedaços de papel alumínio para cobrir cada banho de acrílico e borrife com etanol 70% (EtOH). Transferir os preparativos para o BSC.
  4. Cada plataforma inclui um banho de acrílico, base, inserto de redução de volume, clipe e pegas. Cada pega inclui duas placas e três tipos diferentes de parafusos, incluindo uma rosca M5 x 0,8 mm x parafuso de 10 mm de comprimento que prende as alças à base; duas roscas M6 x 1 mm x parafusos de 20 mm de comprimento que estendem as placas para prender as alças; e quatro parafusos M3 x 0,5 mm rosca x 14 mm de comprimento que, em combinação com quatro molas de compressão, retraem as placas para abrir as alças.
  5. Coloque todos os componentes em recipientes secundários capazes de capturar todos os meios de cultura em caso de vazamento. Submergir em solução de água sanitária a 10% ≥ e deixar de molho por pelo menos 1 h. Enxágue a solução de água sanitária com água da torneira (autoclave conforme necessário) e passe para o BSC.
    NOTA: Para solucionar problemas de contaminação, considere autoclavar toda a água da torneira ou usar água purificada. Consulte a Discussão para obter dicas adicionais ao lidar com a contaminação.
  6. Use os parafusos M3 e as molas de compressão para prender as placas às alças, fixe as alças à base usando o parafuso M5 e insira os parafusos M6 até que eles engatem as placas. Use fita dupla face para fixar a lixa às placas e, em seguida, feche as alças para promover a adesão da lixa às placas. Repita para todas as plataformas.
  7. Quando estiver pronto para carregar uma plataforma, abra totalmente as alças e, com pinças, coloque a perna e o joelho entre as placas, com a superfície superficial do tendão de Aquiles voltada para cima (Figura 1A). Feche frouxamente as alças para segurar suavemente no lugar.
  8. Use pinças para agarrar a cabeça ou o pé femoral exposto e manipular o ângulo de flexão do joelho à medida que você fecha gradualmente as alças para se fixar no lugar. Para o grupo de tensão basal, estenda a articulação do joelho conforme descrito anteriormente. Como as pegas apertam com o joelho estendido, o tornozelo deve se estender naturalmente. Para o grupo de impacto estático, flexione a articulação do joelho entre as pegas, conforme descrito anteriormente.
  9. Para o grupo de impacto estático, coloque o nó overhand da corda ao redor da pata distal e aperte. Encaminhe a corda através de um slot na base localizado abaixo do explante e através do orifício do clipe. Coloque a base no banho de acrílico e prenda o clipe na borda superior do banho (Figura 1A).
  10. Puxe a corda para dorsiflexar o pé a pelo menos 110° em relação à tíbia e use um marcador permanente para marcar a corda ao sair do clipe. Fotografar o explante nessa posição para posteriormente quantificar o ângulo de dorsiflexão (Figura 1A).
  11. Remova a base e fixe a pastilha de redução de volume deslizando ao longo de uma esteira na base. Coloque a base (agora presa à inserção de redução de volume) de volta no banho de acrílico e reposicione o clipe na borda superior. Puxe a corda para retornar ao ângulo de dorsiflexão original usando a corda marcada como guia e prenda a corda para a parte externa do banho com fita adesiva para manter a dorsiflexão estática.
  12. Para o grupo de tensão basal, basta colocar a base com inserção de redução de volume no banho de acrílico assim que o explante estiver posicionado entre as alças e tirar uma fotografia para quantificação do ângulo de dorsiflexão.
  13. Adicionar 125 mL de meio de cultura pré-aquecido (37 °C) a cada plataforma para submergir os explantes. Cubra a parte superior do banho com papel alumínio, coloque em um recipiente secundário e mova para a incubadora. Cultura por 7 dias adicionais, trocando de mídia a cada 48-72 h.
    NOTA: A fita colocada na parte superior do banho pode impedir que as peças de PLA flutuem.

4. Fixação, descalcificação e inclusão em parafina

  1. Após a cultura do explante, usar tesoura para aparar as unhas dos pés/dedos distais e cortar a parte superior da perna proximal à junção miotendínea de Aquiles. Coloque cada articulação do tornozelo aparada em um de processamento forrado com almofadas de biópsia de espuma. Empurre o tornozelo para o canto do para posicionar o tornozelo a aproximadamente 90° de dorsiflexão e feche o para mantê-lo no lugar.
  2. Fixar por 3 dias em formalina tamponada neutra (FBN) a 10% e descalcificar por 2 semanas em ácido etilenodiamenetetracético (EDTA) a 14% dissolvido em água destilada (diH2O) com pH ajustado para 7,4-7,6 com ácido acético glacial.
  3. Para remover os sais, enxágue cuidadosamente as amostras três vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x seguida de diH2O, 5 minutos cada. Realizar processamento rotineiro de amostras para histologia de parafina: desidratar através de uma série graduada de EtOH, limpar em xileno e infiltrar-se com cera de parafina. Orientar e incorporar amostras em parafina para obter cortes de tecido sagital através do tendão de Aquiles em progressão medial para lateral, conforme descrito na seção 5 abaixo (Figura 1B).

