Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Muizen achterpoot explantatiemodel voor het bestuderen van de mechanobiologie van achillespees impingement

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65801
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

Summary

We presenteren een op maat gemaakt experimenteel platform en weefselkweekprotocol dat fibrokraakbeenachtige verandering nabootst die wordt aangedreven door impingement van de achillespeesinsertie in explantaten van de achterpoten van muizen met aanhoudende cellevensvatbaarheid, en biedt een model dat geschikt is voor het onderzoeken van de mechanobiologie van peesimpingement.

Abstract

Peesbotsing op bot genereert een multiaxiale mechanische belastingomgeving met duidelijk verhoogde transversale compressieve rek, die een gelokaliseerd fibrokraakbeenfenotype opwekt dat wordt gekenmerkt door accumulatie van glycosaminoglycaan (GAG)-rijke matrix en remodellering van het collageennetwerk. Hoewel fibrokraakbeen een normaal kenmerk is in aangetaste gebieden van gezonde pezen, zijn overmatige GAG-afzetting en desorganisatie van het collageennetwerk kenmerkende kenmerken van tendinopathie. Dienovereenkomstig wordt impingement klinisch erkend als een belangrijke extrinsieke factor bij het ontstaan en de progressie van tendinopathie. Toch blijft de mechanobiologie die ten grondslag ligt aan peesimpingement onderbelicht. Eerdere pogingen om de cellulaire respons op peesimpingement op te helderen, hebben uniaxiale compressie toegepast op cellen en peesexplantaten in vitro weggesneden. Geïsoleerde cellen missen echter een driedimensionale extracellulaire omgeving die cruciaal is voor de mechanorespons, en zowel in vitro als excitatiestudies kunnen de multiaxiale spanningsomgeving die wordt gegenereerd door peesimpingement in vivo niet recapituleren, wat afhankelijk is van anatomische kenmerken van het geïmpacteerde gebied. Bovendien missen in vivo modellen van peesimpingement controle over de mechanische belastingsomgeving. Om deze beperkingen te overwinnen, presenteren we een nieuw explantatiemodel van de achterpoten van muizen dat geschikt is voor het bestuderen van de mechanobiologie van achillespeesimpingement. Dit model houdt de achillespees in situ om de lokale anatomie te behouden en reproduceert de multiaxiale spanningsomgeving die wordt gegenereerd door botsing van de achillespeesinsertie op de calcaneus tijdens passief toegepaste dorsaalflexie van de enkel met behoud van cellen in hun oorspronkelijke omgeving. We beschrijven een weefselkweekprotocol dat integraal deel uitmaakt van dit model en presenteren gegevens die een duurzame levensvatbaarheid van explantatie gedurende 7 dagen aantonen. De representatieve resultaten tonen een verbeterde histologische GAG-kleuring en verminderde uitlijning van de collageenvezel secundair aan impingement, wat wijst op verhoogde vorming van fibrokraakbeen. Dit model kan gemakkelijk worden aangepast om verschillende mechanische belastingsregimes te onderzoeken en maakt het mogelijk om moleculaire routes te manipuleren die van belang zijn om mechanismen te identificeren die fenotypische veranderingen in de achillespees mediëren als reactie op impingement.

Introduction

Een groot aantal pezen, waaronder de achillespees en rotator cuff-pezen, ervaren benige impingement als gevolg van normale anatomische positionering1,2,3,4. Peesimpingement genereert drukspanning die dwars op de longitudinale vezelas is gericht5,6,7. Gebieden van peesimpingement vertonen een uniek fenotype van fibrokraakbeen waarin gekrompen, ronde cellen (fibrochondrocyten) zijn ingebed in een ongeorganiseerd collageennetwerk met een duidelijk verhoogd glycosaminoglycaan (GAG)-gehalte2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Eerdere studies suggereren dat de ongelijksoortige mechanische omgeving die wordt geproduceerd door peesimpingement deze GAG-rijke matrix in stand houdt door de afzetting van grote aggregerende proteoglycanen, met name aggrecan, te stimuleren, hoewel de onderliggende mechanismen onduidelijk zijn1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Hoewel fibrokraakbeen een normaal kenmerk is in aangetaste gebieden van gezonde pezen, is een afwijkend proteoglycaanmetabolisme geassocieerd met overmatige vorming van fibrokraakbeen een kenmerkend kenmerk van tendinopathie, een veel voorkomende en slopende ziekte die onevenredig vaak voorkomt bij chronisch aangetaste pezen1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Dienovereenkomstig wordt peesimpingement klinisch erkend als een belangrijke extrinsieke factor die verschillende van de meest voorkomende tendinopathieën aandrijft, waaronder rotator cuff-ziekte en insertionele achillespeesontsteking (IAT)50,51,52. Momenteel is de behandeling van tendinopathie inefficiënt. Ongeveer 47% van de patiënten met IAT heeft bijvoorbeeld een chirurgische ingreep nodig na mislukte conservatieve behandeling, met variabele postoperatieve uitkomsten53,54,55,56. Ondanks de schijnbare relatie tussen impingement en tendinopathie, zijn de mechanobiologische mechanismen waarmee cellen in een aangetaste pees hun mechanische omgeving waarnemen en erop reageren, slecht beschreven, wat het begrip van de pathogenese van tendinopathie verduistert en resulteert in een ontoereikende behandeling.

Explantatiemodellen zijn nuttige hulpmiddelen bij de studie van peesmechanobiologie57,58. Als een eerste stap in de richting van het begrijpen van de mechanobiologie van peesimpingement, hebben verschillende eerdere studies de cellulaire respons onderzocht na de toepassing van eenvoudige uniaxiale compressie op cellen of uitgesneden peesexplantaten 27,29,30,31,32,33,34,39. Cellen in vitro missen echter extracellulaire en pericellulaire matrices die de overdracht van spanningen vergemakkelijken, belangrijke groeifactoren en cytokines die vrijkomen door mechanische vervorming sekwestreren en substraat bieden voor focale adhesiecomplexen die een rol spelen bij mechanotransductie57,59. Bovendien kunnen zowel in vitro als excitant-onderzoeken niet worden gerecituleerd in de multiaxiale mechanische belastingsomgeving die wordt gegenereerd door peesimpingement in vivo, die afhankelijk is van anatomische kenmerken van het geïmpacteerde gebied 5,6. In de context van de beknelde achillespeesinsertie omvat dit omliggende weefsels zoals de retrocalcaneale slijmbeurs en Kager's vetkussen 60,61,62,63. Omgekeerd bieden in vivo modellen van peesimpingement 25,28,36,37,38,64,65,66 minimale controle over de omvang en frequentie van de belasting die rechtstreeks op de pees wordt uitgeoefend, wat een algemeen erkende beperking is van in vivo modellen voor het bestuderen van peesmechanobiologie 57,58,67,68,69,70. Gezien de uitdagingen bij het meten van peesspanning in vivo, is de interne rekomgeving die in deze modellen wordt gegenereerd vaak slecht gekarakteriseerd.

In dit manuscript presenteren we een op maat gemaakt experimenteel platform dat de invoeging van de achillespees op de calcaneus in de explantaten van de hele muizen van de achterpoten nabootst dat, in combinatie met dit weefselkweekprotocol, de levensvatbaarheid gedurende 7 dagen in explantatiekweek behoudt en studie van de biologische gevolgen van peesimpingement mogelijk maakt. Het platform is gebouwd op een 3D-geprinte polymelkzuur (PLA) basis die de basis vormt voor de bevestiging van de grepen en 3D-geprinte PLA-volumereductie-inzetstukken. De grepen worden gebruikt om het bovenbeen en de knie proximaal van de achillespees-myotendineuze overgang vast te klemmen met het caudale aspect van de achterpoot naar boven gericht, waardoor de achillespees van bovenaf kan worden afgebeeld met behulp van een ultrasone sonde of omgekeerde microscoop (Figuur 1A). Het volumereductie-inzetstuk glijdt langs een spoor op de basis en vermindert het benodigde volume weefselkweekmedia. Een gevlochten lijn die om de achterpoot is gewikkeld, wordt uit het platform geleid met behulp van het basisontwerp en een 3D-geprinte PLA-clip. Door aan het touwtje te trekken, wordt de achterpoot dorsaalgebogen en wordt de aanhechting van de achillespees tegen de calcaneus gedrukt, wat resulteert in een verhoogde dwarsdrukspanning 5,6 (Figuur 1A). Het platform bevindt zich in een acrylbad dat de explantaties van de achterpoot ondergedompeld houdt in weefselkweekmedia. Door het strakke koord met plakband aan de buitenkant van het bad te bevestigen, wordt de dorsaalflexie van de enkel in stand gehouden om statische impingement van de achillespeesinsertie te produceren. CAD-bestanden voor 3D-geprinte componenten worden geleverd in meerdere formaten (aanvullend bestand 1), waardoor ze kunnen worden geïmporteerd in een reeks commerciële en gratis, open-source CAD-software voor aanpassing aan experimentele behoeften. Als er geen toegang tot 3D-printers beschikbaar is voor fabricage, kunnen CAD-bestanden worden verstrekt aan online 3D-printservices die de onderdelen tegen lage kosten printen en verzenden.

Belangrijk is dat het triceps surae-Achilles musculotendineuze complex zowel de knie- als de enkelgewrichten overspant 71,72,73. Bijgevolg wordt de trekspanning in de achillespees beïnvloed door knieflexie. Knie-extensie plaatst de achillespees onder spanning, terwijl knieflexie de spanning vermindert. Door eerst de knie te strekken en vervolgens de enkel passief te dorsaalbuigen, kunnen drukspanningen bij de geïmpacteerde insertie worden gesuperponeerd op trekspanningen. Omgekeerd, door de enkel passief dorsaalbuigend te maken met de knie gebogen, wordt de trekspanning verminderd en blijft de drukspanning bestaan. Het huidige protocol onderzoekt drie van dergelijke voorwaarden. 1) Voor statische impingement wordt de voet dorsaalgebogen tot < 110° ten opzichte van het scheenbeen om de insertie te beïnvloeden, met de knie gebogen om de spanning te verminderen. 2) Voor de basislijnspanningsgroep wordt de enkel gestrekt boven 145° dorsaalflexie met de knie gestrekt, waardoor bij het inbrengen overwegend trekspanning ontstaat. 3) Voor de onbelaste groep worden explantaten gekweekt in een petrischaal met de knie en enkel in neutrale posities in afwezigheid van extern uitgeoefende belasting. De hierboven genoemde hoeken worden fotografisch gemeten ten opzichte van een coördinatensysteem waarbij de voet en het scheenbeen evenwijdig zijn onder een hoek van 180° en loodrecht op een hoek van 90°.

De belangrijkste stappen van het protocol zijn onder meer: 1) dissectie van explantaten van de achterpoten en zorgvuldige verwijdering van de huid en plantarispees; 2) explantatiecultuur na een 48 uur durende voorbehandeling met dexamethason; 3) weefseldoorsnede en histologische kleuring; en 4) kleurenbeeldanalyse om de vorming van fibrokraakbeen te beoordelen. Na dissectie wordt elke explantatie van de achterpoot gedurende 48 uur voorbehandeld in kweekmedia aangevuld met dexamethason74. Contralaterale ledematen van elke muis worden toegewezen aan afzonderlijke experimentele groepen voor paarsgewijze vergelijking, wat helpt bij het beheersen van biologische variabiliteit. Na de voorbehandeling worden de explantaten op platforms geplaatst zoals hierboven beschreven en nog 7 dagen gekweekt (Figuur 1B). Aanvullende vergelijkingen worden gemaakt met een voorbehandelde (dag 0) groep waarin explantaten direct na de 48 uur voorbehandeling worden verwijderd.

Na explantatiecultuur worden de achterpoten bijgesneden, formaline gefixeerd, ontkalkt en ingebed in paraffine. Seriële doorsnede in sagittale oriëntatie biedt visualisatie van de achillespees vanaf de myotendineuze overgang tot de calcaneale insertie, terwijl de sectiediepte door de hele pees kan worden gevolgd. Terminale deoxynucleotidyltransferase (TdT)-gemedieerde dUTP X-nick-labeling (TUNEL) wordt gebruikt om DNA-schade secundair aan apoptose te visualiseren en de levensvatbaarheid te beoordelen. Toluïdineblauwe histologie en aangepaste kleurenbeeldanalyse worden uitgevoerd om veranderingen in GAG-kleuring te kwantificeren. Toluïdineblauw gekleurde weefselsecties worden vervolgens gebruikt voor SHG-beeldvorming om veranderingen in de organisatie van collagevezels te karakteriseren (Figuur 1B).

De verstrekte representatieve resultaten suggereren een veranderde histologische kleuring van de GAG-rijke matrix en desorganisatie van het extracellulaire collageennetwerk gegenereerd door 7 dagen statische impingement binnen het model. Dit model kan worden gebruikt om moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan impingement-gedreven fibrokraakbeenachtige verandering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Al het dierenwerk werd goedgekeurd door het University of Rochester Committee on Animal Resources.

1. Bereiding van weefselkweekmedia

  1. Kweek alle explantaten in Dulbecco's Modified Eagle Medium (1x DMEM) met 1% v/v penicilline-streptomycine en 200 μM L-ascorbinezuur in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Kweek gedurende de eerste voorbehandeling van 48 uur elke explantatie in 70 ml kweekmedia aangevuld met 100 nM dexamethason74. Na voorbehandeling, kweek ledematen nog 7 dagen zonder dexamethason, waarbij het medium elke 48-72 uur wordt vervangen.
    OPMERKING: Toevoeging van serum, zoals foetaal runderserum, aan de kweekmedia wordt niet geadviseerd in overeenstemming met de aanbevelingen van Wunderli, Blache en Snedeker57. Kortom, serumvrije omstandigheden vertegenwoordigen beter de avasculaire, voedingsarme peesmicro-omgeving die in vivo bestaat. Bovendien kan serumsuppletie de weefselafbraak onder bepaalde kweekomstandigheden bevorderen75 en celproliferatie en migratie uit weefsel stimuleren, beide kenmerken van peespathologie57.
  2. Kweek voor de ongeladen groep elke explantatie in 70 ml media. Voor de basislijnspannings- en statische impingementgroepen heeft elk platform ongeveer 125 ml kweekmedia nodig om het ledemaat ondergedompeld te houden. Dit volume kan variëren afhankelijk van de positionering van het bovenbeen in de grepen en 3D-printparameters, voornamelijk de infill-dichtheid.

2. Explantatusdissectie en voorbehandeling met dexamethason

  1. Euthanaseer muizen via CO2 -inademing en secundaire cervicale dislocatie, of volgens institutionele richtlijnen. Dit protocol maakt gebruik van C57BL/6-muizen jonger dan 1 jaar. De omvang van de achterpoten zal toenemen met de leeftijd en kan een uitdaging worden om in de grepen te passen.
  2. Breng vóór de dissectie 70 ml voorverwarmde (37 °C) kweekmedia over in een petrischaal van 100 mm (diameter) x 25 mm (hoogte) in een steriele biologische veiligheidskast (BSC). Voeg dexamethason toe om een werkconcentratie van 100 nM te bereiken.
  3. Dissecties kunnen op het tafelblad worden uitgevoerd met behulp van absorberende onderleggers, waarbij snel door de dissectie wordt gewerkt voordat de explantaties van de achterpoten in de BSC worden overgebracht. Monteer de chirurgische instrumenten die nodig zijn voor deze dissectie, waaronder een gladde, rechte pincet met fijne punt; rechte pincet met fijne punt en gekartelde tanden; en een rechte, scherpe, fijne schaar.
  4. Voor dissectie van explantaties van de achterpoten, plaatst u de muis in rugligging en identificeert u het heupgewricht. Maak met een fijne schaar een kleine incisie (5-10 mm) door de huid die het proximale en voorste (craniale) aspect van het bovenbeen bedekt.
  5. Trek de incisie uit elkaar om uit te zetten, knijp met de vingers in het blootgestelde bovenbeen en trek voorzichtig distaal aan de huid om de achterpoot tot het niveau van de enkel te deghandhouden. Steek voorzichtig een schaarblad onder de huid langs het dorsale aspect van de voet en maak een incisie die zich uitstrekt tot aan de tenen. Blijf distaal aan de huid trekken om deze volledig te verwijderen.
  6. Plaats de muis om de aanhechting van de achillespees op het achterste (caudale) aspect van de calcaneus te visualiseren, nabij de enkel. Proximaal van de aanhechting van de achillespees ligt de plantarispees direct naast de mediale rand van de achillespees en strekt zich distaal uit naar het plantaire aspect van de voet, over het achterste aspect van de calcaneus.
  7. Om de plantarispees te verwijderen, steekt u voorzichtig een punt van de gladde, fijne pincet tussen de twee pezen en strekt u de punt mediaal uit en gaat u mediaal onder de plantarispees door. Trek de punt proximaal en scheur door de plantaris-spier. Pak met een gekartelde pincet met een fijne punt het losgemaakte proximale uiteinde van de plantarispees vast en trek distaal om te verwijderen.
  8. Gebruik bij het heupgewricht een fijne schaar om door het bekken te knippen en de achterpoot te isoleren. Gebruik de schaar om het resterende bekken los te wrikken en de heupkop bloot te leggen.
  9. Breng de explantatie van de achterpoot over naar de BSC en in de schaal met celkweekmedia met dexamethason. Verplaats de schaal naar de broedmachine en behandel gedurende 48 uur.

3. Explantatiecultuur en laadperrons

  1. Aan het einde van de 48 uur durende voorbehandeling moet voldoende hoeveelheden kweekmedia worden voorverwarmd (hoofdstuk 1). Vanaf dit moment wordt er geen dexamethason meer toegevoegd aan kweekmedia. Op dit moment kunnen ledematen uit de voorbehandelde (dag 0) groep worden gefixeerd, ontkalkt en ingebed in paraffine voor toekomstige secties, kleuring en analyse.
  2. Voor de ongeladen groep, aspiratie voorbehandelingsmedia en breng explantaten over naar verse petrischalen, voeg elk 70 ml kweekmedia toe en keer terug naar de incubator.
  3. Bereid explantatieplatforms voor op de basislijnspanning en statische impingementgroepen. Knip stukjes schuurpapier af die qua grootte vergelijkbaar zijn met de gripplaten. Knip voor de statische impingementgroep stukken gevlochten lijn van ongeveer 18 inch lang en leg een losse platte knoop halverwege de lengte van de lijn. Scheur stukjes aluminiumfolie om elk acrylbad te bedekken en spuit met 70% ethanol (EtOH). Draag de voorbereidingen over aan het BSC.
  4. Elk platform bevat een acrylbad, basis, volumereductie-inzetstuk, clip en grepen. Elke handgreep bevat twee platen en drie verschillende soorten schroeven, waaronder een M5 x 0,8 mm schroefdraad x 10 mm lange schroef waarmee de grepen aan de basis worden bevestigd; twee M6 x 1 mm schroefdraad x 20 mm lange schroeven die de platen verlengen om de grepen vast te klemmen; en vier M3 x 0,5 mm schroefdraad x 14 mm lange schroeven die, in combinatie met vier drukveren, de platen intrekken om de grepen te openen.
  5. Plaats alle componenten in secundaire containers die in staat zijn om alle kweekmedia op te vangen in geval van een lek. Dompel onder in ≥ 10% bleekoplossing en laat minimaal 1 uur weken. Spoel de bleekoplossing af met kraanwater (autoclaaf indien nodig) en ga naar de BSC.
    NOTITIE: Overweeg voor het oplossen van verontreiniging om al het kraanwater in de autoclaaf te zetten of gezuiverd water te gebruiken. Zie de discussie voor aanvullende tips bij het aanpakken van besmetting.
  6. Gebruik de M3-schroeven en drukveren om platen aan de grepen te bevestigen, bevestig de grepen aan de basis met behulp van de M5-schroef en steek de M6-schroeven erin totdat ze in de platen grijpen. Gebruik dubbelzijdig plakband om schuurpapier op de platen te bevestigen en sluit vervolgens de grepen om de hechting van het schuurpapier aan de platen te bevorderen. Herhaal dit voor alle platforms.
  7. Wanneer u klaar bent om een platform te laden, opent u de grepen volledig en plaatst u met een pincet het bovenbeen en de knie tussen de platen met het oppervlakkige oppervlak van de achillespees naar boven gericht (Figuur 1A). Sluit de handgrepen losjes om ze voorzichtig op hun plaats te houden.
  8. Gebruik een pincet om de blootgestelde heupkop of -voet vast te pakken en manipuleer de knieflexiehoek terwijl u de grepen geleidelijk sluit om ze op hun plaats vast te zetten. Verleng voor de basislijnspanningsgroep het kniegewricht zoals eerder beschreven. Als de grepen strakker worden met de knie gestrekt, moet de enkel op natuurlijke wijze worden uitgestrekt. Voor de statische impingementgroep buigt u het kniegewricht tussen de grepen zoals eerder beschreven.
  9. Voor de statische impingement-groep plaatst u de platte knoop van het touw rond de distale poot en trekt u deze aan. Leid de snaar door een gleuf in de basis onder de explantatie en door het clipgat. Plaats de basis in het acrylbad en bevestig de clip aan de bovenrand van het bad (Figuur 1A).
  10. Trek aan het touwtje om de voet dorsiflex te maken tot ten minste 110° ten opzichte van het scheenbeen en gebruik een permanente marker om het touwtje te markeren wanneer het de clip verlaat. Maak een foto van de explantatie in deze positie om later de dorsaalflexiehoek te kwantificeren (Figuur 1A).
  11. Verwijder de basis en bevestig het volumereductie-inzetstuk door langs een rail op de basis te schuiven. Plaats de basis (nu bevestigd aan het volumereductie-inzetstuk) terug in het acrylbad en plaats de clip terug op de bovenrand. Trek aan het touwtje om terug te keren naar de oorspronkelijke dorsaalflexiehoek met behulp van het gemarkeerde touwtje als richtlijn en bevestig het touwtje aan de buitenkant van het bad met tape om de statische dorsaalflexie te behouden.
  12. Voor de basislijnspanningsgroep plaatst u eenvoudig de basis met volumereductie-inzetstuk in het acrylbad zodra de explantatie tussen de grepen is geplaatst en maakt u een foto voor kwantificering van de dorsaalflexiehoek.
  13. Voeg 125 ml voorverwarmde (37 °C) kweekmedia toe aan elk platform om explantaten onder te dompelen. Bedek de bovenkant van het bad met aluminiumfolie, plaats het in een secundaire container en ga naar de couveuse. Kweek gedurende 7 extra dagen, wissel elke 48-72 uur van media.
    NOTITIE: Tape die over de bovenkant van het bad wordt geplaatst, kan voorkomen dat PLA-onderdelen gaan drijven.

