Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Murine Hind Limb Explant modell for å studere mekanobiologi av akillesseneimpingement

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65801
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

Summary

Vi presenterer en tilpasset eksperimentell plattform og vevskulturprotokoll som gjenskaper fibrokartilaginøs forandring drevet av impingement av akillesseninnsettingen i murine bakre lemmereksplanter med vedvarende cellelevedyktighet, og gir en modell som er egnet for å utforske mekanobiologien til senepåvirkning.

Abstract

Seneimpingement på bein genererer et multiaksialt mekanisk belastningsmiljø med markert forhøyet tverrgående kompresjonsstamme, som fremkaller en lokalisert fibrobruskfenotype karakterisert ved akkumulering av glykosaminoglykan (GAG) -rik matrise og remodellering av kollagennettverket. Mens fibrobrusk er en normal funksjon i impinged områder av sunne sener, er overflødig GAG-avsetning og uorganisering av kollagennettverket kjennetegn ved tendinopati. Følgelig er impingement klinisk anerkjent som en viktig ekstrinsisk faktor i initiering og progresjon av tendinopati. Likevel er den mekanobiologiske underliggende seneimpingement fortsatt understudert. Tidligere forsøk på å belyse cellulær respons på seneimpingement har anvendt uniaxial kompresjon på celler og utskårne seneplanter in vitro. Imidlertid mangler isolerte celler et tredimensjonalt ekstracellulært miljø som er avgjørende for mekanorespons, og både in vitro og utskårne eksplantstudier klarer ikke å rekapitulere det multiaksiale belastningsmiljøet generert av seneimpingement in vivo, som avhenger av anatomiske trekk i det impingede området. Videre mangler in vivo-modeller av seneimpingement kontroll over det mekaniske belastningsmiljøet. For å overvinne disse begrensningene presenterer vi en ny murine hind limb explant-modell egnet for å studere mekanobiologien til akillessenimpingement. Denne modellen opprettholder akillessenen in situ for å bevare lokal anatomi og reproduserer det multiaksiale belastningsmiljøet som genereres ved impingement av akillessenens innsetting på calcaneus under passivt påført ankeldorsifleksjon mens de beholder celler i sitt opprinnelige miljø. Vi beskriver en vevskulturprotokoll integrert i denne modellen og presenterer data som etablerer vedvarende eksplanteringsdyktighet over 7 dager. De representative resultatene viser forbedret histologisk GAG-farging og redusert kollagenfiberjustering sekundært til impingement, noe som tyder på forhøyet fibrobruskdannelse. Denne modellen kan enkelt tilpasses for å undersøke forskjellige mekaniske belastningsregimer og muliggjør manipulering av molekylære veier av interesse for å identifisere mekanismer som medierer fenotypisk endring i akillessenen som respons på impingement.

Introduction

En rekke sener, inkludert akillessenen og senene i rotatormansjetten, opplever benete impingement på grunn av normal anatomisk posisjonering1,2,3,4. Seneimpingement genererer trykkbelastning rettet på tvers av den langsgående fiberaksen5,6,7. Regioner med senepåvirkning demonstrerer en unik fibrobruskfenotype der krympede, runde celler (fibrokondrocytter) er innebygd i et uorganisert kollagennettverk med markert økt glykosaminoglykan (GAG) innhold2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Tidligere studier tyder på at det uensartede mekaniske miljøet produsert av seneimpingement opprettholder denne GAG-rike matrisen ved å drive avsetningen av store aggregerende proteoglykaner, spesielt aggrekanske, selv om de underliggende mekanismene er uklare1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Mens fibrokartilje er en normal funksjon i impinged områder av sunne sener, avvikende proteoglykan metabolisme assosiert med overdreven fibrocartilage formasjon er et kjennetegn trekk ved tendinopati, en vanlig og svekkende sykdom som uforholdsmessig oppstår i kronisk impinged sener1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Følgelig er seneimpingement klinisk anerkjent som en viktig ytre faktor som driver flere av de vanligste tendinopatiene, inkludert rotatormansjettsykdom og innsettingsakillestendinopati (IAT)50,51,52. For tiden er behandling av tendinopati ineffektiv. For eksempel trenger ca. 47 % av pasientene med IAT kirurgisk inngrep etter mislykket konservativ behandling, med varierende postoperative utfall53,54,55,56. Til tross for den tilsynelatende sammenhengen mellom impingement og tendinopati, er de mekanobiologiske mekanismene som celler i impinged senesans og reagerer på deres mekaniske miljø dårlig beskrevet, noe som tilslører forståelsen av tendinopati patogenese og resulterer i utilstrekkelig behandling.

Explant-modeller er nyttige verktøy i studiet av senemekanobiologi57,58. Som et første skritt mot å forstå mekanobiologien til seneimpingement, har flere tidligere studier utforsket cellulær respons etter påføring av enkel uniaxial kompresjon til celler eller utskårne seneplanter 27,29,30,31,32,33,34,39. Imidlertid mangler celler in vitro ekstracellulære og pericellulære matriser som letter belastningsoverføring, sekvestrerer viktige vekstfaktorer og cytokiner frigjort ved mekanisk deformasjon, og gir substrat for fokaladhesjonskomplekser som spiller en rolle i mekanotransduksjon57,59. I tillegg klarer både in vitro og utskårne eksplantstudier ikke å rekapitulere det multiaksiale mekaniske belastningsmiljøet generert av seneimpingement in vivo, som avhenger av anatomiske trekk i den impinged region 5,6. I sammenheng med den impinged akillessenen innsetting, inkluderer dette omkringliggende vev som retrocalcaneal bursa og Kager's fett pad 60,61,62,63. Omvendt tillater in vivo-modeller av seneimpingement 25,28,36,37,38,64,65,66 minimal kontroll over størrelsen og frekvensen av belastningen som påføres direkte på senen, noe som er en velkjent begrensning av in vivo-modeller for å studere senemekanobiologi 57,58,67,68,69,70. Gitt utfordringer med å måle senebelastning in vivo, er det indre belastningsmiljøet som genereres i disse modellene ofte dårlig karakterisert.

I dette manuskriptet presenterer vi en tilpasset eksperimentell plattform som gjenskaper impingement av akillessenens innsetting på calcaneus i hele murine baklem eksplanter som, når de er parret med denne vevskulturprotokollen, opprettholder levedyktighet over 7 dager i eksplantkultur og muliggjør studier av de biologiske følgene av senepåvirkning. Plattformen er bygget på en 3D-printet polylaktinsyre (PLA) base som gir grunnlaget for festing av grepene og 3D-trykt PLA volumreduksjonsinnsats. Grepene brukes til å klemme overbenet og kneet proksimalt til akillesens myotendinøse overgang med det kaudale aspektet av bakbenet vendt oppover, slik at akillessenen kan avbildes ovenfra ved hjelp av ultralydsonde eller invertert mikroskop (figur 1A). Volumreduksjonen setter inn lysbilder langs et spor på basen og reduserer det nødvendige volumet av vevskulturmedier. En flettet linje viklet rundt bakpoten rutes ut av plattformen ved hjelp av basisdesignet og et 3D-trykt PLA-klipp. Ved å trekke i strengen dorsibøyes bakpoten, og akillesseninnføringen støtes mot calcaneus, noe som resulterer i forhøyet tverrgående trykkbelastning 5,6 (figur 1A). Plattformen er inneholdt i et akrylbad som opprettholder bakbenets eksplanter nedsenket i vevskulturmedier. Sikring av den stramme strengen på utsiden av badekaret med tape opprettholder ankeldorsifleksjon for å produsere statisk impingement av akillesseninnsettingen. CAD-filer for 3D-printede komponenter leveres i flere formater (tilleggsfil 1), slik at de kan importeres til en rekke kommersielle og gratis CAD-programvare med åpen kildekode for modifisering for å dekke eksperimentelle behov. Hvis tilgang til 3D-skrivere ikke er tilgjengelig for fabrikasjon, kan CAD-filer leveres til online 3D-utskriftstjenester som vil skrive ut og sende delene til lave kostnader.

Det er viktig å merke seg at triceps surae-Achilles muskulotendinøse kompleks spenner over både kne- og ankelleddene 71,72,73. Følgelig påvirkes strekkbelastningen i akillessenen av knefleksjon. Kneforlengelse setter akillessenen under spenning, mens knefleksjon reduserer spenningen. Ved først å forlenge kneet og deretter passivt dorsibøye ankelen, kan kompresjonsbelastninger ved den hindrede innføringen legges over strekkbelastninger. Omvendt, ved passiv dorsiflexing ankelen med kneet bøyd, reduseres strekkbelastningen, og trykkbelastning forblir. Den nåværende protokollen utforsker tre slike forhold. 1) For statisk impingement dorsiflexes foten til < 110° i forhold til tibia for å hindre innføringen, med kneet bøyd for å redusere spenningen. 2) For baseline spenningsgruppen forlenges ankelen over 145° av dorsifleksjon med kneet forlenget, noe som hovedsakelig genererer strekkbelastning ved innføringen. 3) For den lossede gruppen dyrkes eksplanter i en petriskål med kne og ankel i nøytrale stillinger i fravær av eksternt påført belastning. Vinklene nevnt ovenfor er fotografisk målt i forhold til et koordinatsystem der foten og tibia er parallelle i en vinkel på 180° og vinkelrett i en vinkel på 90°.

Viktige trinn i protokollen inkluderer 1) disseksjon av bakre lemmer explants og forsiktig fjerning av huden og plantaris senen; 2) eksplantekultur etter en 48 timers deksametason forbehandling; 3) vevsseksjonering og histologisk farging; og 4) fargebildeanalyse for å vurdere fibrobruskdannelse. Etter disseksjon forbehandles hver bakkroppseksplantasjon i 48 timer i dyrkningsmedier supplert med deksametason74. Kontralaterale lemmer fra hver mus er tildelt separate eksperimentelle grupper for parvis sammenligning, noe som bidrar til å kontrollere biologisk variabilitet. Etter forbehandling plasseres eksplantene i plattformer som beskrevet ovenfor og dyrkes i ytterligere 7 dager (figur 1B). Ytterligere sammenligninger gjøres med en forbehandlet (dag 0) gruppe der eksplanter fjernes umiddelbart etter 48 timers forbehandling.