5. Secção tecidual

  1. Com um micrótomo, corte cuidadosamente na amostra até que as seções fiquem paralelas à face do bloco. Aparar grosseiramente o tornozelo a partir da face medial da articulação, parando antes de atingir a borda medial da inserção do tendão de Aquiles.
  2. Transfira a amostra para um bloco de gelo para ajustar a temperatura e a hidratação e troque as lâminas (ou mude para uma nova seção da lâmina atual). Continue seccionando na amostra com 10 μm de espessura e identifique cuidadosamente a entrada na inserção do tendão de Aquiles com um microscópio de campo claro. Uma vez identificado, execute o corte seriado rastreando o número da seção (ou seja, a profundidade do tecido) através de toda a inserção do tendão de Aquiles.

6. Desparafinização/reidratação e seleção de lâminas

  1. Para cada ensaio abaixo, selecione cortes de tecido compatíveis com o nível de cada par de membros contralaterais. Antes da coloração, coloque em um rack deslizante e passe por 3 trocas de xileno, 2 trocas de 100% de EtOH, 2 trocas de 95% de EtOH e 1 mudança de 70% de EtOH, 5 min cada. Finalize a reidratação em diH2O.

7. TUNEL para avaliar a viabilidade do tendão de Aquiles

  1. Para rotulagem TUNEL, corar de acordo com o protocolo do fabricante. Incubar em 20 μg/mL de proteinase K por 20 min à temperatura ambiente e enxaguar em diH2O. Incubar em 50 μL de solução corante TUNEL (5 μL de solução enzimática, 45 μL de solução rotulada) por 1 h a 37 °C. Enxaguar em diH2O. Monte com reagente antifade contendo DAPI e lamínula.
  2. Imagem da inserção do tendão de Aquiles usando um microscópio de fluorescência com uma lente objetiva 4x. Incluir um canal DAPI (comprimentos de onda de excitação/emissão = 360/460 nm) para visualizar todos os núcleos, um canal TUNEL (TMR Red) (comprimentos de onda de excitação/emissão = 540/580 nm) para visualizar núcleos apoptóticos e, se possível, um canal de campo brilhante.
  3. Para análise de imagens, importe imagens para um software de análise de imagem adequado para processamento baseado em ROI, como FIJI/ImageJ ou MATLAB. Definir uma região de interesse (ROI) delineando todo o tendão de Aquiles em vista (Figura 2A), excluindo as células do epitenon que são altamente suscetíveis à morte induzida por dissecção e mudança súbita nas condições ambientais quando colocadas em cultura.
  4. Para fazer isso, execute a seleção de ROI no MATLAB importando a imagem de campo brilhante e usando a função drawpolygon() para rastrear e delimitar os limites do tendão. O MATLAB cria um objeto Polygon para a ROI, que pode então ser aplicado às imagens de canal DAPI e TUNEL para mascarar dados de intensidade de pixel fora da ROI usando createMask() para analisar apenas núcleos dentro do tendão de Aquiles.
  5. Importe as imagens dos canais DAPI e TUNEL e identifique um limiar de intensidade de fluorescência para definir núcleos apoptóticos (TUNEL+) normalizando para a intensidade máxima de fluorescência de núcleos apoptóticos em tecidos não viáveis, como osso, músculo ou gordura, que são capturados incidentalmente na seção de tecido. Uma vez mascaradas as imagens, calcule a fração de núcleos apoptóticos (núcleos TUNEL+/núcleos DAPI) dentro do tendão de Aquiles.