4. Fixatie, ontkalking en paraffine-inbedding

  1. Gebruik na de explantatiecultuur een schaar om teennagels/distale tenen te knippen en knip het bovenbeen proximaal van de achillespeesovergang weg. Plaats elk bijgesneden enkelgewricht in een verwerkingscassette bekleed met schuimbiopsiekussens. Duw de enkel in de hoek van de cassette om de enkel in een dorsaalflexie van ongeveer 90° te plaatsen en sluit de cassette om hem op zijn plaats te houden.
  2. Fixeer gedurende 3 dagen in 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) en ontkalk gedurende 2 weken in 14% ethyleendiamenetetraazijnzuur (EDTA) opgelost in gedestilleerd water (diH2O) met pH aangepast aan 7,4-7,6 met ijsazijn.
  3. Om zouten te verwijderen, spoelt u de monsters driemaal grondig in zowel 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door diH2O, elk 5 minuten. Voer routinematige monsterverwerking uit voor paraffinehistologie: dehydrateer door een gesorteerde reeks EtOH, helder in xyleen, en infiltreer met paraffinewas. Oriënteer en plaats monsters in paraffine om sagittale weefselsecties te verkrijgen via de achillespees in mediale-naar-laterale progressie zoals beschreven in rubriek 5 hieronder (Figuur 1B).

5. Weefselsecties

  1. Snijd met een microtoom voorzichtig in het monster totdat de secties evenwijdig zijn aan het blokvlak. Trim grof in de enkel vanaf het mediale aspect van het gewricht en stop voordat u de mediale rand van de achillespeesinsertie bereikt.
  2. Breng het monster over naar een ijsblok om de temperatuur en hydratatie aan te passen en verwissel de messen (of verschuif naar een nieuw deel van het huidige mes). Ga door met het doorsnijden in het monster met een dikte van 10 μm en identificeer zorgvuldig de toegang tot de aanhechting van de achillespees met een helderveldmicroscoop. Eenmaal geïdentificeerd, voert u het sectienummer van de seriële secties uit (d.w.z. weefseldiepte) door de gehele insertie van de achillespees.

6. Deparaffinisatie/rehydratatie en objectglaasjesselectie

  1. Selecteer voor elke onderstaande test op niveau afgestemde weefselsecties van elk paar contralaterale ledematen. Plaats het voor het kleuren op een glaasjesrek en doorloop 3 veranderingen van xyleen, 2 veranderingen van 100% EtOH, 2 veranderingen van 95% EtOH en 1 verandering van 70% EtOH, elk 5 minuten. Eindig rehydraterend in diH2O.

7. TUNEL om de levensvatbaarheid van de achillespees te beoordelen

  1. Voor TUNEL-etikettering, beits volgens het protocol van de fabrikant. Incubeer in 20 μg/ml proteïnase K gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en spoel af in diH2O. Incubeer in 50 μL TUNEL-kleuroplossing (5 μL enzymoplossing, 45 μL etiketoplossing) gedurende 1 uur bij 37 °C. Spoel af in diH2O. Bevestig met antifade-reagens dat DAPI en dekglaasje bevat.
  2. Breng de aanhechting van de achillespees in beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een 4x objectieflens. Voeg een DAPI-kanaal toe (excitatie-/emissiegolflengten = 360/460 nm) om alle kernen te visualiseren, een TUNEL-kanaal (TMR Red) (excitatie-/emissiegolflengten = 540/580 nm) om apoptotische kernen te visualiseren, en indien mogelijk een helderveldkanaal.
  3. Voor beeldanalyse importeert u afbeeldingen in beeldanalysesoftware die geschikt is voor verwerking op basis van ROI, zoals FIJI/ImageJ of MATLAB. Definieer een interessegebied (ROI) dat de gehele achillespees in beeld schetst (Figuur 2A), met uitzondering van cellen in het epitenon die zeer vatbaar zijn voor overlijden veroorzaakt door dissectie en plotselinge verandering in omgevingsomstandigheden wanneer ze in kweek worden geplaatst.
  4. Om dit te doen, voert u ROI-selectie uit in MATLAB door het helderveldbeeld te importeren en de drawpolygon()-functie te gebruiken om de grenzen van de pees te traceren en te omsluiten. MATLAB maakt een Polygoon-object voor de ROI, dat vervolgens kan worden toegepast op de DAPI- en TUNEL-kanaalafbeeldingen om pixelintensiteitsgegevens buiten de ROI te maskeren met behulp van createMask() om alleen kernen binnen de achillespees te analyseren.
  5. Importeer de DAPI- en TUNEL-kanaalafbeeldingen en identificeer een fluorescentie-intensiteitsdrempel voor het definiëren van apoptotische (TUNEL+) kernen door te normaliseren naar de maximale fluorescentie-intensiteit van apoptotische kernen in niet-levensvatbare weefsels zoals botten, spieren of vet die incidenteel worden opgevangen in de weefselsectie. Zodra de beelden zijn gemaskeerd, berekent u de fractie van apoptotische kernen (TUNEL+-kernen/DAPI-kernen) in de achillespees.

8. Toluïdine blauwe histologie om de vorming van fibrokraakbeen te karakteriseren

  1. Eenmaal gerehydrateerd (sectie 6), breng het schuifrek met op het niveau afgestemde weefselsecties over van contralaterale paren explantaten naar 0,4% w/v Toluïdineblauw O in 0,1 M natriumacetaatbuffer met pH aangepast aan 4,0 met behulp van ijsazijn. Incubeer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur en spoel daarna 3x in diH2O gedurende 30 s.
  2. Dehydrateer door drie veranderingen van 95% EtOH en twee veranderingen van 100% EtOH, elk 30 s. Helder door drie wisselingen van xyleen, elk 1 minuut. Dekglaasje met montagemedium op xyleenbasis.
  3. Verkrijg 24-bits rood-blauw-groen (RGB) kleurenbeelden van de aanhechting van de achillespees. Gebruik voor dit protocol bijvoorbeeld een adapter om een digitale kleurencamera aan te sluiten op het oculair van een eenvoudige helderveldmicroscoop met een 4x-objectief.
  4. Om verschillen in Toluïdineblauwe kleuring in het compressieve peesfibrokraakbeen (CTF)16 bij de aanhechting van de achillespees te kwantificeren (Figuur 3A,B), importeert u RGB-beelden in beeldanalysesoftware die in staat is om meerdere ROI's te definiëren en te beheren. Opties zijn onder meer de selecties en ROI-beheertools in FIJI/ImageJ of de toolbox voor beeldverwerking in MATLAB. Begin met het instellen van de pixel-/lengteschaal.
    OPMERKING: De softwarekeuze wordt overgelaten aan het oordeel van de onderzoeker en is zeker niet beperkt tot MATLAB of FIJI/ImageJ. De auteurs hebben MATLAB-code (aanvullend bestand 2), documentatie die de implementatie beschrijft (aanvullend bestand 3) en een voorbeeldafbeelding (aanvullend bestand 4) verstrekt. We moedigen onderzoekers aan om deze code te vertalen naar alternatieve programmeertalen voor gebruik in andere software als dat nodig is of de voorkeur heeft.
  5. Identificeer met de afbeelding die wordt weergegeven in de software van uw keuze de kruising van de diepe peesrand met de calcaneus. Volg vanaf hier proximaal 800 μm langs de diepe peesrand om de diepe grens van de CTF vast te stellen. Gebruik bijvoorbeeld de drawpolyline() functie in MATLAB om interactief een polylijn over de RGB-afbeelding te tekenen. MATLAB maakt een Polyline-object met de hoekpunten van de lijn, dat kan worden verwerkt en bijgesneden tot een lengte van 800 μm.
  6. Creëer vanuit deze positie de proximale grens van de CTF door een lijnstuk te tekenen dat aansluit op de oppervlakkige peesrand die loodrecht staat op de lokale vezeloriëntatie.
  7. Ga terug naar het snijpunt van de diepe peesrand en de calcaneus en definieer de distale grens van de CTF door een lijnstuk te trekken dat aansluit op de oppervlakkige peesrand langs de duidelijke vloedlijn die de CTF scheidt van de aanhechtingszone fibrokraakbeen (AZF)16 (Figuur 3A,B). Genereer ten slotte de oppervlakkige grens van de CTF door de oppervlakkige peesrand te volgen om te omsluiten.
  8. Om ruimtelijke variaties in GAG-kleuring over de insertie te beschrijven, verdeelt u de totale CTF in 4 kwadranten (Figuur 3A,B). Verbind het middelpunt van de diepe en oppervlakkige CTF-grenzen met een lijnstuk om een distale/proximale grens te creëren. Ga door het middelpunt van deze grens en verbind de middelpunten van de distale en proximale CTF-grenzen langs de vezeloriëntatie om een oppervlakkige/diepe grens te creëren.
  9. Deze 6 grenzen bieden informatie die kan worden gebruikt om de ROI te definiëren die de volledige CTF vertegenwoordigt, maar ook 4 kwadranten die de CTF onderverdelen. In MATLAB compileer je bijvoorbeeld hoekpunten die de grenzen van elke individuele ROI (CTF, kwadranten 1-4) definiëren in vectoren en gebruik je images.roi.Polygon() om ingesloten Polygoon-objecten te genereren voor elke ROI.
  10. Als de ROI's zijn gedefinieerd, transformeert u RGB-pixelgegevens in de HSV-kleurruimte (Hue-Saturation-Value) met behulp van de kleurtransformatorplug-in in FIJI, de rgb2hsv()-functie in MATLAB of andere software die de juiste transformatievergelijkingen76 toepast. HSV-gegevens kunnen vervolgens worden geprojecteerd in de 2D-tintverzadigingsruimte, waar elke combinatie van tint en verzadiging een unieke kleur codeert (Figuur 3C).
  11. Bereken binnen elke ROI de gemiddelde tint en verzadiging die de gemiddelde vlekkleur in de ROI beschrijven. Dit kan bijvoorbeeld worden bereikt in MATLAB door de Polygoon-objecten te gebruiken die elke ROI definiëren om de afbeelding te maskeren met createMask() om pixelgegevens voor tintverzadiging specifiek binnen elke ROI te analyseren.
  12. Definieer nog een kleine ROI binnen het periostale fibrokraakbeen (PF)16 (Figuur 3A, B) en bereken de gemiddelde tint en verzadiging. Bereken vervolgens de Euclidische afstand die de gemiddelde kleur in elke ROI van de CTF scheidt van die van de PF (Figuur 3C).
    Equation 1
    OPMERKING: De Euclidische afstandsberekening beschrijft de mate van gelijkenis tussen de gemiddelde kleur van de ROI en die van de PF, een typisch fibrokraakbeenachtig weefsel 16,17,77. Een kleinere Euclidische afstand duidt op een ROI-kleur die er meer fibrokraakbeenachtig uitziet.
  13. Gebruik deze afstand om de fibrokraakbeenscore te berekenen, waarbij wordt uitgegaan van een maximale waarde van 1 als de ROI-kleur identiek is aan de PF-kleur en een minimumwaarde van -1 als de ROI- en PF-kleur de maximale scheiding bereiken binnen de kleurruimte voor kleurtoonverzadiging.
    Equation 2
  14. Gemiddelde gegevens voor tint, verzadiging en fibrokraakbeenscore binnen elke ROI over weefselsecties van elke ledemaat. Voer gepaarde statistische vergelijkingen uit tussen groepen contralaterale ledematen.

9. SHG-beeldvorming om verandering in de organisatie van collageennetwerken te onderzoeken

  1. Voer SHG-beeldvorming uit van de Toluïdine blauw gekleurde secties met behulp van een capabel microscoopsysteem met een 20x objectlens. Verwerf z-stacks door de sectiedikte en voer indien nodig tegelscans uit om de aanhechting van de achillespees volledig vast te leggen.
  2. Importeer SHG-beelden in een voorkeurssoftware voor beeldanalyse en definieer ROI's die de CTF bij de aanhechting van de achillespees omvatten en onderverdelen, zoals beschreven voor de Toluïdine-blauwbeeldanalyse in sectie 8 (Figuur 4A,B).
  3. Als SHG-afbeeldingen worden geïmporteerd in MATLAB, gebruikt u de methode voor het definiëren van CTF-ROI's in MATLAB zoals beschreven in sectie 8 . Nadat u ROI's hebt gedefinieerd, brengt u ROI-coördinaten over naar FIJI door ROI-punten uit MATLAB te exporteren als .txt-bestanden en te importeren in FIJI met behulp van File > Import > XY-coördinaten. Leg de selectie over elkaar heen en stuur deze naar de ROI-manager voor analyse.
  4. Om de collageenorganisatie te kwantificeren, gebruikt u de Directionality-plug-in in FIJI, die Fourier-spectrumanalyse uitvoert om verdelingen van vezeloriëntaties over kleine vensters te berekenen die een ROI overspannen. De spreiding van deze verdeling, ook wel dispersie genoemd, is omgekeerd evenredig met de uitlijning van vezels.
    OPMERKING: Collageenvezels kunnen variabele oriëntaties aannemen in verschillende vensters over de CTF als gevolg van grove kromming van de pees in plaats van de afwezigheid van uitlijning/organisatie. Om veranderingen in de collageenorganisatie beter te onderscheiden van de grove kromming van de pees bij de insertie, is het noodzakelijk om kleinere ROI's te definiëren.
  5. Importeer SHG-afbeeldingen in FIJI en stel de pixel-/lengteschaal in. Projecteer gegevens over de maximale pixelintensiteit in een samengestelde 2D-afbeelding en voeg ROI's toe aan de ROI Manager. Leg achtereenvolgens elke CTF-ROI op de afbeelding en teken 10 kleine sub-ROI's van consistente grootte binnen de ROI, waarbij de sub-ROI's worden toegevoegd aan de ROI-manager.
  6. Voer binnen elke sub-ROI de directionaliteitsplug-in in FIJI uit om de glasvezeldispersie te berekenen. Gemiddelde dispersiegegevens over sub-ROI's binnen elke CTF-ROI en gemiddelde dispersiegegevens binnen elke CTF-ROI over secties van elke explantatie. Voer gepaarde statistische vergelijkingen uit tussen groepen contralaterale ledematen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representatieve beelden van TUNEL-gekleurde weefselsecties tonen minimale apoptotische kernen in het lichaam van de achillespees na 7 dagen explantatiekweek in experimentele groepen (Figuur 2A). Kwantificering van deze beelden levert bewijs dat het weefselkweekprotocol gemiddeld tot 78% levensvatbaarheid behoudt in de achillespees na 7 dagen explantatiekweek onder belastingsomstandigheden (Figuur 2B).

Kwalitatief wordt een verbeterde Toluïdineblauwkleuring gewaardeerd na 7 dagen statische impingement in vergelijking met onbelaste controles (Figuur 3A,B), met name in diepe kwadranten grenzend aan de calcaneus waar we eerder de maximale transversale drukspanning 5,6 hebben gemeten. Kwantificering van deze Toluïdineblauw gekleurde weefselsecties duidt op een significante verandering in tint (Figuur 3D), verzadiging (Figuur 3E) en fibrokraakbeenscore (Figuur 3F) na 7 dagen statische impingement in vergelijking met contralaterale onbelaste explantaten. Deze veranderde GAG-kleuring vertegenwoordigt waarschijnlijk de vorming van fibrokraakbeen secundair aan statische impingement binnen dit model. Statistisch significante verschillen in verzadiging en fibrokraakbeenscore werden pas gedetecteerd in kwadrant 1 na 7 dagen basisspanning (Figuur 3E,F). Bovendien daalden de saturatie en de fibrokraakbeenscore ten opzichte van contralaterale onbelaste pezen, een tegenovergestelde trend in vergelijking met statisch impingement. Deze gegevens kunnen de hypothese ondersteunen dat trekbelasting de vorming van impingement-gedreven fibrokraakbeen kan verzwakken of omkeren en rechtvaardigt aanvullend onderzoek in de toekomst.

Kwantificering van SHG-beeldvorming suggereert een subtiele maar significante verandering in de oriëntatie van collageenvezels na 7 dagen statische impingement, opnieuw in het diepe en distale gebied grenzend aan de calcaneus, zoals aangegeven door significante verschillen in dispersie (Figuur 4C).

Figure 1
Figuur 1: Explantatieplatform en experimenteel ontwerp. (A) Fotografische en schematische weergave van het explantatieplatform. (Boven) Foto van een explantatie van de hele achterpoot van muizen die in het platform is geladen, met kritieke componenten gelabeld. (Onder) Schematische weergave van insertionele achillespeesimpingement opgewekt door passief toegepaste dorsaalflexie van de enkel in dit explantatiemodel. (B) Schema van de opzet van het onderzoek en de explantatiecultuur. Explantaten van de achterpoten worden voorbehandeld met 100 nM dexamethason gedurende 48 uur74. Van elke muis wordt vervolgens één explantatie van de achterpoot gekweekt in een schaal die gedurende 7 dagen wordt gelost, terwijl de contralaterale ledemaat in het experimentele platform wordt geladen om de achillespees gedurende 7 dagen onder basisspanning of statische impingement te plaatsen. Seriële weefselcoupes van contralaterale paren ledematen worden ofwel gekleurd met Toluïdineblauw om GAG-rijk weefsel te visualiseren of gebruikt voor TUNEL-kleuring. Toluïdineblauw gekleurde secties worden vervolgens gebruikt voor SHG-beeldvorming om de collageenorganisatie te beoordelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Levensvatbaarheid van de explantatie. (A) Representatieve beelden van TUNEL gekleurde secties van voorbehandelde (dag 0) explantaten (linksboven), onbelaste pezen (rechtsboven), pezen die op basisspanning worden gehouden (linksonder) en statisch geïmpacteerde pezen (rechtsonder). De achillespees is omlijnd in een witte stippellijn en gelabeld AT, terwijl de calcaneus is omlijnd in een ononderbroken gele lijn en gelabeld met C. Apoptotische kernen lijken rood (TUNEL), alle kernen lijken blauw (DAPI). (B) De kwantificering van de dode celfractie was gemiddeld minder dan 22% voor de groepen met onbelaste, basisspanning en statische impingement. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaarddeviatie. In deze datasets zijn uitschieters aanwezig met meer dan 50% celdood, wat kan worden toegeschreven aan peesschade veroorzaakt door een slechte dissectietechniek. De gemiddelde dode celfractie zonder statistische uitschieters is minder dan 15% voor alle groepen. Er werd geen statistisch significant verschil in celdood gevonden tussen onbelaste, baseline spanning en statische impingement groepen (p < 0,05). Dag 0 controle: n=8. Ongeladen: n=18. Basislijnspanning: n=8. Statisch impingement: n=12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Toluïdine blauwe histologie. (A) Representatieve Toluïdineblauwe vlek na 7 dagen onbelaste kweek met het compressieve peesfibrokraakbeen (CTF), het fibrokraakbeen van de aanhechtingszone (AZF) en het periostale fibrokraakbeen (PF) bij de achillespees16. Calcaneus gelabeld C. ROI die de CTF vastlegt, is rood omlijnd en is verder onderverdeeld in 4 kwadranten om aanvullende ruimtelijke informatie te bieden. (B) Representatieve Toluïdineblauwe kleuring na 7 dagen statische impingement, met verbeterde kleuring van de CTF, vooral in kwadrant 1 waar we eerder maximale transversale drukspanningen 5,6 hebben gemeten. (C) Schema van de kleurruimte voor kleurtonen die wordt gebruikt voor de analyse van kleurenafbeeldingen. Kleur wordt beschreven door een combinatie van tint (0°-360°) en verzadiging (0-255)76. De gemiddelde kleur in elke ROI wordt genormaliseerd naar de gemiddelde kleur van de PF door de Euclidische afstand te berekenen die de kleuren in elke ROI scheidt van de kleur in de PF, wat een genormaliseerde fibrokraakbeenscore oplevert. (D-F) Veranderingen in Toluïdine blauwe vlek na 7 dagen statische impingement (boven) en basislijnspanning (onder) in vergelijking met contralaterale onbelaste pezen. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaarddeviatie. (D) Kwantificering van tint geeft significante verschillen in gemiddelde tint in alle regio's na 7 dagen statische impingement in vergelijking met contralaterale onbelaste pezen. Er werd geen vergelijkbare trend gedetecteerd na 7 dagen basisspanning in vergelijking met contralaterale onbelaste pezen. (E) Kwantificering van verzadiging, met significante veranderingen in gemiddelde verzadiging over de gehele CTF en binnen kwadranten 1-3 na 7 dagen statische impingement in vergelijking met contralaterale onbelaste pezen. Omgekeerd werden significante verschillen pas gedetecteerd in kwadrant 1 na 7 dagen basislijnspanning, waar de verzadiging afnam in vergelijking met contralaterale onbelaste pezen. (F) Kwantificering van de fibrokraakbeenscore, met significante veranderingen in de fibrokraakbeenscore in alle regio's na 7 dagen statische impingement in vergelijking met contralaterale onbelaste pezen. Omgekeerd werden significante verschillen alleen gedetecteerd in kwadrant 1 na 7 dagen basislijnspanning, waar de fibrokraakbeenscore afnam in vergelijking met contralaterale onbelaste pezen. De gegevens suggereren een verhoogde GAG-kleuring veroorzaakt door statische impingement, wat wijst op verhoogde fibrokraakbeenvorming. Gegevens die de totale CTF beschrijven, werden vergeleken met behulp van Wilcoxon-matched-pairs ondertekende rangtests. Kwadrantgegevens werden vergeleken met behulp van herhaalde metingen in twee richtingen ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Šídák. *P < 0,05. **p < 0,01. p < 0,005. p < 0,001. Basislijnspanning vs. onbelast: n = 6 paren. Statisch impingement vs. onbelast: n = 8 paren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: SHG-beeldvorming. (A) Representatief SHG-beeld na 7 dagen onbelaste cultuur vergeleken met (B) 7 dagen statische impingement. CTF is rood omlijnd en verdeeld in 4 kwadranten zoals gelabeld, in overeenstemming met de ROI's in de Toluïdine-blauwe analyse hierboven. (C) Binnen elk kwadrant werd de Fourier-spectrumanalyse uitgevoerd in een bewegend subvenster met behulp van de Directionality-plug-in in FIJI. De spreiding van de verdeling van vezeloriëntaties binnen elk subvenster wordt dispersie (°) genoemd en is omgekeerd evenredig met vezeluitlijning. Dispersie = 0° staat voor een perfecte parallelle uitlijning van vezels. Toenemende dispersie vertegenwoordigt een afnemende uitlijning van collageenvezels. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaarddeviatie. Statistisch significante verschillen in dispersie werden gedetecteerd in kwadrant 1 na 7 dagen statische impingement in vergelijking met contralaterale onbelaste pezen, wat wijst op een verhoogde collageendesorganisatie. Kwadrantgegevens werden vergeleken met behulp van herhaalde metingen in twee richtingen ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Šídák. * p < 0,05. Statisch impingement versus onbelast: n = 5 paar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: CAD-bestanden. Deze CAD-bestanden, gecompileerd in meerdere bestandsindelingen, kunnen worden gebruikt om de platformbasis, het inzetstuk voor volumereductie en de clip in 3D te printen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: MATLAB-bestanden. De gecompileerde MATLAB-bestanden maken kwantificering mogelijk van de histologie van Toluïdineblauw, zoals beschreven in sectie 8 van het protocol om de vorming van fibrokraakbeen te beoordelen door ruimtelijke verandering in GAG-kleuring bij het inbrengen van de achillespees. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: Richtlijnen voor het implementeren van MATLAB-code. Dit document beschrijft een pijplijn voor het kwantificeren van veranderingen in GAG-kleuring bij de aanhechting van de achillespees via beeldanalyse van Toluïdineblauwe histologie met behulp van de verstrekte MATLAB-code. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Voorbeeldafbeelding van de toluïdineblauwe histologie. Deze RGB-kleurenafbeelding van Toluïdineblauwe histologie kan worden gebruikt om de verstrekte MATLAB-code uit te voeren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het experimentele explantatieplatform van de achterpoten van muizen in combinatie met het weefselkweekprotocol dat in deze studie wordt beschreven, biedt een geschikt model voor het bestuderen van de mechanobiologie van impingement-gedreven fibrokraakbeenvorming bij de insertie van de achillespees. Het nut van dit explantatiemodel wordt aangetoond door de representatieve resultaten, die wijzen op behoud van de levensvatbaarheid van de cellen gelijktijdig met een significante en ruimtelijk heterogene verandering in Toluïdine-blauwkleuring na 7 dagen statische impingement. Deze bevindingen suggereren een veranderd metabolisme van GAG-rijke matrixmoleculen secundair aan mechanische impingement, consistent met andere modellen en klinische studies 3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,44,49. Bovendien werden subtiele maar significante veranderingen gedetecteerd in de collageenorganisatie via SHG-beeldvorming na 7 dagen statische impingement, consistent met klinische kenmerken van impingement-geassocieerde tendinopathie en in vivo modellen van peesimpingement 28,37,38,43,44,49,64.

Eerdere pogingen om de biologische gevolgen van peesimpingement te onderzoeken, hebben eenvoudige compressie toegepast op geïsoleerde peescellen27,29. Zodra een mechanobiologisch mechanisme van belang is geïdentificeerd, bieden deze modellen superieure therapeutische screeningplatforms in vergelijking met ons explantatiemodel. De bevindingen van deze studies moeten echter met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd, aangezien geïsoleerde cellen die in vitro worden gekweekt, geen driedimensionale extracellulaire omgeving hebben die de mechanorespons beïnvloedt57,59. Bovendien vertonen cellen geïsoleerd uit andere collagene weefsels (bijv. kraakbeen) een veranderde mechanosensitieve ionkanaalactiviteit wanneer ze in vitro mechanisch worden uitgedaagd in afwezigheid van een extracellulaire omgeving78,79. Het gepresenteerde model pakt deze beperkingen aan door een platform te bieden om in situ peescellen in levensvatbare explantaten te onderwerpen aan fysiologisch relevante belastingsomstandigheden.

Explantatiemodellen zijn populaire experimentele systemen voor het onderzoeken van peesbiologie en fysiologie57,58. In de specifieke context van peesimpingement hebben verschillende eerdere studies gedeeltelijke en hele peesexplantaten gebruikt om de peescelrespons op kunstmatige uniaxiale compressie te onderzoeken 30,31,32,33,34,39. Hoewel deze studies een direct verband aantoonden tussen uniaxiale compressie en fibrokraakbeenvorming, is de in vivo mechanische belastingomgeving die wordt gegenereerd door peesimpingement multiaxiaal en afhankelijk van anatomische kenmerken van het geïmpacteerde gebied 5,6. De spanningsomgeving die ontstaat door botsing van de calcaneus op de achillespees tijdens dorsaalflexie van de enkel wordt bijvoorbeeld beïnvloed door de inbrenghoek, het aanhechtingsgebied en de aanwezigheid van omliggende zachte weefsels 60,61,62,63,80,81 . Ons explantatieplatform behoudt deze externe structuren en reproduceert de multiaxiale spanningsomgeving die wordt gegenereerd door impingement, terwijl de cellen in hun oorspronkelijke omgeving blijven6.

Diermodellen zijn van fundamenteel belang geweest bij het onderbouwen van een onmiddellijke relatie tussen mechanische impingement en de typische kenmerken van peesfibrokraakbeen en pathologie, die analoge fenotypes delen 1,25,28,37,64,65,66. In de afgelopen decennia heeft het grootste deel van het in vivo impingement-onderzoek knaagdiermodellen gebruikt om rotator cuff-aandoeningen te bestuderen door chirurgische verkleining van de subacromiale ruimte om de pezen van de rotator cuff kunstmatig te raken. Deze diermodellen zijn gebruikt om de cellulaire en moleculaire pathogenese van impingement tendinopathie in vivo te beschrijven en kunnen worden uitgebreid om nieuwe therapeutische strategieën te evalueren om de klinische vertaling van impingementonderzoek te bevorderen 36,37,38,66,82,83,84,85.

Gevestigde in vivo modellen van peesimpingement hebben echter een aantal belangrijke beperkingen bij het bestuderen van mechanobiologie57,58. Deze modellen introduceren of verwijderen chirurgisch een externe bron van peesimpingement en hervatten fysieke activiteit (vrije kooiactiviteit, geforceerde loopband, enz.) Deze benadering mist controle over de omvang, oriëntatie en frequentie van de kracht die rechtstreeks op de pees wordt uitgeoefend gedurende de duur van het experiment. Gezien de moeilijkheid om weefselspanning in vivo te meten, bieden deze modellen beperkte controle over, of karakterisering van, de mechanische omgeving die in de pees wordt gegenereerd als reactie op impingement. Deze beperking wordt algemeen erkend op het gebied van peesmechanobiologisch onderzoek 57,58,67,68,69,70. Elders zijn geavanceerde experimentele platforms ontworpen om gecontroleerde mechanische overbelasting (vermoeidheid) rechtstreeks op pezen in vivo onder anesthesie toe te passen 67,68,69. Deze modellen controleren de toepassing van mechanische stimuli gedurende korte perioden onder narcose en bieden geen controle over de laadgeschiedenis gedurende de rest van het experiment, aangezien de dieren de normale kooiactiviteit hervatten gedurende dagen tot weken na mechanische overbelasting. Het explantatiemodel dat in dit protocol wordt beschreven, biedt een gecontroleerd voorschrift van achillespeesimpingement om meetbare en goed beschreven patronen van weefselstam6 te genereren, waardoor rigoureuze studie van impingement-mechanobiologie mogelijk wordt. Er moet echter worden opgemerkt dat dit explantatiemodel de noodzaak van in vivo onderzoek naar peesimpingement niet overbodig maakt, maar eerder dient als een aanvullend hulpmiddel om gegevens te verrijken die zijn afgeleid van deze onmisbare diermodellen. Cellulaire en moleculaire routes gedefinieerd in relatie tot impingementmechanica met behulp van dit explantatiemodel kunnen in vivo worden gekarakteriseerd en geëvalueerd als therapeutische doelen met behulp van diermodellen in een complementaire benadering om de klinische vertaling van mechanobiologisch onderzoek te verbeteren. De kracht van deze geïntegreerde strategie wordt uitgebuit in andere gebieden van peesmechanobiologisch onderzoek 58,86,87,88, en dit explantatiemodel verleent zijn toepassing aan peesimpingement.

Het explantatiemodel is niet zonder beperkingen. Zoals met alle explantatiemodellen, kan mechanobiologie alleen over relatief korte tijdschalen worden bestudeerd terwijl het weefsel levensvatbaar blijft 57,89. Hoewel het model een krachtig hulpmiddel is voor het bestuderen van de onmiddellijke cellulaire respons op mechanische impingement, is het niet geschikt voor het bestuderen van chronische peesaandoeningen geassocieerd met impingement. Bovendien is het model niet in staat om rekening te houden met systemische respons en weefseloverspraak, aangezien de bloedtoevoer en neurale communicatie niet in stand worden gehouden. Niettemin biedt het model een platform om de intrinsieke respons van endogene peescellen op mechanische impingement af te bakenen. Een verdere beperking van het model is dat volgens eerder onderzoek 32,90,91,92, we verwachten dat veel grote GAG-rijke proteoglycanen uit de pees zullen diffunderen tijdens de voorbehandeling en vroege tijdstippen van explantatiecultuur, met name fragmenten van aggregerende proteoglycanen die niet verankerd zijn aan de grondmatrix. Daarom zullen veranderingen in GAG-kleuring secundair aan impingement in het model waarschijnlijk veranderingen weerspiegelen in nieuw gesynthetiseerde GAG-rijke macromoleculen die nog niet zijn gekataboliseerd en verankerd blijven in de extracellulaire matrix. Gezien het feit dat deze GAG-rijke proteoglycanen zich lokaliseren in de pericellulaire ruimte 22,30,93,94,95, kan het explantatiemodel het onderzoek naar PCM-remodellering secundair aan peesimpingement vergemakkelijken.

De dissectie van explantaten van de achterpoten van muizen die in dit protocol worden beschreven, vereist oefening, maar een bekwame techniek kan snel worden bereikt. Volledig onthandschoenen (d.w.z. huid verwijderen) kan een uitdaging zijn, vooral rond de vingers van de achterpoot. Hoewel de huid rond de tenen niet volledig hoeft te worden verwijderd, versterkt het wel de steriliteit tijdens de kweek, omdat er bacteriën op de huid en vacht aanwezig zijn.

Het moeilijkste aspect van de dissectie is het verwijderen van de plantarispees mediaal van de achillespees proximaal en het distaal passeren van oppervlakkig naar de achillespees. De plantaris-spierpeeseenheid overspant de knie- en enkelgewrichten in nauwe samenwerking met de triceps surae en achillespees 81,96,97,98,99. Mechanische belastingen die tijdens passieve dorsaalflexie van de enkel over het achterste aspect van de enkel worden overgedragen, worden verdeeld over de plantaris- en achillespezen, en het is bekend dat de plantarispees in vivo hoge spanning draagt 100,101. Bovendien is de anatomische variabiliteit in de menselijke plantaris goed beschreven 96,102,103 en hoewel deze variabiliteit minder voorkomt bij knaagdieren97, heeft het de neiging om de mechanische omgeving in de achillespees in situ te beïnvloeden. In overeenstemming met eerdere technieken die worden gebruikt om de rek in de achillespees in situ 6,104 te meten, moet de plantarispees worden verwijderd om de interne rekomgeving te beheersen die wordt gegenereerd door extern aangebrachte peesimpingement.

Zorgvuldige verwijdering van de plantaris is noodzakelijk om door dissectie geïnduceerde celdood in de achillespees te voorkomen, en de variabiliteit in celapoptose die aanwezig is in de gegevens (Figuur 2B) kan een weerspiegeling zijn van door dissectie veroorzaakte schade als gevolg van een slechte dissectietechniek. Het verwijderen van de plantarispees heeft baat bij een pincet met een fijne punt om de plantaris voorzichtig van de achillespees te scheiden en het plantaris-spier-peescomplex proximaal vrij te maken. Gekartelde pincetten helpen het proximale vrije uiteinde van de plantarispees vast te pakken om distaal te trekken, rond de calcaneus en in de richting van de vingers van de poot voor volledige verwijdering. Lee en Elliott geven een nuttige anatomische beschrijving van de plantaris en achillespezen van de rat en de bijbehorende musculatuur97.

Hoewel we vonden dat de dissectietechniek die in deze studie wordt beschreven voldoende is om steriliteit te garanderen, kan het protocol indien nodig worden aangepast of aangepast in omgevingen waar het handhaven van steriliteit een uitdaging blijkt te zijn. Chirurgische instrumenten kunnen worden geautoclaveerd, betadine-oplossing kan plaatselijk op de huid worden aangebracht en dissectie kan worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast. We hebben ontdekt dat een snelle en efficiënte tafeldissectie van cruciaal belang is en het mogelijk maakt om ontlede ledematen snel over te brengen naar steriele media in een biologische veiligheidskast nadat de steriele grens van de huid is doorbroken.

Een ander belangrijk doelwit voor het oplossen van verontreinigingen is de techniek die wordt gebruikt voor het steriliseren van platformcomponenten. In onze handen hebben we consistent succes gehad met eenvoudig weken in ≥ 10% bleekoplossing met voldoende spoeling in kraanwater zonder autoclaveren. Extra sterilisatie met 70% ethanol kan indien nodig worden toegepast, maar houd er rekening mee dat elk onderdeel dat 3D-geprint is met PLA niet compatibel is met EtOH en kromtrekt. Bovendien kunnen alle onderdelen van het platform, afgezien van het acrylbad en de 3D-geprinte PLA-componenten, worden geautoclaveerd en kunnen componenten gedrenkt in ≥ 10% bleekoplossing worden gespoeld met geautoclaveerd of gezuiverd water. Om roesten te voorkomen, wordt het aangemoedigd om alle metalen onderdelen onmiddellijk na elk experiment te wassen en met de hand te drogen.

De methodologie voor het kwantificeren van Toluïdine-blauwkleuring om de vorming van fibrokraakbeen te karakteriseren, zoals beschreven in dit protocol, maakt gebruik van een innovatieve aangepaste kleurenbeeldanalyse die een brede toepassing biedt op peesonderzoek. Aanzienlijke voordelen worden geboden door pixelgegevens van de RGB- naar de HSV-kleurruimte76 te converteren. Hier codeert tint een dominante golflengte als een karakteristieke kleur van 0°-360°, terwijl verzadiging de zuiverheid van elke tint van 0-255 definieert. Waarde daarentegen beschrijft de helderheid van kleur en als zodanig scheidt het HSV-kleurenschema helderheid (waarde) van kleur (tint, verzadiging). In de context van histologische analyses zijn HSV-pixelgegevens robuuster voor veranderingen in lichttransmissie tijdens microscopie en variaties in de dikte vanweefselsecties 76. Bovendien maakt het werken in de HSV-kleurruimte het mogelijk om specifieke golflengten van belang af te bakenen (via tint), afhankelijk van de histologische vlek76, bijv. tinten rond 240° voor Toluïdine-blauwe kleuring.

Een innovatief aspect van de Toluïdine-blauwbeeldanalyse die in deze studie wordt gepresenteerd, is de fibrokraakbeenscore, een metriek die verband houdt met de Euclidische afstand die de kleur van elke ROI scheidt van de kleur van het periostale fibrokraakbeen. Het periostale fibrokraakbeen komt onmiddellijk na de geboorte naar voren als secundair kraakbeen, terwijl het compressieve peesfibrokraakbeen postnataal afwezig is en, net als andere sesamachtige fibrokraakbeen, lijkt te worden gereguleerd door mechanische vraag in gebieden met verhoogde peescompressie 16,17,28,77. Door fibrokraakbeenscores tussen experimentele groepen te vergelijken, kunnen we niet alleen bepalen of de kleur van de Toluïdineblauwe vlek secundair verandert aan impingement, maar ook of deze verandering resulteert in een uiterlijk dat dichter bij fibrokraakbeen ligt. Deze analyse kan worden uitgebreid naar andere populaire GAG-kleuringen zoals Alcian-blauw en Safranine O, evenals andere regio's van peesfibrokraakbeen en fibrokraakbeenachtige peesentheses, zolang er een controleweefsel aanwezig is dat verwant is aan het periostale fibrokraakbeen. Veranderingen in GAG-kleuring in de pezen en ligamenten van de knie kunnen bijvoorbeeld via de fibrokraakbeenscore worden genormaliseerd naar kleuring in de fibrokraakbeenachtige menisci.

Een cruciaal aspect van dit protocol is het doorsnijden van seriële weefselsecties en het volgen van sectieniveau door de achillespees, wat herhaalbare paraffine-inbedding en nauwgezette identificatie van de toegang tot de achillespeesinsertie vereist voor het volgen van de sectiediepte. Dit sectie- en kleuringsprotocol vereist ongetwijfeld oefening en verfijning, maar kan worden uitgebreid tot cryosectie.

De histologische benadering die in dit manuscript wordt beschreven, kan gemakkelijk worden uitgebreid tot immunohistochemie of immunofluorescentie. In dit opzicht is een belangrijk aspect van het bovenstaande experimentele ontwerp de paarsgewijze vergelijking van contralaterale ledematen van elke muis. Hier worden alle statistische vergelijkingen gemaakt tussen weefselsecties op vergelijkbaar sectieniveau door de achillespees van contralaterale ledematen van dezelfde muis die aan verschillende experimentele groepen zijn toegewezen. Deze strategie helpt de biologische variabiliteit onder controle te houden. Bovendien worden op niveau afgestemde paren van contralaterale weefselsecties tegelijkertijd op hetzelfde objectglaasje gekleurd (histologie) of gelijktijdig op objectglaasje met behulp van identieke werkoplossingen voor alle reagentia, buffers en antilichaamoplossingen (immunokleuring) om te helpen controleren op vlek-tot-kleuringsvariabiliteit die inherent is aan histologie en immunolabeling, evenals anatomische heterogeniteit afhankelijk van sectieniveau, locatie en oriëntatie.

Verschillende andere wijzigingen in het protocol die in dit manuscript worden beschreven, kunnen worden geïmplementeerd voor verdere studie van aanvullende onderzoeksvragen. Hoewel de representatieve gegevens die hier worden verstrekt bijvoorbeeld gericht zijn op 7 dagen statische impingement, kan deze benadering worden aangepast om de biologische gevolgen van intermitterende of cyclische impingement te onderzoeken door het touwtje dat om de achterpoot is gewikkeld door de clip te koppelen aan een mechanische actuator zoals een spuitpomp. Daarnaast biedt het platform de mogelijkheid om moleculaire mechanismen van belang te ondervragen door de kweekmedia aan te vullen met kleine molecuulagonisten/antagonisten, of door gebruik te maken van explantaten van de achterpoten van transgene muizenstammen.

Concluderend hebben we een nieuw explantatiemodel van de achterpoten van muizen gepresenteerd voor het bestuderen van mechanobiologie die ten grondslag ligt aan achillespeesimpingement. Dit wordt bekrachtigd door een weefselkweekprotocol dat de levensvatbaarheid van de cellen gedurende 7 dagen onder belastingsomstandigheden handhaaft. Dit model recapituleert impingement-gedreven fibrokraakbeenvorming en collagene verandering zoals beschreven in andere modelsystemen en bij degeneratieve peesaandoeningen. Het experimentele platform maakt gecontroleerde toepassing en kwantificering van mechanische rekpatronen mogelijk en biedt daarom een uitstekend model voor rigoureuze studie van impingement-mechanobiologie. Dit model kan worden toegepast om moleculaire mechanismen te ondervragen die van belang zijn om potentiële therapeutische doelen te identificeren bij de behandeling van insertionele tendinopathieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs zijn dankbaar voor de steun en hulp van Jeff Fox en Vidya Venkatramani van de Histology, Biochemistry and Molecular Imaging (HBMI) Core van het University of Rochester Center for Musculoskeletal Research, gedeeltelijk gefinancierd door P30AR06965. Daarnaast willen de auteurs het Centrum voor Lichtmicroscopie en Nanoscopie (CALMN) van het University of Rochester Medical Center bedanken voor hulp bij multifotonenmicroscopie. Deze studie werd gefinancierd door R01 AR070765 en R01 AR070765-04S1, evenals 1R35GM147054 en 1R01AR082349.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox - Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cook, J. L., Purdam, C. Is compressive load a factor in the development of tendinopathy. Br J Sports Med. 46 (3), 163-168 (2012).
  2. Benjamin, M., Qin, S., Ralphs, J. R. Fibrocartilage associated with human tendons and their pulleys. J Anat. 187 (Pt 3), 625-633 (1995).
  3. Benjamin, M., Ralphs, J. R. Fibrocartilage in tendons and ligaments - an adaptation to compressive load. J Anat. 193 (4), 481-494 (1998).
  4. Benjamin, M., Theobald, P., Suzuki, D., Toumi, H. The anatomy of the Achilles tendon. The Achilles Tendon. 3, 5-16 (2007).
  5. Chimenti, R. L., et al. Insertional achilles tendinopathy associated with altered transverse compressive and axial tensile strain during ankle dorsiflexion. J Orthop Res. 35 (4), 910-915 (2017).
  6. Mora, K. E., et al. Ultrasound strain mapping of the mouse Achilles tendon during passive dorsiflexion. J Biomech. 132, 110920 (2022).
  7. Pringels, L., et al. Intratendinous pressure changes in the Achilles tendon during stretching and eccentric loading: Implications for Achilles tendinopathy. Scand J Med Sci Sports. 33 (5), 619-630 (2023).
  8. Koob, T. J., Vogel, K. G. Site-related variations in glycosaminoglycan content and swelling properties of bovine flexor tendon. J Orthop Res. 5 (3), 414-424 (1987).
  9. Vogel, K. G., Koob, T. J. Structural specialization in tendons under compression. Int Rev Cytol. 115, 267-293 (1989).
  10. Vogel, K. G., Ordög, A., Pogány, G., Oláh, J. Proteoglycans in the compressed region of human tibialis posterior tendon and in ligaments. J Orthop Res. 11 (1), 68-77 (1993).
  11. Vogel, K. G., Sandy, J. D., Pogány, G., Robbins, J. R. Aggrecan in bovine tendon. Matrix Biol. 14 (2), 171-179 (1994).
  12. Robbins, J. R., Vogel, K. G. Regional expression of mRNA for proteoglycans and collagen in tendon. Eur J Cell Biol. 64 (2), 264-270 (1994).
  13. Vogel, K. Repetitive motion disorders of the upper extremity. Gordon, S. I., Blair, S. J., Fine, L. J. , American Academy of Orthopedic Surgeons, Michigan. (1995).
  14. Benjamin, M., Tyers, R. N., Ralphs, J. R. Age-related changes in tendon fibrocartilage. J Anat. 179, 127-136 (1991).
  15. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: a structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anat Rec. 231 (2), 167-177 (1991).
  16. Rufai, A., Benjamin, M., Ralphs, J. R. Development and ageing of phenotypically distinct fibrocartilages associated with the rat Achilles tendon. Anat Embryol (Berl). 186 (6), 611-618 (1992).
  17. Rufai, A., Ralphs, J. R., Benjamin, M. Ultrastructure of fibrocartilages at the insertion of the rat Achilles tendon. J Anat. 189 (Pt 1), 185-191 (1996).
  18. Waggett, A. D., Ralphs, J. R., Kwan, A. P. L., Woodnutt, D., Benjamin, M. Characterization of collagens and proteoglycans at the insertion of the human achilles tendon. Matrix Biol. 16 (8), 457-470 (1998).
  19. Ralphs, J., et al. Regional differences in cell shape and gap junction expression in rat Achilles tendon: relation to fibrocartilage differentiation. J Anat. 193 (pt 2), 215-222 (1998).
  20. Milz, S., et al. Three-dimensional reconstructions of the Achilles tendon insertion in man. J Anat. 200 (Pt 2), 145-152 (2002).
  21. Tischer, T., Milz, S., Maier, M., Schieker, M., Benjamin, M. An immunohistochemical study of the rabbit suprapatella, a sesamoid fibrocartilage in the quadriceps tendon containing aggrecan. J Histochem Cytochem. 50 (7), 955-960 (2002).
  22. Esquisatto, M. A., Joazeiro, P. P., Pimentel, E. R., Gomes, L. The effect of age on the structure and composition of rat tendon fibrocartilage. Cell Biol Int. 31 (6), 570-577 (2007).
  23. Matuszewski, P. E., et al. Regional variation in human supraspinatus tendon proteoglycans: Decorin, biglycan, and aggrecan. Connect Tissue Res. 53 (5), 343-348 (2012).
  24. Buckley, M. R., Huffman, G. R., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. The location-specific role of proteoglycans in the flexor carpi ulnaris tendon. Connect Tissue Res. 54 (6), 367-373 (2013).
  25. Gillard, G. C., Reilly, H. C., Bell-Booth, P. G., Flint, M. H. The influence of mechanical forces on the glycosaminoglycan content of the rabbit flexor digitorum profundus tendon. Connect Tissue Res. 7 (1), 37-46 (1979).
  26. Giori, N. J., Beaupre, G. S., Carter, D. R. Cellular shape and pressure may mediate mechanical control of tissue composition in tendons. J Orthop Res. 11 (4), 581-591 (1993).
  27. Wren, T. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanobiology of tendon adaptation to compressive loading through fibrocartilaginous metaplasia. J Rehabil Res Dev. 37 (2), 135-143 (2000).
  28. Malaviya, P., et al. An in vivo model for load-modulated remodeling in the rabbit flexor tendon. J Orthop Res. 18 (1), 116-125 (2000).
  29. Shim, J. W., Elder, S. H. Influence of Cyclic Hydrostatic Pressure on Fibrocartilaginous Metaplasia of Achilles Tendon Fibroblasts. Biomech Model Mechanobiol. 5 (4), 247-252 (2006).
  30. Koob, T. J., Clark, P. E., Hernandez, D. J., Thurmond, F. A., Vogel, K. G. Compression loading in vitro regulates proteoglycan synthesis by tendon fibrocartilage. Arch Biochem Biophys. 298 (1), 303-312 (1992).
  31. Evanko, S. P., Vogel, K. G. Proteoglycan Synthesis in Fetal Tendon Is Differentially Regulated by Cyclic Compression in Vitro. Arch Biochem Biophys. 307 (1), 153-164 (1993).
  32. Vogel, K. G. The effect of compressive loading on proteoglycan turnover in cultured fetal tendon. Connect Tissue Res. 34 (3), 227-237 (1996).
  33. Thornton, G. M., et al. Changes in mechanical loading lead to tendon specific alterations in MMP and TIMP expression: influence of stress deprivation and intermittent cyclic hydrostatic compression on rat supraspinatus and Achilles tendons. Br J Sports Med. 44 (10), 698-703 (2010).
  34. Robbins, J. R., Evanko, S. P., Vogel, K. G. Mechanical Loading and TGF-β Regulate Proteoglycan Synthesis in Tendon. Arch Biochem Biophys. 342 (2), 203-211 (1997).
  35. Docking, S., Samiric, T., Scase, E., Purdam, C., Cook, J. Relationship between compressive loading and ECM changes in tendons. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (1), 7-11 (2013).
  36. Wang, X., et al. Aberrant TGF-β activation in bone tendon insertion induces enthesopathy-like disease. J Clin Invest. 128 (2), 846-860 (2018).
  37. Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. J Orthop Res. 36 (10), 2780-2788 (2018).
  38. Liu, Y., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: development and analysis of a novel rat model. J Shoulder Elbow Surg. 31 (9), 1898-1908 (2022).
  39. Majima, T., et al. Compressive compared with tensile loading of medial collateral ligament scar in vitro uniquely influences mRNA levels for aggrecan, collagen type II, and collagenase. J Orthop Res. 18 (4), 524-531 (2000).
  40. Hopkins, C., et al. Critical review on the socio-economic impact of tendinopathy. Asia Pac J Sports Med, Arthrosc, Rehabil Technol. 4, 9-20 (2016).
  41. Scott, A., Ashe, M. C. Common tendinopathies in the upper and lower extremities. Curr Sports Med Rep. 5 (5), 233-241 (2006).
  42. Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin Sports Med. 22 (4), 675-692 (2003).
  43. Bah, I., et al. Tensile mechanical changes in the Achilles tendon due to Insertional Achilles tendinopathy. J Mech Behav Biomed Mater. 112, 104031 (2020).
  44. Chondral Metaplasia in Calcific Insertional Tendinopathy of the Achilles Tendon. Clin J Sport Med. Maffulli, N., Reaper, J., Ewen, S. W. B., Waterston, S. W., Barrass, V. 16 (4), 329-334 (2006).
  45. Corps, A. N., et al. Increased expression of aggrecan and biglycan mRNA in Achilles tendinopathy. Rheumatology (Oxford). 45 (3), 291-294 (2006).
  46. Scott, A., et al. Increased versican content is associated with tendinosis pathology in the patellar tendon of athletes with jumper's knee. Scand J Med Sci Sports. 18 (4), 427-435 (2008).
  47. Attia, M., et al. Greater glycosaminoglycan content in human patellar tendon biopsies is associated with more pain and a lower VISA score. Br J Sports Med. 48 (6), 469-475 (2014).
  48. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative Incidence of Achilles Tendon Rupture and Tendinopathy in Male Former Elite Athletes. Clin J Sport Med. 15 (3), 133-135 (2005).
  49. Corps, A. N., et al. Changes in matrix protein biochemistry and the expression of mRNA encoding matrix proteins and metalloproteinases in posterior tibialis tendinopathy. Ann Rheum Dis. 71 (5), 746-752 (2012).
  50. Neer, C. S. 2nd Anterior acromioplasty for the chronic impingement syndrome in the shoulder: a preliminary report. J Bone Joint Surg Am. 54 (1), 41-50 (1972).
  51. Bigliani, L. U., Ticker, J. B., Flatow, E. L., Soslowsky, L. J., Mow, V. C. The relationship of acromial architecture to rotator cuff disease. Clin Sports Med. 10 (4), 823-838 (1991).
  52. Chimenti, R. L., Cychosz, C. C., Hall, M. M., Phisitkul, P. Current Concepts Review Update Insertional Achilles Tendinopathy. Foot Ankle Int. 38 (10), 1160-1169 (2017).
  53. Nicholson, C. W., Berlet, G. C., Lee, T. H. Prediction of the Success of Nonoperative Treatment of Insertional Achilles Tendinosis Based on MRI. Foot Ankle Int. 28 (4), 472-477 (2007).
  54. Lohrer, H., David, S., Nauck, T. Surgical treatment for achilles tendinopathy - a systematic review. BMC musculoskelet disord. 17 (1), 207 (2016).
  55. McGarvey, W. C., Palumbo, R. C., Baxter, D. E., Leibman, B. D. Insertional Achilles Tendinosis: Surgical Treatment Through a Central Tendon Splitting Approach. Foot Ankle Int. 23 (1), 19-25 (2002).
  56. Maffulli, N., et al. Surgery for chronic Achilles tendinopathy produces worse results in women. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1714-1720 (1714).
  57. Wunderli, S. L., Blache, U., Snedeker, J. G. Tendon explant models for physiologically relevant in vitro study of tissue biology - a perspective. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 262-277 (2020).
  58. Dyment, N. A., et al. A brief history of tendon and ligament bioreactors: Impact and future prospects. J Orthop Res. 38 (11), 2318-2330 (2020).
  59. Screen, H. R. C., Berk, D. E., Kadler, K. E., Ramirez, F., Young, M. F. Tendon Functional Extracellular Matrix. J Orthop Res. 33 (6), 793-799 (2015).
  60. Theobald, P., et al. The functional anatomy of Kager's fat pad in relation to retrocalcaneal problems and other hindfoot disorders. J Anat. 208 (1), 91-97 (2006).
  61. Ghazzawi, A., Theobald, P., Pugh, N., Byrne, C., Nokes, L. Quantifying the motion of Kager's fat pad. J Orthop Res. 27 (11), 1457-1460 (2009).
  62. Malagelada, F., et al. Pressure changes in the Kager fat pad at the extremes of ankle motion suggest a potential role in Achilles tendinopathy. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 28 (1), 148-154 (2020).
  63. Shaw, H. M., Benjamin, M. Structure-function relationships of entheses in relation to mechanical load and exercise. Scand J Med Sci Sports. 17 (4), 303-315 (2007).
  64. Soslowsky, L. J., et al. Rotator cuff tendinosis in an animal model: role of extrinsic and overuse factors. Ann Biomed Eng. 30 (8), 1057-1063 (2002).
  65. Schneeberger, A. G., Nyffeler, R. W., Gerber, C. Structural changes of the rotator cuff caused by experimental subacromial impingement in the rat. J Shoulder Elbow Surg. 7 (4), 375-380 (1998).
  66. Croen, B. J., et al. Chronic subacromial impingement leads to supraspinatus muscle functional and morphological changes: Evaluation in a murine model. J Orthop Res. 39 (10), 2243-2251 (2021).
  67. Andarawis-Puri, N., Flatow, E. L. Tendon fatigue in response to mechanical loading. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 106-114 (2011).
  68. Gains, C. C., Giannapoulos, A., Zamboulis, D. E., Lopez-Tremoleda, J., Screen, H. R. C. Development and application of a novel in vivo overload model of the Achilles tendon in rat. J Biomech. 151, 111546 (2023).
  69. Williamson, P. M., et al. A passive ankle dorsiflexion testing system to assess mechanobiological and structural response to cyclic loading in rat Achilles tendon. J Biomech. 156, 111664 (2023).
  70. Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A Novel, Open-Source, Low-Cost Bioreactor for Load-Controlled Cyclic Loading of Tendon Explants. J Biomech Eng. 144 (8), 084505 (2022).
  71. Orishimo, K. F., et al. Effect of Knee Flexion Angle on Achilles Tendon Force and Ankle Joint Plantarflexion Moment During Passive Dorsiflexion. J Foot Ankle Surg. 47 (1), 34-39 (2008).
  72. Liu, C. L., et al. Influence of different knee and ankle ranges of motion on the elasticity of triceps surae muscles, Achilles tendon, and plantar fascia. Sci Rep. 10 (1), 6643 (2020).
  73. Cruz-Montecinos, C., et al. Soleus muscle and Achilles tendon compressive stiffness is related to knee and ankle positioning. J Electromyogr Kinesiol. 66, 102698 (2022).
  74. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Lose-dose administration of dexamethasone is beneficial in preventing secondary tendon damage in a stress-deprived joint injury explant model. J Orthop Res. 38 (1), 139-149 (2020).
  75. Wunderli, S. L., et al. Tendon response to matrix unloading is determined by the patho-physiological niche. Matrix Biol. 89, 11-26 (2020).
  76. Yabusaki, K., et al. A Novel Quantitative Approach for Eliminating Sample-To-Sample Variation Using a Hue Saturation Value Analysis Program. PloS one. 9 (3), e89627 (2014).
  77. Gao, J., Messner, K., Ralphs, J. R., Benjamin, M. An immunohistochemical study of enthesis development in the medial collateral ligament of the rat knee joint. Anat Embryol. 194 (4), 399-406 (1996).
  78. Han, S. K., Wouters, W. A. J., Clark, A., Herzog, W. Mechanically induced calcium signaling in chondrocytes in situ. J Orthop Res. 30 (3), 475-481 (2012).
  79. Han, W., et al. Impact of cellular microenvironment and mechanical perturbation on calcium signalling in meniscus fibrochondrocytes. Eur Cell Mater. 27, 321-331 (2014).
  80. Rossetti, L., et al. The microstructure and micromechanics of the tendon-bone insertion. Nat Mater. 16 (6), 664-670 (2017).
  81. Sartori, J., Köhring, S., Witte, H., Fischer, M. S., Löffler, M. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
  82. Eliasberg, C. D., et al. Identification of Inflammatory Mediators in Tendinopathy Using a Murine Subacromial Impingement Model. J Orthop Res. 37 (12), 2575-2582 (2019).
  83. Zhang, Y., et al. Expression of alarmins in a murine rotator cuff tendinopathy model. J Orthop Res. 38 (11), 2513-2520 (2020).
  84. Zhang, X., et al. Assessment of Mitochondrial Dysfunction in a Murine Model of Supraspinatus Tendinopathy. J Bone Joint Surg. Am. 103 (2), 174-183 (2021).
  85. Liu, Y., et al. The role of Indian Hedgehog Signaling in tendon response to subacromial impingement: evaluation using a mouse model. Am J Sports Med. 50 (2), 362-370 (2022).
  86. Wang, T., et al. Load-induced regulation of tendon homeostasis by SPARC, a genetic predisposition factor for tendon and ligament injuries. Sci Transl Med. 13 (582), eabe5738 (2021).
  87. Passini, F. S., et al. Shear-stress sensing by PIEZO1 regulates tendon stiffness in rodents and influences jumping performance in humans. Nat Biomed Eng. 5 (12), 1457-1471 (2021).
  88. Jones, D. L., et al. Mechanoepigenetic regulation of extracellular matrix homeostasis via Yap and Taz. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (22), e2211947120 (2023).
  89. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Release of pro-inflammatory cytokines from muscle and bone causes tenocyte death in a novel rotator cuff in vitro explant culture model. Connect Tissue Res. 59 (5), 423-436 (2018).
  90. Rees, S. G., et al. Catabolism of aggrecan, decorin and biglycan in tendon. Biochem J. 350 (Pt 1), 181-188 (2000).
  91. Samiric, T., Ilic, M. Z., Handley, C. J. Large aggregating and small leucine-rich proteoglycans are degraded by different pathways and at different rates in tendon. Eur J Biochem. 271 (17), 3612-3620 (2004).
  92. Rees, S. G., Curtis, C. L., Dent, C. M., Caterson, B. Catabolism of aggrecan proteoglycan aggregate components in short-term explant cultures of tendon. Matrix Biol. 24 (3), 219-231 (2005).
  93. Taye, N., Karoulias, S. Z., Hubmacher, D. The "other" 15-40%: The Role of Non-Collagenous Extracellular Matrix Proteins and Minor Collagens in Tendon. J Orthop Res. 38 (1), 23-35 (2020).
  94. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L. The development of the pressure-bearing tendon of the bullfrog, Rana catesbeiana. Anat Embryol. 200 (1), 55-64 (1999).
  95. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L., Covizi, D. Z., Della Colleta, H. H., Gomes, L. Structure and proteoglycan composition of specialized regions of the elastic tendon of the chicken wing. Cell Tissue Res. 300 (3), 435-446 (2000).
  96. van Sterkenburg, M. N., Kerkhoffs, G. M., Kleipool, R. P., Niek van Dijk, C. The plantaris tendon and a potential role in mid-portion Achilles tendinopathy: an observational anatomical study. J Anat. 218 (3), 336-341 (2011).
  97. Lee, A. H., Elliott, D. M. Comparative multi-scale hierarchical structure of the tail, plantaris, and Achilles tendons in the rat. J Anat. 234 (2), 252-262 (2019).
  98. Lee, A. H., Elliott, D. M. Multi-Scale Loading and Damage Mechanisms of Plantaris and Rat Tail Tendons. J Orthop Res. 37 (8), 1827-1837 (2019).
  99. Fan, H. M., Shrestha, L., Guo, Y., Tao, H. R., Sun, Y. L. The twisted structure of the rat Achilles tendon. J Anat. 239 (5), 1134-1140 (2021).
  100. Cutlip, R. G., Stauber, W. T., Willison, R. H., McIntosh, T. A., Means, K. H. Dynamometer for rat plantar flexor muscles in vivo. Med Biol Eng Comput. 35 (5), 540-543 (1997).
  101. Rijkelijkhuizen, J. M., Baan, G. C., de Haan, A., de Ruiter, C. J., Huijing, P. A. Extramuscular myofascial force transmission for in situ rat medial gastrocnemius and plantaris muscles in progressive stages of dissection. J Exp Biol. 208 (Pt 1), 129-140 (2005).
  102. Saxena, A., Bareither, D. Magnetic Resonance and Cadaveric Findings of the Incidence of Plantaris Tendon. Foot Ankle Int. 21 (7), 570-572 (2000).
  103. dos Santos, M. A., Bertelli, J. A., Kechele, P. R., Duarte, H. Anatomical study of the plantaris tendon: reliability as a tendo-osseous graft. Surg Radiol Anat. 31 (1), 59-61 (2009).
  104. Sartori, J., Köhring, S., Bruns, S., Moosmann, J., Hammel, J. U. Gaining Insight into the Deformation of Achilles Tendon Entheses in Mice. Adv Eng Mater. 23 (11), 2100085 (2021).

Tags

Bio-ingenieurswetenschappen nummer 202
Muizen achterpoot explantatiemodel voor het bestuderen van de mechanobiologie van achillespees impingement
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W.,… More

Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W., Buckley, M. R. Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement. J. Vis. Exp. (202), e65801, doi:10.3791/65801 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter