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Bioengineering

Achilles कण्डरा Impingement के मेकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए Murine हिंद लिंब एक्सप्लांट मॉडल

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65801
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

Summary

हम एक कस्टम प्रयोगात्मक मंच और टिशू कल्चर प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो निरंतर सेल व्यवहार्यता के साथ murine हिंद अंग explants में Achilles कण्डरा सम्मिलन के प्रभाव से प्रेरित फाइब्रोकार्टिलाजिनस परिवर्तन को फिर से बनाता है, जो कण्डरा टकराव के mechanobiology की खोज के लिए उपयुक्त मॉडल प्रदान करता है।

Abstract

हड्डी पर कण्डरा प्रभाव स्पष्ट रूप से ऊंचा अनुप्रस्थ संपीड़ित तनाव के साथ एक बहुअक्षीय यांत्रिक तनाव वातावरण उत्पन्न करता है, जो ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन (जीएजी) -समृद्ध मैट्रिक्स के संचय और कोलेजन नेटवर्क के रीमॉडेलिंग द्वारा विशेषता वाले स्थानीयकृत फाइब्रोकार्टिलेज फेनोटाइप को प्राप्त करता है। जबकि फाइब्रोकार्टिलेज स्वस्थ टेंडन के प्रभावित क्षेत्रों में एक सामान्य विशेषता है, अतिरिक्त जीएजी जमाव और कोलेजन नेटवर्क की अव्यवस्था टेंडिनोपैथी की पहचान विशेषताएं हैं। तदनुसार, टेंडिनोपैथी की दीक्षा और प्रगति में एक महत्वपूर्ण बाहरी कारक के रूप में चिकित्सकीय रूप से मान्यता प्राप्त है। फिर भी, कण्डरा टकराव अंतर्निहित मैकेनोबायोलॉजी का अध्ययन नहीं किया गया है। कण्डरा टकराव के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया को स्पष्ट करने के पूर्व प्रयासों ने कोशिकाओं के लिए एकअक्षीय संपीड़न लागू किया है और इन विट्रो में कण्डरा एक्सप्लांट्स को उत्तेजित किया है। हालांकि, पृथक कोशिकाओं में मेकेनोरेस्पॉन्स के लिए महत्वपूर्ण त्रि-आयामी बाह्य वातावरण की कमी होती है, और इन विट्रो और एक्सक्साइड एक्सप्लांट अध्ययन दोनों विवो में कण्डरा टकराव द्वारा उत्पन्न बहुअक्षीय तनाव वातावरण को पुन: प्राप्त करने में विफल रहते हैं, जो कि प्रभावित क्षेत्र की शारीरिक विशेषताओं पर निर्भर करता है। इसके अलावा, कण्डरा टकराव के विवो मॉडल में यांत्रिक तनाव पर्यावरण पर नियंत्रण की कमी होती है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम एक उपन्यास murine हिंद अंग explant मॉडल प्रस्तुत Achilles कण्डरा impingement के mechanobiology का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है. यह मॉडल स्थानीय शरीर रचना को संरक्षित करने के लिए एच्लीस कण्डरा को सीटू में बनाए रखता है और अपने मूल वातावरण के भीतर कोशिकाओं को बनाए रखते हुए निष्क्रिय रूप से लागू टखने के डॉर्सिफ्लेक्सियन के दौरान कैल्केनस पर एच्लीस कण्डरा सम्मिलन के प्रभाव से उत्पन्न बहुअक्षीय तनाव वातावरण को पुन: पेश करता है। हम इस मॉडल के अभिन्न अंग एक टिशू कल्चर प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और 7 दिनों में निरंतर एक्सप्लांट व्यवहार्यता स्थापित करने वाले डेटा प्रस्तुत करते हैं। प्रतिनिधि परिणाम बढ़ाया हिस्टोलॉजिकल जीएजी धुंधला प्रदर्शित करते हैं और कोलेजन फाइबर संरेखण माध्यमिक को प्रभावित करने के लिए कम हो जाते हैं, ऊंचा फाइब्रोकार्टिलेज गठन का सुझाव देते हैं। इस मॉडल को आसानी से विभिन्न यांत्रिक लोडिंग रेजिमेंस की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और प्रभाव के जवाब में एच्लीस कण्डरा में फेनोटाइपिक परिवर्तन की मध्यस्थता करने वाले तंत्र की पहचान करने के लिए ब्याज के आणविक मार्गों में हेरफेर की अनुमति देता है।

Introduction

एच्लीस कण्डरा और रोटेटर कफ टेंडन सहित टेंडन की एक भीड़, सामान्य शारीरिक स्थिति के कारण बोनी टकराव का अनुभव करती है1,2,3,4. कण्डरा टकराव अनुदैर्ध्य फाइबर अक्ष के लिए अनुप्रस्थ रूप से निर्देशित संपीड़ित तनाव उत्पन्न करता है5,6,7. कण्डरा टकराव के क्षेत्र एक अद्वितीय फाइब्रोकार्टिलेज फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं जिसमें सिकुड़े, गोल कोशिकाएं (फाइब्रोकॉन्ड्रोसाइट्स) एक असंगठित कोलेजन नेटवर्क के भीतर एम्बेडेड होती हैं जिसमें स्पष्ट रूप से ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन (जीएजी) सामग्री होती है2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. पहले के अध्ययनों से पता चलता है कि कण्डरा टकराव द्वारा उत्पादित असमान यांत्रिक वातावरण बड़े एकत्रीकरण प्रोटीओग्लाइकेन्स के जमाव को चलाकर इस जीएजी-समृद्ध मैट्रिक्स को बनाए रखता है, विशेष रूप से एग्रीकेन, हालांकि अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट नहीं हैं1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. जबकि फाइब्रोकार्टिलेज स्वस्थ टेंडन के प्रभावित क्षेत्रों में एक सामान्य विशेषता है, अत्यधिक फाइब्रोकार्टिलेज गठन से जुड़ा असामान्य प्रोटियोग्लाइकन चयापचय टेंडिनोपैथी की एक बानगी विशेषता है, जो एक आम और दुर्बल करने वाली बीमारी है जो कालानुक्रमिक रूप से प्रभावित टेंडन में उभरती है1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. तदनुसार, कण्डरा टकराव को नैदानिक रूप से एक महत्वपूर्ण बाहरी कारक के रूप में मान्यता प्राप्त है, जो रोटेटर कफ रोग और सम्मिलन अकिलीज़ टेंडिनोपैथी (आईएटी) सहित कई सबसे आम टेंडिनोपैथियों को चलाता है50,51,52. वर्तमान में, टेंडिनोपैथी का उपचार अक्षम है। उदाहरण के लिए, आईएटी के लगभग 47% रोगियों को परिवर्तनीय पश्चात परिणामों के साथ असफल रूढ़िवादी प्रबंधन के बाद सर्जिकल हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है53,54,55,56. प्रभाव और टेंडिनोपैथी के बीच स्पष्ट संबंध के बावजूद, मेकेनोबायोलॉजिकल तंत्र जिसके द्वारा कोशिकाओं को कण्डरा अर्थ में लगाया जाता है और उनके यांत्रिक वातावरण का जवाब दिया जाता है, खराब रूप से वर्णित किया जाता है, जो टेंडिनोपैथी रोगजनन की समझ को अस्पष्ट करता है और परिणामस्वरूप अपर्याप्त उपचार होता है।

एक्सप्लांट मॉडल कण्डरा मेकेनोबायोलॉजी57,58 के अध्ययन में उपयोगी उपकरण हैं। कण्डरा टकराव के मेकेनोबायोलॉजी को समझने की दिशा में पहले कदम के रूप में, कई पूर्व अध्ययनों ने कोशिकाओं या एक्साइज्ड कण्डराएक्सप्लांट्स 27,29,30,31,32,33,34,39 के लिए सरल एकअक्षीय संपीड़न के आवेदन के बाद सेलुलर प्रतिक्रिया का पता लगाया है। हालांकि, इन विट्रो में कोशिकाओं में बाह्य और पेरिकोल्युलर मैट्रिसेस की कमी होती है जो तनाव हस्तांतरण की सुविधा प्रदान करते हैं, यांत्रिक विरूपण द्वारा जारी महत्वपूर्ण विकास कारकों और साइटोकिन्स को अनुक्रमित करते हैं, और फोकल आसंजन परिसरों के लिए सब्सट्रेट प्रदान करते हैं जो मैकेनोट्रांसडक्शन57,59में भूमिका निभाते हैं। इसके अतिरिक्त, इन विट्रो और एक्साइज़्ड एक्सप्लांट अध्ययन दोनों विवो में कण्डरा टकराने से उत्पन्न बहुअक्षीय यांत्रिक तनाव वातावरण को पुन: व्यवस्थित करने में विफल रहते हैं, जो कि प्रभावित क्षेत्र 5,6 की शारीरिक विशेषताओं पर निर्भर करता है। इम्पिंग्ड अकिलीज़ टेंडन सम्मिलन के संदर्भ में, इसमें आसपास के ऊतक जैसे रेट्रोकैल्केनियल बर्सा और केगर का वसा पैड60,61,62,63 शामिल हैं। इसके विपरीत, कण्डरा टकराव 25,28,36,37,38,64,65,66 के विवो मॉडल में सीधे कण्डरा पर लागू भार की भयावहता और आवृत्ति पर न्यूनतम नियंत्रण की अनुमति देता है, जो कण्डरा मेकेनोबायोलॉजी 57,58 का अध्ययन करने के लिए विवो मॉडल में एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त सीमा है,67,68,69,70. विवो में कण्डरा तनाव को मापने में चुनौतियों को देखते हुए, इन मॉडलों के भीतर उत्पन्न आंतरिक तनाव वातावरण अक्सर खराब विशेषता है।

इस पांडुलिपि में, हम एक कस्टम प्रयोगात्मक मंच प्रस्तुत करते हैं जो पूरे म्यूरिन हिंद अंग एक्सप्लांट्स के भीतर कैल्केनस पर एच्लीस कण्डरा सम्मिलन के प्रभाव को फिर से बनाता है, जब इस ऊतक संस्कृति प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा जाता है, तो एक्सप्लांट कल्चर में 7 दिनों से अधिक व्यवहार्यता बनाए रखता है और अध्ययन की अनुमति देता है कण्डरा टकराव के जैविक अनुक्रम। प्लेटफ़ॉर्म एक 3D प्रिंटेड पॉलीलैक्टिक एसिड (PLA) बेस पर बनाया गया है जो ग्रिप्स के अटैचमेंट और 3D प्रिंटेड PLA वॉल्यूम रिडक्शन इंसर्ट के लिए नींव प्रदान करता है। पकड़ का उपयोग ऊपरी पैर और घुटने के समीपस्थ को अकिलीज़ मायोटेंडिनस जंक्शन पर ऊपर की ओर हिंद अंग के दुम के पहलू के साथ करने के लिए किया जाता है, जिससे अल्ट्रासाउंड जांच या उल्टे माइक्रोस्कोप(चित्रा 1ए)का उपयोग करके ऊपर से एच्लीस कण्डरा को इमेज किया जा सकता है। वॉल्यूम में कमी आधार पर एक ट्रैक के साथ स्लाइड सम्मिलित करती है और टिशू कल्चर मीडिया की आवश्यक मात्रा को कम करती है। हिंद पंजा के चारों ओर लिपटी एक लट रेखा को आधार डिजाइन और एक 3 डी प्रिंटेड पीएलए क्लिप का उपयोग करके मंच से बाहर निकाला जाता है। स्ट्रिंग पर खींचकर, हिंद पंजा dorsiflexed है, और Achilles कण्डरा सम्मिलन calcaneus के खिलाफ impinged है, ऊंचा अनुप्रस्थ संपीड़न तनाव 5,6 (चित्रा 1 ए) में जिसके परिणामस्वरूप. मंच एक ऐक्रेलिक स्नान के भीतर निहित है जो टिशू कल्चर मीडिया में डूबे हिंद अंग एक्सप्लांट को बनाए रखता है। चिपकने वाली टेप के साथ स्नान के बाहर तना हुआ स्ट्रिंग सुरक्षित करने से एच्लीस कण्डरा सम्मिलन के स्थिर प्रभाव का उत्पादन करने के लिए टखने के डोरसिफ्लेक्सियन को बनाए रखता है। 3 डी मुद्रित घटकों के लिए सीएडी फाइलें कई प्रारूपों (पूरक फ़ाइल 1) में प्रदान की जाती हैं, जो प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप संशोधन के लिए वाणिज्यिक और मुक्त, ओपन-सोर्स सीएडी सॉफ्टवेयर की एक श्रृंखला में आयात की अनुमति देती हैं। यदि निर्माण के लिए 3 डी प्रिंटर तक पहुंच उपलब्ध नहीं है, तो सीएडी फाइलें ऑनलाइन 3 डी प्रिंटिंग सेवाओं को प्रदान की जा सकती हैं जो कम लागत पर भागों को प्रिंट और शिप करेंगी।

महत्वपूर्ण रूप से, ट्राइसेप्स सुरा-अकिलीज़ मस्कुलोटेंडिनस कॉम्प्लेक्स घुटने और टखने दोनों जोड़ों को 71,72,73 तक फैलाता है। नतीजतन, अकिलीज़ कण्डरा में तन्यता तनाव घुटने के लचीलेपन से प्रभावित होता है। घुटने का विस्तार अकिलीज़ कण्डरा को तनाव में रखता है, जबकि घुटने का लचीलापन तनाव को कम करता है। पहले घुटने का विस्तार करके और फिर टखने को निष्क्रिय रूप से डॉर्सिफ्लेक्स करके, टखने को दबाने वाले सम्मिलन पर संपीड़ित उपभेदों को तन्यता उपभेदों पर आरोपित किया जा सकता है। इसके विपरीत, घुटने के फ्लेक्स के साथ टखने को निष्क्रिय रूप से डॉर्सिफ्लेक्स करके, तन्यता तनाव कम हो जाता है, और संपीड़ित तनाव बना रहता है। वर्तमान प्रोटोकॉल तीन ऐसी स्थितियों की पड़ताल करता है। 1) स्थैतिक टकराव के लिए, पैर को टिबिया के संबंध में 110 ° < करने के लिए पृष्ठीय किया जाता है ताकि सम्मिलन को प्रभावित किया जा सके, तनाव को कम करने के लिए घुटने को फ्लेक्स किया जाता है। 2) आधारभूत तनाव समूह के लिए, टखने को घुटने के साथ डोरसिफ्लेक्सियन के 145 ° से ऊपर बढ़ाया जाता है, जिससे सम्मिलन पर मुख्य रूप से तन्यता तनाव पैदा होता है। 3) अनलोड किए गए समूह के लिए, बाहरी रूप से लागू भार की अनुपस्थिति में तटस्थ स्थिति में घुटने और टखने के साथ पेट्री डिश में एक्सप्लांट्स को सुसंस्कृत किया जाता है। ऊपर उल्लिखित कोणों को एक समन्वय प्रणाली के सापेक्ष फोटोग्राफिक रूप से मापा जाता है जहां पैर और टिबिया 180 ° के कोण पर समानांतर होते हैं और 90 ° के कोण पर लंबवत होते हैं।

प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों में शामिल हैं 1) हिंद अंग explants के विच्छेदन और त्वचा और plantaris कण्डरा के सावधान हटाने; 2) 48 घंटे डेक्सामेथासोन प्रीट्रीटमेंट के बाद एक्सप्लांट कल्चर; 3) ऊतक सेक्शनिंग और हिस्टोलॉजिकल धुंधला; और 4) फाइब्रोकार्टिलेज गठन का आकलन करने के लिए रंग छवि विश्लेषण। विच्छेदन के बाद, प्रत्येक हिंद अंग एक्सप्लांट को डेक्सामेथासोन74 के साथ पूरक संस्कृति मीडिया में 48 घंटे के लिए पूर्ववत किया जाता है। प्रत्येक माउस से contralateral अंगों जोड़ीदार तुलना, जो जैविक परिवर्तनशीलता को नियंत्रित करने में मदद करता है के लिए अलग प्रयोगात्मक समूहों को सौंपा जाता है. दिखावा के बाद, एक्सप्लांट्स को ऊपर वर्णित प्लेटफार्मों में तैनात किया जाता है और 7 और दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है (चित्र 1बी)। अतिरिक्त तुलना एक पूर्व उपचारित (दिन 0) समूह के लिए की जाती है जिसमें 48 घंटे के प्रीट्रीटमेंट के तुरंत बाद एक्सप्लांट हटा दिए जाते हैं।

एक्सप्लांट कल्चर के बाद, हिंद अंगों को छंटनी की जाती है, फॉर्मेलिन को ठीक किया जाता है, डिकैल्सीफाइड और पैराफिन में एम्बेडेड किया जाता है। धनु अभिविन्यास में सीरियल सेक्शनिंग पूरे कण्डरा के माध्यम से अनुभाग गहराई को ट्रैक करने की अनुमति देते हुए मायोटेंडिनस जंक्शन से कैल्केनियल सम्मिलन तक एच्लीस कण्डरा का दृश्य प्रदान करता है। टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइडिल ट्रांसफरेज़ (टीडीटी) -मध्यस्थता डीएटीपी एक्स-निक लेबलिंग (ट्यूनल) का उपयोग एपोप्टोसिस के लिए डीएनए क्षति माध्यमिक की कल्पना करने और व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए किया जाता है। टोलुइडाइन ब्लू हिस्टोलॉजी और कस्टम रंग छवि विश्लेषण जीएजी धुंधला में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। टोलुइडाइन नीले सना हुआ ऊतक वर्गों तो कोलाज फाइबर संगठन (चित्रा 1 बी) में परिवर्तन की विशेषता के लिए एसएचजी इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाता है.

प्रदान किए गए प्रतिनिधि परिणाम जीएजी-समृद्ध मैट्रिक्स के परिवर्तित हिस्टोलॉजिकल धुंधला होने और मॉडल के भीतर 7 दिनों के स्थिर प्रभाव से उत्पन्न बाह्य कोलेजन नेटवर्क के अव्यवस्था का सुझाव देते हैं। इस मॉडल का उपयोग आणविक तंत्र का पता लगाने के लिए किया जा सकता है जो प्रभाव-संचालित फाइब्रोकार्टिलाजिनस परिवर्तन के अंतर्निहित है।

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Protocol

सभी जानवरों के काम को पशु संसाधन पर रोचेस्टर समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. टिशू कल्चर मीडिया की तैयारी

  1. संस्कृति Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (1x DMEM) में 1% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 200 माइक्रोन एल-एस्कॉर्बिक एसिड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक इनक्यूबेटर में एक्सप्लांट। प्रारंभिक 48 घंटे pretreatment के लिए, संस्कृति प्रत्येक 100 एनएम डेक्सामेथासोन74 के साथ पूरक संस्कृति मीडिया के 70 एमएल में प्रत्यारोपण. प्रीट्रीटमेंट के बाद, डेक्सामेथासोन के बिना 7 और दिनों के लिए संस्कृति अंग, हर 48-72 घंटे में मीडिया बदलना।
    नोट: सीरम के अलावा, जैसे कि भ्रूण गोजातीय सीरम, संस्कृति मीडिया के लिए वंडरली, ब्लाचे और स्नेडेकर57 द्वारा प्रदान की गई सिफारिशों के अनुरूप सलाह नहीं दी जाती है। संक्षेप में, सीरम मुक्त स्थितियां विवो में मौजूद अवशिष्ट, पोषक तत्व-गरीब कण्डरा माइक्रोएन्वायरमेंट का बेहतर प्रतिनिधित्व करती हैं। इसके अलावा, सीरम पूरकता कुछ संस्कृति शर्तों75 के तहत ऊतक गिरावट को बढ़ावा देने और ऊतक से बाहर सेल प्रसार और प्रवास को उत्तेजित कर सकते हैं, कण्डरा विकृति57 की दोनों विशेषताएं.
  2. अनलोडेड समूह के लिए, प्रत्येक एक्सप्लांट मीडिया के 70 एमएल में संस्कृति करता है। आधारभूत तनाव और स्थैतिक टकराव समूहों के लिए, प्रत्येक मंच को अंग को जलमग्न रखने के लिए संस्कृति मीडिया के लगभग 125 एमएल की आवश्यकता होती है। यह मात्रा पकड़ और 3 डी प्रिंट मापदंडों में ऊपरी पैर की स्थिति के आधार पर भिन्न हो सकती है, मुख्य रूप से इन्फिल घनत्व।

2. एक्सप्लांट विच्छेदन और डेक्सामेथासोन प्रीट्रीटमेंट

  1. सीओ2 साँस लेना और माध्यमिक ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से चूहों को इच्छामृत्यु दें, या संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार। यह प्रोटोकॉल 1 वर्ष से कम उम्र के C57BL/6 चूहों का उपयोग करता है। हिंद अंग का आकार उम्र के साथ बढ़ेगा और पकड़ के भीतर फिट होने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है।
  2. विच्छेदन से पहले, एक बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में एक 100 मिमी (व्यास) x 25 मिमी (ऊंचाई) पेट्री डिश में prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) संस्कृति मीडिया के 70 एमएल हस्तांतरण. 100 एनएम कार्यशील एकाग्रता प्राप्त करने के लिए डेक्सामेथासोन जोड़ें।
  3. विच्छेदन शोषक underpads का उपयोग बेंचटॉप पर किया जा सकता है, बीएससी में हिंद अंग explants हस्तांतरण से पहले विच्छेदन के माध्यम से तेजी से काम कर रहा है. इस विच्छेदन के लिए आवश्यक शल्य चिकित्सा उपकरण इकट्ठा करें जिसमें चिकनी, सीधे, ठीक टिप संदंश शामिल हैं; दाँतेदार दांतों के साथ सीधे, ठीक टिप संदंश; और सीधी, तेज, ठीक कैंची।
  4. हिंद अंग explants के विच्छेदन के लिए, एक लापरवाह स्थिति में माउस जगह है और कूल्हे संयुक्त की पहचान. ठीक कैंची का प्रयोग, ऊपरी पैर के समीपस्थ और पूर्वकाल (कपाल) पहलू ओवरले त्वचा के माध्यम से एक छोटा (5-10 मिमी) चीरा बनाने.
  5. विस्तार करने के लिए चीरा को अलग खींचें, उंगलियों का उपयोग करके उजागर ऊपरी पैर को चुटकी लें, और ध्यान से त्वचा को दूर से खींचें ताकि हिंद अंग को टखने के स्तर तक डिग्लोव किया जा सके। धीरे पैर के पृष्ठीय पहलू के साथ त्वचा के नीचे एक कैंची ब्लेड डालें और पैर की उंगलियों तक फैले एक चीरा बनाएं। पूरी तरह से हटाने के लिए त्वचा को दूर से खींचना जारी रखें।
  6. माउस स्थिति टखने के पास, calcaneus के पीछे (दुम) पहलू पर Achilles कण्डरा प्रविष्टि कल्पना. अकिलीज़ कण्डरा सम्मिलन के समीपस्थ, प्लांटारिस कण्डरा सीधे अकिलीज़ कण्डरा की औसत दर्जे की सीमा के निकट स्थित है और पैर के तल के पहलू की ओर दूर से फैलता है, जो कैल्केनस के पीछे के पहलू से गुजरता है।
  7. प्लांटारिस कण्डरा को हटाने के लिए, ध्यान से दो tendons के बीच चिकनी, ठीक टिप संदंश के एक टिप डालें और रोपण कण्डरा के नीचे से गुजरने वाली नोक का विस्तार करें। टिप को समीपस्थ रूप से ड्रा करें और प्लांटारिस मांसपेशी के माध्यम से फाड़ दें। ठीक टिप, दाँतेदार संदंश का प्रयोग, plantaris कण्डरा के अलग समीपस्थ अंत हड़पने और दूर से दूर खींच को दूर करने के लिए.
  8. कूल्हे के जोड़ पर, श्रोणि के माध्यम से काटने और हिंद अंग को अलग करने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें। शेष श्रोणि को बंद करने और ऊरु सिर को उजागर करने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  9. हिंद अंग एक्सप्लांट को बीएससी में स्थानांतरित करें और डेक्सामेथासोन के साथ सेल कल्चर मीडिया युक्त डिश में। इनक्यूबेटर में पकवान ले जाएँ और 48 घंटे के लिए दिखावा करें।

3. एक्सप्लांट कल्चर और लोडिंग प्लेटफॉर्म

  1. जैसा कि 48 घंटे का दिखावा समाप्त होता है, संस्कृति मीडिया (अनुभाग 1) की पर्याप्त मात्रा को प्रीवार्म करता है। इस बिंदु से आगे, संस्कृति मीडिया में कोई डेक्सामेथासोन नहीं जोड़ा जाएगा। इस समय, पूर्ववर्ती (दिन 0) समूह से अंगों को भविष्य के सेक्शनिंग, धुंधला और विश्लेषण के लिए पैराफिन में तय, डीकैल्सीफाइड और एम्बेडेड किया जा सकता है।
  2. अनलोडेड समूह के लिए, प्रेट्रीटमेंट मीडिया को महाप्राण करें और ताजा पेट्री डिश में एक्सप्लांट्स ट्रांसफर करें, प्रत्येक कल्चर मीडिया के 70 एमएल जोड़ें, और इनक्यूबेटर पर लौटें।
  3. आधारभूत तनाव और स्थैतिक टकराव समूहों के लिए, एक्सप्लांट प्लेटफॉर्म तैयार करें। ग्रिप प्लैटेंस के आकार के समान सैंडपेपर के टुकड़े काटें। स्थिर टकराव समूह के लिए, लट में रेखा के टुकड़ों को लगभग 18 इंच लंबाई में काटें और लाइन की लंबाई के साथ एक ढीले ओवरहैंड गाँठ को आधा टाई करें। प्रत्येक ऐक्रेलिक स्नान को कवर करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के टुकड़े फाड़ें और 70% इथेनॉल (ईटीओएच) के साथ स्प्रे करें। बीएससी को तैयारी स्थानांतरित करें।
  4. प्रत्येक प्लेटफ़ॉर्म में एक ऐक्रेलिक स्नान, आधार, वॉल्यूम में कमी सम्मिलित करने, क्लिप और पकड़ शामिल हैं। प्रत्येक पकड़ में दो प्लैटेंस और तीन अलग-अलग प्रकार के स्क्रू शामिल होते हैं जिनमें एक M5 x 0.8 मिमी धागा x 10 मिमी लंबा पेंच शामिल होता है जो पकड़ को आधार से जोड़ता है; दो M6 x 1 मिमी धागा x 20 मिमी लंबे स्क्रू जो पकड़ को जकड़ने के लिए प्लैटेंस का विस्तार करते हैं; और चार M3 x 0.5 मिमी धागा x 14 मिमी लंबे शिकंजा जो चार संपीड़न स्प्रिंग्स के संयोजन में, पकड़ खोलने के लिए प्लैटेंस को वापस ले लेते हैं।
  5. रिसाव की स्थिति में सभी संस्कृति मीडिया को कैप्चर करने में सक्षम माध्यमिक कंटेनरों में सभी घटकों को रखें। ≥ 10% ब्लीच समाधान में डुबोएं और कम से कम 1 घंटे के लिए भिगोएँ। नल के पानी (आवश्यकतानुसार आटोक्लेव) के साथ ब्लीच समाधान को कुल्ला और बीएससी में चले जाएं।
    नोट: संदूषण के निवारण के लिए, सभी नल के पानी को ऑटोक्लेव करने या शुद्ध पानी का उपयोग करने पर विचार करें। संदूषण को संबोधित करते समय अतिरिक्त युक्तियों के लिए चर्चा देखें।
  6. प्लैटेंस को ग्रिप्स से जोड़ने के लिए M3 स्क्रू और कम्प्रेशन स्प्रिंग्स का उपयोग करें, M5 स्क्रू का उपयोग करके ग्रिप्स को बेस पर सुरक्षित करें, और M6 स्क्रू को तब तक डालें जब तक कि वे प्लैटेंस को संलग्न न कर दें। प्लैटेंस को सैंडपेपर संलग्न करने के लिए दो तरफा टेप का उपयोग करें, फिर प्लेटेंस को सैंडपेपर के आसंजन को बढ़ावा देने के लिए पकड़ बंद करें। सभी प्लेटफार्मों के लिए दोहराएं।
  7. जब एक मंच लोड करने के लिए तैयार है, पूरी तरह से पकड़ खोलने और संदंश का उपयोग कर, ऊपर की ओर का सामना करना पड़ Achilles कण्डरा की सतही सतह के साथ प्लैटेंस के बीच ऊपरी पैर और घुटने जगह (चित्रा 1 ए). धीरे से पकड़ने के लिए पकड़ को ढीला बंद करें।
  8. उजागर ऊरु सिर या पैर हड़पने के लिए संदंश का प्रयोग करें और घुटने के लचीलेपन कोण में हेरफेर के रूप में आप धीरे-धीरे पकड़ जगह में सुरक्षित करने के लिए बंद. आधारभूत तनाव समूह के लिए, घुटने के जोड़ का विस्तार करें जैसा कि पहले वर्णित है। जैसे ही घुटने के साथ पकड़ मजबूत होती है, टखने को स्वाभाविक रूप से विस्तारित करना चाहिए। स्थैतिक टकराव समूह के लिए, पकड़ के बीच घुटने के जोड़ को फ्लेक्स करें जैसा कि पहले वर्णित है।
  9. स्थिर टकराव समूह के लिए, बाहर का पंजा के चारों ओर स्ट्रिंग के ओवरहैंड गाँठ जगह और कस. स्ट्रिंग को एक्सप्लांट के नीचे स्थित बेस में एक स्लॉट के माध्यम से और क्लिप होल के माध्यम से रूट करें। ऐक्रेलिक स्नान में आधार रखें और क्लिप को स्नान के ऊपरी किनारे पर सुरक्षित करें (चित्र 1A)।
  10. स्ट्रिंग को डोरसिफ्लेक्स में खींचें, पैर को टिबिया के संबंध में कम से कम 110 डिग्री तक खींचें और स्ट्रिंग को चिह्नित करने के लिए एक स्थायी मार्कर का उपयोग करें क्योंकि यह क्लिप से बाहर निकलता है। बाद में dorsiflexion कोण(चित्रा 1 ए) यों करने के लिए इस स्थिति में explant की एक तस्वीर ले लो.
  11. आधार निकालें और मात्रा में कमी डालने के आधार पर एक ट्रैक के साथ फिसलने से देते हैं. आधार (अब मात्रा में कमी डालने के लिए संलग्न) ऐक्रेलिक स्नान में वापस रखें और शीर्ष किनारे पर क्लिप की जगह. एक गाइड के रूप में चिह्नित स्ट्रिंग का उपयोग करके मूल dorsiflexion कोण पर लौटने के लिए स्ट्रिंग खींचो और स्थिर dorsiflexion बनाए रखने के लिए टेप के साथ स्नान के बाहर करने के लिए स्ट्रिंग सुरक्षित.
  12. आधारभूत तनाव समूह के लिए, बस मात्रा में कमी के साथ आधार को ऐक्रेलिक स्नान में डालें, एक बार एक्सप्लांट पकड़ के बीच स्थित है और डॉर्सिफ्लेक्सियन कोण की मात्रा का ठहराव के लिए एक तस्वीर लें।
  13. एक्सप्लांट्स को जलमग्न करने के लिए प्रत्येक प्लेटफॉर्म पर प्रीवार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) कल्चर मीडिया के 125 एमएल जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ स्नान के शीर्ष को कवर करें, एक माध्यमिक कंटेनर में रखें, और इनक्यूबेटर में जाएं। 7 अतिरिक्त दिनों के लिए संस्कृति, हर 48-72 घंटे में मीडिया बदलना।
    नोट: स्नान के शीर्ष पर रखा टेप पीएलए भागों को तैरने से रोक सकता है।

4. फिक्सेशन, decalcification और पैराफिन एम्बेडिंग

  1. एक्सप्लांट कल्चर के बाद, टोनेल / डिस्टल पैर की उंगलियों को ट्रिम करने के लिए कैंची का उपयोग करें और ऊपरी पैर को अकिलीज़ मायोटेंडिनस जंक्शन के समीपस्थ काट दें। फोम बायोप्सी पैड के साथ पंक्तिबद्ध एक प्रसंस्करण कैसेट में प्रत्येक छंटनी टखने संयुक्त रखें. टखने को लगभग 90 डिग्री डॉर्सिफ्लेक्सियन पर रखने के लिए टखने को कैसेट कोने में धकेलें और जगह में रखने के लिए कैसेट को बंद करें।
  2. 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन (एनबीएफ) में 3 दिनों के लिए फिक्स करें और ग्लेशियल एसिटिक एसिड के साथ 7.4-7.6 पर समायोजित पीएच के साथ आसुत जल (डीआईएच2ओ) में भंग 14% एथिलीनमेनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) में 2 सप्ताह के लिए डिकैल्सीफाई करें।
  3. लवण को हटाने के लिए, अच्छी तरह से diH2हे, 5 मिनट प्रत्येक के बाद दोनों 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में तीन बार नमूनों को कुल्ला। पैराफिन ऊतक विज्ञान के लिए नियमित नमूना प्रसंस्करण करें: EtOH की एक वर्गीकृत श्रृंखला के माध्यम से निर्जलीकरण, xylene में स्पष्ट, और पैराफिन मोम के साथ घुसपैठ। पैराफिन में ओरिएंट और एम्बेड नमूने औसत दर्जे का करने के लिए पार्श्व से पार्श्व प्रगति में Achilles कण्डरा के माध्यम से धनु ऊतक वर्गों प्राप्त करने के रूप में नीचे अनुभाग 5 (चित्रा 1B) में वर्णित है.

5. ऊतक सेक्शनिंग

  1. एक microtome के साथ, ध्यान से नमूना में ट्रिम जब तक वर्गों ब्लॉक चेहरे के समानांतर हैं. संयुक्त के औसत दर्जे का पहलू से टखने में मोटे तौर पर ट्रिम करें, अकिलीज़ कण्डरा सम्मिलन की औसत दर्जे की सीमा तक पहुंचने से पहले रोकें।
  2. तापमान और जलयोजन को समायोजित करने के लिए नमूने को बर्फ ब्लॉक में स्थानांतरित करें, और ब्लेड बदलें (या वर्तमान ब्लेड के एक नए खंड में स्थानांतरित करें)। 10 माइक्रोन मोटाई पर नमूने में सेक्शनिंग जारी रखें और ध्यान से एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के साथ अकिलीज़ कण्डरा सम्मिलन में प्रवेश की पहचान करें। एक बार पहचाने जाने के बाद, पूरे Achilles कण्डरा सम्मिलन के माध्यम से धारावाहिक सेक्शनिंग ट्रैकिंग अनुभाग संख्या (यानी, ऊतक गहराई) करें।

6. डिपाराफिनाइजेशन / पुनर्जलीकरण और स्लाइड चयन

  1. नीचे प्रत्येक परख के लिए, contralateral अंगों की प्रत्येक जोड़ी से स्तर मिलान ऊतक वर्गों का चयन करें. धुंधला होने से पहले, एक स्लाइड रैक पर रखें और xylene के 3 परिवर्तनों, 100% EtOH के 2 परिवर्तनों, 95% EtOH के 2 परिवर्तन, और 70% EtOH के 1 परिवर्तन, 5 मिनट प्रत्येक के माध्यम से आगे बढ़ें। diH2O में पुनर्जलीकरण समाप्त करें।

7. अकिलीज़ कण्डरा व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए ट्यूनल

  1. TUNEL लेबलिंग के लिए, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार दाग। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 20 माइक्रोग्राम/एमएल प्रोटीनेज के में सेते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए टीयूएनएल दाग समाधान (5 माइक्रोन एंजाइम समाधान, 45 माइक्रोन लेबल समाधान) के 50 माइक्रोन में डीआईएच2ओ में कुल्ला करते हैं। diH2O में कुल्ला, DAPI और coverslip युक्त antifade अभिकर्मक के साथ माउंट.
  2. एक 4x उद्देश्य लेंस के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर Achilles कण्डरा सम्मिलन छवि. सभी नाभिक की कल्पना करने के लिए एक डीएपीआई चैनल (उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य = 360/460 एनएम) शामिल करें, एपोप्टोटिक नाभिक की कल्पना करने के लिए एक ट्यूनल (टीएमआर रेड) चैनल (उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य = 540/580 एनएम), और यदि संभव हो तो, एक ब्राइटफील्ड चैनल।
  3. छवि विश्लेषण के लिए, ROI-आधारित प्रसंस्करण के लिए उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में छवियों को आयात करें, जैसे FIJI/ImageJ या MATLAB। ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र को परिभाषित करें, जो पूरे अकिलीज़ कण्डरा को देखने में रेखांकित करता है (चित्रा 2ए), एपिटेनॉन में कोशिकाओं को छोड़कर जो विच्छेदन से प्रेरित मृत्यु के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और पर्यावरण की स्थिति में अचानक परिवर्तन करते हैं जब संस्कृति में रखा जाता है।
  4. ऐसा करने के लिए, ब्राइटफ़ील्ड छवि आयात करके और कण्डरा की सीमाओं को ट्रेस करने और संलग्न करने के लिए ड्रॉपॉलीगॉन () फ़ंक्शन का उपयोग करके MATLAB में ROI चयन करें। MATLAB ROI के लिए एक बहुभुज ऑब्जेक्ट बनाता है, जिसे तब DAPI और TUNEL चैनल छवियों पर लागू किया जा सकता है ताकि केवल Achilles कण्डरा के भीतर नाभिक का विश्लेषण करने के लिए createMask() का उपयोग करके ROI के बाहर पिक्सेल तीव्रता डेटा को मुखौटा किया जा सके।
  5. DAPI और TUNEL चैनल छवियों को आयात करें और हड्डी, मांसपेशियों या वसा जैसे गैर-व्यवहार्य ऊतकों में एपोप्टोटिक नाभिक की अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता को सामान्य करके एपोप्टोटिक (ट्यूनल +) नाभिक को परिभाषित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति तीव्रता सीमा की पहचान करें जो आकस्मिक रूप से ऊतक अनुभाग में कब्जा कर लिया जाता है। एक बार छवियों नकाबपोश हैं, Achilles कण्डरा के भीतर apoptotic नाभिक (TUNEL+ नाभिक/DAPI नाभिक) के अंश की गणना.

8. टोलुइडाइन ब्लू हिस्टोलॉजी फाइब्रोकार्टिलेज गठन को चिह्नित करने के लिए

  1. एक बार पुनर्जलीकरण (धारा 6), ग्लेशियल एसिटिक एसिड का उपयोग करके पीएच के साथ समायोजित पीएच के साथ 0.1 एम सोडियम एसीटेट बफर में 0.4% डब्ल्यू / वी टोलुइडीन ब्लू ओ में 0.4% डब्ल्यू / वी टोलुइडीन ब्लू ओ के स्तर-मिलान ऊतक वर्गों के साथ स्लाइड रैक स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं, तो 30 एस प्रत्येक के लिए diH2ओ में 3x कुल्ला.
  2. 95% EtOH के तीन परिवर्तनों और 100% EtOH, 30 s प्रत्येक के दो परिवर्तनों के माध्यम से निर्जलीकरण। जाइलीन के तीन परिवर्तनों के माध्यम से साफ़ करें, प्रत्येक 1 मिनट। xylene आधारित बढ़ते माध्यम के साथ coverslip.
  3. Achilles कण्डरा सम्मिलन के 24-बिट लाल-नीले-हरे (RGB) रंग चित्र प्राप्त करें। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल के लिए एक 4x उद्देश्य के साथ एक साधारण ब्राइटफ़ील्ड माइक्रोस्कोप के ऐपिस के लिए एक डिजिटल रंग कैमरा इंटरफ़ेस करने के लिए एक एडेप्टर का उपयोग करें।
  4. Achilles कण्डरा सम्मिलन(चित्रा 3A,B)16 पर संपीड़ित कण्डरा fibrocartilage (CTF)16 के भीतर टोलुइडीन नीले धुंधला में अंतर यों करने के लिए, एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आयात आरजीबी छवियों को परिभाषित करने और कई आरओआई का प्रबंधन करने में सक्षम. विकल्पों में FIJI/ImageJ में चयन और ROI प्रबंधक उपकरण या MATLAB में इमेज प्रोसेसिंग टूलबॉक्स शामिल हैं। पिक्सेल/लंबाई स्केल सेट करके शुरू करें।
    नोट: सॉफ्टवेयर विकल्प शोधकर्ता के विवेक पर छोड़ दिया गया है और निश्चित रूप से MATLAB या FIJI/ImageJ तक सीमित नहीं है। लेखकों ने MATLAB कोड (पूरक फ़ाइल 2), कार्यान्वयन का वर्णन करने वाले दस्तावेज़ (पूरक फ़ाइल 3), और एक नमूना छवि (पूरक फ़ाइल 4) प्रदान की है। हम शोधकर्ताओं को इस कोड को वैकल्पिक प्रोग्रामिंग भाषाओं में अनुवाद करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं ताकि आवश्यकतानुसार या पसंद किए जाने वाले अन्य सॉफ़्टवेयर में उपयोग किया जा सके।
  5. पसंद के सॉफ्टवेयर में प्रदर्शित छवि के साथ, कैल्केनस के साथ गहरे कण्डरा सीमा के चौराहे की पहचान करें। यहां से, सीटीएफ की गहरी सीमा स्थापित करने के लिए गहरे कण्डरा सीमा के साथ समीपस्थ रूप से 800 माइक्रोन का पता लगाएं। उदाहरण के लिए, MATLAB में drawpolyline() फ़ंक्शन का उपयोग अंतःक्रियात्मक रूप से RGB छवि पर पॉलीलाइन खींचने के लिए करें। MATLAB एक पॉलीलाइन ऑब्जेक्ट बनाता है जिसमें लाइन के कोने होते हैं, जिसे संसाधित किया जा सकता है और 800 माइक्रोन की लंबाई तक छंटनी की जा सकती है।
  6. इस स्थिति से, सतही कण्डरा सीमा से जुड़ने वाली रेखा खंड खींचकर सीटीएफ की समीपस्थ सीमा बनाएं जो स्थानीय फाइबर अभिविन्यास के लंबवत है।
  7. गहरी कण्डरा सीमा और कैल्केनस के चौराहे पर वापस जाएं और सीटीएफ को अटैचमेंट ज़ोन फाइब्रोकार्टिलेज (एजेडएफ)16(चित्रा 3ए,बी)से अलग करने वाले विशिष्ट ज्वार के साथ सतही कण्डरा सीमा से जुड़ते हुए एक रेखा खंड खींचकर सीटीएफ की डिस्टल सीमा को परिभाषित करें। अंत में, संलग्न करने के लिए सतही कण्डरा सीमा का पता लगाकर सीटीएफ की सतही सीमा उत्पन्न करें।
  8. सम्मिलन भर में जीएजी धुंधला में स्थानिक विविधताओं का वर्णन करने के लिए, कुल सीटीएफ को 4 चतुर्थांश(चित्रा 3ए,बी)में विभाजित करें। एक डिस्टल/समीपस्थ सीमा बनाने के लिए गहरी और सतही CTF सीमाओं के मध्य बिंदु को एक रेखा खंड से कनेक्ट करें। इस सीमा के मध्य बिंदु से गुजरते हुए, एक सतही/गहरी सीमा बनाने के लिए फाइबर अभिविन्यास के साथ डिस्टल और समीपस्थ सीटीएफ सीमाओं के मध्य बिंदुओं को कनेक्ट करें।
  9. ये 6 सीमाएं ऐसी जानकारी प्रदान करती हैं जिनका उपयोग पूरे सीटीएफ का प्रतिनिधित्व करने वाले आरओआई को परिभाषित करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन सीटीएफ को उप-विभाजित करने वाले 4 चतुर्थांश भी। MATLAB में, उदाहरण के लिए, प्रत्येक व्यक्ति ROI (CTF, quadrants 1-4) की सीमाओं को वैक्टर में परिभाषित करने वाले शीर्षों को संकलित करें और प्रत्येक ROI के लिए संलग्न बहुभुज ऑब्जेक्ट उत्पन्न करने के लिए images.roi.Polygon() का उपयोग करें।
  10. आरओआई परिभाषित के साथ, फिजी में रंग ट्रांसफार्मर प्लगइन का उपयोग करके आरजीबी पिक्सेल डेटा को ह्यू-संतृप्ति-मूल्य (एचएसवी) रंग स्थान में बदलना, मैटलैब में आरजीबी 2 एचएसवी () फ़ंक्शन, या उपयुक्त परिवर्तन समीकरण76 लागू करने वाले अन्य सॉफ़्टवेयर। एचएसवी डेटा को तब 2 डी ह्यू-संतृप्ति स्थान में पेश किया जा सकता है, जहां रंग और संतृप्ति का प्रत्येक संयोजन एक अद्वितीय रंग(चित्रा 3सी)को एन्कोड करता है।
  11. प्रत्येक आरओआई के भीतर, औसत रंग और संतृप्ति की गणना करें जो आरओआई में औसत दाग रंग का वर्णन करता है। यह MATLAB में प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, प्रत्येक ROI का उपयोग करके createMask() का उपयोग करके छवि को मास्क करने के लिए प्रत्येक ROI को परिभाषित करने वाले बहुभुज ऑब्जेक्ट्स का उपयोग करके विशेष रूप से प्रत्येक ROI के भीतर ह्यू-संतृप्ति पिक्सेल डेटा का विश्लेषण करने के लिए।
  12. पेरिओस्टियल फाइब्रोकार्टिलेज (पीएफ)16 (चित्रा 3ए, बी)के भीतर एक और छोटे आरओआई को परिभाषित करें और औसत रंग और संतृप्ति की गणना करें। फिर, पीएफ (चित्रा 3सी) के लिए सीटीएफ के प्रत्येक आरओआई में औसत रंग को अलग करने वाले यूक्लिडियन दूरी की गणना करें।
    Equation 1
    नोट: यूक्लिडियन दूरी गणना पीएफ के आरओआई के औसत रंग के बीच समानता की डिग्री का वर्णन करती है, एक सर्वोत्कृष्ट फाइब्रोकार्टिलाजिनस ऊतक 16,17,77। एक छोटी यूक्लिडियन दूरी एक आरओआई रंग को इंगित करती है जो दिखने में अधिक फाइब्रोकार्टिलाजिनस है।
  13. फाइब्रोकार्टिलेज स्कोर की गणना करने के लिए इस दूरी का उपयोग करें, जो 1 का अधिकतम मान मानता है यदि आरओआई रंग पीएफ रंग के समान है और -1 का न्यूनतम मूल्य यदि आरओआई और पीएफ रंग रंग-संतृप्ति रंग स्थान के भीतर अधिकतम पृथक्करण तक पहुंचता है।
    Equation 2
  14. प्रत्येक अंग से ऊतक वर्गों में प्रत्येक आरओआई के भीतर रंग, संतृप्ति और फाइब्रोकार्टिलेज स्कोर के लिए औसत डेटा। विपरीत अंगों के समूहों के बीच युग्मित सांख्यिकीय तुलना करें।

9. कोलेजन नेटवर्क संगठन में परिवर्तन की जांच के लिए एसएचजी इमेजिंग

  1. एक 20x वस्तु लेंस के साथ एक सक्षम खुर्दबीन प्रणाली का उपयोग Toluidine नीले सना वर्गों के SHG इमेजिंग प्रदर्शन. अनुभाग मोटाई के माध्यम से जेड-स्टैक प्राप्त करें और एच्लीस कण्डरा सम्मिलन को पूरी तरह से पकड़ने के लिए आवश्यकतानुसार टाइल स्कैनिंग करें।
  2. एसएचजी छवियों को एक पसंदीदा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आयात करें और धारा 8(चित्रा 4ए,बी)में टोलुइडाइन नीली छवि विश्लेषण के लिए वर्णित के रूप में अकिलीज़ कण्डरा सम्मिलन पर सीटीएफ को शामिल और उप-विभाजित करने वाले आरओआई को परिभाषित करें।
  3. यदि SHG छवियों को MATLAB में आयात किया जाता है, तो MATLAB में CTF ROI को परिभाषित करने के लिए दृष्टिकोण का उपयोग करें जैसा कि धारा 8 में उल्लिखित है। आरओआई को परिभाषित करने के बाद, .txt फाइलों के रूप में मैटलैब से आरओआई कोने निर्यात करके और फ़ाइल > आयात > एक्सवाई निर्देशांक का उपयोग करके एफआईजी में आयात करके आरओआई निर्देशांक को फिजी में स्थानांतरित करें। चयन को ओवरले करें और विश्लेषण के लिए ROI प्रबंधक को भेजें।
  4. कोलेजन संगठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए, फिजी में दिशात्मकता प्लगइन का उपयोग करें, जो आरओआई में फैले छोटे खिड़कियों में फाइबर अभिविन्यास के वितरण की गणना करने के लिए फूरियर स्पेक्ट्रम विश्लेषण करता है। इस वितरण का प्रसार, जिसे फैलाव कहा जाता है, फाइबर संरेखण से विपरीत रूप से संबंधित है।
    नोट: कोलेजन फाइबर संरेखण/संगठन की अनुपस्थिति के बजाय कण्डरा की सकल वक्रता के कारण सीटीएफ में विभिन्न खिड़कियों में चर अभिविन्यास ग्रहण कर सकते हैं। सम्मिलन पर कण्डरा की सकल वक्रता से कोलेजन संगठन में परिवर्तनों को बेहतर ढंग से अलग करने के लिए, छोटे आरओआई को परिभाषित करना आवश्यक है।
  5. फिजी में एसएचजी छवियों को आयात करें और पिक्सेल/लंबाई पैमाने को सेट करें। अधिकतम पिक्सेल तीव्रता डेटा को 2D समग्र छवि में प्रोजेक्ट करें और ROI प्रबंधक में ROI जोड़ें। क्रमिक रूप से प्रत्येक CTF ROI को छवि पर ओवरले करें और ROI प्रबंधक में उप-ROI जोड़ते हुए, ROI के भीतर लगातार आकार के 10 छोटे उप-ROI बनाएं।
  6. प्रत्येक उप-आरओआई के भीतर, फाइबर फैलाव की गणना करने के लिए फिजी में दिशात्मकता प्लगइन चलाएं। प्रत्येक CTF ROI के भीतर उप-ROI में औसत फैलाव डेटा, और प्रत्येक एक्सप्लांट से अनुभागों में प्रत्येक CTF ROI के भीतर औसत फैलाव डेटा। विपरीत अंगों के समूहों के बीच युग्मित सांख्यिकीय तुलना करें।

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Representative Results

ट्यूनल सना हुआ ऊतक वर्गों की प्रतिनिधि छवियां प्रयोगात्मक समूहों(चित्रा 2ए)में एक्सप्लांट कल्चर के 7 दिनों के बाद अकिलीज़ कण्डरा के शरीर के भीतर न्यूनतम एपोप्टोटिक नाभिक प्रदर्शित करती हैं। इन छवियों की मात्रा का ठहराव सबूत प्रदान करता है कि टिशू कल्चर प्रोटोकॉल लोडिंग शर्तों (चित्रा 2बी) में एक्सप्लांट कल्चर के 7 दिनों के बाद एच्लीस कण्डरा के भीतर औसतन 78% व्यवहार्यता बनाए रखता है।

गुणात्मक रूप से, बढ़ाया टोलुइडाइन ब्लू धुंधला अनलोड नियंत्रण(चित्रा 3ए,बी)की तुलना में स्थिर प्रभाव के 7 दिनों के बाद सराहना की जाती है, विशेष रूप से कैल्केनस से सटे गहरे चतुर्थांशों में जहां हमने पहले अधिकतम अनुप्रस्थ संपीड़न तनाव 5,6 मापा है। इन टोलुइडीन नीले दाग ऊतक वर्गों की मात्रा का ठहराव रंग (चित्रा 3 डी), संतृप्ति(चित्रा 3ई), और फाइब्रोकार्टिलेज स्कोर(चित्रा 3एफ)में महत्वपूर्ण परिवर्तन को दर्शाता है, जो कि कॉन्ट्रालेटरल अनलोडेड एक्सप्लांट्स की तुलना में स्थिर प्रभाव के 7 दिनों के बाद होता है। यह परिवर्तित जीएजी धुंधला होने की संभावना इस मॉडल के भीतर स्थिर प्रभाव के लिए फाइब्रोकार्टिलेज गठन माध्यमिक का प्रतिनिधित्व करती है। संतृप्ति और फाइब्रोकार्टिलेज स्कोर में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर केवल आधारभूत तनाव(चित्रा 3ई,एफ)के 7 दिनों के बाद चतुर्थांश 1 में पाए गए थे। इसके अलावा, संतृप्ति और फाइब्रोकार्टिलेज स्कोर contralateral अनलोड tendons के सापेक्ष कम हो गया, स्थिर impingement की तुलना में एक विपरीत प्रवृत्ति। यह डेटा इस परिकल्पना का समर्थन कर सकता है कि तन्यता लोडिंग प्रभाव-संचालित फाइब्रोकार्टिलेज गठन को क्षीण या उलट सकती है और भविष्य में अतिरिक्त जांच की गारंटी देती है।

एसएचजी इमेजिंग की मात्रा का ठहराव स्थिर प्रभाव के 7 दिनों के बाद कोलेजन फाइबर अभिविन्यास में सूक्ष्म लेकिन महत्वपूर्ण परिवर्तन का सुझाव देता है, फिर से कैल्केनस से सटे गहरे और बाहर के क्षेत्र में, जैसा कि फैलाव में महत्वपूर्ण अंतर (चित्रा 4सी)द्वारा दर्शाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: एक्सप्लांट प्लेटफॉर्म और प्रयोगात्मक डिजाइन। (ए) एक्सप्लांट प्लेटफॉर्म का फोटोग्राफिक और योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (शीर्ष) एक पूरे murine हिंद अंग explant की तस्वीर मंच में लोड किया गया, महत्वपूर्ण घटकों लेबल के साथ. (नीचे) योजनाबद्ध चित्रण सम्मिलन Achilles कण्डरा इस explant मॉडल में निष्क्रिय रूप से लागू टखने dorsiflexion द्वारा प्राप्त impingement. (बी) अध्ययन डिजाइन और एक्सप्लांट संस्कृति का योजनाबद्ध। हिंद अंग explants 48 घंटे74 के लिए 100 एनएम डेक्सामेथासोन में pretreated कर रहे हैं. प्रत्येक माउस से, एक हिंद अंग explant तो 7 दिनों के लिए उतार दिया एक डिश में सुसंस्कृत है, जबकि contralateral अंग प्रयोगात्मक मंच में लोड किया जाता है या तो आधारभूत तनाव या 7 दिनों के लिए स्थिर impingement के तहत Achilles कण्डरा जगह है. अंगों के contralateral जोड़े से सीरियल ऊतक वर्गों या तो टोलुइडीन नीले रंग के साथ दाग रहे हैं GAG अमीर ऊतक कल्पना या TUNEL धुंधला के लिए इस्तेमाल किया. टोलुइडाइन नीले रंग के वर्गों का उपयोग तब कोलेजन संगठन का आकलन करने के लिए एसएचजी इमेजिंग के लिए किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक्सप्लांट व्यवहार्यता। (ए) पूर्वनिर्धारित (दिन 0) एक्सप्लांट्स (ऊपर बाएं), अनलोडेड टेंडन (ऊपर दाएं), बेसलाइन तनाव (नीचे बाएं) पर बनाए गए टेंडन और स्थैतिक रूप से टकराने वाले टेंडन (नीचे दाएं) से ट्यूनल दाग वाले वर्गों की प्रतिनिधि छवियां। Achilles कण्डरा एक धराशायी सफेद रेखा में उल्लिखित है और एटी लेबल, जबकि calcaneus एक ठोस पीले रंग की रेखा में उल्लिखित है और लेबल सी एपोप्टोटिक नाभिक लाल दिखाई देते हैं (TUNEL), सभी नाभिक नीले (DAPI) दिखाई देते हैं. (बी) मृत कोशिका अंश की मात्रा का ठहराव अनलोडेड, बेसलाइन तनाव और स्थैतिक टकराव समूहों के लिए औसतन 22% से कम था। डेटा माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है। आउटलेयर इन डेटा सेटों में 50% से अधिक कोशिका मृत्यु के साथ मौजूद हैं, जिन्हें खराब विच्छेदन तकनीक से प्रेरित कण्डरा क्षति के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। हटाए गए सांख्यिकीय आउटलेयर के साथ औसत मृत कोशिका अंश सभी समूहों के लिए 15% से कम है। कोशिका मृत्यु में कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर अनलोडेड, आधारभूत तनाव और स्थैतिक प्रभाव समूहों (पी < 0.05) के बीच पाया गया। दिन 0 नियंत्रण: एन = 8। अनलोड: एन = 18। बेसलाइन तनाव: n = 8। स्थैतिक प्रभाव: n = 12। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: टोलुइडीन ब्लू हिस्टोलॉजी। (ए) अकिलीज़ सम्मिलन16 पर संपीड़ित कण्डरा फाइब्रोकार्टिलेज (सीटीएफ), अटैचमेंट ज़ोन फाइब्रोकार्टिलेज (एजेडएफ), और पेरीओस्टेल फाइब्रोकार्टिलेज (पीएफ) का चित्रण करने वाली अनलोडेड संस्कृति के 7 दिनों के बाद प्रतिनिधि टोलुइडाइन नीला दाग। CTF पर कब्जा करने वाले C. ROI लेबल वाले Calcaneus को लाल रंग में रेखांकित किया गया है और अतिरिक्त स्थानिक जानकारी प्रदान करने के लिए इसे 4 चतुर्थांशों में विभाजित किया गया है। (बी) प्रतिनिधि टोलुइडाइन नीले दाग स्थिर टकराव के 7 दिनों के बाद, सीटीएफ की बढ़ी हुई धुंधला के साथ, विशेष रूप से चतुर्थांश 1 में जहां हमने पहले अधिकतम अनुप्रस्थ संपीड़ित उपभेदोंको 5,6 मापा है। (सी)रंग छवि विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले रंग-संतृप्ति रंग स्थान का योजनाबद्ध। रंग रंग (0 ° -360 °) और संतृप्ति (0-255) 76 के संयोजन द्वारा वर्णित है। प्रत्येक आरओआई में औसत रंग पीएफ में रंग से प्रत्येक आरओआई में रंगों को अलग करने वाली यूक्लिडियन दूरी की गणना करके पीएफ के औसत रंग के लिए सामान्यीकृत किया जाता है, जो एक सामान्यीकृत फाइब्रोकार्टिलेज स्कोर प्रदान करता है। (डीएफ) कॉन्ट्रालेटरल अनलोडेड टेंडन की तुलना में 7 दिनों के स्थिर टकराव (शीर्ष) और बेसलाइन तनाव (नीचे) के बाद टोलुइडिन नीले दाग में परिवर्तन। डेटा माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) रंग की मात्रा का ठहराव विपरीत अनलोडेड टेंडन की तुलना में स्थिर टकराव के 7 दिनों के बाद सभी क्षेत्रों में औसत रंग में महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है। 7 दिनों के बाद बेसलाइन तनाव के बाद कॉन्ट्रालेटरल अनलोडेड टेंडन की तुलना में कोई समान प्रवृत्ति नहीं पाई गई। (ई) संतृप्ति की मात्रा, पूरे सीटीएफ में औसत संतृप्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ और कॉन्ट्रालेटरल अनलोडेड टेंडन की तुलना में 7 दिनों के स्थैतिक टकराव के बाद 1-3 चतुर्थांश के भीतर। इसके विपरीत, आधारभूत तनाव के 7 दिनों के बाद केवल चतुर्थांश 1 में महत्वपूर्ण अंतर का पता चला था, जहां संतृप्ति contralateral अनलोड tendons की तुलना में कम हो गई। (एफ) फाइब्रोकार्टिलेज स्कोर की मात्रा, कॉन्ट्रालेटरल अनलोडेड टेंडन की तुलना में 7 दिनों के स्थैतिक प्रभाव के बाद सभी क्षेत्रों में फाइब्रोकार्टिलेज स्कोर में महत्वपूर्ण बदलाव के साथ। इसके विपरीत, आधारभूत तनाव के 7 दिनों के बाद केवल चतुर्थांश 1 में महत्वपूर्ण अंतर का पता चला था, जहां फाइब्रोकार्टिलेज स्कोर कॉन्ट्रालेटरल अनलोडेड टेंडन की तुलना में कम हो गया था। डेटा बढ़े हुए फाइब्रोकार्टिलेज गठन के स्थिर प्रभाव संकेत द्वारा लाया गया बढ़ाया जीएजी दाग का सुझाव देता है। कुल सीटीएफ का वर्णन करने वाले डेटा की तुलना विलकॉक्सन मिलान-जोड़े हस्ताक्षरित रैंक परीक्षणों का उपयोग करके की गई थी। चतुर्थांश डेटा Šídák के कई तुलना परीक्षण के साथ दोहराया उपायों दो तरह ANOVA का उपयोग कर तुलना की गई. *पी < 0.05। **p < 0.01. पी < 0.005। पी < 0.001। बेसलाइन तनाव बनाम अनलोडेड: n = 6 जोड़े। स्थैतिक प्रभाव बनाम अनलोडेड: n = 8 जोड़े। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एसएचजी इमेजिंग। (ए) 7 दिनों के स्थिर प्रभाव की तुलना में अनलोडेड कल्चर के 7 दिनों के बाद प्रतिनिधि एसएचजी छवि। सीटीएफ को लाल रंग में रेखांकित किया गया है और लेबल के रूप में 4 चतुर्थांशों में विभाजित किया गया है, जो ऊपर टोलुइडिन नीले विश्लेषण में आरओआई के अनुरूप है। (सी) प्रत्येक चतुर्थांश के भीतर, फूरियर स्पेक्ट्रम विश्लेषण फिजी में दिशात्मकता प्लगइन का उपयोग कर एक चलती उप-खिड़की में किया गया था। प्रत्येक उप-खिड़की के भीतर फाइबर अभिविन्यास के वितरण के प्रसार को फैलाव (°) कहा जाता है और यह फाइबर संरेखण से विपरीत रूप से संबंधित है। परिक्षेपण = 0° तंतुओं के पूर्ण समांतर संरेखण का प्रतिनिधित्व करता है। बढ़ता फैलाव घटते कोलेजन फाइबर संरेखण का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है। फैलाव में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर चतुर्थांश 1 में 7 दिनों के बाद कॉन्ट्रालेटरल अनलोडेड टेंडन की तुलना में स्थिर प्रभाव के बाद पाया गया, जो कोलेजन अव्यवस्था में वृद्धि का सुझाव देता है। चतुर्थांश डेटा Šídák के कई तुलना परीक्षण के साथ दोहराया उपायों दो तरह ANOVA का उपयोग कर तुलना की गई. * पी < 0.05। स्थैतिक प्रभाव बनाम अनलोडेड: n = 5 जोड़े। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: सीएडी फाइलें। कई फ़ाइल स्वरूपों में संकलित इन CAD फ़ाइलों का उपयोग प्लेटफ़ॉर्म बेस, वॉल्यूम में कमी डालने और क्लिप को 3D प्रिंट करने के लिए किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: MATLAB फ़ाइलें। संकलित MATLAB फाइलें Toluidine नीले ऊतक विज्ञान की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देती हैं जैसा कि प्रोटोकॉल की धारा 8 में वर्णित है ताकि Achilles कण्डरा सम्मिलन पर GAG धुंधला में स्थानिक परिवर्तन के माध्यम से फाइब्रोकार्टिलेज गठन का आकलन किया जा सके। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 3: MATLAB कोड को लागू करने के लिए दिशानिर्देश। यह दस्तावेज़ प्रदान किए गए MATLAB कोड का उपयोग करके Toluidine नीले ऊतक विज्ञान के छवि विश्लेषण के माध्यम से Achilles कण्डरा सम्मिलन पर GAG धुंधला में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक पाइपलाइन का वर्णन करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: टोलुइडिन ब्लू हिस्टोलॉजी की नमूना छवि। Toluidine ब्लू हिस्टोलॉजी की इस RGB रंग छवि का उपयोग प्रदान किए गए MATLAB कोड को निष्पादित करने के लिए किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन में वर्णित टिशू कल्चर प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा गया प्रायोगिक murine हिंद अंग एक्सप्लांट प्लेटफॉर्म Achilles कण्डरा सम्मिलन पर impingement संचालित fibrocartilage गठन के mechanobiology का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रदान करते हैं। इस एक्सप्लांट मॉडल की उपयोगिता प्रतिनिधि परिणामों द्वारा प्रदर्शित की जाती है, जो 7 दिनों के स्थिर टकराव के बाद टोलुइडीन ब्लू धुंधला में महत्वपूर्ण और स्थानिक रूप से विषम परिवर्तन के साथ सेल व्यवहार्यता सहवर्ती के रखरखाव का संकेत देती है। ये निष्कर्ष यांत्रिक प्रभाव के लिए माध्यमिक जीएजी समृद्ध मैट्रिक्स अणुओं के परिवर्तित चयापचय का सुझाव देते हैं, अन्य मॉडल और नैदानिक अध्ययन 3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 के अनुरूप ,36,37,38,44,49. इसके अतिरिक्त, स्थैतिक टकराव के 7 दिनों के बाद एसएचजी इमेजिंग के माध्यम से कोलेजन संगठन में सूक्ष्म लेकिन महत्वपूर्ण परिवर्तनों का पता चला था, जो कि प्रभाव से जुड़े टेंडिनोपैथी की नैदानिक विशेषताओं के अनुरूप और कण्डरा टकराव 28,37,38,43,44,49,64 के विवो मॉडल में था।

कण्डरा टकराव के जैविक अनुक्रम का पता लगाने के लिए पूर्व प्रयासों ने पृथक कण्डरा कोशिकाओं को सरल संपीड़न लागू किया है27,29. एक बार ब्याज के एक मेकेनोबायोलॉजिकल तंत्र की पहचान हो जाने के बाद, ये मॉडल हमारे एक्सप्लांट मॉडल की तुलना में बेहतर चिकित्सीय स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म प्रदान करते हैं। हालांकि, इन अध्ययनों के निष्कर्षों को सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए, क्योंकि इन विट्रो में सुसंस्कृत पृथक कोशिकाओं में त्रि-आयामी बाह्य वातावरण की कमी होती है जो मैकेनोरिस्पॉन्स57,59 को प्रभावित करती है। इसके अतिरिक्त, अन्य कोलेजनस ऊतकों (जैसे, उपास्थि) से अलग कोशिकाओं को बदल mechanosensitive आयन चैनल गतिविधि का प्रदर्शन जब यंत्रवत् एक बाह्य वातावरण78,79 की अनुपस्थिति में इन विट्रो में चुनौती दी. प्रस्तुत मॉडल शारीरिक रूप से प्रासंगिक लोडिंग स्थितियों के लिए व्यवहार्य एक्सप्लांट्स के भीतर सीटू कण्डरा कोशिकाओं में विषय के लिए एक मंच प्रदान करके इन सीमाओं को संबोधित करता है।

एक्सप्लांट मॉडल कण्डरा जीव विज्ञान और शरीर विज्ञान57,58 की जांच के लिए लोकप्रिय प्रयोगात्मक प्रणालियां हैं। कण्डरा टकराव के विशिष्ट संदर्भ में, कई पूर्व अध्ययनों ने कृत्रिम एकअक्षीय संपीड़न30,31,32,33,34,39 के लिए कण्डरा सेल प्रतिक्रिया का पता लगाने के लिए आंशिक और पूरे-कण्डरा एक्सप्लांट्स को नियोजित किया है। जबकि इन अध्ययनों ने एकअक्षीय संपीड़न और फाइब्रोकार्टिलेज गठन के बीच एक सीधा लिंक प्रदर्शित किया, कण्डरा टकराव द्वारा उत्पन्न विवो यांत्रिक तनाव वातावरण में बहुअक्षीय है और प्रभावित क्षेत्र 5,6 की शारीरिक विशेषताओं पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, टखने के डॉर्सिफ्लेक्सियन के दौरान अकिलीज़ कण्डरा पर कैल्केनस के प्रभाव से बनाया गया तनाव वातावरण सम्मिलन कोण, लगाव के क्षेत्र और आसपास के नरम ऊतकों की उपस्थिति से प्रभावित होता है 60,61,62,63,80,81. हमारा एक्सप्लांट प्लेटफॉर्म इन बाहरी संरचनाओं को संरक्षित करता है और अपने मूल वातावरण के भीतर कोशिकाओं को बनाए रखते हुए प्रभाव से उत्पन्न बहुअक्षीय तनाव वातावरणको पुन: पेश करता है।

पशु मॉडल यांत्रिक प्रभाव और कण्डरा फाइब्रोकार्टिलेज और पैथोलॉजी की सर्वोत्कृष्ट विशेषताओं के बीच तत्काल संबंध को प्रमाणित करने में मौलिक रहे हैं, जो अनुरूप फेनोटाइप 1,25,28,37,64,65,66 साझा करते हैं। हाल के दशकों में, विवो प्रभाव अनुसंधान के बहुमत ने रोटेटर कफ टेंडन को कृत्रिम रूप से प्रभावित करने के लिए सबक्रोमियल स्पेस की सर्जिकल कमी के माध्यम से रोटेटर कफ रोग का अध्ययन करने के लिए कृंतक मॉडल का उपयोग किया है। इन पशु मॉडल का उपयोग विवो में इम्पिंगमेंट टेंडिनोपैथी के सेलुलर और आणविक रोगजनन का वर्णन करने के लिए किया गया है और इसे 36,37,38,66,82,83,84,85 के नैदानिक अनुवाद को बढ़ावा देने के लिए उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों का मूल्यांकन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

कण्डरा टकराव के विवो मॉडल में स्थापित, हालांकि, मैकेनोबायोलॉजी57,58 का अध्ययन करने में कई महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। ये मॉडल शल्य चिकित्सा से कण्डरा टकराव के बाहरी स्रोत को पेश करते हैं या हटाते हैं और शारीरिक गतिविधि (मुफ्त पिंजरे की गतिविधि, मजबूर ट्रेडमिल रनिंग, आदि) को फिर से शुरू करते हैं। इस दृष्टिकोण में प्रयोग की अवधि के दौरान सीधे कण्डरा पर लागू बल की परिमाण, अभिविन्यास और आवृत्ति पर नियंत्रण का अभाव है। विवो में ऊतक तनाव को मापने में कठिनाई को देखते हुए, ये मॉडल प्रभाव के जवाब में कण्डरा के भीतर उत्पन्न यांत्रिक वातावरण पर सीमित नियंत्रण या लक्षण वर्णन प्रदान करते हैं। यह सीमा कण्डरा मेकेनोबायोलॉजी अनुसंधान 57,58,67,68,69,70 के क्षेत्र में अच्छी तरह से पहचानी जाती है। कहीं और, परिष्कृत प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों को संज्ञाहरण67,68,69 के तहत विवो में सीधे टेंडन पर नियंत्रित यांत्रिक अधिभार (थकान) लागू करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। ये मॉडल संज्ञाहरण के तहत छोटी अवधि के लिए यांत्रिक उत्तेजनाओं के आवेदन को नियंत्रित करते हैं और प्रयोग के शेष हिस्सों में लोडिंग इतिहास पर कोई नियंत्रण नहीं देते हैं क्योंकि जानवर यांत्रिक अधिभार के बाद हफ्तों तक सामान्य पिंजरे गतिविधि को फिर से शुरू करते हैं। इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक्सप्लांट मॉडल ऊतक तनाव6 के औसत दर्जे का और अच्छी तरह से वर्णित पैटर्न उत्पन्न करने के लिए एच्लीस कण्डरा टकराव के नियंत्रित नुस्खे प्रदान करता है, जिससे प्रभाव मैकेनोबायोलॉजी के कठोर अध्ययन की अनुमति मिलती है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह एक्सप्लांट मॉडल कण्डरा टकराव की विवो जांच की आवश्यकता को कम नहीं करता है, बल्कि, यह इन अपरिहार्य पशु मॉडल से प्राप्त डेटा को समृद्ध करने के लिए एक पूरक उपकरण के रूप में कार्य करता है। इस एक्सप्लांट मॉडल का उपयोग करके प्रभाव यांत्रिकी के संबंध में परिभाषित सेलुलर और आणविक मार्गों को विवो में चित्रित किया जा सकता है और मैकेनोबायोलॉजी अनुसंधान के नैदानिक अनुवाद को बढ़ाने के लिए एक पूरक दृष्टिकोण में पशु मॉडल का उपयोग करके चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है। इस एकीकृत रणनीति की शक्ति का कण्डरा मेकेनोबायोलॉजी अनुसंधान58,86,87,88 के अन्य क्षेत्रों में शोषण किया जा रहा है, और यह एक्सप्लांट मॉडल कण्डरा प्रभाव के लिए अपना आवेदन प्रदान करता है।

एक्सप्लांट मॉडल सीमाओं के बिना नहीं है। सभी एक्सप्लांट मॉडल के साथ, मेकोबायोलॉजी का अध्ययन केवल अपेक्षाकृत कम समय के तराजू पर किया जा सकता है, जबकि ऊतकव्यवहार्य 57,89 रहता है। जबकि मॉडल यांत्रिक प्रभाव के लिए तत्काल सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, यह प्रभाव से जुड़े क्रोनिक कण्डरा रोग का अध्ययन करने के लिए अनुकूल नहीं है। इसके अतिरिक्त, मॉडल प्रणालीगत प्रतिक्रिया और ऊतक क्रॉसस्टॉक के लिए खाते में असमर्थ है क्योंकि रक्त की आपूर्ति और तंत्रिका संचार बनाए नहीं रखा जाता है। फिर भी, मॉडल यांत्रिक प्रभाव के लिए अंतर्जात कण्डरा कोशिकाओं की आंतरिक प्रतिक्रिया को चित्रित करने के लिए एक मंच प्रदान करता है। मॉडल की एक और सीमा यह है कि पूर्व शोध 32,90,91,92 के अनुसार, हम उम्मीद करते हैं कि कई बड़े जीएजी-समृद्ध प्रोटियोग्लाइकेन्स प्रीट्रीटमेंट और एक्सप्लांट कल्चर के शुरुआती समय बिंदुओं के दौरान कण्डरा से बाहर निकलेंगे, विशेष रूप से एग्रीगेटिंग प्रोटीओग्लाइकेन्स के टुकड़े ग्राउंड मैट्रिक्स से लंगर नहीं डालते हैं। इसलिए, मॉडल में प्रभाव डालने के लिए जीएजी दाग माध्यमिक में परिवर्तन नए संश्लेषित जीएजी-समृद्ध मैक्रोमोलेक्यूल्स में परिवर्तन को प्रतिबिंबित करने की संभावना है जो अभी तक कैटाबोलाइज्ड नहीं हुए हैं और बाह्य मैट्रिक्स के भीतर लंगर डाले हुए हैं। यह देखते हुए कि ये जीएजी-समृद्ध प्रोटियोग्लाइकेन्स पेरिसेल्युलर स्पेस 22,30,93,94,95 में स्थानीयकृत होते हैं, एक्सप्लांट मॉडल पीसीएम रीमॉडेलिंग माध्यमिक से कण्डरा टकराव की जांच की सुविधा प्रदान कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित murine हिंद अंग explants के विच्छेदन अभ्यास की आवश्यकता है, लेकिन कुशल तकनीक जल्दी से हासिल किया जा सकता है. पूर्ण degloving (यानी, त्वचा हटाने) चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है, विशेष रूप से हिंद पंजा के अंकों के आसपास। जबकि पैर की उंगलियों के आसपास की त्वचा को पूरी तरह से हटाने की आवश्यकता नहीं होती है, यह पूरे संस्कृति में बाँझपन को मजबूत करता है क्योंकि बैक्टीरिया त्वचा और फर पर मौजूद होता है।

विच्छेदन का सबसे कठिन पहलू प्लांटारिस कण्डरा को औसत दर्जे का अकिलीज़ कण्डरा को समीपस्थ रूप से हटाना और अकिलीज़ कण्डरा को सतही रूप से पारित करना है। प्लांटारिस मांसपेशी-कण्डरा इकाई ट्राइसेप्स सुरा और अकिलीज़ कण्डरा 81,96,97,98,99 के साथ घनिष्ठ संबंध में घुटने और टखने के जोड़ों को फैलाती है। निष्क्रिय टखने के डॉर्सिफ्लेक्सियन के दौरान टखने के पीछे के पहलू में स्थानांतरित यांत्रिक भार प्लांटारिस और अकिलीज़ टेंडन के बीच वितरित किए जाते हैं, और प्लांटारिस कण्डरा को विवो100,101 में उच्च तनाव सहन करने के लिए जाना जाता है। इसके अतिरिक्त, मानव प्लांटारिस में शारीरिक परिवर्तनशीलता 96,102,103 अच्छी तरह से वर्णित है और जबकि यह परिवर्तनशीलता कृन्तकों97 में कम प्रचलित है, इसमें सीटू में एच्लीस कण्डरा के भीतर यांत्रिक वातावरण को प्रभावित करने की प्रवृत्ति है। स्वस्थानी 6,104 में Achilles कण्डरा के भीतर तनाव को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली पूर्व तकनीकों के अनुरूप, बाहरी रूप से लागू कण्डरा प्रभाव द्वारा उत्पन्न आंतरिक तनाव वातावरण को नियंत्रित करने के लिए प्लांटारिस कण्डरा को हटा दिया जाना चाहिए।

प्लांटारिस को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए Achilles कण्डरा में विच्छेदन प्रेरित कोशिका मृत्यु से बचने के लिए आवश्यक है, और डेटा (चित्रा 2B) में मौजूद सेल apoptosis में परिवर्तनशीलता गरीब विच्छेदन तकनीक के कारण विच्छेदन प्रेरित क्षति को प्रतिबिंबित कर सकते हैं. प्लांटारिस कण्डरा को हटाने से ठीक टिप संदंश से लाभ होता है ताकि प्लांटारिस को अकिलीज़ से सावधानीपूर्वक अलग किया जा सके और प्लांटारिस मांसपेशी-कण्डरा परिसर को समीपस्थ रूप से मुक्त किया जा सके। दाँतेदार संदंश प्लांटारिस कण्डरा के समीपस्थ मुक्त अंत को पकड़ने में मदद करते हैं ताकि कैल्केनस के चारों ओर और पूर्ण हटाने के लिए पंजा के अंकों की ओर दूर से खींचा जा सके। ली और इलियट चूहे plantaris और Achilles tendons और संबद्ध मांसलता97 का एक उपयोगी शारीरिक विवरण प्रदान करते हैं.

जबकि हमने इस अध्ययन में वर्णित विच्छेदन तकनीक को बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त पाया, प्रोटोकॉल को सेटिंग्स में आवश्यकतानुसार समायोजित या संशोधित किया जा सकता है जहां बाँझपन बनाए रखना चुनौतीपूर्ण साबित होता है। सर्जिकल उपकरण आटोक्लेव किए जा सकते हैं, बीटाडाइन समाधान को त्वचा पर शीर्ष रूप से लागू किया जा सकता है, और विच्छेदन को जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जा सकता है। हमने पाया है कि तेज और कुशल बेंचटॉप विच्छेदन महत्वपूर्ण है और त्वचा द्वारा प्रदान की गई बाँझ सीमा का उल्लंघन होने के बाद विच्छेदित अंगों को जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ मीडिया में जल्दी से स्थानांतरित करने की अनुमति देता है।

संदूषण के निवारण के लिए एक और प्रमुख लक्ष्य प्लेटफ़ॉर्म घटकों को स्टरलाइज़ करने के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीक है। हमारे हाथों में, हमें आटोक्लेविंग के बिना नल के पानी में पर्याप्त rinsing के साथ ≥ 10% ब्लीच समाधान में सरल सोख के साथ लगातार सफलता मिली है। 70% इथेनॉल का उपयोग करके अतिरिक्त नसबंदी को आवश्यकतानुसार लागू किया जा सकता है लेकिन ध्यान रखें कि पीएलए के साथ मुद्रित कोई भी घटक 3 डी ईटीओएच के साथ असंगत है और ताना होगा। इसके अतिरिक्त, ऐक्रेलिक स्नान और 3 डी मुद्रित पीएलए घटकों से अलग मंच के सभी हिस्सों को आटोक्लेव किया जा सकता है, और 10% ब्लीच समाधान ≥ भिगोए गए घटकों को आटोक्लेव या शुद्ध पानी से धोया जा सकता है। जंग से बचने के लिए, यह धोने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, और हाथ तुरंत प्रत्येक प्रयोग के बाद सभी धातु घटकों सूखी.

इस प्रोटोकॉल में वर्णित फाइब्रोकार्टिलेज गठन को चिह्नित करने के लिए टोलुइडीन ब्लू धुंधला होने की मात्रा निर्धारित करने की पद्धति एक अभिनव कस्टम रंग छवि विश्लेषण को नियोजित करती है जो कण्डरा अनुसंधान के लिए व्यापक अनुप्रयोग प्रदान करती है। आरजीबी से एचएसवी कलर स्पेस76 में पिक्सेल डेटा परिवर्तित करके महत्वपूर्ण लाभ प्रदान किए जाते हैं। यहां, रंग 0 ° -360 ° से एक विशेषता रंग के रूप में एक प्रमुख तरंग दैर्ध्य को एन्कोड करता है, जबकि संतृप्ति 0-255 से प्रत्येक रंग की शुद्धता को परिभाषित करती है। मूल्य, इसके विपरीत, रंग की चमक का वर्णन करता है और इस तरह, एचएसवी रंग योजना चमक (मूल्य) को रंग (रंग, संतृप्ति) से अलग करती है। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के संदर्भ में, एचएसवी पिक्सेल डेटा माइक्रोस्कोपी के दौरान प्रकाश संचरण में परिवर्तन और ऊतक अनुभाग मोटाई76 में भिन्नता के लिए अधिक मजबूत है। इसके अतिरिक्त, एचएसवी रंग अंतरिक्ष में काम करने से हिस्टोलॉजिकल दाग76 के आधार पर ब्याज की विशिष्ट तरंग दैर्ध्य (ह्यू के माध्यम से) के परिसीमन की अनुमति मिलती है, उदाहरण के लिए, टोलुइडिन नीले धुंधला के लिए लगभग 240 ° रंग।

इस अध्ययन में प्रस्तुत टोलुइडाइन ब्लू इमेज विश्लेषण का एक अभिनव पहलू फाइब्रोकार्टिलेज स्कोर है, एक मीट्रिक जो यूक्लिडियन दूरी से संबंधित है जो प्रत्येक आरओआई के रंग को पेरीओस्टियल फाइब्रोकार्टिलेज के रंग से अलग करता है। पेरीओस्टियल फाइब्रोकार्टिलेज जन्म के तुरंत बाद एक माध्यमिक उपास्थि के रूप में उभरता है, जबकि संपीड़ित कण्डरा फाइब्रोकार्टिलेज प्रसवोत्तर अनुपस्थित है और, अन्य सीसामोइड फाइब्रोकार्टिलेज की तरह, ऊंचा कण्डरा संपीड़न 16,17,28,77 के क्षेत्रों में यांत्रिक मांग द्वारा विनियमित होता है . प्रयोगात्मक समूहों के बीच फाइब्रोकार्टिलेज स्कोर की तुलना करके, हम न केवल यह निर्धारित कर सकते हैं कि टोलुइडिन नीले दाग का रंग माध्यमिक रूप से प्रभाव में बदल रहा है, लेकिन क्या इस परिवर्तन के परिणामस्वरूप फाइब्रोकार्टिलेज के करीब उपस्थिति होती है। इस विश्लेषण को अन्य लोकप्रिय जीएजी दाग जैसे कि अल्कियन ब्लू और सैफ्रानिन ओ, साथ ही कण्डरा फाइब्रोकार्टिलेज और फाइब्रोकार्टिलाजिनस कण्डरा एन्थेसिस के अन्य क्षेत्रों तक बढ़ाया जा सकता है, जब तक कि एक नियंत्रण ऊतक पेरिओस्टियल फाइब्रोकार्टिलेज के समान मौजूद होता है। उदाहरण के लिए, घुटने के टेंडन और स्नायुबंधन में जीएजी धुंधला में परिवर्तन फाइब्रोकार्टिलाजिनस मेनिसी में धुंधला होने के लिए फाइब्रोकार्टिलेज स्कोर के माध्यम से सामान्यीकृत किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू धारावाहिक ऊतक सेक्शनिंग और ट्रैकिंग अनुभाग स्तर है जो Achilles कण्डरा, जो दोहराने योग्य पैराफिन एम्बेडिंग और अनुभाग गहराई की ट्रैकिंग के लिए Achilles कण्डरा प्रविष्टि में प्रवेश की छानबीन पहचान की आवश्यकता है. इस सेक्शनिंग और धुंधला प्रोटोकॉल निस्संदेह अभ्यास और शोधन की आवश्यकता है, लेकिन क्रायोसेक्शनिंग के लिए बढ़ाया जा सकता है।

इस पांडुलिपि में वर्णित हिस्टोलॉजिकल दृष्टिकोण को आसानी से इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इम्यूनोफ्लोरेसेंस तक बढ़ाया जा सकता है। इस संबंध में, उपरोक्त प्रयोगात्मक डिजाइन का एक महत्वपूर्ण पहलू प्रत्येक माउस से contralateral अंगों की जोड़ी की तुलना है. यहां, सभी सांख्यिकीय तुलनाएं विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों को सौंपे गए एक ही माउस से विपरीत अंगों से अकिलीज़ कण्डरा के माध्यम से तुलनीय खंड स्तर पर ऊतक वर्गों के बीच खींची जाती हैं। यह रणनीति जैविक परिवर्तनशीलता को नियंत्रित करने में मदद करती है। इसके अतिरिक्त, contralateral ऊतक वर्गों के स्तर मिलान जोड़े एक ही स्लाइड रैक पर एक साथ (ऊतक विज्ञान) या एक साथ स्लाइड सभी अभिकर्मकों, बफर, और एंटीबॉडी समाधान (immunostaining) के लिए समान काम कर समाधान का उपयोग कर दाग के लिए दाग के लिए दाग का उपयोग कर दाग विज्ञान और immunolabeling में निहित परिवर्तनशीलता के लिए दाग के रूप में अच्छी तरह से अनुभाग स्तर, स्थान, और अभिविन्यास पर निर्भर शारीरिक विषमता.

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल के लिए कई अन्य संशोधनों अतिरिक्त शोध सवालों के आगे के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, जबकि यहां प्रदान किया गया प्रतिनिधि डेटा स्थैतिक टकराव के 7 दिनों पर केंद्रित है, इस दृष्टिकोण को क्लिप के माध्यम से हिंद पंजा के चारों ओर लिपटे स्ट्रिंग को युग्मित करके आंतरायिक या चक्रीय टकराव के जैविक अनुक्रम की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, मंच छोटे अणु एगोनिस्ट / विरोधी के साथ संस्कृति मीडिया को पूरक करके, या ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों से हिंद अंग एक्सप्लांट्स का उपयोग करके ब्याज के आणविक तंत्र से पूछताछ करने का अवसर प्रदान करता है।

अंत में, हमने एच्लीस कण्डरा टकराव के अंतर्निहित मैकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास म्यूरिन हिंद अंग एक्सप्लांट मॉडल प्रस्तुत किया है। यह एक टिशू कल्चर प्रोटोकॉल द्वारा संपन्न है जो 7 दिनों में लोडिंग स्थितियों में सेल व्यवहार्यता बनाए रखता है। यह मॉडल अन्य मॉडल प्रणालियों के साथ-साथ अपक्षयी कण्डरा रोग में वर्णित प्रभाव-संचालित फाइब्रोकार्टिलेज गठन और कोलेजनस परिवर्तन को पुन: प्रस्तुत करता है। प्रयोगात्मक मंच यांत्रिक तनाव पैटर्न के नियंत्रित अनुप्रयोग और मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, और इसलिए प्रभाव मैकेनोबायोलॉजी के कठोर अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करता है। इस मॉडल को सम्मिलन टेंडिनोपैथियों के उपचार में संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए ब्याज के आणविक तंत्र से पूछताछ करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक रोचेस्टर सेंटर फॉर मस्कुलोस्केलेटल रिसर्च के हिस्टोलॉजी, बायोकैमिस्ट्री और आणविक इमेजिंग (एचबीएमआई) कोर के जेफ फॉक्स और विद्या वेंकटरमानी द्वारा प्रदान किए गए समर्थन और सहायता के लिए आभारी हैं, जो P30AR06965 द्वारा भाग में वित्त पोषित है। इसके अतिरिक्त, लेखक मल्टीफोटन माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता के लिए रोचेस्टर मेडिकल सेंटर विश्वविद्यालय में सेंटर फॉर लाइट माइक्रोस्कोपी और नैनोस्कोपी (CALMN) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस अध्ययन को R01 AR070765 और R01 AR070765-04S1, साथ ही 1R35GM147054 और 1R01AR082349 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox - Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining

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बायोइंजीनियरिंग अंक 202
Achilles कण्डरा Impingement के मेकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए Murine हिंद लिंब एक्सप्लांट मॉडल
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Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W.,… More

Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W., Buckley, M. R. Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement. J. Vis. Exp. (202), e65801, doi:10.3791/65801 (2023).

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