8. Histologia do azul de toluidina para caracterizar a formação de fibrocartilagem

  1. Uma vez reidratada (Seção 6), transferir a cremalheira deslizante com cortes de tecido compatíveis com o nível de pares de explantes contralaterais para 0,4% p/v de azul de toluidina O em tampão acetato de sódio 0,1 M com pH ajustado para 4,0 usando ácido acético glacial. Incubar por 10 min à temperatura ambiente, depois enxaguar 3x em diH2O por 30 s cada.
  2. Desidratar através de três trocas de EtOH 95% e duas trocas de EtOH 100%, 30 s cada. Limpar através de três trocas de xileno, 1 min cada. Tampa com meio de montagem à base de xileno.
  3. Obtenha imagens coloridas de 24 bits Vermelho-Azul-Verde (RGB) da inserção do tendão de Aquiles. Por exemplo, para este protocolo use um adaptador para fazer a interface de uma câmera digital colorida com a ocular de um microscópio de campo brilhante simples com uma objetiva de 4x.
  4. Para quantificar as diferenças na coloração com azul de toluidina dentro da fibrocartilagem compressiva do tendão (CTF)16 na inserção do tendão de Aquiles (Figura 3A,B), importe imagens RGB para um software de análise de imagens capaz de definir e gerenciar múltiplas ROIs. As opções incluem as seleções e as ferramentas de gerenciador de ROI no FIJI/ImageJ ou a caixa de ferramentas de processamento de imagem no MATLAB. Comece definindo a escala de pixel/comprimento.
    NOTA: A escolha do software é deixada a critério do pesquisador e certamente não se limita ao MATLAB ou FIJI/ImageJ. Os autores forneceram código MATLAB (Arquivo Suplementar 2), documentação descrevendo a implementação (Arquivo Suplementar 3) e uma imagem de exemplo (Arquivo Suplementar 4). Encorajamos os pesquisadores a traduzir esse código para linguagens de programação alternativas para uso em outros softwares, conforme necessário ou preferido.
  5. Com a imagem exibida no software de escolha, identifique a intersecção da borda profunda do tendão com o calcâneo. A partir daqui, traçar proximalmente 800 μm ao longo da borda tendínea profunda para estabelecer o limite profundo da CTF. Por exemplo, use a função drawpolyline() no MATLAB para desenhar interativamente uma polilinha sobre a imagem RGB. O MATLAB cria um objeto Polyline contendo os vértices da linha, que pode ser processado e cortado para um comprimento de 800 μm.
  6. A partir dessa posição, crie o limite proximal do CTF desenhando um segmento de reta conectando-se à borda superficial do tendão que é perpendicular à orientação da fibra local.
  7. Voltar à intersecção da borda profunda do tendão e do calcâneo e definir o limite distal da FTC desenhando um segmento de linha conectando-se à borda superficial do tendão ao longo da maré distinta que separa a FTC da fibrocartilagem da zona de inserção (AZF)16 (Figura 3A,B). Por fim, gerar o limite superficial do CTF traçando a borda superficial do tendão para encerrá-lo.
  8. Para descrever as variações espaciais na coloração de GAG ao longo da inserção, divida o CTF total em 4 quadrantes (Figura 3A,B). Conecte o ponto médio dos limites profundos e superficiais do CTF com um segmento de reta para criar um limite distal/proximal. Passando pelo ponto médio dessa fronteira, conecte os pontos médios dos limites distais e proximais da CTF ao longo da orientação da fibra para criar um limite superficial/profundo.
  9. Esses 6 limites fornecem informações que podem ser usadas para definir a ROI representando todo o CTF, mas também 4 quadrantes subdividindo o CTF. No MATLAB, por exemplo, compile vértices definindo os limites de cada ROI individual (CTF, quadrantes 1-4) em vetores e use images.roi.Polygon() para gerar objetos Polygon fechados para cada ROI.
  10. Com ROIs definidos, transforme os dados de pixel RGB no espaço de cores Hue-Saturation-Value (HSV) usando o plug-in de transformador de cores no FIJI, a função rgb2hsv() no MATLAB ou outro software que aplique as equações de transformação apropriadas76. Os dados do HSV podem então ser projetados no espaço de saturação de matiz 2D, onde cada combinação de matiz e saturação codifica uma cor única (Figura 3C).
  11. Dentro de cada ROI, calcule a tonalidade e a saturação médias que descrevem a cor média da mancha na ROI. Isso pode ser alcançado no MATLAB, por exemplo, usando os objetos Polygon que definem cada ROI para mascarar a imagem usando createMask() para analisar dados de pixel de saturação de matiz especificamente dentro de cada ROI.
  12. Definir outra pequena ROI dentro da fibrocartilagem periosteal (FP)16 (Figura 3A, B) e calcular a tonalidade e saturação médias. Em seguida, calcule a distância euclidiana separando a cor média em cada ROI do CTF com a do LP (Figura 3C).
    Equation 1
    OBS: O cálculo da distância euclidiana descreve o grau de semelhança entre a cor média da ROI com a do LP, um tecido fibrocartilaginoso por excelência16,17,77. Uma distância euclidiana menor indica uma cor de ROI que é mais fibrocartilaginosa na aparência.
  13. Use essa distância para calcular o escore de fibrocartilagem, que assume um valor máximo de 1 se a cor da ROI for idêntica à cor do PF e um valor mínimo de -1 se a cor da ROI e do PF atingirem a separação máxima dentro do espaço de cores de saturação de matiz.
    Equation 2
  14. Dados médios de matiz, saturação e escore de fibrocartilagem dentro de cada ROI em seções de tecido de cada membro. Realizar comparações estatísticas pareadas entre grupos de membros contralaterais.

9. Imagem por SHG para investigar mudanças na organização da rede de colágeno

  1. Realizar imagens SHG das seções coradas com azul de Toluidina usando um sistema de microscópio capaz com uma lente de objeto de 20x. Adquira z-stacks através da espessura da seção e execute a varredura de blocos conforme necessário para capturar totalmente a inserção do tendão de Aquiles.
  2. Importar imagens SHG para um software de análise de imagem preferido e definir ROIs englobando e subdividindo o CTF na inserção do tendão de Aquiles, conforme descrito para a análise de imagem azul de Toluidina na seção 8 (Figura 4A,B).
  3. Se as imagens SHG forem importadas para o MATLAB, use a abordagem para definir ROIs CTF no MATLAB, conforme descrito na seção 8 . Depois de definir ROIs, transfira as coordenadas de ROI para o FIJI exportando vértices de ROI do MATLAB como arquivos .txt e importando para o FIJI usando as coordenadas File > Import > XY. Sobreponha a seleção e envie para o gerente de ROI para análise.
  4. Para quantificar a organização do colágeno, use o plug-in Directionality no FIJI, que realiza a análise do espectro de Fourier para calcular distribuições de orientações de fibras em pequenas janelas que abrangem um ROI. A dispersão dessa distribuição, conhecida como dispersão, está inversamente relacionada ao alinhamento das fibras.
    NOTA: As fibras colágenas podem assumir orientações variáveis em diferentes janelas através do CTF devido à curvatura grosseira do tendão em vez da ausência de alinhamento/organização. Para melhor distinguir as alterações na organização do colágeno da curvatura grosseira do tendão na inserção, é necessário definir ROIs menores.
  5. Importe imagens SHG para FIJI e defina a escala de pixel/comprimento. Projete dados de intensidade máxima de pixels em uma imagem composta 2D e adicione ROIs ao ROI Manager. Sobreponha sequencialmente cada ROI do CTF na imagem e desenhe 10 pequenas sub-ROIs de tamanho consistente dentro da ROI, adicionando as sub-ROIs ao gerenciador de ROI.
  6. Dentro de cada sub-ROI, execute o plugin de direcionalidade no FIJI para calcular a dispersão da fibra. Dados médios de dispersão entre sub-ROIs dentro de cada ROI de CTF e dados de dispersão média dentro de cada ROI de CTF em seções de cada explante. Realizar comparações estatísticas pareadas entre grupos de membros contralaterais.