Etter eksplantkultur blir bakre lemmer trimmet ned, formalin fast, avkalket og innebygd i paraffin. Seriesnitt i sagittal orientering gir visualisering av akillessenen fra det myotendinøse overgangen til kalkinnføringen, samtidig som snittdybden kan spores gjennom hele senen. Terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT)-mediert dUTP X-nick-merking (TUNEL) brukes til å visualisere DNA-skade sekundært til apoptose og vurdere levedyktighet. Toluidinblå histologi og tilpasset fargebildeanalyse utføres for å kvantifisere endringer i GAG-farging. Toluidinblåfargede vevsseksjoner brukes deretter til SHG-avbildning for å karakterisere endringer i collagefiberorganisasjon (figur 1B).

De oppgitte representative resultatene antyder endret histologisk farging av den GAG-rike matrisen og desorganisering av det ekstracellulære kollagennettverket generert av 7 dager med statisk impingement i modellen. Denne modellen kan brukes til å utforske molekylære mekanismer som ligger til grunn for impingement-drevet fibrocartilaginous forandring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt dyrearbeid ble godkjent av University of Rochester Committee on Animal Resources.

1. Fremstilling av vevskulturmedier

  1. Dyrkning alle eksplanterer i Dulbeccos modifiserte ørnemedium (1x DMEM) med 1% v/v penicillin-streptomycin og 200 μM L-askorbinsyre i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2. For de første 48 timers forbehandlingen dyrket hver plante i 70 ml kulturmedier supplert med 100 nM deksametason74. Etter forbehandling, kultur lemmer i 7 dager uten dexametason, skiftende media hver 48-72 h.
    MERK: Tilsetning av serum, som føtalt bovint serum, til kulturmediet anbefales ikke i samsvar med anbefalinger fra Wunderli, Blache og Snedeker57. Kort sagt, serumfrie forhold representerer bedre det raske, næringsfattige senemikromiljøet som finnes in vivo. Videre kan serumtilskudd fremme vevsnedbrytning under visse kulturbetingelser75 og stimulere celleproliferasjon og migrasjon ut av vev, begge trekk ved senepatologi57.
  2. For den lossede gruppen, dyrk hver eksplant i 70 ml medier. For gruppene baseline tension og statisk impingement krever hver plattform ca. 125 ml kulturmedier for å holde lemmen nedsenket. Dette volumet kan variere avhengig av plasseringen av det øvre benet i grepene og 3D-utskriftsparametrene, først og fremst fylltettheten.

2. Explant disseksjon og deksametason forbehandling

  1. Avlive mus via CO2 -innånding og sekundær cervikal dislokasjon, eller i henhold til institusjonelle retningslinjer. Denne protokollen bruker C57BL/6 mus som er mindre enn 1 år gamle. Bakbensstørrelsen vil øke med alderen og kan bli utfordrende å passe inn i grepene.
  2. Før disseksjon skal 70 ml forvarmede (37 °C) dyrkningsmedier overføres til en petriskål på 100 mm (diameter) x 25 mm (høyde) i et sterilt biologisk sikkerhetsskap (BSC). Legg til deksametason for å oppnå 100 nM arbeidskonsentrasjon.
  3. Disseksjoner kan utføres på benken ved hjelp av absorberende underlag, og arbeider raskt gjennom disseksjonen før overføring av bakre lemmereksplanter til BSC. Monter de kirurgiske verktøyene som kreves for denne disseksjonen, som inkluderer glatte, rette, fine spisstang; rett, fin spisstang med takkede tenner; og rett, skarp, fin saks.
  4. For disseksjon av bakre lemmer, plasser musen i en liggende stilling og identifiser hofteleddet. Bruk fin saks til å lage et lite (5-10 mm) snitt gjennom huden som ligger over det proksimale og fremre (kraniale) aspektet av overbenet.
  5. Trekk snittet fra hverandre for å ekspandere, klem det eksponerte overbenet med fingrene, og trekk huden forsiktig distalt for å avfette bakbenet til ankelnivået. Sett forsiktig ett sakseblad under huden langs det dorsale aspektet av foten og gjør et snitt som strekker seg til tærne. Fortsett å trekke huden distalt for å fjerne den helt.
  6. Plasser musen for å visualisere akillessenen innsetting på bakre (caudal) aspekt av calcaneus, nær ankelen. Proksimalt for akillessenen ligger plantarissenen rett ved siden av den mediale grensen til akillessenen og strekker seg distalt mot plantaraspektet av foten, og passerer over det bakre aspektet av calcaneus.
  7. For å fjerne plantarissenen, sett forsiktig inn en spiss av de glatte, fine spisstangene mellom de to senene og forleng spissen medialt som passerer under plantarissenen. Tegn spissen nærmest og rive gjennom plantarismuskelen. Bruk fin spiss, taggete tang, ta tak i den frittliggende proksimale enden av plantarissenen og trekk distalt for å fjerne.
  8. Ved hofteleddet, bruk fin saks for å kutte gjennom bekkenet og isolere bakbenet. Bruk saksen til å lirke av det gjenværende bekkenet og blottlegge lårhodet.
  9. Overfør bakbenet explant til BSC og inn i parabolen som inneholder cellekulturmedier med dexametason. Flytt parabolen inn i inkubatoren og forbehandle i 48 timer.

3. Ekspeder kultur og lasteplattformer

  1. Når 48 timers forbehandling avsluttes, må du forvarme tilstrekkelige mengder kulturmedier (avsnitt 1). Fra dette tidspunktet vil ingen deksametason bli lagt til kulturmedier. På dette tidspunktet kan lemmer fra gruppen forbehandlet (dag 0) fikseres, avkalkes og legges inn i parafin for fremtidig seksjonering, farging og analyse.
  2. For den lossede gruppen, aspirer forbehandlingsmedier og overfører eksplanter til friske petriskåler, tilsett 70 ml kulturmedier hver, og gå tilbake til inkubatoren.
  3. For baseline spennings- og statisk impingementgrupper, klargjør explant-plattformer. Klipp biter av sandpapir i samme størrelse som gripeplaterne. For den statiske impingementgruppen, kutt stykker av flettet linje omtrent 18 tommer i lengde og forhåndsbind en løs overhåndsknute halvveis langs lengden av linjen. Riv biter av aluminiumsfolie for å dekke hvert akrylbad og spray med 70% etanol (EtOH). Overføringspreparater til BSC.
  4. Hver plattform inkluderer et akrylbad, base, volumreduksjonsinnsats, klips og grep. Hvert grep inkluderer to plater og tre forskjellige typer skruer, inkludert en M5 x 0,8 mm gjenge x 10 mm lang skrue som fester grepene til basen; to M6 x 1 mm gjenger x 20 mm lange skruer som strekker platenene for å klemme grepene; og fire M3 x 0,5 mm gjenger x 14 mm lange skruer som, i kombinasjon med fire kompresjonsfjærer, trekker platene inn for å åpne grepene.
  5. Plasser alle komponenter i sekundære beholdere som er i stand til å fange opp alle kulturmedier i tilfelle lekkasje. Senk i ≥ 10% blekemiddel løsning og suge i minst 1 time. Skyll av blekemiddelløsningen med vann fra springen (autoklav etter behov) og flytt inn i BSC.
    MERK: For feilsøking av forurensning, bør du vurdere å autoklavere alt vann fra springen eller bruke renset vann. Se diskusjonen hvis du vil ha flere tips om håndtering av forurensning.
  6. Bruk M3-skruene og kompresjonsfjærene til å feste plater til grepene, fest grepene til basen ved hjelp av M5-skruen, og sett inn M6-skruene til de griper inn platen. Bruk dobbeltsidig tape for å feste sandpapir til platen, og lukk deretter grepene for å fremme vedheft av sandpapiret til platenene. Gjenta for alle plattformer.
  7. Når du er klar til å laste en plattform, åpner du grepene helt og bruker tang, plasserer overbenet og kneet mellom platene med den overfladiske overflaten av akillessenen vendt oppover (figur 1A). Lukk grepene løst for å holde dem forsiktig på plass.
  8. Bruk tang til å ta tak i det eksponerte lårbenets hode eller fot og manipuler knefleksjonsvinkelen mens du gradvis lukker grepene for å feste på plass. For baseline spenningsgruppen, forleng kneleddet som beskrevet tidligere. Når grepene strammes med kneet forlenget, bør ankelen naturlig forlenges. For den statiske impingementgruppen, bøy kneleddet mellom grepene som beskrevet tidligere.
  9. For den statiske impingementgruppen, plasser overhåndsknuten på strengen rundt den distale poten og stramme. Før strengen gjennom et spor i basen som ligger under eksplanten og gjennom klipshullet. Plasser basen i akrylbadet og fest klipsen til den øvre kanten av badekaret (figur 1A).
  10. Trekk strengen for å dorsiflex foten til minst 110 ° i forhold til tibia og bruk en permanent markør for å markere strengen når den kommer ut av klipsen. Ta et bilde av eksplanten i denne posisjonen for senere å kvantifisere dorsifleksjonsvinkelen (figur 1A).
  11. Fjern basen og fest volumreduksjonsinnsatsen ved å skyve langs et spor på basen. Plasser basen (nå festet til volumreduksjonsinnsatsen) tilbake i akrylbadet og plasser klipsen på toppkanten. Trekk strengen for å gå tilbake til den opprinnelige dorsifleksjonsvinkelen ved å bruke den merkede strengen som en guide og fest strengen til utsiden av badekaret med tape for å opprettholde statisk dorsifleksjon.
  12. For baseline spenningsgruppen, bare plasser basen med volumreduksjonsinnsats i akrylbadet når eksplanten er plassert mellom grepene og ta et bilde for kvantifisering av dorsifleksjonsvinkel.
  13. Tilsett 125 ml forvarmede (37 °C) kulturmedier til hver plattform for å senke eksplanter. Dekk toppen av badekaret med aluminiumsfolie, sett i en sekundær beholder, og flytt inn i inkubatoren. Kultur i 7 ekstra dager, skiftende media hver 48-72 h.
    MERK: Tape plassert over toppen av badekaret kan forhindre at PLA-deler flyter.

4. Fiksering, avkalking og parafininnebygging

  1. Etter eksplantdyrkning bruker du saks til å trimme tånegler/distale tær og klipper vekk overbeinet proksimalt for akillesovergangen. Plasser hvert trimmet ankelledd i en behandlingskassett foret med skumbiopsiputer. Skyv ankelen inn i kassetthjørnet for å plassere ankelen på omtrent 90° dorsifleksjon og lukk kassetten for å holde den på plass.
  2. Fiks i 3 dager i 10% nøytral bufret formalin (NBF) og avkalk i 2 uker i 14% etylendiamenetetraeddiksyre (EDTA) oppløst i destillert vann (diH2O) med pH justert til 7,4-7,6 med iseddik.
  3. For å fjerne salter, skyll prøvene grundig tre ganger i både 1x fosfatbufret saltvann (PBS) etterfulgt av diH2O, 5 minutter hver. Utfør rutinemessig prøvebehandling for parafinhistologi: dehydrere gjennom en gradert serie EtOH, klar i xylen og infiltrere med parafinvoks. Orienter og legg inn prøver i parafin for å oppnå sagittale vevssnitt gjennom akillessenen i medial-til-lateral progresjon som beskrevet i avsnitt 5 nedenfor (figur 1B).

5. Vev seksjonering

  1. Med en mikrotom, trim forsiktig inn i prøven til seksjonene er parallelle med blokkflaten. Trim grovt inn i ankelen fra det mediale aspektet av leddet, stopp før du når medialgrensen til akillesseninnføringen.
  2. Overfør prøven til en isblokk for å justere temperatur og fuktighet, og bytt kniver (eller skift til en ny del av det nåværende bladet). Fortsett seksjoneringen i prøven ved 10 μm tykkelse og identifiser nøye inngangen til akillesseninnsettingen med et brightfield-mikroskop. Når det er identifisert, utfør seriell seksjonssporingsseksjonsnummer (dvs. vevsdybde) gjennom hele akillesseninnsettingen.

6. Deparaffinisering / rehydrering og lysbildevalg

  1. For hver analyse nedenfor, velg nivåmatchede vevsseksjoner fra hvert par kontralaterale lemmer. Før farging, plasser på et lysbildestativ og flytt gjennom 3 endringer av xylen, 2 endringer på 100% EtOH, 2 endringer på 95% EtOH og 1 endring på 70% EtOH, 5 min hver. Avslutt rehydrering i diH2O.

7. TUNEL for å vurdere levedyktigheten til akillessenen

  1. For TUNEL-merking, flekk i henhold til produsentens protokoll. Inkuber i 20 μg/ml proteinase K i 20 minutter ved romtemperatur og skyll i diH2O. Inkuber i 50 mikrol TUNEL flekkløsning (5 μL enzymløsning, 45 μL etikettoppløsning) i 1 time ved 37 °C. Skyll i diH2O. Monter med antifadereagens inneholdende DAPI og dekkslip.
  2. Se for deg akillesseninnsettingen ved hjelp av et fluorescensmikroskop med en 4x objektivlinse. Inkluder en DAPI-kanal (eksitasjons-/emisjonsbølgelengder = 360/460 nm) for å visualisere alle kjerner, en TUNEL (TMR Red)-kanal (eksitasjons-/emisjonsbølgelengder = 540/580 nm) for å visualisere apoptotiske kjerner, og om mulig, en lysfeltkanal.
  3. For bildeanalyse, importer bilder til en bildeanalyseprogramvare som er egnet for ROI-basert behandling, for eksempel FIJI / ImageJ eller MATLAB. Definer et interesseområde (ROI) som beskriver hele akillessenen i sikte (figur 2A), unntatt celler i epitenon som er svært utsatt for død indusert av disseksjon og plutselig endring i miljøforhold når de plasseres i kultur.
  4. Dette gjør du ved å utføre ROI-valg i MATLAB ved å importere brightfield-bildet og bruke drawpolygon()-funksjonen til å spore og omslutte grensene til senen. MATLAB oppretter et polygonobjekt for avkastningen, som deretter kan brukes på DAPI- og TONEL-kanalbildene for å maskere ut bildepunktintensitetsdata utenfor avkastningen ved hjelp av createMask() for bare å analysere kjerner i akillessenen.
  5. Importer DAPI- og TUNEL-kanalbildene og identifiser en fluorescensintensitetsterskel for å definere apoptotiske (TUNEL+) kjerner ved å normalisere til maksimal fluorescensintensitet av apoptotiske kjerner i ikke-levedyktige vev som bein, muskler eller fett som tilfeldigvis fanges opp i vevsdelen. Når bildene er maskert, beregner du brøkdelen av apoptotiske kjerner (TUNEL + kjerner / DAPI-kjerner) i akillessenen.

8. Toluidinblå histologi for å karakterisere fibrobruskdannelse

  1. Når det er rehydrert (seksjon 6), overfør glidestativ med nivåmatchede vevsseksjoner fra kontralaterale eksplantpar til 0,4% w / v toluidinblå O i 0,1 M natriumacetatbuffer med pH justert til 4,0 ved bruk av iseddik. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur, skyll deretter 3x i diH2O i 30 s hver.
  2. Dehydrer gjennom tre endringer på 95% EtOH og to endringer på 100% EtOH, 30 s hver. Klar gjennom tre endringer av xylen, 1 min hver. Dekkslipp med xylenbasert monteringsmedium.
  3. Få 24-biters rød-blå-grønne (RGB) fargebilder av akillesseninnsettingen. For eksempel, for denne protokollen bruker du en adapter til å grensesnitt et digitalt fargekamera til okularet til et enkelt lysfeltmikroskop med et 4x objektiv.
  4. For å kvantifisere forskjeller i toluidinblå farging i trykksenefibrobrusk (CTF)16 ved akillesseninnsetting (figur 3A,B), importer RGB-bilder til et bildeanalyseprogram som kan definere og administrere flere avkastninger. Alternativene inkluderer valgene og ROI-styringsverktøyene i FIJI/ImageJ eller verktøykassen for bildebehandling i MATLAB. Begynn med å angi skalaen for piksel/lengde.
    MERK: Valg av programvare er overlatt til forskerens skjønn og er absolutt ikke begrenset til MATLAB eller FIJI / ImageJ. Forfatterne har levert MATLAB-kode (tilleggsfil 2), dokumentasjon som beskriver implementering (tilleggsfil 3) og eksempelbilde (tilleggsfil 4). Vi oppfordrer forskere til å oversette denne koden til alternative programmeringsspråk for bruk i annen programvare etter behov eller foretrekk.
  5. Med bildet som vises i den valgte programvaren, identifiser skjæringspunktet mellom den dype senegrensen med calcaneus. Herfra sporer du omtrent 800 μm langs den dype senegrensen for å etablere den dype grensen til CTF. Bruk for eksempel drawpolyline()-funksjonen i MATLAB til interaktivt å tegne en polylinje over RGB-bildet. MATLAB lager et polylinjeobjekt som inneholder hjørnene på linjen, som kan behandles og trimmes til en lengde på 800 μm.
  6. Fra denne posisjonen oppretter du den proksimale grensen til CTF ved å tegne et linjesegment som forbinder den overfladiske senegrensen som er vinkelrett på den lokale fiberorienteringen.
  7. Flytt tilbake til skjæringspunktet mellom den dype senegrensen og calcaneus og definer CTFs distale grense ved å tegne et linjesegment som forbinder den overfladiske senegrensen langs det distinkte tidevannsmerket som skiller CTF fra festesonen fibrobrusk (AZF)16 (figur 3A,B). Til slutt, generer den overfladiske grensen til CTF ved å spore den overfladiske senegrensen for å omslutte.
  8. For å beskrive romlige variasjoner i GAG-farging over innsettingen, del den totale CTF i 4 kvadranter (figur 3A, B). Koble midtpunktet til de dype og overfladiske CTF-grensene med et linjesegment for å skape en distal/proksimal grense. Når du passerer gjennom midtpunktet til denne grensen, kobler du midtpunktene til de distale og proksimale CTF-grensene langs fiberorienteringen for å skape en overfladisk / dyp grense.
  9. Disse 6 grensene gir informasjon som kan brukes til å definere avkastningen som representerer hele CTF, men også 4 kvadranter som deler CTF. I MATLAB kan du for eksempel kompilere toppunkter som definerer grensene for hver enkelt ROI (CTF, kvadranter 1-4) til vektorer og bruke images.roi.Polygon() til å generere lukkede polygonobjekter for hver avkastning.
  10. Når avkastningen er definert, transformerer du RGB-pikseldata til fargerommet Hue-Saturation-Value (HSV) ved hjelp av fargetransformator-plugin-modulen i FIJI, rgb2hsv()-funksjonen i MATLAB eller annen programvare som bruker de riktige transformasjonsligningene76. HSV-data kan deretter projiseres i 2D-fargetonemetningsrommet, der hver kombinasjon av kulør og metning koder for en unik farge (figur 3C).
  11. Innenfor hver avkastning beregner du gjennomsnittlig kulør og metning som beskriver den gjennomsnittlige flekkfargen i avkastningen. Dette kan oppnås i MATLAB, for eksempel ved å bruke Polygon-objektene som definerer hver avkastning for å maskere bildet ved hjelp av createMask() for å analysere kulørmetningspikseldata spesifikt innenfor hver avkastning.
  12. Definer en annen liten avkastning innenfor periosteal fibrobrusk (PF)16 (figur 3A, B) og beregne gjennomsnittlig fargetone og metning. Deretter beregner du den euklidske avstanden som skiller gjennomsnittsfargen i hver avkastning på CTF til den for PF (figur 3C).
    Equation 1
    MERK: Den euklidske avstandsberegningen beskriver graden av likhet mellom gjennomsnittsfargen på avkastningen til PF, et typisk fibrokartilaginøst vev 16,17,77. En mindre euklidsk avstand indikerer en avkastningsfarge som er mer fibrocartilaginous i utseende.
  13. Bruk denne avstanden til å beregne fibrobruskscore, som forutsetter en maksimumsverdi på 1 hvis avkastningsfargen er identisk med PF-fargen, og en minimumsverdi på -1 hvis ROI- og PF-fargen når maksimal separasjon innenfor fargeområdet for kulørmetning.
    Equation 2
  14. Gjennomsnittlige data for fargetone, metning og fibrocartilage score innenfor hver avkastning på tvers av vevsseksjoner fra hver lem. Utfør parrede statistiske sammenligninger mellom grupper av kontralaterale lemmer.

