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Bioengineering

아킬레스건 충돌의 기계생물학 연구를 위한 쥐 뒷다리 이식 모델

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65801
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

Summary

쥐 뒷다리 이식에서 아킬레스건 삽입의 충돌로 인한 섬유연골 변화를 지속적인 세포 생존력으로 재현하는 맞춤형 실험 플랫폼 및 조직 배양 프로토콜을 제시하여 힘줄 충돌의 역학을 탐구하는 데 적합한 모델을 제공합니다.

Abstract

뼈에 대한 힘줄 충돌은 횡방향 압축 변형률이 현저하게 상승한 다축 기계적 변형 환경을 생성하며, 이는 글리코사미노글리칸(GAG)이 풍부한 매트릭스의 축적과 콜라겐 네트워크의 리모델링을 특징으로 하는 국부적인 섬유연골 표현형을 유도합니다. 섬유연골은 건강한 힘줄의 충돌 부위에서 정상적인 특징이지만, 과도한 GAG 침착과 콜라겐 네트워크의 무질서는 건병증의 특징입니다. 따라서 충돌은 건병증의 시작과 진행에 중요한 외적 요인으로 임상적으로 인식되고 있습니다. 그럼에도 불구하고 힘줄 충돌의 기저에 있는 기계생물학은 여전히 연구가 부족합니다. 힘줄 충돌에 대한 세포 반응을 밝히기 위한 이전의 노력은 세포에 단축 압축을 적용하고 체외에서 힘줄 외식을 절제했습니다. 그러나 분리된 세포는 기계적 반응에 중요한 3차원 세포외 환경이 부족하며, 시험관 내 및 절제된 외식물 연구 모두 충돌 부위의 해부학적 특징에 따라 생체 내 힘줄 충돌에 의해 생성된 다축 변형 환경을 재현하지 못합니다. 더욱이, 힘줄 충돌의 생체 내 모델은 기계적 변형 환경에 대한 제어가 부족합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 아킬레스건 충돌의 기계생물학 연구에 적합한 새로운 쥐 뒷다리 이식 모델을 제시합니다. 이 모델은 아킬레스건을 제자리에서 유지하여 국소 해부학적 구조를 보존하고, 수동적으로 적용된 발목 배굴곡 중에 종골에 아킬레스건 삽입이 충돌하여 생성된 다축 변형 환경을 재현하면서 세포를 원래 환경 내에 유지합니다. 이 모델에 필수적인 조직 배양 프로토콜을 설명하고 7일 동안 지속적인 이식 생존 가능성을 설정하는 데이터를 제시합니다. 대표적인 결과는 조직학적 GAG 염색이 향상되고 충돌에 이차적으로 콜라겐 섬유 정렬이 감소했음을 보여주며, 이는 섬유연골 형성 증가를 시사합니다. 이 모델은 다양한 기계적 부하 요법을 조사하는 데 쉽게 적용할 수 있으며 충돌에 대한 반응으로 아킬레스건의 표현형 변화를 중재하는 메커니즘을 식별하기 위해 관심 분자 경로를 조작할 수 있습니다.

Introduction

아킬레스건과 회전근개 힘줄을 포함한 많은 힘줄은 정상적인 해부학적 위치로 인해 뼈 충돌을 경험합니다1,2,3,4. 힘줄 충돌은 종방향 섬유 축에 횡방향으로 향하는 압축 변형을 생성합니다.5,6,7. 힘줄 충돌 부위는 수축된 둥근 세포(섬유연골세포)가 글리코사미노글리칸(GAG) 함량이 현저히 증가한 무질서한 콜라겐 네트워크 내에 내장되어 있는 독특한 섬유연골 표현형을 보여줍니다2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. 이전 연구에서는 힘줄 충돌에 의해 생성된 이질적인 기계적 환경이 기본 메커니즘은 불분명하지만 큰 응집체 프로테오글리칸, 특히 아그레칸의 침착을 유도하여 이 GAG가 풍부한 매트릭스를 유지한다고 제안합니다1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. 섬유연골은 건강한 힘줄의 충돌 부위에서 정상적인 특징이지만, 과도한 섬유연골 형성과 관련된 비정상적인 프로테오글리칸 대사는 만성적으로 충돌된 힘줄에서 불균형적으로 나타나는 흔하고 쇠약해지는 질병인 건병증의 특징입니다1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. 따라서 힘줄 충돌은 회전근개 질환 및 삽입성 아킬레스 건병증(IAT)을 포함한 가장 흔한 건병증을 유발하는 중요한 외인적 요인으로 임상적으로 인식되고 있습니다50,51,52. 현재 건병증의 치료는 비효율적입니다. 예를 들어, IAT 환자의 약 47%는 보존적 관리 실패 후 외과적 개입이 필요하며, 수술 후 결과는 다양합니다53,54,55,56. 충돌과 건병증 사이의 명백한 관계에도 불구하고, 충돌한 힘줄의 세포가 기계적 환경을 감지하고 반응하는 기계생물학적 메커니즘이 제대로 설명되지 않아 건병증 발병기전에 대한 이해가 모호하고 부적절한 치료가 발생합니다.

외식(Explant) 모델은 힘줄 기계생물학(tendon mechanobiology) 57,58 연구에 유용한 도구이다. 힘줄 충돌의 기계생물학을 이해하기 위한 첫 번째 단계로, 몇몇 선행 연구에서는 세포 또는 절제된 힘줄 외피 27,29,30,31,32,33,34,39에 간단한 단축 압축을 적용한 후 세포 반응을 탐구했습니다. 그러나, 시험관 내 세포에는 균주 전달을 촉진하고, 기계적 변형에 의해 방출되는 중요한 성장 인자와 사이토카인을 격리하며, 기계적 형질도입에 중요한 역할을 하는 국소 접착 복합체를 위한 기질을 제공하는 세포외 및 세포주위 기질이 부족합니다57,59. 또한, in vitro 및 excised explant 연구 모두 in vivo에서 힘줄 충돌에 의해 생성된 다축 기계적 변형 환경을 재현하지 못하며, 이는 충돌 영역 5,6의 해부학적 특징에 의존한다. 충돌된 아킬레스건 삽입의 맥락에서, 여기에는 후종골 윤활낭 및 Kager의 지방 패드60,61,62,63과 같은 주변 조직이 포함됩니다. 반대로, 힘줄 충돌(25,28,36,37,38,64,65,66)의 생체내 모델은 힘줄에 직접 가해지는 하중의 크기 및 빈도에 대한 최소한의 제어를 허용하며, 이는 힘줄 기계생물학을 연구하기 위한 생체내 모델의 잘 알려진 한계이다57,58,67,68,69,70입니다. 생체 내 힘줄 변형률 측정의 어려움을 감안할 때, 이러한 모델 내에서 생성된 내부 변형률 환경은 종종 제대로 특성화되지 않습니다.

이 원고에서는 전체 쥐 뒷다리 외식에서 종골에 대한 아킬레스건 삽입의 충돌을 재현하는 맞춤형 실험 플랫폼을 제시하며, 이 조직 배양 프로토콜과 짝을 이룰 때 식생 배양에서 7일 동안 생존력을 유지하고 힘줄 충돌의 생물학적 후유증을 연구할 수 있습니다. 이 플랫폼은 3D 프린팅된 폴리락트산(PLA) 베이스를 기반으로 제작되어 그립 부착 및 3D 프린팅된 PLA 체적 감소 인서트를 부착할 수 있는 기반을 제공합니다. 이 그립은 뒷다리의 꼬리 쪽이 위쪽을 향하도록 위쪽 다리와 무릎 근위부를 고정하는 데 사용되며, 초음파 프로브 또는 도립 현미경을 사용하여 위에서 아킬레스건을 이미지화할 수 있습니다(그림 1A). 부피 감소 인서트는 베이스의 트랙을 따라 미끄러지며 필요한 조직 배양 배지의 부피를 줄입니다. 뒷발을 감싼 땋은 선은 기본 디자인과 3D 프린팅된 PLA 클립을 사용하여 플랫폼 밖으로 라우팅됩니다. 줄을 당기면 뒷발이 배굴곡되고 아킬레스건 삽입이 종골에 부딪혀 횡방향 압박 변형률이 상승합니다 5,6 (그림 1A). 플랫폼은 조직 배양 배지에 잠긴 뒷다리 외출부를 유지하는 아크릴 욕조 내에 포함되어 있습니다. 팽팽한 끈을 접착 테이프로 욕조 외부에 고정하면 발목 배굴곡이 유지되어 아킬레스건 삽입의 정적 충돌이 발생합니다. 3D 프린팅 부품용 CAD 파일은 다양한 형식(보충 파일 1)으로 제공되므로 다양한 상용 및 무료 오픈 소스 CAD 소프트웨어로 가져와 실험 요구 사항에 맞게 수정할 수 있습니다. 제작을 위해 3D 프린터에 액세스할 수 없는 경우 저렴한 비용으로 부품을 인쇄하고 배송하는 온라인 3D 프린팅 서비스에 CAD 파일을 제공할 수 있습니다.

중요한 것은 삼두근-아킬레스 근 복합체가 무릎과 발목 관절 모두에 걸쳐 있다는 것입니다 71,72,73. 결과적으로 아킬레스건의 인장 변형은 무릎 굴곡의 영향을 받습니다. 무릎 신전은 아킬레스건에 긴장을 가하는 반면 무릎 굴곡은 긴장을 줄입니다. 먼저 무릎을 펴고 발목을 수동적으로 배측 굴곡함으로써 충돌된 삽입부의 압축 변형이 인장 변형에 중첩될 수 있습니다. 반대로 무릎을 구부린 상태에서 발목을 수동적으로 배측 굴곡하면 인장 변형이 감소하고 압축 변형이 남습니다. 현재 프로토콜은 이러한 세 가지 조건을 탐색합니다. 1) 정적 충돌의 경우 발을 경골에 대해 110° < 배굴곡하여 삽입을 방해하고 무릎을 구부려 긴장을 줄입니다. 2) 베이스라인 장력 그룹의 경우 무릎을 펴고 발목을 배굴곡 145° 이상으로 펴서 삽입 시 주로 인장 변형을 발생시킵니다. 3) 무부하 그룹의 경우, 외식은 외부에서 가해지는 하중이 없는 상태에서 무릎과 발목이 중립 위치에 있는 페트리 접시에서 배양됩니다. 위에서 언급한 각도는 발과 경골이 180° 각도로 평행하고 90° 각도로 수직인 좌표계를 기준으로 사진으로 측정한 것입니다.

프로토콜의 주요 단계에는 1) 뒷다리 외피 절개 및 피부와 족저 힘줄의 신중한 제거가 포함됩니다. 2) 48시간 덱사메타손 전처리 후 이식 배양; 3) 조직 절편 및 조직학적 염색; 4) 섬유연골 형성을 평가하기 위한 컬러 이미지 분석. 절개 후, 각 뒷다리 이식은 덱사메타손74가 보충된 배양 배지에서 48시간 동안 전처리됩니다. 각 마우스의 반대쪽 팔다리는 쌍별 비교를 위해 별도의 실험 그룹에 할당되어 생물학적 변동성을 제어하는 데 도움이 됩니다. 전처리 후, 외식을 위에서 설명한 대로 플랫폼에 배치하고 7일 더 배양합니다(그림 1B). 48시간 전처리 직후 외식재를 제거하는 전처리(0일) 그룹에 대한 추가 비교가 이루어집니다.

이식 배양 후 뒷다리를 다듬고 포르말린을 고정하고 석회질을 제거하고 파라핀에 넣습니다. 시상 방향의 연속 절편은 근건성 접합부에서 종골 삽입까지 아킬레스건을 시각화하는 동시에 전체 힘줄을 통해 절편 깊이를 추적할 수 있습니다. 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT) 매개 dUTP X-nick 라벨링(TUNEL)은 세포사멸에 의한 이차적인 DNA 손상을 시각화하고 생존 가능성을 평가하는 데 사용됩니다. 톨루이딘 블루 조직학 및 맞춤형 컬러 이미지 분석을 수행하여 GAG 염색의 변화를 정량화합니다. 그런 다음 톨루이딘 블루 염색 조직 절편을 SHG 이미징에 사용하여 콜라주 섬유 조직의 변화를 특성화합니다(그림 1B).

제공된 대표적인 결과는 GAG가 풍부한 매트릭스의 조직학적 염색 변경과 모델 내에서 7일간의 정적 충돌에 의해 생성된 세포외 콜라겐 네트워크의 무질서를 시사합니다. 이 모델은 충돌 유도 섬유연골 변화의 기저에 있는 분자 메커니즘을 탐구하는 데 활용할 수 있습니다.

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Protocol

모든 동물 연구는 로체스터 대학교 동물 자원 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 조직 배양 배지의 제조

  1. 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에서 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신 및 200μM L-아스코르브산을 사용하여 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(1x DMEM)에서 모든 외식을 배양합니다. 초기 48시간 전처리의 경우, 100nM 덱사메타손74가 보충된 70mL의 배양 배지에서 각 이식체를 배양합니다. 전처리 후, 덱사메타손 없이 7일 동안 팔다리를 배양하고 48-72시간마다 배지를 교체합니다.
    참고: 소 태아 혈청과 같은 혈청을 배양 배지에 첨가하는 것은 Wunderli, Blache 및 Snedeker57에서 제공한 권장 사항과 일치하는 것으로 권장되지 않습니다. 간단히 말해서, 무혈청 상태는 생체 내에 존재하는 무혈성, 영양분이 부족한 힘줄 미세환경을 더 잘 나타냅니다. 더욱이, 혈청 보충은 특정 배양 조건(75 ) 하에서 조직 분해를 촉진할 수 있고, 힘줄 병리학(57)의 두 가지 특징인 세포 증식 및 조직 외부로의 이동을 자극할 수 있다.
  2. 언로드된 그룹의 경우 각 explant를 70mL의 배지에서 배양합니다. 베이스라인 장력 및 정적 충돌 그룹의 경우, 각 플랫폼에는 팔다리를 물에 담그기 위해 약 125mL의 배양 배지가 필요합니다. 이 체적은 그립의 상부 다리 위치 및 3D 인쇄 매개변수(주로 채우기 밀도)에 따라 달라질 수 있습니다.

2. 외식성 해부 및 덱사메타손 전처리

  1. CO2 흡입 및 이차성 자궁경부 탈구를 통해 또는 기관 지침에 따라 마우스를 안락사시킵니다. 이 프로토콜은 1년 미만의 C57BL/6 마우스를 사용합니다. 뒷다리 크기는 나이가 들면서 증가하며 그립에 맞추기가 어려울 수 있습니다.
  2. 해부 전에 70mL의 예열된(37°C) 배양 배지를 멸균 생물 안전 작업대(BSC)의 100mm(직경) x 25mm(높이) 페트리 접시에 옮깁니다. 덱사메타손을 첨가하여 100nM 작업 농도를 달성합니다.
  3. 흡수성 언더패드를 사용하여 벤치탑에서 해부를 수행할 수 있으며, 뒷다리 이식물을 BSC로 옮기기 전에 해부를 통해 신속하게 작업할 수 있습니다. 이 해부에 필요한 매끄럽고 곧고 가는 팁 겸자를 포함하는 수술 도구를 조립하십시오. 톱니 모양의 이빨이 있는 곧고 가는 팁 겸자; 그리고 곧고 날카롭고 가는 가위.
  4. 뒷다리 이식 부위를 해부하려면 마우스를 앙와위 자세로 놓고 고관절을 확인합니다. 가는 가위를 사용하여 위쪽 다리의 근위 및 전방(두개골)을 덮는 피부를 통해 작은(5-10mm) 절개합니다.
  5. 절개 부위를 당겨 확장하고, 노출된 윗다리를 손가락으로 꼬집고, 피부를 원위부로 조심스럽게 당겨 뒷다리를 발목 높이까지 벗깁니다. 발의 등쪽을 따라 피부 아래에 가위 날을 부드럽게 삽입하고 발가락까지 뻗은 절개를 합니다. 피부를 말단부로 계속 당겨 완전히 제거합니다.
  6. 마우스를 배치하여 발목 근처의 종골의 후방(꼬리) 측면에 아킬레스건 삽입을 시각화합니다. 아킬레스건 삽입부에 근접한 족저건은 아킬레스건의 내측 경계에 바로 인접해 있으며 발의 발바닥 쪽을 향해 원위부로 뻗어 종골의 뒤쪽을 지나갑니다.
  7. 발바닥 힘줄을 제거하려면 두 힘줄 사이에 매끄럽고 가는 끝 겸자의 한쪽 끝을 조심스럽게 삽입하고 발바닥 힘줄 아래를 지나 팁을 내측으로 확장합니다. 팁을 근방으로 당겨 발바닥 근육을 찢습니다. 끝이 가는 톱니 모양의 집게를 사용하여 발바닥 힘줄의 분리된 근위 끝을 잡고 말단부로 당겨 제거합니다.
  8. 고관절에서 가는 가위를 사용하여 골반을 자르고 뒷다리를 분리합니다. 가위를 사용하여 남은 골반을 들어 올리고 대퇴골두를 노출시킵니다.
  9. 뒷다리 이식을 BSC로 옮기고 덱사메타손이 함유된 세포 배양 배지가 들어 있는 접시에 넣습니다. 접시를 인큐베이터로 옮기고 48시간 동안 전처리합니다.

3. Explant 배양 및 로딩 플랫폼

  1. 48시간 전처리가 끝나면 충분한 양의 배양 배지를 예열합니다(섹션 1). 이 시점부터 덱사메타손은 배양 배지에 첨가되지 않습니다. 이때, 전처리된(0일) 그룹의 팔다리를 고정, 석회질 제거 및 향후 절편, 염색 및 분석을 위해 파라핀에 매립할 수 있습니다.
  2. 언로드된 그룹의 경우 전처리 배지를 흡인하고 외식을 신선한 페트리 접시로 옮기고 각각 70mL의 배양 배지를 추가한 다음 인큐베이터로 돌아갑니다.
  3. 기준선 장력 및 정적 충돌 그룹의 경우 외형 플랫폼을 준비합니다. 그립 플래튼과 비슷한 크기의 사포 조각을 자릅니다. 정적 충돌 그룹의 경우 약 18인치 길이의 꼰 선 조각을 자르고 선 길이를 따라 중간에 느슨한 오버핸드 매듭을 미리 묶습니다. 알루미늄 호일 조각을 찢어 각 아크릴 수조를 덮고 70% 에탄올(EtOH)을 뿌립니다. BSC로 준비 사항을 전송합니다.
  4. 각 플랫폼에는 아크릴 수조, 베이스, 부피 감소 인서트, 클립 및 그립이 포함되어 있습니다. 각 그립에는 그립을 베이스에 부착하는 M5 x 0.8mm 나사 x 10mm 길이 나사 1개를 포함하여 2개의 플래튼과 3가지 유형의 나사가 포함되어 있습니다. 그립을 고정하기 위해 플래튼을 연장하는 M6 x 1mm 나사 x 20mm 길이 나사 2개; M3 x 0.5 mm 나사 x 14 mm 길이 스크류 4개와 4개의 압축 스프링이 결합되어 플래튼을 집어넣어 그립을 엽니다.
  5. 누출 시 모든 배양 배지를 포집할 수 있는 보조 용기에 모든 구성 요소를 넣습니다. 10% 표백제 용액≥ 담그고 최소 1시간 동안 담그십시오. 표백제 용액을 수돗물(필요에 따라 오토클레이브)로 헹구고 BSC로 이동합니다.
    알림: 오염 문제를 해결하려면 모든 수돗물을 고압멸균하거나 정제수를 사용하는 것이 좋습니다. 오염 문제를 해결할 때 추가 팁은 토론을 참조하십시오.
  6. M3 나사와 압축 스프링을 사용하여 플래튼을 그립에 부착하고, M5 나사를 사용하여 그립을 베이스에 고정하고, 플래튼에 맞물릴 때까지 M6 나사를 삽입합니다. 양면 테이프를 사용하여 플래튼에 사포를 부착한 다음 그립을 닫아 플래튼에 사포가 접착되도록 합니다. 모든 플랫폼에 대해 반복합니다.
  7. 플랫폼을 로드할 준비가 되면 그립을 완전히 열고 집게를 사용하여 아킬레스건의 표면 표면이 위를 향하도록 위쪽 다리와 무릎을 플래튼 사이에 놓습니다(그림 1A). 그립을 느슨하게 닫아 제자리에 부드럽게 고정합니다.
  8. 집게를 사용하여 노출된 대퇴골두나 발을 잡고 그립을 서서히 닫아 제자리에 고정하면서 무릎 굴곡 각도를 조작합니다. 기준선 장력 그룹의 경우 앞에서 설명한 대로 무릎 관절을 확장합니다. 무릎을 쭉 뻗은 상태에서 그립이 조여지면서 발목이 자연스럽게 펴집니다. 정적 충돌 그룹의 경우 앞에서 설명한 대로 그립 사이의 무릎 관절을 구부립니다.
  9. 정적 충돌 그룹의 경우 스트링의 오버핸드 매듭을 원위 발 주위에 놓고 조입니다. 외식구 아래에 있는 베이스의 슬롯과 클립 구멍을 통해 스트링을 배선합니다. 베이스를 아크릴 수조에 넣고 클립을 수조의 상단 가장자리에 고정합니다(그림 1A).
  10. 스트링을 당겨 경골에 대해 발을 최소 110°로 배구부리고 영구 마커를 사용하여 스트링이 클립에서 나올 때 표시합니다. 이 위치에서 외식의 사진을 찍어 나중에 배측 굴곡 각도를 정량화합니다(그림 1A).
  11. 베이스를 제거하고 베이스의 트랙을 따라 밀어 부피 감소 인서트를 부착합니다. 베이스(이제 부피 감소 인서트에 부착됨)를 아크릴 수조에 다시 놓고 클립을 상단 가장자리에 재배치합니다. 표시된 끈을 가이드로 사용하여 끈을 당겨 원래 배측 굴곡 각도로 돌아가고 테이프로 끈을 욕조 외부에 고정하여 정적 배측 굴곡을 유지합니다.
  12. 베이스라인 장력 그룹의 경우, 외식구가 그립 사이에 위치하면 부피 감소 인서트가 있는 베이스를 아크릴 수조에 놓고 배측 굴곡 각도의 정량화를 위해 사진을 찍기만 하면 됩니다.
  13. 125mL의 예열된(37°C) 배양 배지를 각 플랫폼에 추가하여 외식물을 담그십시오. 수조 상단을 알루미늄 호일로 덮고 보조 용기에 넣고 인큐베이터로 이동합니다. 추가 7일 동안 배양하고 48-72시간마다 배지를 교체합니다.
    알림: 수조 상단에 테이프를 붙이면 PLA 부품이 뜨는 것을 방지할 수 있습니다.

4. 고정, 석회질 제거 및 파라핀 임베딩

  1. 이식 배양 후 가위를 사용하여 발톱/원위 발가락을 다듬고 아킬레스건 근연부에 근접한 위쪽 다리를 잘라냅니다. 손질된 각 발목 관절을 폼 생검 패드가 늘어선 처리 카세트에 넣습니다. 발목을 카세트 모서리에 밀어 넣어 발목을 약 90° 배굴곡 위치에 놓고 카세트를 닫아 제자리에 고정합니다.
  2. 10% 중성 완충 포르말린(NBF)에 3일 동안 고정하고 빙초산으로 pH를 7.4-7.6으로 조정한 증류수(diH2O)에 용해된 14% 에틸렌디아메네테트라아세트산(EDTA)에서 2주 동안 석회질을 제거합니다.
  3. 염을 제거하려면 샘플을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세 번 헹군 다음 diH2O에서 각각 5분씩 헹굽니다. 파라핀 조직학을 위한 일상적인 시료 처리 수행: 등급이 매겨진 일련의 EtOH를 통해 탈수하고, 크실렌에서 투명하고, 파라핀 왁스로 침투시킵니다. 아래 섹션 5에 설명된 대로 내측에서 외측으로 진행되는 아킬레스건을 통해 시상 조직 절편을 얻기 위해 샘플을 파라핀에 배향하고 포함합니다(그림 1B).

5. 조직 절편

  1. 마이크로톰을 사용하여 단면이 블록 면과 평행이 될 때까지 샘플을 조심스럽게 다듬습니다. 관절의 내측 측면에서 발목을 심하게 다듬고 아킬레스건 삽입의 내측 경계에 도달하기 전에 멈춥니다.
  2. 샘플을 얼음 블록으로 옮겨 온도와 수분을 조정하고 블레이드를 교체합니다(또는 현재 블레이드의 새 부분으로 이동). 10μm 두께로 샘플을 계속 절편하고 명시야 현미경으로 아킬레스건 삽입부의 진입을 주의 깊게 식별합니다. 식별되면 전체 아킬레스건 삽입을 통해 단면 번호(즉, 조직 깊이)를 추적하는 연속 절편을 수행합니다.

6. 탈파라핀화/재수화 및 슬라이드 선택

  1. 아래의 각 분석에 대해 각 반대측 사지 쌍에서 수평이 일치하는 조직 절편을 선택합니다. 염색하기 전에 슬라이드 랙에 놓고 크실렌 3회 변화, 100% EtOH 2회 변화, 95% EtOH 2회 변화, 70% EtOH 1회 변화를 각각 5분씩 진행합니다. diH2O에서 수분 보충을 마칩니다.

7. 아킬레스건 생존력을 평가하기 위한 TUNEL

  1. TUNEL 라벨링의 경우 제조업체의 프로토콜에 따라 염색하십시오. 실온에서 20 μg/mL proteinase K에서 20분 동안 배양하고 diH2O에서 헹굽니다. 50 μL의 TUNEL 염색 용액(5 μL 효소 용액, 45 μL 라벨 용액)에서 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. diH2O. DIP와 커버슬립이 포함된 변색 방지 시약으로 마운트에 헹굽니다.
  2. 4x 대물렌즈가 장착된 형광 현미경을 사용하여 아킬레스건 삽입을 이미지화합니다. 모든 핵을 시각화하기 위한 DAPI 채널(여기/방출 파장 = 360/460nm), 세포사멸 핵을 시각화하기 위한 TUNEL(여기/방출 파장 = 540/580nm), 그리고 가능한 경우 명시야 채널을 포함합니다.
  3. 영상 분석의 경우, ROI 기반 처리에 적합한 영상 분석 소프트웨어(예: FIJI/ImageJ 또는 MATLAB)로 영상을 가져옵니다. 전체 아킬레스건을 윤곽으로 하는 관심 영역(ROI)을 정의하고(그림 2A), 배양할 때 해부 및 환경 조건의 급격한 변화로 인해 유도된 죽음에 매우 취약한 에피테논의 세포를 제외합니다.
  4. 이렇게 하려면 MATLAB에서 명시야 영상을 가져오고 drawpolygon() 함수를 사용하여 힘줄의 경계를 추적하고 둘러싸는 방식으로 ROI 선택을 수행합니다. MATLAB은 ROI에 대한 Polygon 객체를 생성하고, 이 객체를 DAPI 및 TUNEL 채널 영상에 적용하면 아킬레스건 내의 핵만 분석하기 위해 createMask()를 사용하여 ROI 외부의 픽셀 명암 데이터를 마스킹할 수 있습니다.
  5. DAPI 및 TUNEL 채널 이미지를 가져오고, 조직 절편에서 우연히 포획된 뼈, 근육 또는 지방과 같은 생존 불가능한 조직에서 세포사멸 핵의 최대 형광 강도로 정규화하여 자가사멸(TUNEL+) 핵을 정의하기 위한 형광 강도 임계값을 식별합니다. 이미지가 마스킹되면 아킬레스건 내 자가사멸 핵(TUNEL+ 핵/DAPI 핵)의 분율을 계산합니다.

8. 섬유연골 형성을 특성화하기 위한 톨루이딘 블루 조직학

  1. 수분이 재수화되면(섹션 6), 수평이 일치하는 조직 절편이 있는 슬라이드 랙을 반대측 외피 쌍에서 빙초산을 사용하여 pH를 4.0으로 조정한 0.1M 아세트산나트륨 완충액의 0.4% w/v 톨루이딘 블루 O로 옮깁니다. 실온에서 10분 동안 배양한 다음 diH2O에서 각각 30초 동안 3번 헹굽니다.
  2. 95% EtOH의 3회 변화와 100% EtOH의 2회 변화를 각각 30초 동안 탈수합니다. 크실렌을 각각 1분씩 세 번 교체하여 씻어냅니다. 크실렌 기반 장착 매체가 있는 커버슬립.
  3. 아킬레스건 삽입의 24비트 RGB(Red-Blue-Green) 컬러 이미지를 얻습니다. 예를 들어, 이 프로토콜의 경우 어댑터를 사용하여 디지털 컬러 카메라를 4x 대물렌즈가 있는 간단한 명시야 현미경의 접안렌즈에 연결합니다.
  4. 아킬레스건 삽입 시 압박 힘줄 섬유연골(CTF)16 내 톨루이딘 블루 염색의 차이를 정량화하려면(그림 3A,B) RGB 이미지를 여러 ROI를 정의하고 관리할 수 있는 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다. 옵션에는 선택 및 ROI 관리자 툴(FIJI/ImageJ) 또는 영상 처리 툴박스(MATLAB)가 있습니다. 먼저 픽셀/길이 배율을 설정합니다.
    참고: 소프트웨어 선택은 연구자의 재량에 달려 있으며 MATLAB 또는 FIJI/ImageJ에 국한되지 않습니다. 저자는 MATLAB 코드(보충 파일 2), 구현을 설명하는 문서(보충 파일 3) 및 샘플 이미지(보충 파일 4)를 제공했습니다. 연구원은 이 코드를 다른 프로그래밍 언어로 변환하여 필요하거나 선호하는 경우 다른 소프트웨어에서 사용할 것을 권장합니다.
  5. 선택한 소프트웨어에 표시된 이미지를 사용하여 심부 힘줄 경계와 종골의 교차점을 식별합니다. 여기에서 CTF의 깊은 경계를 설정하기 위해 깊은 힘줄 경계를 따라 근방 800μm를 추적합니다. 예를 들어, MATLAB의 drawpolyline() 함수를 사용하여 RGB 영상 위에 대화형 방식으로 다중선을 그릴 수 있습니다. MATLAB은 선의 꼭짓점을 포함하는 Polyline 객체를 생성하며, 이 꼭짓점은 800μm 길이로 처리 및 트리밍할 수 있습니다.
  6. 이 위치에서 국소 섬유 방향에 수직인 표면 힘줄 경계에 연결되는 선분을 그려 CTF의 근위 경계를 만듭니다.
  7. 심부 힘줄 경계와 종골의 교차점으로 돌아가 CTF를 부착 영역 섬유연골(AZF)16에서 분리하는 뚜렷한 조수 표시를 따라 표재성 힘줄 경계에 연결되는 선분을 그려 CTF의 원위 경계를 정의합니다(그림 3A,B). 마지막으로, 둘러싸고 있는 표재성 힘줄 경계를 추적하여 CTF의 표재성 경계를 생성합니다.
  8. 삽입 전반에 걸친 GAG 염색의 공간적 변화를 설명하기 위해 전체 CTF를 4개의 사분면으로 나눕니다(그림 3A,B). 깊고 피복적인 CTF 경계의 중간점을 선분과 연결하여 원위/근위 경계를 만듭니다. 이 경계의 중간점을 통과하여 섬유 방향을 따라 원위 및 근위 CTF 경계의 중간점을 연결하여 표면/심부 경계를 만듭니다.
  9. 이 6개의 경계는 전체 CTF를 나타내는 ROI를 정의하는 데 사용할 수 있는 정보를 제공할 뿐만 아니라 CTF를 세분화하는 4개의 사분면도 제공합니다. 예를 들어, MATLAB에서 각 개별 ROI(CTF, 사분면 1-4)의 경계를 정의하는 꼭짓점을 벡터로 컴파일하고 images.roi.Polygon()을 사용하여 각 ROI에 대해 닫힌 Polygon 객체를 생성합니다.
  10. ROI가 정의된 상태에서 FIJI의 색 변환기 플러그인, MATLAB의 rgb2hsv() 함수 또는 적절한 변환 방정식76을 적용하는 다른 소프트웨어를 사용하여 RGB 픽셀 데이터를 HSV(Hue-Saturation-Value) 색 공간으로 변환합니다. 그런 다음 HSV 데이터를 2D 색조 채도 공간에 투영할 수 있으며, 여기서 색조와 채도의 각 조합은 고유한 색상을 인코딩합니다(그림 3C).
  11. 각 ROI 내에서 ROI의 평균 얼룩 색상을 설명하는 평균 색조 및 채도를 계산합니다. 예를 들어, MATLAB에서는 각 ROI 내에서 색조-채도 픽셀 데이터를 분석하기 위해 createMask()를 사용하여 이미지를 마스킹하기 위해 각 ROI를 정의하는 Polygon 객체를 사용하여 이를 달성할 수 있습니다.
  12. 골막 섬유연골(periosteal fibrocartilage, PF)16 내에서 또 다른 작은 ROI를 정의하고(그림 3A, B) 평균 색조와 채도를 계산합니다. 그런 다음 CTF의 각 ROI의 평균 색상을 PF의 ROI로 분리하는 유클리드 거리를 계산합니다(그림 3C).
    Equation 1
    참고 : 유클리드 거리 계산은 ROI의 평균 색상과 전형적인 섬유 연골 조직 16,17,77 인 PF의 평균 색상 사이의 유사성 정도를 설명합니다. 유클리드 거리가 작을수록 외관상 섬유연골이 더 많은 ROI 색상을 나타냅니다.
  13. 이 거리를 사용하여 섬유연골 점수를 계산하는데, ROI 색이 PF 색과 동일한 경우 최대값 1을 가정하고 ROI 및 PF 색이 색조 채도 색 공간 내에서 최대 분리에 도달하는 경우 최소값 -1을 가정합니다.
    Equation 2
  14. 각 사지의 조직 절편에 대한 각 ROI 내에서 색조, 채도 및 섬유연골 점수에 대한 평균 데이터입니다. 반대쪽 사지 그룹 간에 쌍을 이루는 통계적 비교를 수행합니다.

9. 교원질 네트워크 조직에 있는 변화를 조사하는 SHG 화상 진찰

  1. 20x 대물렌즈가 장착된 유능한 현미경 시스템을 사용하여 Toluidine blue 염색 절편의 SHG 이미징을 수행합니다. 단면 두께를 통해 z-스택을 획득하고 필요에 따라 타일 스캔을 수행하여 아킬레스건 삽입을 완전히 캡처합니다.
  2. SHG 이미지를 선호하는 이미지 분석 소프트웨어로 가져오고 섹션 8의 Toluidine blue 이미지 분석에 대해 설명된 대로 아킬레스건 삽입 시 CTF를 포함하고 세분화하는 ROI를 정의합니다(그림 4A,B).
  3. SHG 이미지를 MATLAB으로 가져오는 경우 섹션 8에 설명된 대로 MATLAB에서 CTF ROI를 정의하는 방법을 사용하십시오. ROI를 정의한 후에는 MATLAB에서 ROI 꼭짓점을 .txt 파일로 내보내고 파일 > 가져오기 > XY 좌표를 사용하여 FIJI로 가져와서 ROI 좌표를 FIJI로 전송합니다. 선택 항목을 오버레이하고 분석을 위해 ROI 관리자에게 보냅니다.
  4. 콜라겐 조직을 정량화하려면 푸리에 스펙트럼 분석을 수행하는 피지의 방향성 플러그인을 사용하여 ROI에 걸쳐 있는 작은 창에서 섬유 배향의 분포를 계산합니다. 분산이라고 하는 이 분포의 확산은 섬유 정렬과 반비례합니다.
    참고: 콜라겐 섬유는 정렬/조직의 부재보다는 힘줄의 총 곡률로 인해 CTF를 가로지르는 다른 창에서 다양한 방향을 취할 수 있습니다. 콜라겐 조직의 변화와 삽입 시 힘줄의 총 만곡을 더 잘 구별하려면 더 작은 ROI를 정의해야 합니다.
  5. SHG 이미지를 FIJI로 가져오고 픽셀/길이 스케일을 설정합니다. 최대 픽셀 강도 데이터를 2D 합성 영상에 투영하고 ROI Manager에 ROI를 추가할 수 있습니다. 각 CTF ROI를 영상에 순차적으로 오버레이하고 ROI 내에 일정한 크기의 작은 하위 ROI 10개를 그려 ROI 매니저에 하위 ROI를 추가합니다.
  6. 각 하위 ROI 내에서 FIJI에서 방향성 플러그인을 실행하여 광섬유 분산을 계산합니다. 각 CTF ROI 내의 하위 ROI에 대한 평균 분산 데이터 및 각 explant의 섹션에 대한 각 CTF ROI 내의 평균 분산 데이터. 반대쪽 사지 그룹 간에 쌍을 이루는 통계적 비교를 수행합니다.

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Representative Results

TUNEL 염색 조직 절편의 대표 이미지는 실험군에서 7일간의 식생 배양 후 아킬레스건 체내 최소 세포사멸 핵을 보여줍니다(그림 2A). 이러한 이미지의 정량화는 조직 배양 프로토콜이 로딩 조건에서 7일간의 이식 배양 후 아킬레스건 내에서 평균 최대 78%의 생존율을 유지한다는 증거를 제공합니다(그림 2B).

정성적으로 향상된 톨루이딘 블루 염색은 하중이 가해지지 않은 대조군에 비해 7일 동안 정적 충돌이 발생한 후 높이 평가되며(그림 3A,B), 특히 이전에 최대 횡방향 압축 변형률 5,6을 측정한 종골에 인접한 깊은 사분면에서 더욱 그렇습니다. 이러한 톨루이딘 블루 염색 조직 절편의 정량화는 반대측 무부하 외식에 비해 7일간의 정적 충돌 후 색조(그림 3D), 포화도(그림 3E) 및 섬유연골 점수(그림 3F)의 상당한 변화를 나타냅니다. 이 변경된 GAG 염색은 이 모델 내에서 정적 충돌에 의한 이차적인 섬유 연골 형성을 나타낼 수 있습니다. 포화도와 섬유연골 점수의 통계적으로 유의미한 차이는 기준선 장력 7일 후 1사분면에서만 감지되었습니다(그림 3E,F). 또한, 포화도와 섬유연골 점수는 반대쪽 무부하 힘줄에 비해 감소했는데, 이는 정적 충돌에 비해 반대 경향이었습니다. 이 데이터는 인장 하중이 충돌로 인한 섬유 연골 형성을 약화시키거나 역전시킬 수 있다는 가설을 뒷받침할 수 있으며 향후 추가 조사가 필요합니다.

SHG 이미징의 정량화는 7일간의 정적 충돌 후 교원질 섬유 방향의 미묘하지만 중요한 변화를 시사하며, 이는 분산의 상당한 차이로 알 수 있듯이 종골에 인접한 깊은 원위 영역에서도 마찬가지입니다(그림 4C).

Figure 1
그림 1: Explant 플랫폼 및 실험 설계. (A) 외식용 플랫폼의 사진 및 개략도 표현. (맨 위로) 전체 쥐 뒷다리 이식 부위가 플랫폼에 적재되어 있고 중요한 구성 요소에 라벨이 붙어 있는 사진. (하단) 이 외식성 모델에서 수동적으로 적용된 발목 배굴곡에 의해 유도된 삽입 아킬레스건 충돌을 묘사한 개략도. (B) 연구 설계 및 외식 배양 개략도. 뒷다리 외식은 100nM 덱사메타손에서 48시간 동안 전처리됩니다.74. 그런 다음 각 마우스에서 하나의 뒷다리 이식을 7일 동안 언로드된 접시에서 배양하고, 반대쪽 사지를 실험 플랫폼에 로드하여 아킬레스건을 7일 동안 기준선 장력 또는 정적 충돌 하에 놓습니다. 반대쪽 사지 쌍의 연속 조직 절편은 GAG가 풍부한 조직을 시각화하기 위해 톨루이딘 블루로 염색하거나 TUNEL 염색에 사용합니다. 그런 다음 톨루이딘 블루 염색 절편을 SHG 이미징에 사용하여 콜라겐 조직을 평가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 이식 생존력. (A) 전처리된(0일) 외식(왼쪽 위), 하중이 가해지지 않은 힘줄(오른쪽 위), 기준선 장력으로 유지되는 힘줄(왼쪽 아래) 및 정적으로 충돌한 힘줄(오른쪽 아래)에서 TUNEL 염색 절편의 대표 이미지. 아킬레스건은 흰색 점선으로 윤곽선이 그려져 있고 AT로 표시되어 있는 반면, 종골은 노란색 실선으로 윤곽선이 표시되어 있고 C로 표시되어 있습니다. 세포사멸 핵은 빨간색(TUNEL)으로 나타나고 모든 핵은 파란색(DAPI)으로 표시됩니다. (B) 죽은 세포 분획의 정량화는 무부하, 기준선 장력 및 정적 충돌 그룹에 대해 평균 22% 미만이었습니다. 데이터는 평균± 표준 편차를 나타냅니다. 이러한 데이터 세트에는 세포 사멸이 50% 이상 존재하는 특이치가 있으며, 이는 잘못된 해부 기술로 인한 힘줄 손상에 기인할 수 있습니다. 통계적 이상치가 제거된 평균 데드 셀 비율은 모든 그룹에서 15% 미만입니다. 세포 사멸에서 통계적으로 유의한 차이는 무부하, 기준선 장력 및 정적 충돌 그룹 간에 발견되지 않았습니다(p < 0.05). 0일 대조군: n=8. 언로드됨: n=18. 기준선 장력: n=8. 정적 충돌: n=12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 톨루이딘 블루 조직학. (A) 아킬레스건 삽입 시 압축성 힘줄 섬유연골(CTF), 부착부 섬유연골(AZF) 및 골막 섬유연골(PF)을 묘사하는 배양 7일 후의 대표적인 톨루이딘 블루 염색16. CTF를 캡처하는 C. ROI로 표시된 Calcaneus는 빨간색 윤곽선으로 표시되며 추가 공간 정보를 제공하기 위해 4개의 사분면으로 더 세분화됩니다. (B) 7일간의 정적 충돌 후 대표적인 톨루이딘 블루 염색, 특히 이전에 최대 횡방향 압축 변형률 5,6을 측정한 1사분면에서 CTF의 염색이 강화되었습니다. (C) 컬러 이미지 분석에 사용되는 색조-채도 색 공간의 개략도. 색상은 색조 (0 ° -360 °)와 채도 (0-255) 76의 조합으로 설명됩니다. 각 ROI의 평균 색은 PF의 색에서 각 ROI의 색을 분리하는 유클리드 거리를 계산하여 PF의 평균 색으로 정규화되며, 이는 정규화된 섬유연골 점수를 제공합니다. (D-F) 반대측 무부하 힘줄과 비교하여 정적 충돌(위) 및 기준선 장력(아래)의 7일 후 톨루이딘 블루 염색의 변화. 데이터는 평균± 표준 편차를 나타냅니다. (D) 색조의 정량화는 반대측 무부하 힘줄과 비교하여 정적 충돌 7일 후 모든 영역에서 평균 색조의 상당한 차이를 나타냅니다. 반대쪽 무부하 힘줄과 비교하여 기준선 긴장 7일 후에 유사한 추세가 감지되지 않았습니다. (E) 반대측 무부하 힘줄과 비교하여 정적 충돌 7일 후 전체 CTF 및 사분면 1-3 사분면 내에서 평균 포화도의 상당한 변화가 있는 포화도 정량화. 반대로, 유의미한 차이는 기준선 긴장 7일 후 1사분면에서만 감지되었으며, 반대쪽 무부하 힘줄에 비해 포화도가 감소했습니다. (F) 반대측 무부하 힘줄과 비교하여 정적 충돌 7일 후 모든 영역에서 섬유연골 점수의 상당한 변화와 함께 섬유연골 점수의 정량화. 반대로, 유의미한 차이는 기준선 긴장 7일 후 1사분면에서만 감지되었으며, 반대쪽 무부하 힘줄에 비해 섬유연골 점수가 감소했습니다. 이 데이터는 정적 충돌로 인한 GAG 염색 증가를 시사하며, 이는 섬유연골 형성 증가를 나타냅니다. 총 CTF를 설명하는 데이터는 Wilcoxon matched-pairs signed rank test를 사용하여 비교되었습니다. 사분면 데이터는 Šídák의 다중 비교 검정과 함께 반복 측정 이원 분산 분석을 사용하여 비교되었습니다. *p < 0.05. **p < 0.01. p < 0.005입니다. p < 0.001입니다. 기준선 장력 대 무부하: n = 6쌍. 정적 충돌 대 무부하: n = 8쌍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: SHG 이미징. (A) 7일간의 언로드 배양 후의 대표 SHG 이미지와 (B) 7일간의 정적 충돌 후의 모습. CTF는 빨간색으로 윤곽선이 표시되고 레이블에 따라 4개의 사분면으로 나뉘며, 이는 위의 톨루이딘 블루 분석의 ROI와 일치합니다. (C) 각 사분면 내에서, 푸리에 스펙트럼 분석은 피지의 방향성 플러그인을 사용하여 움직이는 하위 창에서 수행되었다. 각 하위 창 내에서 섬유 배향 분포의 확산을 분산(°)이라고 하며 섬유 정렬과 반비례합니다. 분산 = 0°는 섬유의 완벽한 평행 정렬을 나타냅니다. 분산이 증가하면 콜라겐 섬유 정렬이 감소한다는 것을 나타냅니다. 데이터는 평균± 표준 편차를 나타냅니다. 통계적으로 유의미한 분산 차이는 반대쪽 무부하 힘줄과 비교하여 정적 충돌 후 7일 후 1사분면에서 감지되었으며, 이는 콜라겐 무질서가 증가했음을 시사합니다. 사분면 데이터는 Šídák의 다중 비교 검정과 함께 반복 측정 이원 분산 분석을 사용하여 비교되었습니다. * p < 0.05. 정적 충돌 대 무부하: n = 5쌍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: CAD 파일. 여러 파일 형식으로 컴파일된 이러한 CAD 파일은 플랫폼 베이스, 부피 감소 삽입 및 클립을 3D 인쇄하는 데 사용할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: MATLAB 파일. 컴파일된 MATLAB 파일을 사용하면 프로토콜의 섹션 8에 설명된 대로 Toluidine blue 조직학을 정량화하여 아킬레스건 삽입 시 GAG 염색의 공간적 변화를 통해 섬유연골 형성을 평가할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: MATLAB 코드 구현을 위한 지침. 이 문서에서는 제공된 MATLAB 코드를 사용하여 Toluidine blue 조직학의 이미지 분석을 통해 아킬레스건 삽입 시 GAG 염색의 변화를 정량화하는 파이프라인에 대해 설명합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 4: 톨루이딘 블루 조직학의 샘플 이미지. 톨루이딘 블루 조직학의 이 RGB 컬러 이미지는 제공된 MATLAB 코드를 실행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 연구에서 설명한 조직 배양 프로토콜과 결합된 실험용 쥐 뒷다리 이식 플랫폼은 아킬레스건 삽입 시 충돌 유도 섬유연골 형성의 역학을 연구하는 데 적합한 모델을 제공합니다. 이 이식 모델의 유용성은 7일간의 정적 충돌 후 톨루이딘 블루 염색에서 유의미하고 공간적으로 이질적인 변화와 함께 세포 생존율의 유지를 나타내는 대표적인 결과로 입증됩니다. 이러한 발견은 기계적 충돌에 이차적으로 GAG가 풍부한 기질 분자의 변화된 대사를 시사하며, 이는 다른 모델 및 임상 연구와 일치합니다 3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,44,49입니다. 또한, 정적 충돌 7일 후 SHG 이미징을 통해 콜라겐 조직에서 미묘하면서도 중요한 변화가 감지되었으며, 이는 충돌 관련 건병증의 임상적 특징 및 힘줄 충돌 28,37,38,43,44,49,64의 생체 내 모델과 일치합니다.

힘줄 충돌의 생물학적 후유증을 탐구하기 위한 이전의 노력은 분리된 힘줄 세포에 간단한 압축을 적용하였다27,29. 관심 있는 기계생물학적 메커니즘이 확인되면 이러한 모델은 이식 모델에 비해 우수한 치료 스크리닝 플랫폼을 제공합니다. 그러나, 이러한 연구의 결과는 시험관내에서 배양된 분리된 세포가 기계적 반응에 영향을 미치는 3차원 세포외 환경이 없기 때문에 주의해서 해석되어야 한다57,59. 또한, 다른 콜라겐 조직(예를 들어, 연골)으로부터 분리된 세포는 세포외 환경이 없는 상태에서 시험관내에서 기계적으로 도전할 때 변화된 기계민감성 이온 채널 활성을 나타낸다78,79. 제시된 모델은 생리학적으로 관련된 하중 조건에 대한 생존 가능한 외식물 내에서 제자리 힘줄 세포를 대상으로 하는 플랫폼을 제공하여 이러한 한계를 해결합니다.

외식(Explant) 모델은 힘줄의 생물학 및 생리학을 조사하기 위한 인기 있는 실험 시스템이다57,58. 힘줄 충돌의 특정 맥락에서, 몇몇 선행 연구에서는 인공 단축 압박에 대한 힘줄 세포 반응을 탐구하기 위해 부분 및 전체 힘줄 이식을 사용했습니다 30,31,32,33,34,39. 이러한 연구들은 단축 압박과 섬유연골 형성 사이의 직접적인 연관성을 보여주었지만, 힘줄 충돌에 의해 생성된 생체 내 기계적 변형 환경은 다축이며 충돌 부위의 해부학적 특징에 의존한다 5,6. 예를 들어, 발목 배굴곡 동안 아킬레스건에 종골이 충돌하여 생성된 변형 환경은 삽입 각도, 부착 영역 및 주변 연조직의 존재에 의해 영향을 받습니다 60,61,62,63,80,81. 당사의 외이식 플랫폼은 이러한 외부 구조를 보존하고 충돌에 의해 생성된 다축 변형 환경을 재현하는 동시에 세포를 원래 환경 내에서 유지합니다6.

동물 모델은 기계적 충돌과 힘줄 섬유 연골 및 병리학의 전형적인 특징 사이의 즉각적인 관계를 입증하는 데 기본적이었으며, 이는 유사한 표현형 1,25,28,37,64,65,66을 공유합니다. 최근 수십 년 동안 대부분의 생체 내 충돌 연구는 회전근개 힘줄을 인위적으로 충돌시키기 위해 견봉하 공간을 외과적으로 축소하여 회전근개 질환을 연구하기 위해 설치류 모델을 활용했습니다. 이러한 동물 모델은 생체 내 충돌 건병증의 세포 및 분자 발병 기전을 설명하는 데 사용되어 왔으며 충돌 연구의 임상 번역을 촉진하기 위한 새로운 치료 전략을 평가하기 위해 확장될 수 있습니다 36,37,38,66,82,83,84,85.

그러나 힘줄 충돌의 생체 내 모델은 기계생물학을 연구하는 데 몇 가지 중요한 한계가 있습니다57,58. 이 모델은 힘줄 충돌의 외부 원인을 외과적으로 도입 또는 제거하고 신체 활동(프리 케이지 활동, 강제 트레드밀 달리기 등)을 재개합니다. 이 접근 방식은 실험 기간 동안 힘줄에 직접 가해지는 힘의 크기, 방향 및 빈도를 제어하지 못합니다. 생체 내 조직 변형률 측정의 어려움을 감안할 때, 이러한 모델은 충돌에 대한 반응으로 힘줄 내에서 생성된 기계적 환경에 대한 제한된 제어 또는 특성화를 제공합니다. 이러한 한계는 힘줄 기계생물학 연구 분야(57,58,67,68,69,70)에서 잘 알려져 있다. 다른 곳에서, 정교한 실험 플랫폼들은 마취 67,68,69 하에서 생체 내에서 힘줄에 제어된 기계적 과부하(피로)를 직접 적용하도록 설계되었다. 이 모델은 마취 상태에서 짧은 기간 동안 기계적 자극의 적용을 제어하고 동물이 기계적 과부하 후 며칠에서 몇 주 동안 정상적인 케이지 활동을 재개함에 따라 실험의 나머지 기간 동안 로딩 이력을 제어하지 않습니다. 이 프로토콜에 기술된 이식 모델은 아킬레스건 충돌의 통제된 처방을 제공하여 측정 가능하고 잘 설명된 조직 변형패턴6을 생성하여 충돌 기계생물학에 대한 엄격한 연구를 가능하게 합니다. 그러나 이 이식 모델은 힘줄 충돌에 대한 생체 내 조사의 필요성을 없애는 것이 아니라 이러한 필수 동물 모델에서 파생된 데이터를 풍부하게 하는 보조 도구 역할을 한다는 점에 유의해야 합니다. 이 이식 모델을 사용하여 충돌 역학과 관련하여 정의된 세포 및 분자 경로는 생체 내에서 특성화할 수 있으며 기계생물학 연구의 임상 번역을 향상시키기 위해 보완적인 접근 방식으로 동물 모델을 사용하여 치료 대상으로 평가할 수 있습니다. 이 통합 전략의 힘은 힘줄 기계생물학 연구 58,86,87,88의 다른 영역에서 활용되고 있으며, 이 이식 모델은 힘줄 충돌에 적용됩니다.

이식 모델에 한계가 없는 것은 아닙니다. 모든 explant 모형으로 것과 같이, 기계생물학은 조직이 생존 가능한 남아 있는 동안 상대적으로 짧은 시간 가늠자에 해서만 공부될 수 있다57,89. 이 모델은 기계적 충돌에 대한 즉각적인 세포 반응을 연구하기 위한 강력한 도구이지만 충돌과 관련된 만성 힘줄 질환을 연구하는 데는 적합하지 않습니다. 또한 이 모델은 혈액 공급과 신경 통신이 유지되지 않기 때문에 전신 반응 및 조직 누화를 설명할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고 이 모델은 기계적 충돌에 대한 내인성 힘줄 세포의 고유한 반응을 설명할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 이 모델의 또 다른 한계는 선행 연구 32,90,91,92에 따르면, 많은 큰 GAG가 풍부한 프로테오글리칸이 전처리 및 식물 배양의 초기 시점 동안 힘줄에서 확산될 것으로 예상하며, 특히 기저 매트릭스에 고정되지 않은 응집 프로테오글리칸 단편이 확산될 것으로 예상한다는 것입니다. 따라서 모델에서 충돌에 이차적으로 발생하는 GAG 염색의 변화는 아직 이화되지 않고 세포외 기질 내에 고정되어 있는 새로 합성된 GAG가 풍부한 거대분자의 변화를 반영할 가능성이 높습니다. 이러한 GAG가 풍부한 프로테오글리칸이 세포 주위 공간(22,30,93,94,95)에 국한된다는 점을 감안할 때, 이식 모델은 힘줄 충돌에 이차적으로 PCM 리모델링의 조사를 용이하게 할 수 있습니다.

이 프로토콜에 설명된 쥐 뒷다리 이식의 해부는 연습이 필요하지만 능숙한 기술을 빠르게 달성할 수 있습니다. 완전한 탈글러브(즉, 피부 제거)는 특히 뒷발의 손가락 주변에서 어려울 수 있습니다. 발가락 주위의 피부를 완전히 제거할 필요는 없지만 피부와 털에 박테리아가 존재하기 때문에 배양 전반에 걸쳐 불임성을 강화합니다.

해부의 가장 어려운 측면은 아킬레스건에 근접한 내측의 족저건을 제거하고 원위부의 아킬레스건으로 표재성을 통과하는 것입니다. 발바닥 근육-힘줄 단위는 무릎과 발목 관절에 걸쳐 삼두근 수라 및 아킬레스 건 81,96,97,98,99와 밀접하게 관련되어 있습니다. 수동적 발목 배굴곡 동안 발목의 후방을 가로질러 전달되는 기계적 하중은 족저건과 아킬레스건 사이에 분산되어 있으며, 족저건은 생체 내 높은 응력을 견디는 것으로 알려져 있습니다 100,101. 또한, 인간 발바닥의 해부학적 가변성은잘 기술되어 있으며, 이러한 가변성은 설치류(97)에서는 덜 일반적이지만, 제자리 아킬레스건 내의 기계적 환경에 영향을 미치는 경향이 있다. 아킬레스건 내 변형률을 측정하는 데 사용된 이전 기법과 일치하게, 6,104 외부에서 가해지는 힘줄 충돌에 의해 생성된 내부 변형 환경을 제어하기 위해 족저건을 제거해야 합니다.

아킬레스건에서 박리로 인한 세포 사멸을 피하기 위해서는 발바닥을 조심스럽게 제거해야 하며, 데이터에 존재하는 세포 사멸의 가변성(그림 2B)은 잘못된 해부 기술로 인한 박리로 인한 손상을 반영할 수 있습니다. 족저힘줄을 제거하면 끝이 가는 집게를 통해 발바닥을 아킬레스건에서 조심스럽게 분리하고 발바닥 근육-힘줄 복합체를 근방에서 풀어줍니다. 톱니 모양의 집게는 족저힘줄의 근위 자유 끝을 잡고 원위, 종골 주위 및 발의 손가락 쪽으로 당겨 완전히 제거하는 데 도움이 됩니다. Lee와 Elliott는 쥐의 발바닥과 아킬레스건, 그리고 관련 근육 조직에 대한 유용한 해부학적 설명을 제공한다97.

이 연구에서 설명한 해부 기법이 무균을 보장하기에 충분하다는 것을 발견했지만, 무균 유지가 어려운 환경에서 필요에 따라 프로토콜을 조정하거나 수정할 수 있습니다. 수술 도구는 고압 멸균 할 수 있고, 베타 딘 용액은 피부에 국소 적으로 적용 할 수 있으며, 해부는 생물 안전 캐비닛에서 수행 할 수 있습니다. 우리는 신속하고 효율적인 벤치탑 해부가 중요하며 피부가 제공하는 멸균 경계가 뚫린 후 절개된 팔다리를 생물학적 안전 캐비닛의 멸균 배지로 신속하게 옮길 수 있다는 것을 발견했습니다.

오염 문제 해결의 또 다른 주요 대상은 플랫폼 구성 요소를 멸균하는 데 사용되는 기술입니다. 우리는 고압멸균 없이 수돗물에 적절하게 헹구고 ≥ 10% 표백제 용액에 간단히 담그는 것으로 일관된 성공을 거두었습니다. 필요에 따라 70% 에탄올을 사용한 추가 멸균을 적용할 수 있지만 PLA로 3D 프린팅된 모든 구성 요소는 EtOH와 호환되지 않으며 뒤틀릴 수 있습니다. 또한 아크릴 수조 및 3D 프린팅된 PLA 구성 요소를 제외한 플랫폼의 모든 부품을 고압멸균할 수 있으며 10% 표백제 용액에 담근 ≥ 구성 요소는 고압멸균 또는 정제수로 헹굴 수 있습니다. 녹이 슬지 않도록 각 실험 직후에 모든 금속 부품을 세척하고 손으로 건조하는 것이 좋습니다.

이 프로토콜에 설명된 섬유연골 형성을 특성화하기 위해 톨루이딘 블루 염색을 정량화하는 방법론은 힘줄 연구에 광범위하게 적용할 수 있는 혁신적인 맞춤형 컬러 이미지 분석을 사용합니다. 픽셀 데이터를 RGB로부터 HSV 색 공간(76)으로 변환함으로써 상당한 이점이 제공된다. 여기서 색조는 0°-360°의 특징적인 색상으로 지배적인 파장을 인코딩하는 반면, 채도는 0-255°의 각 색조의 순도를 정의합니다. 반대로 값은 색상의 밝기를 설명하므로 HSV 색 구성표는 밝기(값)와 색상(색조, 채도)을 구분합니다. 조직학적 분석의 맥락에서, HSV 픽셀 데이터는 현미경 검사 중 광 투과율의 변화와 조직 절편 두께의 변화에 대해 더 강력하다(76). 또한, HSV 색 공간에서의 작업은 조직학적 염색(76)에 따라 (색조를 통해) 특정 관심 파장의 묘사를 가능하게 한다(예: 톨루이딘 청색 염색의 경우 약 240°의 색조).

이 연구에서 제시된 톨루이딘 블루 이미지 분석의 혁신적인 측면은 섬유연골 점수로, 각 ROI의 색상을 골막 섬유연골의 색상과 분리하는 유클리드 거리와 관련된 지표입니다. 골막 섬유연골은 출생 직후 2차 연골로 나타나는 반면, 압박 힘줄 섬유연골은 출생 후 존재하지 않으며, 다른 세사모이드 섬유연골과 마찬가지로 힘줄 압박이 상승한 부위의 기계적 요구에 의해 조절되는 것으로 보인다 16,17,28,77. 실험군 간의 섬유연골 점수를 비교함으로써 톨루이딘 블루 염색 색상이 충돌에 의해 이차적으로 변하는지 여부뿐만 아니라 이러한 변화가 섬유연골에 더 가깝게 보이는지 여부를 확인할 수 있습니다. 이 분석은 Alcian blue 및 Safranin O와 같은 다른 인기 있는 GAG 염색뿐만 아니라 힘줄 섬유연골 및 섬유연골 힘줄 돌기의 다른 영역으로 확장될 수 있습니다. 예를 들어, 무릎 힘줄과 인대의 GAG 염색 변화는 섬유 연골 점수를 통해 섬유 연골 반월상 연골의 염색으로 정규화될 수 있습니다.

이 프로토콜의 중요한 측면은 연속 조직 절편 및 아킬레스건을 통한 단면 수준 추적이며, 이를 위해서는 단면 깊이를 추적하기 위해 반복 가능한 파라핀 임베딩과 아킬레스건 삽입으로의 진입을 면밀히 식별해야 합니다. 이 절편 및 염색 프로토콜은 의심할 여지 없이 연습과 개선이 필요하지만 동결 절개로 확장될 수 있습니다.

이 원고에 기술된 조직학적 접근법은 면역조직화학 또는 면역형광으로 쉽게 확장될 수 있습니다. 이와 관련하여, 상기 실험 설계의 중요한 측면은 각 마우스의 반대쪽 팔다리를 쌍으로 비교하는 것입니다. 여기서, 모든 통계적 비교는 다른 실험 그룹에 할당된 동일한 마우스의 반대쪽 사지에서 아킬레스건을 통해 유사한 섹션 수준의 조직 섹션 간에 그려집니다. 이 전략은 생물학적 변동성을 제어하는 데 도움이 됩니다. 또한 모든 시약, 완충액 및 항체 용액(면역염색)에 대해 동일한 작업 용액을 사용하여 동일한 슬라이드 랙에서 동시에 수평 일치된 쌍의 반대쪽 조직 절편을 염색(조직학) 또는 슬라이드에서 동시에 염색하여 조직학 및 면역 표지에 내재된 염색 간 변동성과 절편 수준, 위치 및 방향에 따른 해부학적 이질성을 제어하는 데 도움이 됩니다.

이 원고에 기술된 프로토콜에 대한 몇 가지 다른 수정은 추가 연구 질문에 대한 추가 연구를 위해 구현될 수 있습니다. 예를 들어, 여기에 제공된 대표 데이터는 7일간의 정적 충돌에 초점을 맞추고 있지만, 이 접근 방식은 클립을 통해 뒷발을 감싼 끈을 주사기 펌프와 같은 기계식 액추에이터에 연결하여 간헐적 또는 주기적 충돌의 생물학적 후유증을 조사하는 데 적용할 수 있습니다. 또한 이 플랫폼은 배양 배지에 저분자 작용제/길항제를 보충하거나 형질전환 마우스 균주에서 뒷다리 이식을 사용하여 관심 분자 메커니즘을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다.

결론적으로, 우리는 아킬레스건 충돌의 기저에 있는 기계생물학을 연구하기 위한 새로운 쥐 뒷다리 이식 모델을 제시했습니다. 이는 7일 동안 로딩 조건에서 세포 생존력을 유지하는 조직 배양 프로토콜에 의해 부여됩니다. 이 모델은 퇴행성 힘줄 질환뿐만 아니라 다른 모델 시스템에서 설명된 대로 충돌에 의한 섬유연골 형성 및 콜라겐 변화를 요약합니다. 실험 플랫폼은 기계적 변형 패턴의 제어된 적용 및 정량화를 가능하게 하므로 충돌 기계생물학의 엄격한 연구를 위한 훌륭한 모델을 제공합니다. 이 모델은 삽입 건병증 치료에서 잠재적인 치료 표적을 식별하기 위해 관심 분자 메커니즘을 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자들은 P30AR06965가 부분적으로 자금을 지원한 로체스터 대학교 근골격계 연구 센터의 조직학, 생화학 및 분자 이미징(HBMI) 코어의 Jeff Fox와 Vidya Venkatramani가 제공한 지원과 도움에 감사드립니다. 또한 저자들은 다광자 현미경 검사에 도움을 준 로체스터 대학 의료 센터의 광학 현미경 및 나노스코피 센터(CALMN)에 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구는 R01 AR070765 및 R01 AR070765-04S1, 1R35GM147054 및 1R01AR082349의 자금 지원을 받았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox - Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining

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References

  1. Cook, J. L., Purdam, C. Is compressive load a factor in the development of tendinopathy. Br J Sports Med. 46 (3), 163-168 (2012).
  2. Benjamin, M., Qin, S., Ralphs, J. R. Fibrocartilage associated with human tendons and their pulleys. J Anat. 187 (Pt 3), 625-633 (1995).
  3. Benjamin, M., Ralphs, J. R. Fibrocartilage in tendons and ligaments - an adaptation to compressive load. J Anat. 193 (4), 481-494 (1998).
  4. Benjamin, M., Theobald, P., Suzuki, D., Toumi, H. The anatomy of the Achilles tendon. The Achilles Tendon. 3, 5-16 (2007).
  5. Chimenti, R. L., et al. Insertional achilles tendinopathy associated with altered transverse compressive and axial tensile strain during ankle dorsiflexion. J Orthop Res. 35 (4), 910-915 (2017).
  6. Mora, K. E., et al. Ultrasound strain mapping of the mouse Achilles tendon during passive dorsiflexion. J Biomech. 132, 110920 (2022).
  7. Pringels, L., et al. Intratendinous pressure changes in the Achilles tendon during stretching and eccentric loading: Implications for Achilles tendinopathy. Scand J Med Sci Sports. 33 (5), 619-630 (2023).
  8. Koob, T. J., Vogel, K. G. Site-related variations in glycosaminoglycan content and swelling properties of bovine flexor tendon. J Orthop Res. 5 (3), 414-424 (1987).
  9. Vogel, K. G., Koob, T. J. Structural specialization in tendons under compression. Int Rev Cytol. 115, 267-293 (1989).
  10. Vogel, K. G., Ordög, A., Pogány, G., Oláh, J. Proteoglycans in the compressed region of human tibialis posterior tendon and in ligaments. J Orthop Res. 11 (1), 68-77 (1993).
  11. Vogel, K. G., Sandy, J. D., Pogány, G., Robbins, J. R. Aggrecan in bovine tendon. Matrix Biol. 14 (2), 171-179 (1994).
  12. Robbins, J. R., Vogel, K. G. Regional expression of mRNA for proteoglycans and collagen in tendon. Eur J Cell Biol. 64 (2), 264-270 (1994).
  13. Vogel, K. Repetitive motion disorders of the upper extremity. Gordon, S. I., Blair, S. J., Fine, L. J. , American Academy of Orthopedic Surgeons, Michigan. (1995).
  14. Benjamin, M., Tyers, R. N., Ralphs, J. R. Age-related changes in tendon fibrocartilage. J Anat. 179, 127-136 (1991).
  15. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: a structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anat Rec. 231 (2), 167-177 (1991).
  16. Rufai, A., Benjamin, M., Ralphs, J. R. Development and ageing of phenotypically distinct fibrocartilages associated with the rat Achilles tendon. Anat Embryol (Berl). 186 (6), 611-618 (1992).
  17. Rufai, A., Ralphs, J. R., Benjamin, M. Ultrastructure of fibrocartilages at the insertion of the rat Achilles tendon. J Anat. 189 (Pt 1), 185-191 (1996).
  18. Waggett, A. D., Ralphs, J. R., Kwan, A. P. L., Woodnutt, D., Benjamin, M. Characterization of collagens and proteoglycans at the insertion of the human achilles tendon. Matrix Biol. 16 (8), 457-470 (1998).
  19. Ralphs, J., et al. Regional differences in cell shape and gap junction expression in rat Achilles tendon: relation to fibrocartilage differentiation. J Anat. 193 (pt 2), 215-222 (1998).
  20. Milz, S., et al. Three-dimensional reconstructions of the Achilles tendon insertion in man. J Anat. 200 (Pt 2), 145-152 (2002).
  21. Tischer, T., Milz, S., Maier, M., Schieker, M., Benjamin, M. An immunohistochemical study of the rabbit suprapatella, a sesamoid fibrocartilage in the quadriceps tendon containing aggrecan. J Histochem Cytochem. 50 (7), 955-960 (2002).
  22. Esquisatto, M. A., Joazeiro, P. P., Pimentel, E. R., Gomes, L. The effect of age on the structure and composition of rat tendon fibrocartilage. Cell Biol Int. 31 (6), 570-577 (2007).
  23. Matuszewski, P. E., et al. Regional variation in human supraspinatus tendon proteoglycans: Decorin, biglycan, and aggrecan. Connect Tissue Res. 53 (5), 343-348 (2012).
  24. Buckley, M. R., Huffman, G. R., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. The location-specific role of proteoglycans in the flexor carpi ulnaris tendon. Connect Tissue Res. 54 (6), 367-373 (2013).
  25. Gillard, G. C., Reilly, H. C., Bell-Booth, P. G., Flint, M. H. The influence of mechanical forces on the glycosaminoglycan content of the rabbit flexor digitorum profundus tendon. Connect Tissue Res. 7 (1), 37-46 (1979).
  26. Giori, N. J., Beaupre, G. S., Carter, D. R. Cellular shape and pressure may mediate mechanical control of tissue composition in tendons. J Orthop Res. 11 (4), 581-591 (1993).
  27. Wren, T. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanobiology of tendon adaptation to compressive loading through fibrocartilaginous metaplasia. J Rehabil Res Dev. 37 (2), 135-143 (2000).
  28. Malaviya, P., et al. An in vivo model for load-modulated remodeling in the rabbit flexor tendon. J Orthop Res. 18 (1), 116-125 (2000).
  29. Shim, J. W., Elder, S. H. Influence of Cyclic Hydrostatic Pressure on Fibrocartilaginous Metaplasia of Achilles Tendon Fibroblasts. Biomech Model Mechanobiol. 5 (4), 247-252 (2006).
  30. Koob, T. J., Clark, P. E., Hernandez, D. J., Thurmond, F. A., Vogel, K. G. Compression loading in vitro regulates proteoglycan synthesis by tendon fibrocartilage. Arch Biochem Biophys. 298 (1), 303-312 (1992).
  31. Evanko, S. P., Vogel, K. G. Proteoglycan Synthesis in Fetal Tendon Is Differentially Regulated by Cyclic Compression in Vitro. Arch Biochem Biophys. 307 (1), 153-164 (1993).
  32. Vogel, K. G. The effect of compressive loading on proteoglycan turnover in cultured fetal tendon. Connect Tissue Res. 34 (3), 227-237 (1996).
  33. Thornton, G. M., et al. Changes in mechanical loading lead to tendon specific alterations in MMP and TIMP expression: influence of stress deprivation and intermittent cyclic hydrostatic compression on rat supraspinatus and Achilles tendons. Br J Sports Med. 44 (10), 698-703 (2010).
  34. Robbins, J. R., Evanko, S. P., Vogel, K. G. Mechanical Loading and TGF-β Regulate Proteoglycan Synthesis in Tendon. Arch Biochem Biophys. 342 (2), 203-211 (1997).
  35. Docking, S., Samiric, T., Scase, E., Purdam, C., Cook, J. Relationship between compressive loading and ECM changes in tendons. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (1), 7-11 (2013).
  36. Wang, X., et al. Aberrant TGF-β activation in bone tendon insertion induces enthesopathy-like disease. J Clin Invest. 128 (2), 846-860 (2018).
  37. Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. J Orthop Res. 36 (10), 2780-2788 (2018).
  38. Liu, Y., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: development and analysis of a novel rat model. J Shoulder Elbow Surg. 31 (9), 1898-1908 (2022).
  39. Majima, T., et al. Compressive compared with tensile loading of medial collateral ligament scar in vitro uniquely influences mRNA levels for aggrecan, collagen type II, and collagenase. J Orthop Res. 18 (4), 524-531 (2000).
  40. Hopkins, C., et al. Critical review on the socio-economic impact of tendinopathy. Asia Pac J Sports Med, Arthrosc, Rehabil Technol. 4, 9-20 (2016).
  41. Scott, A., Ashe, M. C. Common tendinopathies in the upper and lower extremities. Curr Sports Med Rep. 5 (5), 233-241 (2006).
  42. Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin Sports Med. 22 (4), 675-692 (2003).
  43. Bah, I., et al. Tensile mechanical changes in the Achilles tendon due to Insertional Achilles tendinopathy. J Mech Behav Biomed Mater. 112, 104031 (2020).
  44. Chondral Metaplasia in Calcific Insertional Tendinopathy of the Achilles Tendon. Clin J Sport Med. Maffulli, N., Reaper, J., Ewen, S. W. B., Waterston, S. W., Barrass, V. 16 (4), 329-334 (2006).
  45. Corps, A. N., et al. Increased expression of aggrecan and biglycan mRNA in Achilles tendinopathy. Rheumatology (Oxford). 45 (3), 291-294 (2006).
  46. Scott, A., et al. Increased versican content is associated with tendinosis pathology in the patellar tendon of athletes with jumper's knee. Scand J Med Sci Sports. 18 (4), 427-435 (2008).
  47. Attia, M., et al. Greater glycosaminoglycan content in human patellar tendon biopsies is associated with more pain and a lower VISA score. Br J Sports Med. 48 (6), 469-475 (2014).
  48. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative Incidence of Achilles Tendon Rupture and Tendinopathy in Male Former Elite Athletes. Clin J Sport Med. 15 (3), 133-135 (2005).
  49. Corps, A. N., et al. Changes in matrix protein biochemistry and the expression of mRNA encoding matrix proteins and metalloproteinases in posterior tibialis tendinopathy. Ann Rheum Dis. 71 (5), 746-752 (2012).
  50. Neer, C. S. 2nd Anterior acromioplasty for the chronic impingement syndrome in the shoulder: a preliminary report. J Bone Joint Surg Am. 54 (1), 41-50 (1972).
  51. Bigliani, L. U., Ticker, J. B., Flatow, E. L., Soslowsky, L. J., Mow, V. C. The relationship of acromial architecture to rotator cuff disease. Clin Sports Med. 10 (4), 823-838 (1991).
  52. Chimenti, R. L., Cychosz, C. C., Hall, M. M., Phisitkul, P. Current Concepts Review Update Insertional Achilles Tendinopathy. Foot Ankle Int. 38 (10), 1160-1169 (2017).
  53. Nicholson, C. W., Berlet, G. C., Lee, T. H. Prediction of the Success of Nonoperative Treatment of Insertional Achilles Tendinosis Based on MRI. Foot Ankle Int. 28 (4), 472-477 (2007).
  54. Lohrer, H., David, S., Nauck, T. Surgical treatment for achilles tendinopathy - a systematic review. BMC musculoskelet disord. 17 (1), 207 (2016).
  55. McGarvey, W. C., Palumbo, R. C., Baxter, D. E., Leibman, B. D. Insertional Achilles Tendinosis: Surgical Treatment Through a Central Tendon Splitting Approach. Foot Ankle Int. 23 (1), 19-25 (2002).
  56. Maffulli, N., et al. Surgery for chronic Achilles tendinopathy produces worse results in women. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1714-1720 (1714).
  57. Wunderli, S. L., Blache, U., Snedeker, J. G. Tendon explant models for physiologically relevant in vitro study of tissue biology - a perspective. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 262-277 (2020).
  58. Dyment, N. A., et al. A brief history of tendon and ligament bioreactors: Impact and future prospects. J Orthop Res. 38 (11), 2318-2330 (2020).
  59. Screen, H. R. C., Berk, D. E., Kadler, K. E., Ramirez, F., Young, M. F. Tendon Functional Extracellular Matrix. J Orthop Res. 33 (6), 793-799 (2015).
  60. Theobald, P., et al. The functional anatomy of Kager's fat pad in relation to retrocalcaneal problems and other hindfoot disorders. J Anat. 208 (1), 91-97 (2006).
  61. Ghazzawi, A., Theobald, P., Pugh, N., Byrne, C., Nokes, L. Quantifying the motion of Kager's fat pad. J Orthop Res. 27 (11), 1457-1460 (2009).
  62. Malagelada, F., et al. Pressure changes in the Kager fat pad at the extremes of ankle motion suggest a potential role in Achilles tendinopathy. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 28 (1), 148-154 (2020).
  63. Shaw, H. M., Benjamin, M. Structure-function relationships of entheses in relation to mechanical load and exercise. Scand J Med Sci Sports. 17 (4), 303-315 (2007).
  64. Soslowsky, L. J., et al. Rotator cuff tendinosis in an animal model: role of extrinsic and overuse factors. Ann Biomed Eng. 30 (8), 1057-1063 (2002).
  65. Schneeberger, A. G., Nyffeler, R. W., Gerber, C. Structural changes of the rotator cuff caused by experimental subacromial impingement in the rat. J Shoulder Elbow Surg. 7 (4), 375-380 (1998).
  66. Croen, B. J., et al. Chronic subacromial impingement leads to supraspinatus muscle functional and morphological changes: Evaluation in a murine model. J Orthop Res. 39 (10), 2243-2251 (2021).
  67. Andarawis-Puri, N., Flatow, E. L. Tendon fatigue in response to mechanical loading. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 106-114 (2011).
  68. Gains, C. C., Giannapoulos, A., Zamboulis, D. E., Lopez-Tremoleda, J., Screen, H. R. C. Development and application of a novel in vivo overload model of the Achilles tendon in rat. J Biomech. 151, 111546 (2023).
  69. Williamson, P. M., et al. A passive ankle dorsiflexion testing system to assess mechanobiological and structural response to cyclic loading in rat Achilles tendon. J Biomech. 156, 111664 (2023).
  70. Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A Novel, Open-Source, Low-Cost Bioreactor for Load-Controlled Cyclic Loading of Tendon Explants. J Biomech Eng. 144 (8), 084505 (2022).
  71. Orishimo, K. F., et al. Effect of Knee Flexion Angle on Achilles Tendon Force and Ankle Joint Plantarflexion Moment During Passive Dorsiflexion. J Foot Ankle Surg. 47 (1), 34-39 (2008).
  72. Liu, C. L., et al. Influence of different knee and ankle ranges of motion on the elasticity of triceps surae muscles, Achilles tendon, and plantar fascia. Sci Rep. 10 (1), 6643 (2020).
  73. Cruz-Montecinos, C., et al. Soleus muscle and Achilles tendon compressive stiffness is related to knee and ankle positioning. J Electromyogr Kinesiol. 66, 102698 (2022).
  74. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Lose-dose administration of dexamethasone is beneficial in preventing secondary tendon damage in a stress-deprived joint injury explant model. J Orthop Res. 38 (1), 139-149 (2020).
  75. Wunderli, S. L., et al. Tendon response to matrix unloading is determined by the patho-physiological niche. Matrix Biol. 89, 11-26 (2020).
  76. Yabusaki, K., et al. A Novel Quantitative Approach for Eliminating Sample-To-Sample Variation Using a Hue Saturation Value Analysis Program. PloS one. 9 (3), e89627 (2014).
  77. Gao, J., Messner, K., Ralphs, J. R., Benjamin, M. An immunohistochemical study of enthesis development in the medial collateral ligament of the rat knee joint. Anat Embryol. 194 (4), 399-406 (1996).
  78. Han, S. K., Wouters, W. A. J., Clark, A., Herzog, W. Mechanically induced calcium signaling in chondrocytes in situ. J Orthop Res. 30 (3), 475-481 (2012).
  79. Han, W., et al. Impact of cellular microenvironment and mechanical perturbation on calcium signalling in meniscus fibrochondrocytes. Eur Cell Mater. 27, 321-331 (2014).
  80. Rossetti, L., et al. The microstructure and micromechanics of the tendon-bone insertion. Nat Mater. 16 (6), 664-670 (2017).
  81. Sartori, J., Köhring, S., Witte, H., Fischer, M. S., Löffler, M. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
  82. Eliasberg, C. D., et al. Identification of Inflammatory Mediators in Tendinopathy Using a Murine Subacromial Impingement Model. J Orthop Res. 37 (12), 2575-2582 (2019).
  83. Zhang, Y., et al. Expression of alarmins in a murine rotator cuff tendinopathy model. J Orthop Res. 38 (11), 2513-2520 (2020).
  84. Zhang, X., et al. Assessment of Mitochondrial Dysfunction in a Murine Model of Supraspinatus Tendinopathy. J Bone Joint Surg. Am. 103 (2), 174-183 (2021).
  85. Liu, Y., et al. The role of Indian Hedgehog Signaling in tendon response to subacromial impingement: evaluation using a mouse model. Am J Sports Med. 50 (2), 362-370 (2022).
  86. Wang, T., et al. Load-induced regulation of tendon homeostasis by SPARC, a genetic predisposition factor for tendon and ligament injuries. Sci Transl Med. 13 (582), eabe5738 (2021).
  87. Passini, F. S., et al. Shear-stress sensing by PIEZO1 regulates tendon stiffness in rodents and influences jumping performance in humans. Nat Biomed Eng. 5 (12), 1457-1471 (2021).
  88. Jones, D. L., et al. Mechanoepigenetic regulation of extracellular matrix homeostasis via Yap and Taz. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (22), e2211947120 (2023).
  89. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Release of pro-inflammatory cytokines from muscle and bone causes tenocyte death in a novel rotator cuff in vitro explant culture model. Connect Tissue Res. 59 (5), 423-436 (2018).
  90. Rees, S. G., et al. Catabolism of aggrecan, decorin and biglycan in tendon. Biochem J. 350 (Pt 1), 181-188 (2000).
  91. Samiric, T., Ilic, M. Z., Handley, C. J. Large aggregating and small leucine-rich proteoglycans are degraded by different pathways and at different rates in tendon. Eur J Biochem. 271 (17), 3612-3620 (2004).
  92. Rees, S. G., Curtis, C. L., Dent, C. M., Caterson, B. Catabolism of aggrecan proteoglycan aggregate components in short-term explant cultures of tendon. Matrix Biol. 24 (3), 219-231 (2005).
  93. Taye, N., Karoulias, S. Z., Hubmacher, D. The "other" 15-40%: The Role of Non-Collagenous Extracellular Matrix Proteins and Minor Collagens in Tendon. J Orthop Res. 38 (1), 23-35 (2020).
  94. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L. The development of the pressure-bearing tendon of the bullfrog, Rana catesbeiana. Anat Embryol. 200 (1), 55-64 (1999).
  95. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L., Covizi, D. Z., Della Colleta, H. H., Gomes, L. Structure and proteoglycan composition of specialized regions of the elastic tendon of the chicken wing. Cell Tissue Res. 300 (3), 435-446 (2000).
  96. van Sterkenburg, M. N., Kerkhoffs, G. M., Kleipool, R. P., Niek van Dijk, C. The plantaris tendon and a potential role in mid-portion Achilles tendinopathy: an observational anatomical study. J Anat. 218 (3), 336-341 (2011).
  97. Lee, A. H., Elliott, D. M. Comparative multi-scale hierarchical structure of the tail, plantaris, and Achilles tendons in the rat. J Anat. 234 (2), 252-262 (2019).
  98. Lee, A. H., Elliott, D. M. Multi-Scale Loading and Damage Mechanisms of Plantaris and Rat Tail Tendons. J Orthop Res. 37 (8), 1827-1837 (2019).
  99. Fan, H. M., Shrestha, L., Guo, Y., Tao, H. R., Sun, Y. L. The twisted structure of the rat Achilles tendon. J Anat. 239 (5), 1134-1140 (2021).
  100. Cutlip, R. G., Stauber, W. T., Willison, R. H., McIntosh, T. A., Means, K. H. Dynamometer for rat plantar flexor muscles in vivo. Med Biol Eng Comput. 35 (5), 540-543 (1997).
  101. Rijkelijkhuizen, J. M., Baan, G. C., de Haan, A., de Ruiter, C. J., Huijing, P. A. Extramuscular myofascial force transmission for in situ rat medial gastrocnemius and plantaris muscles in progressive stages of dissection. J Exp Biol. 208 (Pt 1), 129-140 (2005).
  102. Saxena, A., Bareither, D. Magnetic Resonance and Cadaveric Findings of the Incidence of Plantaris Tendon. Foot Ankle Int. 21 (7), 570-572 (2000).
  103. dos Santos, M. A., Bertelli, J. A., Kechele, P. R., Duarte, H. Anatomical study of the plantaris tendon: reliability as a tendo-osseous graft. Surg Radiol Anat. 31 (1), 59-61 (2009).
  104. Sartori, J., Köhring, S., Bruns, S., Moosmann, J., Hammel, J. U. Gaining Insight into the Deformation of Achilles Tendon Entheses in Mice. Adv Eng Mater. 23 (11), 2100085 (2021).

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생명 공학 202 호
아킬레스건 충돌의 기계생물학 연구를 위한 쥐 뒷다리 이식 모델
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Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W., Buckley, M. R. Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement. J. Vis. Exp. (202), e65801, doi:10.3791/65801 (2023).

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