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Representative Results

Imagens representativas de cortes de tecido corados com TUNEL demonstram núcleos apoptóticos mínimos dentro do corpo do tendão de Aquiles após 7 dias de cultura de explantes em todos os grupos experimentais (Figura 2A). A quantificação dessas imagens fornece evidências de que o protocolo de cultura de tecidos mantém até 78% de viabilidade em média dentro do tendão de Aquiles após 7 dias de cultura de explantes em condições de carregamento (Figura 2B).

Qualitativamente, a coloração com azul de toluidina realçada é apreciada após 7 dias de impacto estático em comparação com controles sem carga (Figura 3A,B), particularmente em quadrantes profundos adjacentes ao calcâneo, onde medimos previamente a deformação máxima de compressão transversal 5,6. A quantificação desses cortes de tecido corados com azul de toluidina indica mudança significativa na tonalidade (Figura 3D), saturação (Figura 3E) e escore de fibrocartilagem (Figura 3F) após 7 dias de impacto estático em comparação com explantes contralaterais descarregados. Essa coloração alterada de GAG provavelmente representa a formação de fibrocartilagem secundária ao impacto estático dentro deste modelo. Diferenças estatisticamente significativas na saturação e no escore da fibrocartilagem só foram detectadas no quadrante 1 após 7 dias de tensão basal (Figura 3E,F). Além disso, o escore de saturação e fibrocartilagem diminuiu em relação aos tendões descarregados contralaterais, uma tendência oposta em relação ao impacto estático. Esses dados podem apoiar a hipótese de que o carregamento de tração pode atenuar ou reverter a formação de fibrocartilagem impulsionada pelo impacto e merecer investigação adicional no futuro.

A quantificação da imagem de SHG sugere mudança sutil, mas significativa, na orientação das fibras colágenas após 7 dias de impacto estático, novamente na região profunda e distal adjacente ao calcâneo, como indicado por diferenças significativas na dispersão (Figura 4C).

Figure 1
Figura 1: Plataforma de explante e planejamento experimental. (A) Representação fotográfica e esquemática da plataforma de explante. (Topo) Fotografia de um explante de membro posterior murino inteiro carregado na plataforma, com componentes críticos rotulados. (Parte inferior) Esquema descrevendo impacto insercional do tendão de Aquiles provocado pela dorsiflexão passiva do tornozelo neste modelo de explante. (B) Esquema do desenho do estudo e cultura do explante. Os explantes dos membros posteriores são pré-tratados em dexametasona 100 nM por 48 h74. De cada camundongo, um explante do membro posterior é então cultivado em uma placa descarregada por 7 dias, enquanto o membro contralateral é carregado na plataforma experimental para colocar o tendão de Aquiles sob tensão basal ou impacto estático por 7 dias. Cortes seriados de tecidos de pares de membros contralaterais são corados com azul de Toluidina para visualizar tecido rico em GAG ou usados para coloração TUNEL. Cortes corados com azul de toluidina são então usados para imagens de HSG para avaliar a organização do colágeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Viabilidade do explante. (A) Imagens representativas de cortes corados pelo TUNEL de explantes pré-tratados (dia 0) (canto superior esquerdo), tendões descarregados (canto superior direito), tendões mantidos na tensão basal (inferior esquerdo) e tendões estaticamente impactados (inferior direito). O tendão de Aquiles é delineado em uma linha branca tracejada e rotulado como AT, enquanto o calcâneo é delineado em uma linha amarela sólida e rotulado como C. Os núcleos apoptóticos aparecem vermelhos (TUNEL), todos os núcleos aparecem azuis (DAPI). (B) A quantificação da fração de células mortas foi, em média, inferior a 22% para os grupos descarregado, tensão basal e impacto estático. Os dados representam média ± desvio padrão. Valores atípicos estão presentes nesses conjuntos de dados com morte celular superior a 50%, o que pode ser atribuído ao dano tendíneo induzido pela má técnica de dissecção. A fração média de células mortas com outliers estatísticos removidos é inferior a 15% para todos os grupos. Não houve diferença estatisticamente significativa na morte celular entre os grupos sem carga, tensão basal e impacto estático (p < 0,05). Dia 0 controle: n=8. Descarregado: n=18. Tensão basal: n=8. Impacto estático: n=12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Histologia do azul de Toluidina. (A) Coloração representativa do azul de toluidina após 7 dias de cultura sem carga, mostrando fibrocartilagem compressiva do tendão (CTF), fibrocartilagem da zona de inserção (AZF) e fibrocartilagem periosteal (LP) na inserção de Aquiles16. Calcâneo marcado C. A captura da ROI do CTF é delineada em vermelho e é subdividida em 4 quadrantes para fornecer informações espaciais adicionais. (B) Coloração representativa do azul de toluidina após 7 dias de impacto estático, com acentuação da coloração do CTF, especialmente no quadrante 1, onde já medimos previamente as deformações compressivas transversais máximas 5,6. (C) Esquema do espaço de cores de saturação de matiz utilizado para análise de imagens coloridas. A cor é descrita por uma combinação de matiz (0°-360°) e saturação (0-255)76. A cor média em cada ROI é normalizada para a cor média do LP calculando-se a distância euclidiana separando as cores em cada ROI da cor no LP, o que fornece um escore de fibrocartilagem normalizado. (D-F) Alterações na coloração azul de toluidina após 7 dias de impacto estático (superior) e tensão basal (inferior) em comparação com tendões contralaterais descarregados. Os dados representam média ± desvio padrão. (D) A quantificação da tonalidade indica diferenças significativas na tonalidade média em todas as regiões após 7 dias de impacto estático em comparação com tendões contralaterais descarregados. Nenhuma tendência semelhante foi detectada após 7 dias de tensão basal em comparação com tendões contralaterais descarregados. (E) Quantificação da saturação, com mudanças significativas na saturação média em todo o CTF e dentro dos quadrantes 1-3 após 7 dias de impacto estático em relação aos tendões contralaterais descarregados. Por outro lado, diferenças significativas só foram detectadas no quadrante 1 após 7 dias de tensão basal, onde a saturação diminuiu em relação aos tendões descarregados contralaterais. (F) Quantificação do escore de fibrocartilagem, com mudanças significativas no escore de fibrocartilagem em todas as regiões após 7 dias de impacto estático em relação aos tendões contralaterais descarregados. Por outro lado, diferenças significativas só foram detectadas no quadrante 1 após 7 dias de tensão basal, onde o escore da fibrocartilagem diminuiu em relação aos tendões contralaterais descarregados. Os dados sugerem aumento da coloração por GAG provocado por impacto estático indicativo de aumento da formação de fibrocartilagem. Os dados que descrevem o total de FCT foram comparados por meio do teste dos postos sinalizados pareados de Wilcoxon. Os dados dos quadrantes foram comparados usando ANOVA two-way para medidas repetidas com o teste de comparações múltiplas de Šídák. *p < 0,05. **p < 0,01. p < 0,005. p < 0,001. Tensão basal vs. descarregada: n = 6 pares. Impacto estático vs. descarregado: n = 8 pares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagem de SHG. (A) Imagem representativa de SHG após 7 dias de cultura descarregada em comparação com (B) 7 dias de impacto estático. O CTF é delineado em vermelho e dividido em 4 quadrantes conforme rotulado, consistente com as ROIs na análise de azul de Toluidina acima. (C) Dentro de cada quadrante, a análise do espectro de Fourier foi realizada em uma sub-janela móvel usando o plugin Directionality em FIJI. A dispersão da distribuição das orientações das fibras dentro de cada sub-janela é denominada dispersão (°) e está inversamente relacionada com o alinhamento das fibras. Dispersão = 0° representa perfeito alinhamento paralelo das fibras. O aumento da dispersão representa a diminuição do alinhamento das fibras colágenas. Os dados representam média ± desvio padrão. Diferenças estatisticamente significativas na dispersão foram detectadas no quadrante 1 após 7 dias de impacto estático em comparação com tendões contralaterais descarregados, sugerindo aumento da desorganização do colágeno. Os dados dos quadrantes foram comparados usando ANOVA two-way para medidas repetidas com o teste de comparações múltiplas de Šídák. * p < 0,05. Impacto estático vs descarregado: n = 5 pares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: arquivos CAD. Esses arquivos CAD, compilados em vários formatos de arquivo, podem ser usados para imprimir em 3D a base da plataforma, inserção de redução de volume e clipe. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: arquivos MATLAB. Os arquivos MATLAB compilados permitem quantificar a histologia do azul de Toluidina conforme descrito na seção 8 do protocolo para avaliar a formação de fibrocartilagem através da mudança espacial na coloração GAG na inserção do tendão de Aquiles. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 3: Diretrizes para implementar o código MATLAB. Este documento descreve um pipeline para quantificar as alterações na coloração de GAG na inserção do tendão de Aquiles através da análise de imagem da histologia do azul de Toluidina usando o código MATLAB fornecido. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Imagem de amostra da histologia do azul de Toluidina. Esta imagem colorida RGB da histologia azul de Toluidina pode ser usada para executar o código MATLAB fornecido. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

A plataforma experimental de explante de membro posterior murino pareada com o protocolo de cultura de tecidos descrito neste estudo fornece um modelo adequado para o estudo da mecanobiologia da formação de fibrocartilagem impulsionada pelo impacto na inserção do tendão de Aquiles. A utilidade deste modelo de explante é demonstrada pelos resultados representativos, que indicam manutenção da viabilidade celular concomitante com mudança significativa e espacialmente heterogênea na coloração com azul de toluidina após 7 dias de impacto estático. Esses achados sugerem metabolismo alterado de moléculas de matriz rica em GAG secundárias ao impacto mecânico, consistente com outros modelos e estudos clínicos 3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,44,49. Além disso, alterações sutis, mas significativas, foram detectadas na organização do colágeno por meio da imagem de SHG após 7 dias de impacto estático, consistentes com as características clínicas de tendinopatia associada ao impacto e modelos in vivo de impacto tendíneo 28,37,38,43,44,49,64.

Esforços anteriores para explorar as sequelas biológicas do impacto tendíneo aplicaram compressão simples a células tendinosas isoladas27,29. Uma vez identificado um mecanismo mecanobiológico de interesse, esses modelos fornecem plataformas de triagem terapêutica superiores em comparação com nosso modelo de explante. Entretanto, os achados desses estudos devem ser interpretados com cautela, uma vez que células isoladas cultivadas in vitro carecem de um ambiente extracelular tridimensional que influencie a mecanoresposta57,59. Além disso, células isoladas de outros tecidos colágenos (por exemplo, cartilagem) demonstram atividade alterada dos canais iônicos mecanossensíveis quando desafiadas mecanicamente in vitro na ausência de um ambiente extracelular78,79. O modelo apresentado aborda essas limitações, fornecendo uma plataforma para submeter células tendinosas in situ dentro de explantes viáveis a condições de carga fisiologicamente relevantes.

Modelos de explantes são sistemas experimentais populares para sondar a biologia e fisiologia tendínea57,58. No contexto específico do impacto tendíneo, vários estudos prévios empregaram explantes parciais e totais dos tendões para explorar a resposta das células tendíneas à compressão uniaxial artificial30,31,32,33,34,39. Enquanto esses estudos demonstraram uma ligação direta entre compressão uniaxial e formação de fibrocartilagem, o ambiente de deformação mecânica in vivo gerado pelo impacto tendíneo é multiaxial e depende das características anatômicas da região impactada5,6. Por exemplo, o ambiente de deformação criado pelo impacto do calcâneo sobre o tendão de Aquiles durante a dorsiflexão do tornozelo é influenciado pelo ângulo de inserção, área de fixação e presença de tecidos moles circunjacentes 60,61,62,63,80,81 . Nossa plataforma de explante preserva essas estruturas externas e reproduz o ambiente de deformação multiaxial gerado pelo impacto, mantendo as células dentro de seu ambiente nativo6.

Modelos animais têm sido fundamentais para fundamentar uma relação imediata entre o impacto mecânico e as características por excelência da fibrocartilagem tendínea e da patologia, que compartilham fenótipos análogos1,25,28,37,64,65,66. Nas últimas décadas, a maioria das pesquisas de impacto in vivo tem utilizado modelos de roedores para estudar a doença do manguito rotador através da redução cirúrgica do espaço subacromial para impactar artificialmente os tendões do manguito rotador. Esses modelos animais têm sido utilizados para descrever a patogênese celular e molecular da tendinopatia do impacto in vivo e podem ser estendidos para avaliar novas estratégias terapêuticas para promover a tradução clínica da pesquisa do impacto 36,37,38,66,82,83,84,85.

Modelos estabelecidos de impacto tendíneo, entretanto, apresentam várias limitações importantes no estudo da mecanobiologia57,58. Esses modelos introduzem ou removem cirurgicamente uma fonte externa de impacto tendíneo e retomam a atividade física (atividade em gaiola livre, corrida forçada em esteira, etc.) Essa abordagem não tem controle sobre a magnitude, orientação e frequência da força aplicada diretamente ao tendão durante toda a duração do experimento. Dada a dificuldade em medir a deformação tecidual in vivo, esses modelos oferecem controle limitado ou caracterização do ambiente mecânico gerado dentro do tendão em resposta ao impacto. Essa limitação é bem reconhecida no campo da pesquisa mecanobiologia tendínea57,58,67,68,69,70. Em outros lugares, sofisticadas plataformas experimentais foram projetadas para aplicar sobrecarga mecânica controlada (fadiga) diretamente em tendões in vivo sob anestesia 67,68,69. Esses modelos controlam a aplicação de estímulos mecânicos por curtos períodos sob anestesia e não oferecem controle sobre o histórico de carga durante o restante do experimento, à medida que os animais retomam a atividade normal da gaiola por dias a semanas após a sobrecarga mecânica. O modelo de explante descrito neste protocolo oferece prescrição controlada do impacto do tendão de Aquiles para gerar padrões mensuráveis e bem descritos de deformaçãotecidual6, permitindo um estudo rigoroso da mecanobiologia do impacto. Deve-se notar, no entanto, que esse modelo de explante não elimina a necessidade de investigação in vivo do impacto tendíneo, mas serve como uma ferramenta complementar para enriquecer dados derivados desses modelos animais indispensáveis. Vias celulares e moleculares definidas em relação à mecânica do impacto usando este modelo de explante podem ser caracterizadas in vivo e avaliadas como alvos terapêuticos usando modelos animais em uma abordagem complementar para melhorar a tradução clínica da pesquisa mecanobiológica. O poder dessa estratégia integrada está sendo explorado em outros domínios da pesquisa mecanobiológica tendínea58,86,87,88, e este modelo de explante confere sua aplicação ao impacto tendíneo.

O modelo de explante não é isento de limitações. Como em todos os modelos de explantes, a mecanobiologia só pode ser estudada em escalas de tempo relativamente curtas, enquanto o tecido permanece viável57,89. Embora o modelo seja uma ferramenta poderosa para estudar a resposta celular imediata ao impacto mecânico, ele não é adequado para estudar a doença tendínea crônica associada ao impacto. Além disso, o modelo é incapaz de explicar a resposta sistêmica e o crosstalk tecidual, uma vez que o suprimento sanguíneo e a comunicação neural não são mantidos. No entanto, o modelo fornece uma plataforma para delinear a resposta intrínseca das células endógenas do tendão ao impacto mecânico. Uma outra limitação do modelo é que, de acordo com pesquisas prévias32,90,91,92, esperamos que muitos proteoglicanos grandes ricos em GAG se difundam para fora do tendão durante o pré-tratamento e os primeiros momentos de cultura de explantes, particularmente fragmentos de proteoglicanos agregantes não ancorados à matriz terrestre. Portanto, mudanças na coloração de GAG secundárias ao impacto no modelo provavelmente refletirão mudanças em macromoléculas ricas em GAG recém-sintetizadas que ainda não foram catabolizadas e permanecem ancoradas na matriz extracelular. Dado que esses proteoglicanos ricos em GAG localizam-se no espaço pericelular22,30,93,94,95, o modelo de explante pode facilitar a investigação do remodelamento da PCM secundário ao impacto tendíneo.

A dissecção de explantes murinos de membros posteriores descritos neste protocolo requer prática, mas a técnica proficiente pode ser obtida rapidamente. O desenluvamento completo (ou seja, a remoção da pele) pode ser um desafio, particularmente ao redor dos dedos da pata traseira. Embora a pele ao redor dos dedos dos pés não precise ser totalmente removida, ela reforça a esterilidade durante toda a cultura, pois as bactérias estão presentes na pele e no pelo.

O aspecto mais difícil da dissecção é a remoção do tendão plantar medial ao tendão de Aquiles proximalmente e passando superficialmente ao tendão de Aquiles distalmente. A unidade músculo-tendínea plantar abrange as articulações do joelho e tornozelo em íntima associação com o tríceps sural e o tendão de Aquiles 81,96,97,98,99. As cargas mecânicas transferidas através da face posterior do tornozelo durante a dorsiflexão passiva do tornozelo são distribuídas entre os tendões plantar e Aquiles, e o tendão plantar é conhecido por suportar alto estresse in vivo100,101. Além disso, a variabilidade anatômica no plantar humano é bem descrita 96,102,103 e, embora essa variabilidade seja menos prevalente em roedores 97, tem a propensão a afetar o ambiente mecânico dentro do tendão de Aquiles in situ. De acordo com técnicas prévias utilizadas para medir o estiramento dentro do tendão de Aquiles in situ 6,104, o tendão plantar deve ser removido para controlar o ambiente interno de deformação gerado pelo impacto tendíneo aplicado externamente.

A remoção cuidadosa do plantar é necessária para evitar a morte celular induzida por dissecção no tendão de Aquiles, e a variabilidade na apoptose celular presente nos dados (Figura 2B) pode refletir dano induzido pela dissecção devido à má técnica de dissecção. A remoção do tendão plantar se beneficia de pinças de ponta fina para separar cuidadosamente o plantar do Aquiles e liberar o complexo músculo-tendão plantar proximalmente. Pinças serrilhadas ajudam a segurar a extremidade livre proximal do tendão plantar para puxar distalmente, ao redor do calcâneo e em direção aos dedos da pata para remoção completa. Lee e Elliott fornecem uma descrição anatômica útil dos tendões plantar e de Aquiles de ratos e da musculatura associada97.

Embora tenhamos considerado a técnica de dissecção descrita neste estudo suficiente para garantir a esterilidade, o protocolo pode ser ajustado ou modificado conforme necessário em ambientes onde a manutenção da esterilidade se mostra um desafio. As ferramentas cirúrgicas podem ser autoclavadas, a solução de betadina pode ser aplicada topicamente na pele e a dissecção pode ser realizada em um gabinete de segurança biológica. Descobrimos que a dissecção de bancada rápida e eficiente é fundamental e permite que os membros dissecados sejam rapidamente transferidos para meios estéreis em um gabinete de segurança biológica após o rompimento do limite estéril fornecido pela pele.

Outro alvo primordial para solucionar a contaminação é a técnica utilizada para esterilizar componentes da plataforma. Em nossas mãos, temos tido sucesso consistente com embebições simples em solução ≥ de água sanitária a 10% com enxágue adequado em água da torneira sem autoclavagem. A esterilização adicional usando etanol a 70% pode ser aplicada conforme necessário, mas esteja ciente de que qualquer componente impresso em 3D com PLA é incompatível com EtOH e empenará. Além disso, todas as partes da plataforma, exceto o banho de acrílico e os componentes PLA impressos em 3D, podem ser autoclavados, e os componentes embebidos em solução ≥ 10% de água sanitária podem ser enxaguados com água autoclavada ou purificada. Para evitar a ferrugem, recomenda-se lavar e secar manualmente todos os componentes metálicos imediatamente após cada experimento.

A metodologia de quantificação da coloração com azul de toluidina para caracterizar a formação de fibrocartilagens descrita neste protocolo emprega uma inovadora análise personalizada de imagens coloridas que oferece ampla aplicação à pesquisa tendínea. Vantagens significativas são fornecidas pela conversão de dados de pixel do RGB para o espaço de cores HSV76. Aqui, a tonalidade codifica um comprimento de onda dominante como uma cor característica de 0°-360°, enquanto a saturação define a pureza de cada tonalidade de 0-255. Valor, por outro lado, descreve o brilho da cor e, como tal, o esquema de cores HSV separa o brilho (valor) da cor (matiz, saturação). No contexto das análises histológicas, os dados de pixel de HSV são mais robustos a mudanças na transmissão de luz durante a microscopia e variações na espessura do corte tecidual76. Além disso, trabalhar no espaço de cores do HSV permite delinear comprimentos de onda específicos de interesse (via matiz) dependendo da coloração histológica76, por exemplo, matizes em torno de 240° para coloração com azul de Toluidina.

Um aspecto inovador da análise da imagem azul de Toluidina apresentada neste estudo é o escore de fibrocartilagem, métrica que se relaciona com a distância euclidiana que separa a cor de cada ROI da cor da fibrocartilagem periosteal. A fibrocartilagem periosteal surge como cartilagem secundária imediatamente após o nascimento, enquanto a fibrocartilagem compressiva tendínea está ausente no pós-natal e, como outras fibrocartilagens sesamoides, parece ser regulada pela demanda mecânica em regiões de elevada compressão tendínea16,17,28,77. Comparando os escores de fibrocartilagem entre os grupos experimentais, podemos determinar não apenas se a coloração azul de Toluidina está mudando secundária ao impacto, mas se essa alteração resulta em uma aparência mais próxima da fibrocartilagem. Essa análise pode ser estendida a outras colorações populares de GAG, como Alcian blue e Safranin O, bem como outras regiões de fibrocartilagem tendínea e enteses de tendões fibrocartilaginosos, desde que haja um tecido controle semelhante à fibrocartilagem periosteal. Por exemplo, alterações na coloração de GAG nos tendões e ligamentos do joelho poderiam ser normalizadas através do escore de fibrocartilagem para coloração nos meniscos fibrocartilaginosos.

Um aspecto crucial deste protocolo é a secção seriada do tecido e o rastreamento do nível de secção através do tendão de Aquiles, que requer a inclusão de parafina repetível e a identificação escrutinada da entrada na inserção do tendão de Aquiles para rastreamento da profundidade da seção. Este protocolo de seccionamento e coloração sem dúvida requer prática e refinamento, mas pode ser estendido à criossecção.

A abordagem histológica descrita neste manuscrito pode ser facilmente estendida para imunohistoquímica ou imunofluorescência. Nesse sentido, um aspecto importante do desenho experimental acima é a comparação pareada dos membros contralaterais de cada camundongo. Aqui, todas as comparações estatísticas são feitas entre cortes de tecido em nível de corte comparável através do tendão de Aquiles de membros contralaterais do mesmo camundongo atribuídos a diferentes grupos experimentais. Essa estratégia auxilia no controle da variabilidade biológica. Além disso, pares de cortes de tecido contralateral pareados em nível são corados na mesma lâmina simultaneamente (histologia) ou na lâmina simultaneamente usando soluções de trabalho idênticas para todos os reagentes, tampões e soluções de anticorpos (imunomarcação) para ajudar a controlar a variabilidade de coloração para coloração inerente à histologia e imunomarcação, bem como a heterogeneidade anatômica dependendo do nível de corte, localização e orientação.

Várias outras modificações no protocolo descrito neste manuscrito podem ser implementadas para um estudo mais aprofundado de questões adicionais de pesquisa. Por exemplo, enquanto os dados representativos fornecidos aqui estão focados em 7 dias de impacto estático, essa abordagem pode ser adaptada para investigar as sequelas biológicas do impacto intermitente ou cíclico acoplando a corda enrolada ao redor da pata traseira através do clipe a um atuador mecânico como uma bomba de seringa. Além disso, a plataforma oferece a oportunidade de interrogar mecanismos moleculares de interesse, suplementando os meios de cultura com agonistas/antagonistas de pequenas moléculas, ou usando explantes de membros posteriores de linhagens transgênicas de camundongos.

Em conclusão, apresentamos um novo modelo de explante de membro posterior murino para estudar mecanobiologia subjacente ao impacto do tendão de Aquiles. Isso é dotado por um protocolo de cultura de tecidos que mantém a viabilidade celular através de condições de carga ao longo de 7 dias. Este modelo recapitula a formação de fibrocartilagem impulsionada pelo impacto e a alteração colagenosa, como descrito em outros sistemas modelo, bem como na doença degenerativa do tendão. A plataforma experimental permite a aplicação controlada e quantificação de padrões mecânicos de deformação, fornecendo, portanto, um excelente modelo para o estudo rigoroso da mecanobiologia do impacto. Este modelo pode ser aplicado para interrogar mecanismos moleculares de interesse para identificar potenciais alvos terapêuticos no tratamento de tendinopatias insercionais.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem o apoio e a assistência fornecidos por Jeff Fox e Vidya Venkatramani do Núcleo de Histologia, Bioquímica e Imagem Molecular (HBMI) do Centro de Pesquisa Musculoesquelética da Universidade de Rochester, financiado em parte pela P30AR06965. Além disso, os autores gostariam de agradecer ao Center for Light Microscopy and Nanoscopy (CALMN) do University of Rochester Medical Center pelo auxílio com microscopia multifóton. O presente estudo foi financiado por R01 AR070765 e R01 AR070765-04S1, bem como 1R35GM147054 e 1R01AR082349.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox - Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
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Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining

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