9. SHG-avbildning for å undersøke endring i kollagennettverksorganisasjon

  1. Utfør SHG-avbildning av toluidinblåfargede seksjoner ved hjelp av et dyktig mikroskopsystem med en 20x objektlinse. Hent z-stabler gjennom seksjonstykkelsen og utfør flisskanning etter behov for å fange opp akillesseninnsettingen fullstendig.
  2. Importer SHG-bilder til en foretrukket bildeanalyseprogramvare og definer avkastning som omfatter og deler CTF ved akillesseninnsetting som beskrevet for toluidinblå bildeanalyse i avsnitt 8 (figur 4A, B).
  3. Hvis SHG-bilder importeres til MATLAB, bruker du fremgangsmåten for å definere CTF-avkastning i MATLAB som beskrevet i avsnitt 8. Når du har definert ROIer, overfører du ROI-koordinater til FIJI ved å eksportere ROI-hjørner fra MATLAB som .txt-filer og importere til FIJI ved hjelp av File > Import > XY-koordinater. Legg over utvalget og send det til ROI-ansvarlig for analyse.
  4. For å kvantifisere kollagenorganisasjonen, bruk Direksjonalitet-plugin i FIJI, som utfører Fourier-spektrumanalyse for å beregne fordelinger av fiberorienteringer over små vinduer som spenner over en avkastning. Spredningen av denne fordelingen, referert til som dispersjon, er omvendt relatert til fiberjustering.
    MERK: Kollagenfibre kan anta variable orienteringer i forskjellige vinduer over CTF på grunn av grov krumning av senen i stedet for fravær av justering / organisering. For bedre å skille endringer i kollagenorganisasjonen fra bruttokurvatur i senen ved innsettingen, er det nødvendig å definere mindre avkastning.
  5. Importer SHG-bilder til FIJI og angi skala for piksel/lengde. Projiser data om maksimal bildepunktintensitet i et sammensatt 2D-bilde, og legg til avkastning på investeringen i ROI Manager. Legg sekvensielt hver CTF-avkastning på bildet og tegn 10 små underavkastninger av konsistent størrelse innenfor avkastningen, og legg til underavkastningen i ROI-behandleren.
  6. Innenfor hver sub-ROI, kjør direksjonalitetsprogrammet i FIJI for å beregne fiberspredning. Gjennomsnittlige spredningsdata på tvers av underavkastninger innenfor hver CTF-avkastning, og gjennomsnittlige spredningsdata innenfor hver CTF-avkastning på tvers av seksjoner fra hvert eksanlegg. Utfør parrede statistiske sammenligninger mellom grupper av kontralaterale lemmer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative bilder av TUNEL-fargede vevssnitt viser minimalt med apoptotiske kjerner i kroppen av akillessenen etter 7 dager med eksplantkultur på tvers av eksperimentelle grupper (figur 2A). Kvantifisering av disse bildene gir holdepunkter for at vevskulturprotokollen opprettholder opptil 78 % levedyktighet i gjennomsnitt i akillessenen etter 7 dager med eksplantdyrkning på tvers av belastningsforhold (figur 2B).

Kvalitativt er forbedret toluidinblå farging verdsatt etter 7 dager med statisk impingement sammenlignet med ubelastede kontroller (figur 3A, B), spesielt i dype kvadranter ved siden av calcaneus hvor vi tidligere har målt maksimal tverrgående trykkbelastning 5,6. Kvantifisering av disse toluidinblåfargede vevssnittene indikerer signifikant endring i fargetone (figur 3D), metning (figur 3E) og fibrobruskscore (figur 3F) etter 7 dager med statisk impingement sammenlignet med kontralaterale ubelastede eksplanter. Denne endrede GAG-fargingen representerer sannsynligvis fibrobruskdannelse sekundært til statisk impingement i denne modellen. Statistisk signifikante forskjeller i metning og fibrokartilje ble kun påvist i kvadrant 1 etter 7 dager med baselinespenning (figur 3E,F). Videre ble metning og fibrobruskscore redusert i forhold til kontralaterale ubelastede sener, en motsatt trend sammenlignet med statisk impingement. Disse dataene kan støtte hypotesen om at strekkbelastning kan dempe eller reversere impingementdrevet fibrobruskdannelse og garanterer ytterligere undersøkelser i fremtiden.

Kvantifisering av SHG-avbildning antyder subtil, men signifikant endring i kollagenfiberorientering etter 7 dager med statisk impingement, igjen i den dype og distale regionen ved siden av calcaneus, som indikert av signifikante forskjeller i dispersjon (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Explant plattform og eksperimentell design. (A) Fotografisk og skjematisk fremstilling av explant-plattformen. (Øverst) Fotografi av en hel murine baklem explant lastet inn i plattformen, med kritiske komponenter merket. (Nederst) Skjematisk fremstilling av innsetting av akillesseneimpingement fremkalt av passivt påført ankeldorsifleksjon i denne eksplanteringsmodellen. (B) Skjematisk av studiedesign og eksplantkultur. Hind lem explants er forbehandlet i 100 nM dexametason i 48 timer74. Fra hver mus dyrkes deretter en baklem explant i en tallerken losset i 7 dager, mens den kontralaterale lemmen lastes inn i den eksperimentelle plattformen for å plassere akillessenen under enten baseline spenning eller statisk impingement i 7 dager. Serielle vevsseksjoner fra kontralaterale par lemmer er enten farget med toluidinblått for å visualisere GAG-rikt vev eller brukes til TUNEL-farging. Toluidinblåfargede seksjoner brukes deretter til SHG-avbildning for å vurdere kollagenorganisasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksplant levedyktighet. (A) Representative bilder av TUNEL-fargede seksjoner fra forbehandlede (dag 0) eksplanter (øverst til venstre), ubelastede sener (øverst til høyre), sener opprettholdt ved baseline spenning (nederst til venstre) og statisk impinged sener (nederst til høyre). Akillessenen er skissert i en stiplet hvit linje og merket AT, mens calcaneus er skissert i en solid gul linje og merket C. Apoptotiske kjerner vises røde (TUNEL), alle kjerner vises blå (DAPI). (B) Kvantifisering av døde cellefraksjoner var i gjennomsnitt mindre enn 22 % for gruppene med losset, baselinespenning og statisk impingement. Data representerer gjennomsnitt ± standardavvik. Uteliggere er tilstede i disse datasettene med større enn 50% celledød, noe som kan tilskrives seneskader forårsaket av dårlig disseksjonsteknikk. Den gjennomsnittlige dødcellefraksjonen med statistiske uteliggere fjernet er mindre enn 15 % for alle grupper. Det ble ikke funnet statistisk signifikant forskjell i celledød mellom uladet, baseline spenning og statiske impingementgrupper (p < 0,05). Dag 0 kontroll: n = 8. Losset: n = 18. Baseline spenning: n = 8. Statisk impingement: n = 12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Toluidinblå histologi. (A) Representativ toluidinblå flekk etter 7 dager med losset kultur som viser trykksenefibrobrusk (CTF), festesone fibrobrusk (AZF) og periosteal fibrobrusk (PF) ved akillesinnsetting16. Calcaneus merket C. ROI fange CTF er skissert i rødt og er videre delt inn i 4 kvadranter for å gi ytterligere romlig informasjon. (B) Representativ toluidinblå flekk etter 7 dager med statisk impingement, med forbedret farging av CTF, spesielt i kvadrant 1 hvor vi tidligere har målt maksimale tverrgående trykkbelastninger 5,6. (C) Skjematisk fremstilling av fargeområdet for kulørmetning som brukes til fargebildeanalyse. Farge beskrives med en kombinasjon av kulør (0°-360°) og metning (0-255)76. Gjennomsnittsfargen i hver avkastning normaliseres til gjennomsnittsfargen til PF ved å beregne euklidsk avstand som skiller farger i hver avkastning fra fargen i PF, noe som gir en normalisert fibrobruskscore. (VG Nett) Endringer i toluidinblå flekk etter 7 dager med statisk impingement (øverst) og baseline spenning (nederst) sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. Data representerer gjennomsnitt ± standardavvik. (D) Kvantifisering av fargetone indikerer signifikante forskjeller i gjennomsnittlig fargetone i alle regioner etter 7 dager med statisk impingement sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. Ingen tilsvarende trend ble påvist etter 7 dager med baseline spenning sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. (E) Kvantifisering av metning, med signifikante endringer i gjennomsnittlig metning over hele CTF og innenfor kvadranter 1-3 etter 7 dager med statisk impingement sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. Omvendt ble signifikante forskjeller bare påvist i kvadrant 1 etter 7 dager med baseline spenning, hvor metningen ble redusert sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. (F) Kvantifisering av fibrocartilage score, med signifikante endringer i fibrocartilage score på tvers av alle regioner etter 7 dager med statisk impingement sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. Omvendt ble signifikante forskjeller bare påvist i kvadrant 1 etter 7 dager med baseline spenning, hvor fibrokartiljescore ble redusert sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener. Dataene antyder forbedret GAG-flekk forårsaket av statisk impingement som indikerer økt fibrobruskdannelse. Data som beskriver den totale CTF ble sammenlignet ved hjelp av Wilcoxon matched-pairs signerte rangtester. Kvadrantdata ble sammenlignet ved hjelp av gjentatte målinger toveis ANOVA med Šídáks multiple sammenligningstest. *p < 0,05. **p < 0,01. p < 0,005. p < 0,001. Baseline spenning vs. losset: n = 6 par. Statisk impingement vs. losset: n = 8 par. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: SHG-avbildning. (A) Representativt SHG-bilde etter 7 dager med losset kultur sammenlignet med (B) 7 dager med statisk impingement. CTF er skissert i rødt og delt inn i 4 kvadranter som merket, i samsvar med avkastningen i toluidinblå analyse ovenfor. (C) Innenfor hver kvadrant ble Fourierspektrumanalyse utført i et bevegelig undervindu ved hjelp av Direksjonalitet-plugin i FIJI. Spredningen av fordelingen av fiberorienteringer innenfor hvert undervindu kalles dispersjon (°) og er omvendt relatert til fiberjustering. Dispersjon = 0 ° representerer perfekt parallell justering av fibre. Økende dispersjon representerer avtagende kollagenfiberjustering. Data representerer gjennomsnitt ± standardavvik. Statistisk signifikante forskjeller i dispersjon ble påvist i kvadrant 1 etter 7 dager med statisk impingement sammenlignet med kontralaterale ubelastede sener, noe som tyder på økt kollagendesorganisering. Kvadrantdata ble sammenlignet ved hjelp av gjentatte målinger toveis ANOVA med Šídáks multiple sammenligningstest. * p < 0,05. Statisk impingement vs losset: n = 5 par. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: CAD-filer. Disse CAD-filer, kompilert i flere filformater, kan brukes til å 3D-printe plattformen base, volumreduksjon sette inn og klipp. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: MATLAB-filer. De kompilerte MATLAB-filene tillater kvantifisering av toluidinblå histologi som beskrevet i avsnitt 8 i protokollen for å vurdere fibrobruskdannelse gjennom romlig endring i GAG-farging ved akillesseninnsetting. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Retningslinjer for implementering av MATLAB-kode. Dette dokumentet beskriver en pipeline for å kvantifisere endringer i GAG-farging ved akillesseninnsetting via bildeanalyse av toluidinblå histologi ved bruk av den medfølgende MATLAB-koden. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 4: Eksempelbilde av toluidinblå histologi. Dette RGB-fargebildet av toluidinblå histologi kan brukes til å utføre den medfølgende MATLAB-koden. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den eksperimentelle murine bakre lem explant-plattformen sammen med vevskulturprotokollen beskrevet i denne studien gir en egnet modell for å studere mekanobiologien til impingementdrevet fibrobruskdannelse ved akillesseninnsettingen. Nytten av denne eksplanteringsmodellen er demonstrert av de representative resultatene, som indikerer vedlikehold av cellelevedyktighet samtidig med signifikant og romlig heterogen forandring i toluidinblå farging etter 7 dager med statisk impingement. Disse funnene antyder endret metabolisme av GAG-rike matriksmolekyler sekundært til mekanisk impingement, i samsvar med andre modeller og kliniske studier 3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,44,49. I tillegg ble subtile, men signifikante endringer påvist i kollagenorganisering via SHG-avbildning etter 7 dager med statisk impingement, i samsvar med kliniske trekk ved impingementassosiert tendinopati og in vivo-modeller av seneimpingement 28,37,38,43,44,49,64.

Tidligere forsøk på å utforske de biologiske følgene av seneimpingement har anvendt enkel kompresjon på isolerte seneceller27,29. Når en mekanobiologisk mekanisme av interesse er identifisert, gir disse modellene overlegne terapeutiske screeningplattformer sammenlignet med vår eksplanteringsmodell. Funnene fra disse studiene må imidlertid tolkes med forsiktighet, da isolerte celler dyrket in vitro mangler et tredimensjonalt ekstracellulært miljø som påvirker mekanorespons57,59. I tillegg viser celler isolert fra andre kollagenøse vev (f.eks. brusk) endret mekanosensitiv ionkanalaktivitet når de utfordres mekanisk in vitro i fravær av et ekstracellulært miljø78,79. Modellen som presenteres adresserer disse begrensningene ved å gi en plattform for å utsette in situ seneceller i levedyktige eksplanter til fysiologisk relevante belastningsforhold.

Explant-modeller er populære eksperimentelle systemer for å undersøke senebiologi og fysiologi57,58. I den spesifikke konteksten av seneimpingement har flere tidligere studier benyttet partielle og hele seneplanter for å utforske senecellerespons på kunstig uniaxial kompresjon 30,31,32,33,34,39. Mens disse studiene viste en direkte sammenheng mellom uniaxial kompresjon og fibrobruskdannelse, er det in vivo mekaniske belastningsmiljøet generert av seneimpingement multiaksialt og avhenger av anatomiske trekk i den impinged region 5,6. For eksempel påvirkes belastningsmiljøet som oppstår ved impingement av calcaneus på akillessenen under ankeldorsifleksjon av innføringsvinkel, festeområde og tilstedeværelsen av omkringliggende bløtvev 60,61,62,63,80,81 . Vår eksplantplattform bevarer disse eksterne strukturene og reproduserer det multiaksiale belastningsmiljøet som genereres ved impingement, samtidig som cellene opprettholdes i sitt opprinnelige miljø6.

Dyremodeller har vært grunnleggende for å underbygge et umiddelbart forhold mellom mekanisk impingement og de typiske egenskapene til senefibrobrusk og patologi, som deler analoge fenotyper 1,25,28,37,64,65,66. I de siste tiårene har flertallet av in vivo impingement forskning benyttet gnagermodeller for å studere rotator cuff sykdom gjennom kirurgisk reduksjon av subakromial plass for kunstig å impinge rotator cuff sener. Disse dyremodellene har blitt brukt til å beskrive cellulær og molekylær patogenese av impingementtendinopati in vivo og kan utvides til å evaluere nye terapeutiske strategier for å fremme klinisk oversettelse av impingementforskning 36,37,38,66,82,83,84,85.

Etablerte in vivo-modeller av seneimpingement har imidlertid flere viktige begrensninger i studiet av mekanobiologi57,58. Disse modellene kirurgisk introdusere eller fjerne en ekstern kilde til sene impingement og gjenoppta fysisk aktivitet (gratis bur aktivitet, tvunget tredemølle løping, etc.) Denne tilnærmingen mangler kontroll over størrelsen, orienteringen og frekvensen av kraft som påføres direkte på senen gjennom hele eksperimentets varighet. Gitt vanskeligheten med å måle vevsbelastning in vivo, gir disse modellene begrenset kontroll over eller karakterisering av det mekaniske miljøet som genereres i senen som respons på impingement. Denne begrensningen er godt anerkjent innen forskning på senemekanobiologi 57,58,67,68,69,70. Andre steder har sofistikerte eksperimentelle plattformer blitt designet for å påføre kontrollert mekanisk overbelastning (utmatting) direkte på sener in vivo under anestesi 67,68,69. Disse modellene kontrollerer bruken av mekaniske stimuli i korte perioder under anestesi og gir ingen kontroll over lastehistorikken gjennom resten av forsøket, da dyrene gjenopptar normal buraktivitet i dager til uker etter mekanisk overbelastning. Explant-modellen beskrevet i denne protokollen tilbyr kontrollert forskrivning av akillesseneimpingement for å generere målbare og velbeskrevne mønstre av vevsstamme6, noe som muliggjør streng studie av impingementmekanobiologi. Det skal imidlertid bemerkes at denne eksplanteringsmodellen ikke fjerner behovet for in vivo-undersøkelse av senepåvirkning, men snarere tjener som et supplerende verktøy for å berike data avledet fra disse uunnværlige dyremodellene. Cellulære og molekylære veier definert i forhold til impingementmekanikk ved hjelp av denne eksplanteringsmodellen kan karakteriseres in vivo og evalueres som terapeutiske mål ved hjelp av dyremodeller i en komplementær tilnærming for å forbedre klinisk oversettelse av mekanobiologisk forskning. Kraften i denne integrerte strategien blir utnyttet i andre riker av senemekanobiologiforskning 58,86,87,88, og denne eksplantmodellen gir sin anvendelse på seneimpingement.

Explant-modellen er ikke uten begrensninger. Som med alle eksplantasjonsmodeller, kan mekanobiologi bare studeres over relativt korte tidsskalaer mens vevet forblir levedyktig 57,89. Selv om modellen er et kraftig verktøy for å studere den umiddelbare cellulære responsen på mekanisk impingement, er den ikke egnet til å studere kronisk senesykdom assosiert med impingement. I tillegg er modellen ikke i stand til å redegjøre for systemisk respons og vev crosstalk siden blodtilførsel og nevral kommunikasjon ikke opprettholdes. Likevel gir modellen en plattform for å avgrense den iboende responsen av endogene seneceller til mekanisk impingement. En ytterligere begrensning av modellen er at vi ifølge tidligere forskning 32,90,91,92 forventer at mange store GAG-rike proteoglykaner vil diffundere ut av senen under forbehandling og tidlige tidspunkter av eksplantekultur, spesielt fragmenter av aggregerende proteoglykaner som ikke er forankret til jordmatrisen. Derfor vil endringer i GAG-flekk sekundært til impingement i modellen sannsynligvis gjenspeile endringer i nylig syntetiserte GAG-rike makromolekyler som ennå ikke er katabolisert og forblir forankret i den ekstracellulære matrisen. Gitt at disse GAG-rike proteoglykanene lokaliserer til det pericellulære rommet 22,30,93,94,95, kan eksplantmodellen lette undersøkelsen av PCM-remodellering sekundært til seneimpingement.

Disseksjonen av murine bakre lemmer eksplanter beskrevet i denne protokollen krever øvelse, men dyktig teknikk kan oppnås raskt. Fullstendig avfetting (dvs. hudfjerning) kan være utfordrende, spesielt rundt sifrene i bakpoten. Mens huden rundt tærne ikke trenger å fjernes helt, forsterker den steriliteten gjennom kulturen, da bakterier er tilstede på huden og pelsen.

Det vanskeligste aspektet ved disseksjonen er fjerning av plantarissenen medialt til akillessenen proksimalt og passering overfladisk til akillessenen distalt. Plantaris muskel-sene-enheten spenner over kne- og ankelleddene i nær tilknytning til triceps surae og akillessenen 81,96,97,98,99. Mekaniske belastninger som overføres over det bakre aspektet av ankelen under passiv ankeldorsifleksjon fordeles mellom plantaris- og akillessenene, og plantarissenen er kjent for å bære høy belastning in vivo100,101. I tillegg er anatomisk variabilitet i den menneskelige plantaris godt beskrevet 96,102,103, og mens denne variabiliteten er mindre utbredt hos gnagere97, har den tilbøyelighet til å påvirke det mekaniske miljøet i akillessenen in situ. I samsvar med tidligere teknikker brukt til å måle belastning i akillessenen in situ 6,104, bør plantarissenen fjernes for å kontrollere det indre belastningsmiljøet som genereres av eksternt påført senepåvirkning.

Forsiktig fjerning av plantaris er nødvendig for å unngå disseksjonsindusert celledød i akillessenen, og variasjonen i celleapoptose i dataene (figur 2B) kan gjenspeile disseksjonsindusert skade på grunn av dårlig disseksjonsteknikk. Fjerning av plantarissenen drar nytte av fine spisstang for å forsiktig skille plantaris fra akillesen og frigjøre plantarismuskel-senkomplekset proksimalt. Taggete tang hjelper til med å gripe den proksimale frie enden av plantarissenen for å trekke distalt, rundt calcaneus og mot potens sifre for fullstendig fjerning. Lee og Elliott gir en nyttig anatomisk beskrivelse av rotteplantarisene og akillessenene og tilhørende muskulatur97.

Selv om vi fant at disseksjonsteknikken beskrevet i denne studien var tilstrekkelig for å sikre sterilitet, kan protokollen justeres eller modifiseres etter behov i settinger der det er utfordrende å opprettholde sterilitet. Kirurgiske verktøy kan autoklaveres, betadinoppløsning kan påføres topisk på huden, og disseksjon kan utføres i et biologisk sikkerhetsskap. Vi har funnet at rask og effektiv benkedisseksjon er kritisk og gjør det mulig å dissekere lemmer raskt overføres til sterile medier i et biologisk sikkerhetsskap etter at den sterile grensen som huden gir, er brutt.

Et annet hovedmål for feilsøking av forurensning er teknikken som brukes til sterilisering av plattformkomponenter. I våre hender har vi hatt jevn suksess med enkle bløtlegginger i ≥ 10% blekemiddelløsning med tilstrekkelig skylling i kranvann uten autoklavering. Ytterligere sterilisering ved bruk av 70% etanol kan påføres etter behov, men vær oppmerksom på at enhver komponent 3D trykt med PLA er uforenlig med EtOH og vil fordreie. I tillegg kan alle deler av plattformen bortsett fra akrylbadet og 3D-printede PLA-komponenter autoklaveres, og komponenter dynket i ≥ 10% blekemiddelløsning kan skylles med autoklavert eller renset vann. For å unngå rust oppfordres det til å vaske og håndtørke alle metallkomponenter umiddelbart etter hvert eksperiment.

Metoden for å kvantifisere toluidinblå farging for å karakterisere fibrobruskdannelse beskrevet i denne protokollen benytter en innovativ tilpasset fargebildeanalyse som gir bred anvendelse på seneforskning. Betydelige fordeler er gitt ved å konvertere pikseldata fra RGB til HSV-fargerommet76. Her koder kulør en dominerende bølgelengde som en karakteristisk farge fra 0°-360°, mens metning definerer renheten til hver nyanse fra 0-255. Verdi beskriver omvendt lysstyrken på fargen, og som sådan skiller HSV-fargeskjemaet lysstyrke (verdi) fra farge (fargetone, metning). I histologiske analyser er HSV-pikseldata mer robuste for endringer i lystransmisjon under mikroskopi og variasjoner i vevssnitttykkelse76. I tillegg tillater arbeid i HSV-fargerommet avgrensning av spesifikke bølgelengder av interesse (via fargetone) avhengig av den histologiske flekken76, for eksempel nyanser rundt 240 ° for toluidinblå farging.

Et innovativt aspekt ved toluidinblåbildeanalysen som presenteres i denne studien, er fibrobruskscoren, en beregning som er relatert til den euklidske avstanden som skiller fargen på hver avkastning til fargen på periosteal fibrobrusk. Den periosteal fibrocartilage fremstår som en sekundær brusk umiddelbart etter fødselen, mens den komprimerende sene fibrocartilage er fraværende postnatalt og, som andre sesamoid fibrocartilages, synes å være regulert av mekanisk etterspørsel i regioner med forhøyet sene kompresjon 16,17,28,77. Ved å sammenligne fibrocartilage score mellom eksperimentelle grupper, kan vi avgjøre ikke bare om Toluidine blå flekkfarge endrer seg sekundært til impingement, men om denne endringen resulterer i et utseende nærmere fibrocartilage. Denne analysen kan utvides til andre populære GAG-flekker som Alcian blå og Safranin O, samt andre regioner av senefibrobrusk og fibrocartilaginous seneavhandlinger, så lenge et kontrollvev er tilstede beslektet med periosteal fibrobrusk. For eksempel kan endringer i GAG-farging i sener og leddbånd i kneet normaliseres via fibrocartilage score til farging i fibrocartilaginous menisk.

Et avgjørende aspekt ved denne protokollen er seriell vevsseksjonering og sporing av seksjonsnivå gjennom akillessenen, noe som krever repeterbar parafininnebygging og omhyggelig identifisering av inngang i akillesseninnsetting for sporing av seksjonsdybde. Denne seksjonerings- og fargeprotokollen krever utvilsomt øvelse og raffinement, men kan utvides til kryoseksjonering.

Den histologiske tilnærmingen beskrevet i dette manuskriptet kan lett utvides til immunhistokjemi eller immunfluorescens. I denne forbindelse er et viktig aspekt av den ovennevnte eksperimentelle designen den parvise sammenligningen av kontralaterale lemmer fra hver mus. Her trekkes alle statistiske sammenligninger mellom vevssnitt på sammenlignbart snittnivå gjennom akillessenen fra kontralaterale ekstremiteter fra samme mus tildelt ulike forsøksgrupper. Denne strategien bidrar til å kontrollere biologisk variabilitet. I tillegg farges nivåmatchede par kontralaterale vevsseksjoner på samme glidestativ samtidig (histologi) eller på lysbildet samtidig ved å bruke identiske arbeidsløsninger for alle reagenser, buffere og antistoffløsninger (immunfarging) for å kontrollere variasjonen mellom flekker og flekker som er iboende i histologi og immunmerking, samt anatomisk heterogenitet avhengig av seksjonsnivå, plassering og orientering.

Flere andre endringer i protokollen beskrevet i dette manuskriptet kan implementeres for videre studier av ytterligere forskningsspørsmål. For eksempel, mens de representative dataene som er gitt her, er fokusert på 7 dager med statisk impingement, kan denne tilnærmingen tilpasses for å undersøke de biologiske følgene av intermitterende eller syklisk impingement ved å koble strengen viklet rundt bakpoten gjennom klipsen til en mekanisk aktuator som en sprøytepumpe. I tillegg gir plattformen mulighet til å undersøke molekylære mekanismer av interesse ved å supplere kulturmediet med småmolekylagonister/antagonister, eller ved å bruke bakbenseksplanter fra transgene musestammer.

Avslutningsvis har vi presentert en ny murine hind limb explant modell for å studere mekanobiologi underliggende akillessene impingement. Dette er utstyrt med en vevskulturprotokoll som opprettholder cellens levedyktighet over belastningsforhold over 7 dager. Denne modellen rekapitulerer impingement-drevet fibrobruskdannelse og kollagenøs forandring som beskrevet i andre modellsystemer, samt i degenerativ senesykdom. Den eksperimentelle plattformen tillater kontrollert anvendelse og kvantifisering av mekaniske tøyningsmønstre, og gir derfor en utmerket modell for grundige studier av impingement mekanobiologi. Denne modellen kan brukes til å undersøke molekylære mekanismer av interesse for å identifisere potensielle terapeutiske mål i behandlingen av innsettingstendinopatier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige for støtte og assistanse fra Jeff Fox og Vidya Venkatramani fra University of Rochester Center for Musculoskeletal Research's Histology, Biochemistry and Molecular Imaging (HBMI) Core, finansiert delvis av P30AR06965. I tillegg vil forfatterne takke Center for Light Microscopy and Nanoscopy (CALMN) ved University of Rochester Medical Center for hjelp med multifotonmikroskopi. Denne studien ble finansiert av R01 AR070765 og R01 AR070765-04S1, samt 1R35GM147054 og 1R01AR082349.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox - Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cook, J. L., Purdam, C. Is compressive load a factor in the development of tendinopathy. Br J Sports Med. 46 (3), 163-168 (2012).
  2. Benjamin, M., Qin, S., Ralphs, J. R. Fibrocartilage associated with human tendons and their pulleys. J Anat. 187 (Pt 3), 625-633 (1995).
  3. Benjamin, M., Ralphs, J. R. Fibrocartilage in tendons and ligaments - an adaptation to compressive load. J Anat. 193 (4), 481-494 (1998).
  4. Benjamin, M., Theobald, P., Suzuki, D., Toumi, H. The anatomy of the Achilles tendon. The Achilles Tendon. 3, 5-16 (2007).
  5. Chimenti, R. L., et al. Insertional achilles tendinopathy associated with altered transverse compressive and axial tensile strain during ankle dorsiflexion. J Orthop Res. 35 (4), 910-915 (2017).
  6. Mora, K. E., et al. Ultrasound strain mapping of the mouse Achilles tendon during passive dorsiflexion. J Biomech. 132, 110920 (2022).
  7. Pringels, L., et al. Intratendinous pressure changes in the Achilles tendon during stretching and eccentric loading: Implications for Achilles tendinopathy. Scand J Med Sci Sports. 33 (5), 619-630 (2023).
  8. Koob, T. J., Vogel, K. G. Site-related variations in glycosaminoglycan content and swelling properties of bovine flexor tendon. J Orthop Res. 5 (3), 414-424 (1987).
  9. Vogel, K. G., Koob, T. J. Structural specialization in tendons under compression. Int Rev Cytol. 115, 267-293 (1989).
  10. Vogel, K. G., Ordög, A., Pogány, G., Oláh, J. Proteoglycans in the compressed region of human tibialis posterior tendon and in ligaments. J Orthop Res. 11 (1), 68-77 (1993).
  11. Vogel, K. G., Sandy, J. D., Pogány, G., Robbins, J. R. Aggrecan in bovine tendon. Matrix Biol. 14 (2), 171-179 (1994).
  12. Robbins, J. R., Vogel, K. G. Regional expression of mRNA for proteoglycans and collagen in tendon. Eur J Cell Biol. 64 (2), 264-270 (1994).
  13. Vogel, K. Repetitive motion disorders of the upper extremity. Gordon, S. I., Blair, S. J., Fine, L. J. , American Academy of Orthopedic Surgeons, Michigan. (1995).
  14. Benjamin, M., Tyers, R. N., Ralphs, J. R. Age-related changes in tendon fibrocartilage. J Anat. 179, 127-136 (1991).
  15. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: a structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anat Rec. 231 (2), 167-177 (1991).
  16. Rufai, A., Benjamin, M., Ralphs, J. R. Development and ageing of phenotypically distinct fibrocartilages associated with the rat Achilles tendon. Anat Embryol (Berl). 186 (6), 611-618 (1992).
  17. Rufai, A., Ralphs, J. R., Benjamin, M. Ultrastructure of fibrocartilages at the insertion of the rat Achilles tendon. J Anat. 189 (Pt 1), 185-191 (1996).
  18. Waggett, A. D., Ralphs, J. R., Kwan, A. P. L., Woodnutt, D., Benjamin, M. Characterization of collagens and proteoglycans at the insertion of the human achilles tendon. Matrix Biol. 16 (8), 457-470 (1998).
  19. Ralphs, J., et al. Regional differences in cell shape and gap junction expression in rat Achilles tendon: relation to fibrocartilage differentiation. J Anat. 193 (pt 2), 215-222 (1998).
  20. Milz, S., et al. Three-dimensional reconstructions of the Achilles tendon insertion in man. J Anat. 200 (Pt 2), 145-152 (2002).
  21. Tischer, T., Milz, S., Maier, M., Schieker, M., Benjamin, M. An immunohistochemical study of the rabbit suprapatella, a sesamoid fibrocartilage in the quadriceps tendon containing aggrecan. J Histochem Cytochem. 50 (7), 955-960 (2002).
  22. Esquisatto, M. A., Joazeiro, P. P., Pimentel, E. R., Gomes, L. The effect of age on the structure and composition of rat tendon fibrocartilage. Cell Biol Int. 31 (6), 570-577 (2007).
  23. Matuszewski, P. E., et al. Regional variation in human supraspinatus tendon proteoglycans: Decorin, biglycan, and aggrecan. Connect Tissue Res. 53 (5), 343-348 (2012).
  24. Buckley, M. R., Huffman, G. R., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. The location-specific role of proteoglycans in the flexor carpi ulnaris tendon. Connect Tissue Res. 54 (6), 367-373 (2013).
  25. Gillard, G. C., Reilly, H. C., Bell-Booth, P. G., Flint, M. H. The influence of mechanical forces on the glycosaminoglycan content of the rabbit flexor digitorum profundus tendon. Connect Tissue Res. 7 (1), 37-46 (1979).
  26. Giori, N. J., Beaupre, G. S., Carter, D. R. Cellular shape and pressure may mediate mechanical control of tissue composition in tendons. J Orthop Res. 11 (4), 581-591 (1993).
  27. Wren, T. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanobiology of tendon adaptation to compressive loading through fibrocartilaginous metaplasia. J Rehabil Res Dev. 37 (2), 135-143 (2000).
  28. Malaviya, P., et al. An in vivo model for load-modulated remodeling in the rabbit flexor tendon. J Orthop Res. 18 (1), 116-125 (2000).
  29. Shim, J. W., Elder, S. H. Influence of Cyclic Hydrostatic Pressure on Fibrocartilaginous Metaplasia of Achilles Tendon Fibroblasts. Biomech Model Mechanobiol. 5 (4), 247-252 (2006).
  30. Koob, T. J., Clark, P. E., Hernandez, D. J., Thurmond, F. A., Vogel, K. G. Compression loading in vitro regulates proteoglycan synthesis by tendon fibrocartilage. Arch Biochem Biophys. 298 (1), 303-312 (1992).
  31. Evanko, S. P., Vogel, K. G. Proteoglycan Synthesis in Fetal Tendon Is Differentially Regulated by Cyclic Compression in Vitro. Arch Biochem Biophys. 307 (1), 153-164 (1993).
  32. Vogel, K. G. The effect of compressive loading on proteoglycan turnover in cultured fetal tendon. Connect Tissue Res. 34 (3), 227-237 (1996).
  33. Thornton, G. M., et al. Changes in mechanical loading lead to tendon specific alterations in MMP and TIMP expression: influence of stress deprivation and intermittent cyclic hydrostatic compression on rat supraspinatus and Achilles tendons. Br J Sports Med. 44 (10), 698-703 (2010).
  34. Robbins, J. R., Evanko, S. P., Vogel, K. G. Mechanical Loading and TGF-β Regulate Proteoglycan Synthesis in Tendon. Arch Biochem Biophys. 342 (2), 203-211 (1997).
  35. Docking, S., Samiric, T., Scase, E., Purdam, C., Cook, J. Relationship between compressive loading and ECM changes in tendons. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (1), 7-11 (2013).
  36. Wang, X., et al. Aberrant TGF-β activation in bone tendon insertion induces enthesopathy-like disease. J Clin Invest. 128 (2), 846-860 (2018).
  37. Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. J Orthop Res. 36 (10), 2780-2788 (2018).
  38. Liu, Y., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: development and analysis of a novel rat model. J Shoulder Elbow Surg. 31 (9), 1898-1908 (2022).
  39. Majima, T., et al. Compressive compared with tensile loading of medial collateral ligament scar in vitro uniquely influences mRNA levels for aggrecan, collagen type II, and collagenase. J Orthop Res. 18 (4), 524-531 (2000).
  40. Hopkins, C., et al. Critical review on the socio-economic impact of tendinopathy. Asia Pac J Sports Med, Arthrosc, Rehabil Technol. 4, 9-20 (2016).
  41. Scott, A., Ashe, M. C. Common tendinopathies in the upper and lower extremities. Curr Sports Med Rep. 5 (5), 233-241 (2006).
  42. Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin Sports Med. 22 (4), 675-692 (2003).
  43. Bah, I., et al. Tensile mechanical changes in the Achilles tendon due to Insertional Achilles tendinopathy. J Mech Behav Biomed Mater. 112, 104031 (2020).
  44. Chondral Metaplasia in Calcific Insertional Tendinopathy of the Achilles Tendon. Clin J Sport Med. Maffulli, N., Reaper, J., Ewen, S. W. B., Waterston, S. W., Barrass, V. 16 (4), 329-334 (2006).
  45. Corps, A. N., et al. Increased expression of aggrecan and biglycan mRNA in Achilles tendinopathy. Rheumatology (Oxford). 45 (3), 291-294 (2006).
  46. Scott, A., et al. Increased versican content is associated with tendinosis pathology in the patellar tendon of athletes with jumper's knee. Scand J Med Sci Sports. 18 (4), 427-435 (2008).
  47. Attia, M., et al. Greater glycosaminoglycan content in human patellar tendon biopsies is associated with more pain and a lower VISA score. Br J Sports Med. 48 (6), 469-475 (2014).
  48. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative Incidence of Achilles Tendon Rupture and Tendinopathy in Male Former Elite Athletes. Clin J Sport Med. 15 (3), 133-135 (2005).
  49. Corps, A. N., et al. Changes in matrix protein biochemistry and the expression of mRNA encoding matrix proteins and metalloproteinases in posterior tibialis tendinopathy. Ann Rheum Dis. 71 (5), 746-752 (2012).
  50. Neer, C. S. 2nd Anterior acromioplasty for the chronic impingement syndrome in the shoulder: a preliminary report. J Bone Joint Surg Am. 54 (1), 41-50 (1972).
  51. Bigliani, L. U., Ticker, J. B., Flatow, E. L., Soslowsky, L. J., Mow, V. C. The relationship of acromial architecture to rotator cuff disease. Clin Sports Med. 10 (4), 823-838 (1991).
  52. Chimenti, R. L., Cychosz, C. C., Hall, M. M., Phisitkul, P. Current Concepts Review Update Insertional Achilles Tendinopathy. Foot Ankle Int. 38 (10), 1160-1169 (2017).
  53. Nicholson, C. W., Berlet, G. C., Lee, T. H. Prediction of the Success of Nonoperative Treatment of Insertional Achilles Tendinosis Based on MRI. Foot Ankle Int. 28 (4), 472-477 (2007).
  54. Lohrer, H., David, S., Nauck, T. Surgical treatment for achilles tendinopathy - a systematic review. BMC musculoskelet disord. 17 (1), 207 (2016).
  55. McGarvey, W. C., Palumbo, R. C., Baxter, D. E., Leibman, B. D. Insertional Achilles Tendinosis: Surgical Treatment Through a Central Tendon Splitting Approach. Foot Ankle Int. 23 (1), 19-25 (2002).
  56. Maffulli, N., et al. Surgery for chronic Achilles tendinopathy produces worse results in women. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1714-1720 (1714).
  57. Wunderli, S. L., Blache, U., Snedeker, J. G. Tendon explant models for physiologically relevant in vitro study of tissue biology - a perspective. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 262-277 (2020).
  58. Dyment, N. A., et al. A brief history of tendon and ligament bioreactors: Impact and future prospects. J Orthop Res. 38 (11), 2318-2330 (2020).
  59. Screen, H. R. C., Berk, D. E., Kadler, K. E., Ramirez, F., Young, M. F. Tendon Functional Extracellular Matrix. J Orthop Res. 33 (6), 793-799 (2015).
  60. Theobald, P., et al. The functional anatomy of Kager's fat pad in relation to retrocalcaneal problems and other hindfoot disorders. J Anat. 208 (1), 91-97 (2006).
  61. Ghazzawi, A., Theobald, P., Pugh, N., Byrne, C., Nokes, L. Quantifying the motion of Kager's fat pad. J Orthop Res. 27 (11), 1457-1460 (2009).
  62. Malagelada, F., et al. Pressure changes in the Kager fat pad at the extremes of ankle motion suggest a potential role in Achilles tendinopathy. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 28 (1), 148-154 (2020).
  63. Shaw, H. M., Benjamin, M. Structure-function relationships of entheses in relation to mechanical load and exercise. Scand J Med Sci Sports. 17 (4), 303-315 (2007).
  64. Soslowsky, L. J., et al. Rotator cuff tendinosis in an animal model: role of extrinsic and overuse factors. Ann Biomed Eng. 30 (8), 1057-1063 (2002).
  65. Schneeberger, A. G., Nyffeler, R. W., Gerber, C. Structural changes of the rotator cuff caused by experimental subacromial impingement in the rat. J Shoulder Elbow Surg. 7 (4), 375-380 (1998).
  66. Croen, B. J., et al. Chronic subacromial impingement leads to supraspinatus muscle functional and morphological changes: Evaluation in a murine model. J Orthop Res. 39 (10), 2243-2251 (2021).
  67. Andarawis-Puri, N., Flatow, E. L. Tendon fatigue in response to mechanical loading. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 106-114 (2011).
  68. Gains, C. C., Giannapoulos, A., Zamboulis, D. E., Lopez-Tremoleda, J., Screen, H. R. C. Development and application of a novel in vivo overload model of the Achilles tendon in rat. J Biomech. 151, 111546 (2023).
  69. Williamson, P. M., et al. A passive ankle dorsiflexion testing system to assess mechanobiological and structural response to cyclic loading in rat Achilles tendon. J Biomech. 156, 111664 (2023).
  70. Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A Novel, Open-Source, Low-Cost Bioreactor for Load-Controlled Cyclic Loading of Tendon Explants. J Biomech Eng. 144 (8), 084505 (2022).
  71. Orishimo, K. F., et al. Effect of Knee Flexion Angle on Achilles Tendon Force and Ankle Joint Plantarflexion Moment During Passive Dorsiflexion. J Foot Ankle Surg. 47 (1), 34-39 (2008).
  72. Liu, C. L., et al. Influence of different knee and ankle ranges of motion on the elasticity of triceps surae muscles, Achilles tendon, and plantar fascia. Sci Rep. 10 (1), 6643 (2020).
  73. Cruz-Montecinos, C., et al. Soleus muscle and Achilles tendon compressive stiffness is related to knee and ankle positioning. J Electromyogr Kinesiol. 66, 102698 (2022).
  74. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Lose-dose administration of dexamethasone is beneficial in preventing secondary tendon damage in a stress-deprived joint injury explant model. J Orthop Res. 38 (1), 139-149 (2020).
  75. Wunderli, S. L., et al. Tendon response to matrix unloading is determined by the patho-physiological niche. Matrix Biol. 89, 11-26 (2020).
  76. Yabusaki, K., et al. A Novel Quantitative Approach for Eliminating Sample-To-Sample Variation Using a Hue Saturation Value Analysis Program. PloS one. 9 (3), e89627 (2014).
  77. Gao, J., Messner, K., Ralphs, J. R., Benjamin, M. An immunohistochemical study of enthesis development in the medial collateral ligament of the rat knee joint. Anat Embryol. 194 (4), 399-406 (1996).
  78. Han, S. K., Wouters, W. A. J., Clark, A., Herzog, W. Mechanically induced calcium signaling in chondrocytes in situ. J Orthop Res. 30 (3), 475-481 (2012).
  79. Han, W., et al. Impact of cellular microenvironment and mechanical perturbation on calcium signalling in meniscus fibrochondrocytes. Eur Cell Mater. 27, 321-331 (2014).
  80. Rossetti, L., et al. The microstructure and micromechanics of the tendon-bone insertion. Nat Mater. 16 (6), 664-670 (2017).
  81. Sartori, J., Köhring, S., Witte, H., Fischer, M. S., Löffler, M. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
  82. Eliasberg, C. D., et al. Identification of Inflammatory Mediators in Tendinopathy Using a Murine Subacromial Impingement Model. J Orthop Res. 37 (12), 2575-2582 (2019).
  83. Zhang, Y., et al. Expression of alarmins in a murine rotator cuff tendinopathy model. J Orthop Res. 38 (11), 2513-2520 (2020).
  84. Zhang, X., et al. Assessment of Mitochondrial Dysfunction in a Murine Model of Supraspinatus Tendinopathy. J Bone Joint Surg. Am. 103 (2), 174-183 (2021).
  85. Liu, Y., et al. The role of Indian Hedgehog Signaling in tendon response to subacromial impingement: evaluation using a mouse model. Am J Sports Med. 50 (2), 362-370 (2022).
  86. Wang, T., et al. Load-induced regulation of tendon homeostasis by SPARC, a genetic predisposition factor for tendon and ligament injuries. Sci Transl Med. 13 (582), eabe5738 (2021).
  87. Passini, F. S., et al. Shear-stress sensing by PIEZO1 regulates tendon stiffness in rodents and influences jumping performance in humans. Nat Biomed Eng. 5 (12), 1457-1471 (2021).
  88. Jones, D. L., et al. Mechanoepigenetic regulation of extracellular matrix homeostasis via Yap and Taz. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (22), e2211947120 (2023).
  89. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Release of pro-inflammatory cytokines from muscle and bone causes tenocyte death in a novel rotator cuff in vitro explant culture model. Connect Tissue Res. 59 (5), 423-436 (2018).
  90. Rees, S. G., et al. Catabolism of aggrecan, decorin and biglycan in tendon. Biochem J. 350 (Pt 1), 181-188 (2000).
  91. Samiric, T., Ilic, M. Z., Handley, C. J. Large aggregating and small leucine-rich proteoglycans are degraded by different pathways and at different rates in tendon. Eur J Biochem. 271 (17), 3612-3620 (2004).
  92. Rees, S. G., Curtis, C. L., Dent, C. M., Caterson, B. Catabolism of aggrecan proteoglycan aggregate components in short-term explant cultures of tendon. Matrix Biol. 24 (3), 219-231 (2005).
  93. Taye, N., Karoulias, S. Z., Hubmacher, D. The "other" 15-40%: The Role of Non-Collagenous Extracellular Matrix Proteins and Minor Collagens in Tendon. J Orthop Res. 38 (1), 23-35 (2020).
  94. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L. The development of the pressure-bearing tendon of the bullfrog, Rana catesbeiana. Anat Embryol. 200 (1), 55-64 (1999).
  95. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L., Covizi, D. Z., Della Colleta, H. H., Gomes, L. Structure and proteoglycan composition of specialized regions of the elastic tendon of the chicken wing. Cell Tissue Res. 300 (3), 435-446 (2000).
  96. van Sterkenburg, M. N., Kerkhoffs, G. M., Kleipool, R. P., Niek van Dijk, C. The plantaris tendon and a potential role in mid-portion Achilles tendinopathy: an observational anatomical study. J Anat. 218 (3), 336-341 (2011).
  97. Lee, A. H., Elliott, D. M. Comparative multi-scale hierarchical structure of the tail, plantaris, and Achilles tendons in the rat. J Anat. 234 (2), 252-262 (2019).
  98. Lee, A. H., Elliott, D. M. Multi-Scale Loading and Damage Mechanisms of Plantaris and Rat Tail Tendons. J Orthop Res. 37 (8), 1827-1837 (2019).
  99. Fan, H. M., Shrestha, L., Guo, Y., Tao, H. R., Sun, Y. L. The twisted structure of the rat Achilles tendon. J Anat. 239 (5), 1134-1140 (2021).
  100. Cutlip, R. G., Stauber, W. T., Willison, R. H., McIntosh, T. A., Means, K. H. Dynamometer for rat plantar flexor muscles in vivo. Med Biol Eng Comput. 35 (5), 540-543 (1997).
  101. Rijkelijkhuizen, J. M., Baan, G. C., de Haan, A., de Ruiter, C. J., Huijing, P. A. Extramuscular myofascial force transmission for in situ rat medial gastrocnemius and plantaris muscles in progressive stages of dissection. J Exp Biol. 208 (Pt 1), 129-140 (2005).
  102. Saxena, A., Bareither, D. Magnetic Resonance and Cadaveric Findings of the Incidence of Plantaris Tendon. Foot Ankle Int. 21 (7), 570-572 (2000).
  103. dos Santos, M. A., Bertelli, J. A., Kechele, P. R., Duarte, H. Anatomical study of the plantaris tendon: reliability as a tendo-osseous graft. Surg Radiol Anat. 31 (1), 59-61 (2009).
  104. Sartori, J., Köhring, S., Bruns, S., Moosmann, J., Hammel, J. U. Gaining Insight into the Deformation of Achilles Tendon Entheses in Mice. Adv Eng Mater. 23 (11), 2100085 (2021).

Tags

Bioteknologi utgave 202
Murine Hind Limb Explant modell for å studere mekanobiologi av akillesseneimpingement
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W.,… More

Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W., Buckley, M. R. Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement. J. Vis. Exp. (202), e65801, doi:10.3791/65801 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter