Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Модель эксплантата задней конечности мыши для изучения механобиологии импинджмента ахиллова сухожилия

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65801
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

Summary

Мы представляем индивидуальную экспериментальную платформу и протокол культивирования тканей, которые воссоздают фиброзно-хрящевые изменения, вызванные импинджментом прикрепления ахиллова сухожилия в эксплантатах задних конечностей мышей с устойчивой жизнеспособностью клеток, предоставляя модель, подходящую для изучения механобиологии импинджмента сухожилий.

Abstract

Соприкосновение сухожилия с костью создает многоосную механическую деформационную среду с заметно повышенной поперечной сжимающей деформацией, что вызывает локализованный фенотип фиброзного хряща, характеризующийся накоплением богатого гликозаминогликаном (ГАГ) матрикса и ремоделированием коллагеновой сети. В то время как фиброзно-хрящевая ткань является нормальным признаком в ущемленных областях здоровых сухожилий, избыточное отложение ГАГ и дезорганизация коллагеновой сети являются отличительными признаками тендинопатии. Соответственно, импинджмент клинически признан важным внешним фактором в инициации и прогрессировании тендинопатии. Тем не менее, механобиология, лежащая в основе импинджмента сухожилий, остается недостаточно изученной. В предыдущих попытках выяснить клеточный ответ на импинджмент сухожилий применялась одноосная компрессия к клеткам и иссеченные экспланты сухожилий in vitro. Тем не менее, изолированным клеткам не хватает трехмерной внеклеточной среды, имеющей решающее значение для механореакции, и как в исследованиях in vitro , так и в исследованиях эксплантов не удается повторить многоосную напряженную среду, генерируемую импинджментом сухожилий in vivo, которая зависит от анатомических особенностей ущемленной области. Более того, в моделях соударения сухожилий in vivo отсутствует контроль над средой механической деформации. Для преодоления этих ограничений мы представляем новую модель эксплантата задней конечности мыши, пригодную для изучения механобиологии импинджмента ахиллова сухожилия. Эта модель поддерживает ахиллово сухожилие in situ для сохранения локальной анатомии и воспроизводит многоосную деформационную среду, создаваемую импинджментом прикрепления ахиллова сухожилия к пяточной кости во время пассивного тыльного сгибания голеностопного сустава, сохраняя клетки в их родной среде. Мы описываем протокол культивирования тканей, неотъемлемый от этой модели, и представляем данные, устанавливающие устойчивую жизнеспособность эксплантата в течение 7 дней. Репрезентативные результаты демонстрируют усиленное гистологическое окрашивание ГАГ и снижение выравнивания коллагеновых волокон на фоне импинджмента, что указывает на повышенное образование фиброзно-хрящевой ткани. Эта модель может быть легко адаптирована для исследования различных режимов механического нагружения и позволяет манипулировать интересующими молекулярными путями для выявления механизмов, опосредующих фенотипические изменения в ахилловом сухожилии в ответ на импинджмент.

Introduction

Множество сухожилий, включая сухожилие ахиллова сухожилия и сухожилия вращательной манжеты плеча, испытывают костный импинджмент из-за нормального анатомического положения1,2,3,4. Соударение сухожилий создает сжимающую нагрузку, направленную поперек продольной оси волокон5,6,7. Области импинджмента сухожилий демонстрируют уникальный фенотип фиброзного хряща, в котором сморщенные круглые клетки (фиброзхондроциты) встроены в дезорганизованную коллагеновую сеть с заметно повышенным содержанием гликозаминогликанов (ГАГ)2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Предыдущие исследования показывают, что несопоставимая механическая среда, создаваемая соударением сухожилий, поддерживает эту богатую GAG матрицу, стимулируя отложение крупных агрегирующих протеогликанов, в первую очередь аггрекана, хотя лежащие в их основе механизмы неясны1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. В то время как фиброзно-хрящевая ткань является нормальным признаком в ущемленных областях здоровых сухожилий, аберрантный метаболизм протеогликанов, связанный с чрезмерным образованием фиброзно-хрящевой ткани, является отличительной чертой тендинопатии, распространенного и изнурительного заболевания, которое непропорционально проявляется в хронически ущемленных сухожилиях1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Соответственно, импинджмент сухожилий клинически признан важным внешним фактором, приводящим к нескольким наиболее распространенным тендинопатиям, включая болезнь вращательной манжеты плеча и инсерционную тендинопатию ахиллова сухожилия (IAT)50,51,52. В настоящее время лечение тендинопатии неэффективно. Например, примерно 47% пациентов с ИАТ нуждаются в хирургическом вмешательстве после неудачного консервативного лечения с различными послеоперационными исходами53,54,55,56. Несмотря на очевидную связь между импинджментом и тендинопатией, механобиологические механизмы, с помощью которых клетки в ущемленном сухожилии чувствуют и реагируют на свою механическую среду, плохо описаны, что затрудняет понимание патогенеза тендинопатии и приводит к неадекватному лечению.

Эксплантированные модели являются полезными инструментами при изучении механобиологии сухожилий57,58. В качестве первого шага к пониманию механобиологии импинджмента сухожилий в нескольких предыдущих исследованиях изучался клеточный ответ после применения простой одноосной компрессии к клеткам или эксплантированным эксплантам сухожилий 27,29,30,31,32,33,34,39. Однако в клетках in vitro отсутствуют внеклеточные и перицеллюлярные матрицы, которые облегчают перенос деформации, связывают важные факторы роста и цитокины, высвобождаемые при механической деформации, и обеспечивают субстрат для комплексов фокальной адгезии, которые играют роль в механотрансдукции57,59. Кроме того, как в исследованиях in vitro, так и в исследованиях эксплантов не удалось повторить многоосную механическую деформационную среду, создаваемую импинджментом сухожилий in vivo, которая зависит от анатомических особенностей ущемленной области 5,6. В контексте ущемления ахиллова сухожилия это включает окружающие ткани, такие как запяточная синовиальная сумка и жировая подушкаКагера 60,61,62,63. И наоборот, in vivo модели соприкосновения сухожилий 25,28,36,37,38,64,65,66 позволяют осуществлять минимальный контроль над величиной и частотой нагрузки, прикладываемой непосредственно к сухожилию, что является общепризнанным ограничением моделей in vivo для изучения механобиологии сухожилий57,58,67,68,69,70. Учитывая трудности измерения деформации сухожилий in vivo, внутренняя напряженная среда, создаваемая в этих моделях, часто плохо характеризуется.

В этой рукописи мы представляем специальную экспериментальную платформу, которая воссоздает импинджмент прикрепления ахиллова сухожилия к пяточной кости внутри целых эксплантов задних конечностей мыши, что в сочетании с этим протоколом культивирования тканей сохраняет жизнеспособность в течение 7 дней в культуре эксплантов и позволяет изучать биологические последствия импинджмента сухожилий. Платформа построена на основе полимолочной кислоты (PLA), напечатанной на 3D-принтере, которая обеспечивает основу для крепления захватов и напечатанной на 3D-принтере вставки для уменьшения объема PLA. Захваты используются для зажима верхней части голени и колена проксимальнее миотендовидного соединения ахиллова сухожилия с каудальной стороной задней конечности, обращенной вверх, что позволяет визуализировать ахиллово сухожилие сверху с помощью ультразвукового датчика или инвертированного микроскопа (рис. 1А). Вкладыш для уменьшения объема скользит по дорожке на основании и уменьшает необходимый объем среды для культивирования тканей. Плетеная леска, обернутая вокруг задней лапы, выводится из платформы с использованием базовой конструкции и зажима из PLA, напечатанного на 3D-принтере. При натяжении тетиви задняя лапа сгибается, и прикрепление ахиллова сухожилия упирается в пяточную кость, что приводит к повышенной поперечной сжимающей деформации 5,6 (рис. 1А). Платформа находится в акриловой ванне, в которой эксплантаты задних конечностей погружаются в питательную среду для тканей. Крепление натянутой струны к внешней стороне ванны с помощью клейкой ленты поддерживает тыльное сгибание голеностопного сустава, вызывая статическое соприкосновение прикрепления ахиллова сухожилия. Файлы САПР для компонентов, напечатанных на 3D-принтере, предоставляются в нескольких форматах (Дополнительный файл 1), что позволяет импортировать их в ряд коммерческих и бесплатных программ САПР с открытым исходным кодом для модификации в соответствии с экспериментальными потребностями. Если доступ к 3D-принтерам недоступен для изготовления, файлы САПР могут быть предоставлены онлайн-сервисам 3D-печати, которые напечатают и отправят детали по низкой цене.

Важно отметить, что трехглаво-ахиллово мышечно-ахиллово соединение охватывает как коленный, так и голеностопный суставы 71,72,73. Следовательно, растяжение ахиллова сухожилия зависит от сгибания колена. Разгибание колена напрягает ахиллово сухожилие, в то время как сгибание колена уменьшает напряжение. Сначала разгибая колено, а затем пассивно сгибая голеностопный сустав, можно наложить компрессионные нагрузки в месте ущемления на растягивающие напряжения. И наоборот, при пассивном тыльном сгибании голеностопного сустава при согнутом колене растягивающее напряжение уменьшается, а сжимающее напряжение сохраняется. В настоящем протоколе рассматриваются три таких состояния. 1) При статическом импинджменте стопа сгибается на < 110° по отношению к большеберцовой кости, чтобы соприкоснуться с местом присоединения, при этом колено сгибается для уменьшения напряжения. 2) В группе исходного напряжения голеностопный сустав вытягивается на 145° тыльного сгибания, а колено вытянуто, создавая преимущественно растягивающее напряжение в месте введения. 3) Для разгруженной группы экспланты культивируют в чашке Петри с коленом и голеностопом в нейтральном положении при отсутствии внешней нагрузки. Углы, упомянутые выше, фотографически измеряются относительно системы координат, в которой стопа и большеберцовая кости параллельны под углом 180° и перпендикулярны под углом 90°.

Ключевые этапы протокола включают: 1) рассечение эксплантов задних конечностей и тщательное удаление кожи и подошвенного сухожилия; 2) эксплантировать культуру после 48-часовой предварительной обработки дексаметазоном; 3) срез тканей и гистологическое окрашивание; 4) анализ цветного изображения для оценки формирования фиброзно-хрящевой ткани. После диссекции каждый эксплант задней конечности предварительно обрабатывают в течение 48 ч в питательной среде с добавлением дексаметазона74. Контралатеральные конечности каждой мыши распределяются по отдельным экспериментальным группам для попарного сравнения, что помогает контролировать биологическую изменчивость. После предварительной обработки экспланты помещают на платформы, как описано выше, и культивируют еще 7 дней (рис. 1B). Дополнительные сравнения были проведены с группой, получавшей предварительную обработку (день 0), в которой эксплантаты удалялись сразу после 48-часовой предварительной обработки.

После эксплантации культуры задние конечности обрезают, формалин фиксируют, декальцинируют и заделывают в парафин. Последовательный срез в сагиттальной ориентации обеспечивает визуализацию ахиллова сухожилия от миотендинозного соединения до пяточной вставки, позволяя отслеживать глубину сечения по всему сухожилию. Терминальное дезоксинуклеотидилтрансферазное (TdT)-опосредованное мечение dUTP X-ника (TUNEL) используется для визуализации повреждений ДНК на фоне апоптоза и оценки жизнеспособности. Гистология толуидинового синего и анализ пользовательских цветных изображений проводятся для количественной оценки изменений в окрашивании ГАГ. Затем срезы тканей, окрашенные толуидиновым синим, затем используются для визуализации ГВГ, чтобы охарактеризовать изменения в организации коллагеновых волокон (рис. 1B).

Представленные репрезентативные результаты свидетельствуют об измененном гистологическом окрашивании богатого ГАГ матрикса и дезорганизации внеклеточной коллагеновой сети, генерируемой 7-дневным статическим импинджментом в пределах модели. Эта модель может быть использована для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе фиброзно-хрящевых изменений, вызванных импинджментом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все работы с животными были одобрены Комитетом по ресурсам животных Университета Рочестера.

1. Подготовка питательных сред для тканей

  1. Культивирование всех эксплантов в модифицированной среде Dulbecco Eagle Medium (1x DMEM) с 1% v/v пенициллина-стрептомицина и 200 мкМ L-аскорбиновой кислоты в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. В течение первых 48 ч предварительной обработки культивируйте каждый эксплант в 70 мл питательной среды, дополненной 100 нМ дексаметазоном74. После предварительной обработки культивируют конечности еще 7 дней без дексаметазона, меняя среду каждые 48-72 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление сыворотки, такой как фетальная бычья сыворотка, в питательную среду не рекомендуется в соответствии с рекомендациями, предоставленными Wunderli, Blache, and Snedeker57. Короче говоря, условия без сыворотки лучше представляют собой аваскулярное, бедное питательными веществами микроокружение сухожилий, которое существует in vivo. Кроме того, добавки сыворотки могут способствовать деградации тканей при определенных условиях культивирования75 и стимулировать пролиферацию клеток и миграцию из тканей, что является признаком патологии сухожилий57.
  2. Для разгруженной группы культивируют каждую эксплантацию в 70 мл среды. Для групп исходного натяжения и статического импинджмента для каждой платформы требуется примерно 125 мл питательной среды, чтобы удержать конечность под водой. Этот объем может варьироваться в зависимости от положения верхней ноги в захватах и параметров 3D-печати, в первую очередь плотности заполнения.

2. Диссекция эксплантата и предварительная обработка дексаметазоном

  1. Усыпляйте мышей с помощью ингаляцииСО2 и вторичного вывиха шейки матки или в соответствии с рекомендациями учреждения. В этом протоколе используются мыши C57BL/6 в возрасте до 1 года. Размер задних конечностей увеличивается с возрастом, и их может быть трудно поместить в хваты.
  2. Перед вскрытием перелейте 70 мл предварительно подогретых (37 °C) питательных сред в чашку Петри размером 100 мм (диаметр) x 25 мм (высота) в стерильном шкафу биологической безопасности (BSC). Добавьте дексаметазон для достижения рабочей концентрации 100 нМ.
  3. Вскрытие может быть выполнено на столе с использованием абсорбирующих пеленок, быстро проходя через рассечение перед переносом эксплантатов задних конечностей в BSC. Соберите хирургические инструменты, необходимые для этого препарирования, которые включают гладкие, прямые, тонкие щипцы; прямые, тонкие кончики щипцов с зазубренными зубьями; и прямые, острые, тонкие ножницы.
  4. Для рассечения эксплантов задних конечностей поместите мышь в положение лежа на спине и определите тазобедренный сустав. Тонкими ножницами сделайте небольшой (5-10 мм) разрез через кожу, накладывая проксимальную и переднюю (черепную) поверхность верхней части ноги.
  5. Раздвиньте разрез, чтобы расширить, зажмите пальцами обнаженную верхнюю часть ноги и осторожно потяните кожу дистально, чтобы снять перчатку с задней конечности до уровня лодыжки. Аккуратно введите одно лезвие ножниц под кожу вдоль тыльной стороны стопы и сделайте разрез, доходящий до пальцев ног. Продолжайте натягивать кожу дистально до полного удаления.
  6. Расположите мышь так, чтобы визуализировать прикрепление ахиллова сухожилия к задней (каудальной) стороне пяточной кости, рядом с лодыжкой. Проксимальнее прикрепления ахиллова сухожилия подошвенное сухожилие находится непосредственно рядом с медиальной границей ахиллова сухожилия и простирается дистально к подошвенной части стопы, проходя над задней стороной пяточной кости.
  7. Чтобы удалить подошвенное сухожилие, осторожно вставьте один кончик гладких тонких щипцов между двумя сухожилиями и вытяните кончик медиально, проходя под сухожилием подошвенного сустава. Протяните кончик проксимально и разорвите подошвенную мышцу. С помощью тонких зазубренных щипцов захватите отслоившийся проксимальный конец сухожилия подошвенной мышцы и потяните дистально, чтобы удалить.
  8. В тазобедренном суставе тонкими ножницами разрежьте таз и изолируйте заднюю конечность. Ножницами подденьте оставшийся таз и обнажите головку бедренной кости.
  9. Эксплант задней конечности переносят в БСК и в чашку, содержащую питательные среды для клеток с дексаметазоном. Переместите посуду в инкубатор и предварительно обрабатывайте в течение 48 ч.

3. Эксплантация культур и погрузочные платформы

  1. По завершении 48-часовой предварительной обработки подогрейте достаточное количество питательных сред (секция 1). С этого момента дексаметазон не будет добавляться в питательные среды. В это время конечности из предварительно обработанной группы (день 0) могут быть зафиксированы, декальцинированы и погружены в парафин для последующего секционирования, окрашивания и анализа.
  2. Для разгруженной группы аспирируют среду предварительной обработки и переносят экспланты в свежие чашки Петри, добавляют по 70 мл питательных сред и возвращают в инкубатор.
  3. Для базовых групп растяжения и статического удара подготовьте эксплантационные платформы. Вырежьте кусочки наждачной бумаги, похожие по размеру на валики захвата. Для статической ударной группы отрежьте куски плетеной лески длиной примерно 18 дюймов и предварительно завяжите свободный верхний узел на полпути по длине лески. Оторвите кусочки алюминиевой фольги, чтобы покрыть каждую акриловую ванну, и опрыскайте 70% этанолом (EtOH). Переведите подготовку в ССП.
  4. Каждая платформа включает в себя акриловую ванну, основание, вставку для уменьшения объема, зажим и ручки. Каждый захват включает в себя две валики и три различных типа винтов, в том числе один винт M5 x 0,8 мм с резьбой x длиной 10 мм, который крепит захваты к основанию; два винта M6 с резьбой 1 мм x длиной 20 мм, которые удлиняют валики для зажима захватов; и четыре винта M3 x 0,5 мм с резьбой x 14 мм, которые в сочетании с четырьмя пружинами сжатия втягивают валики для открытия захватов.
  5. Поместите все компоненты во вторичные контейнеры, способные улавливать все питательные среды в случае утечки. Погрузите ≥ 10% раствор отбеливателя и выдержите не менее 1 часа. Смойте раствор отбеливателя водопроводной водой (при необходимости в автоклаве) и переместите в BSC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для устранения загрязнений рассмотрите возможность автоклавирования всей водопроводной воды или использования очищенной воды. Дополнительные советы по борьбе с загрязнением см. в разделе Обсуждение .
  6. С помощью винтов M3 и пружин сжатия прикрепите плиты к рукояткам, закрепите рукоятки на основании с помощью винта M5 и вставьте винты M6 до зацепления с опорами. Используйте двусторонний скотч, чтобы прикрепить наждачную бумагу к валикам, затем закройте захваты, чтобы улучшить сцепление наждачной бумаги с валиками. Повторите эти действия для всех платформ.
  7. Когда будете готовы к нагрузке на платформу, полностью раскройте захваты и с помощью щипцов поместите верхнюю часть ноги и колено между валиками так, чтобы поверхностная поверхность ахиллова сухожилия была обращена вверх (рис. 1А). Неплотно закройте ручки, чтобы аккуратно удерживать их на месте.
  8. Используйте щипцы, чтобы захватить обнаженную головку бедренной кости или стопу и манипулировать углом сгибания колена, постепенно смыкая захваты, чтобы зафиксировать их на месте. Для исходной группы натяжения разогнетайте коленный сустав, как описано выше. По мере того, как хват сжимается при вытянутом колене, голеностоп должен естественным образом разгибаться. Для статической ударной группы согните коленный сустав между захватами, как описано выше.
  9. Для статической ударной группы поместите верхний узел струны вокруг дистальной части лапы и затяните. Пропустите струну через прорезь в основании, расположенную под эксплантом, и через отверстие для зажима. Поместите основание в акриловую ванну и закрепите зажим на верхнем краю ванны (Рисунок 1A).
  10. Потяните за шнурок, чтобы сгибнуть стопу не менее чем на 110° по отношению к большеберцовой кости, и используйте перманентный маркер, чтобы отметить струну, когда она выходит из зажима. Сфотографируйте эксплант в этом положении, чтобы позже количественно оценить угол тыльного сгибания (рис. 1A).
  11. Снимите основание и прикрепите вставку уменьшения громкости, скользя по дорожке на основании. Поместите основание (теперь прикрепленное к вставке для уменьшения объема) обратно в акриловую ванну и переместите зажим на верхний край. Натяните струну, чтобы вернуться к исходному углу тыльного сгибания, используя отмеченную струну в качестве направляющей, и закрепите струну снаружи ванны лентой, чтобы сохранить статическое тыльное сгибание.
  12. Для базовой группы натяжения просто поместите основание со вставкой для уменьшения объема в акриловую ванну, как только эксплантат будет расположен между захватами, и сделайте фотографию для количественной оценки угла тыльного сгибания.
  13. Добавьте 125 мл предварительно подогретой (37 °C) питательной среды на каждую платформу для погружения эксплантов. Сверху ванну накройте алюминиевой фольгой, поместите во вторичную емкость и переместите в инкубатор. Бактериологическое исследование в течение 7 дополнительных дней, смена среды каждые 48-72 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лента, размещенная поперек верхней части ванны, может предотвратить всплытие деталей PLA.

4. Фиксация, декальцинация и заделка парафина

  1. После культивирования эксплантов используйте ножницы для обрезки ногтей на ногах/дистальных пальцах ног и отрезания верхней части ноги проксимальнее миотендинного соединения ахилла. Поместите каждый обрезанный голеностопный сустав в рабочую кассету, выстланную поролоновыми биопсийными прокладками. Вставьте лодыжку в угол кассеты, чтобы расположить лодыжку под углом тыльного сгибания примерно 90°, и закройте кассету, чтобы она оставалась на месте.
  2. Фиксируют в течение 3 дней в 10% нейтральном буферном формалине (NBF) и декальцинируют в течение 2 недель в 14% этилендиаменететрауксусной кислоте (ЭДТА), растворенной в дистиллированной воде (diH2O) с pH, доведенным до 7,4-7,6 ледяной уксусной кислотой.
  3. Чтобы удалить соли, тщательно промойте образцы три раза в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) с последующим diH2O, по 5 минут каждый. Выполните рутинную обработку образцов для гистологии парафина: обезвоживайте через градуированную серию EtOH, очищайте в ксилоле и инфильтрируйте парафином. Сориентируйте и внедрите образцы в парафин для получения сагиттальных срезов ткани через ахиллово сухожилие в медиально-латеральной прогрессии, как описано в разделе 5 ниже (Рисунок 1B).

5. Срезы тканей

  1. С помощью микротома аккуратно обрежьте образец до тех пор, пока срезы не станут параллельны поверхности блока. Грубо подрезать голеностопный сустав с медиальной стороны сустава, останавливаясь перед достижением медиальной границы прикрепления ахиллова сухожилия.
  2. Перенесите образец в ледяную глыбу, чтобы отрегулировать температуру и гидратацию, и замените лезвия (или перейдите на новую секцию текущего лезвия). Продолжайте срез образца толщиной 10 мкм и тщательно определяйте вход в прикрепление ахиллова сухожилия с помощью светлопольного микроскопа. После определения выполните последовательное срезирование, отслеживая номер участка (т.е. глубину ткани) по всему вживлению ахиллова сухожилия.

6. Депарафинизация/регидратация и выбор предметных стекол

  1. Для каждого анализа, приведенного ниже, выберите соответствующие уровни срезы тканей из каждой пары контралатеральных конечностей. Перед окрашиванием поместите на штатив и пройдите через 3 смены ксилола, 2 смены 100% EtOH, 2 смены 95% EtOH и 1 смену 70% EtOH по 5 минут каждая. Завершите регидратацию в diH2O.

7. TUNEL для оценки жизнеспособности ахиллова сухожилия

  1. Для маркировки TUNEL красьте в соответствии с протоколом производителя. Инкубируют в 20 мкг/мл протеиназы К в течение 20 мин при комнатной температуре и промывают в diH2O. Инкубируют в 50 мкл раствора красителя TUNEL (5 мкл раствора фермента, 45 мкл этикеточного раствора) в течение 1 ч при 37 °C. Промыть в diH2O. Монтировать антифейдным реагентом, содержащим DAPI и покровное стекло.
  2. Изображение прикрепления ахиллова сухожилия с помощью флуоресцентного микроскопа с 4-кратным объективом. Включите канал DAPI (длины волн возбуждения/излучения = 360/460 нм) для визуализации всех ядер, канал TUNEL (TMR Red) (длины волн возбуждения/излучения = 540/580 нм) для визуализации апоптотических ядер и, если возможно, канал светлого поля.
  3. Для анализа изображений импортируйте изображения в программное обеспечение для анализа изображений, подходящее для обработки на основе окупаемости инвестиций, например FIJI/ImageJ или MATLAB. Определите область интереса (ROI), охватывающую все ахиллово сухожилие (рис. 2A), исключая клетки эпитенона, которые очень восприимчивы к гибели, вызванной рассечением и внезапным изменением условий окружающей среды при помещении в культуру.
  4. Для этого выполните выбор ROI в MATLAB, импортировав изображение светлого поля и используя функцию drawpolygon() для трассировки и заключения границ сухожилия. MATLAB создает объект Polygon для ROI, который затем может быть применен к изображениям каналов DAPI и TUNEL для маскировки данных интенсивности пикселей за пределами ROI с помощью createMask(), чтобы анализировать только ядра в ахилловом сухожилии.
  5. Импортируйте изображения каналов DAPI и TUNEL и определите порог интенсивности флуоресценции для определения апоптотических (TUNEL+) ядер путем нормализации до максимальной интенсивности флуоресценции апоптотических ядер в нежизнеспособных тканях, таких как кости, мышцы или жир, которые случайно захвачены в тканевой секции. После того, как изображения замаскированы, вычислите долю апоптотических ядер (ядра TUNEL+/ядра DAPI) в ахилловом сухожилии.

8. Гистология толуидинового синего для характеристики формирования фиброзно-хрящевой ткани

  1. После регидратации (Секция 6) переносите штатив для предметных стекол с согласованными по уровню срезами тканей с контралатеральных пар эксплантов на 0,4% с толуидиновым синим O в 0,1 М буфере из ацетата натрия с pH, доведенным до 4,0 с помощью ледяной уксусной кислоты. Инкубируйте 10 мин при комнатной температуре, затем промойте 3 раза в diH2Oпо 30 с каждый.
  2. Обезвоживание путем трех смен 95% EtOH и двух смен 100% EtOH по 30 с каждая. Процедите через три смены ксилола по 1 минуте каждая. Покровный щиток с монтажным материалом на основе ксилола.
  3. Получение 24-битных цветных изображений вставки ахиллова сухожилия в красно-сине-зеленом (RGB). Например, для этого протокола используйте адаптер для подключения цифровой цветной камеры к окуляру простого светлопольного микроскопа с 4-кратным объективом.
  4. Чтобы количественно оценить различия в окрашивании толуидиновым синим в компрессионном фиброзном хряще сухожилия (CTF)16 при вставке ахиллова сухожилия (рис. 3A, B), импортируйте RGB-изображения в программное обеспечение для анализа изображений, способное определять и управлять несколькими ROI. Опции включают в себя инструменты выбора и управления ROI в FIJI/ImageJ или набор инструментов обработки изображений в MATLAB. Начните с установки масштаба в пикселях/длины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор программного обеспечения остается на усмотрение исследователя и, конечно, не ограничивается MATLAB или FIJI/ImageJ. Авторы предоставили код MATLAB (Дополнительный файл 2), документацию с описанием реализации (Дополнительный файл 3) и образец изображения (Дополнительный файл 4). Мы призываем исследователей переводить этот код на альтернативные языки программирования для использования в другом программном обеспечении по мере необходимости или предпочтения.
  5. С помощью изображения, отображаемого в выбранном программном обеспечении, определите пересечение глубокой границы сухожилия с пяточной костью. Отсюда проведите проксимально 800 мкм вдоль глубокой границы сухожилия, чтобы установить глубокую границу CTF. Например, используйте функцию drawpolyline() в MATLAB для интерактивного рисования полилинии поверх изображения RGB. MATLAB создает объект Polyline, содержащий вершины линии, которые могут быть обработаны и обрезаны до длины 800 мкм.
  6. Из этого положения создайте проксимальную границу CTF, нарисовав отрезок линии, соединяющийся с поверхностной границей сухожилия, которая перпендикулярна ориентации локального волокна.
  7. Вернитесь к пересечению глубокой границы сухожилия и пяточной кости и определите дистальную границу ХТФ, нарисовав отрезок линии, соединяющийся с поверхностной границей сухожилия вдоль отчетливой метки прилива, отделяющей ХТФ от зоны прикрепления фиброзно-хрящевой ткани (AZF)16 (рис. 3A,B). Наконец, сгенерируйте поверхностную границу CTF, обведя поверхностную границу сухожилия, которую нужно охватить.
  8. Чтобы описать пространственные вариации окрашивания ГАГ в месте вставки, разделите общую КТФ на 4 квадранта (рис. 3A,B). Соедините среднюю точку глубокой и поверхностной границ CTF с отрезком линии, чтобы создать дистальную/проксимальную границу. Пройдя через среднюю точку этой границы, соедините средние точки дистальной и проксимальной границ CTF вдоль ориентации волокна, чтобы создать поверхностную/глубокую границу.
  9. Эти 6 границ предоставляют информацию, которая может быть использована для определения ROI, представляющей весь CTF, а также 4 квадранта, разделяющих CTF. Например, в MATLAB можно скомпилировать вершины, определяющие границы каждого отдельного ROI (CTF, квадранты 1-4), в векторы и использовать images.roi.Polygon() для генерации вложенных объектов Polygon для каждого ROI.
  10. Определив ROI, преобразуйте данные пикселей RGB в цветовое пространство Hue-Saturation-Value (HSV) с помощью плагина преобразователя цвета в FIJI, функции rgb2hsv() в MATLAB или другого программного обеспечения, применяющего соответствующие уравнения преобразования76. Затем данные HSV могут быть спроецированы в 2D-пространство насыщенности тона, где каждая комбинация оттенка и насыщенности кодирует уникальный цвет (рис. 3C).
  11. В пределах каждого ROI вычислите средний оттенок и насыщенность, которые описывают средний цвет пятна в ROI. Это может быть достигнуто в MATLAB, например, с помощью объектов Polygon, определяющих каждый ROI, для маскировки изображения с помощью createMask() для анализа пиксельных данных насыщенности цветового тона, конкретно в рамках каждого ROI.
  12. Определите еще один небольшой ROI в периостальном фиброзном хряще (PF)16 (рис. 3A, B) и рассчитайте средний оттенок и насыщенность. Затем вычислите евклидово расстояние, отделяющее средний цвет в каждом ROI CTF от цвета PF (рис. 3C).
    Equation 1
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расчет евклидова расстояния описывает степень сходства между средним цветом ROI и цветом PF, квинтэссенции фиброзно-хрящевой ткани 16,17,77. Меньшее евклидово расстояние указывает на более волокнистый хрящевой цвет ROI.
  13. Используйте это расстояние для расчета показателя фиброзно-хрящевой ткани, который предполагает максимальное значение 1, если цвет ROI идентичен цвету PF, и минимальное значение -1, если цвет ROI и цвет PF достигают максимального разделения в цветовом пространстве насыщенности тона.
    Equation 2
  14. Средние данные по тону, насыщению и оценке фиброзно-хрящевой ткани в пределах каждого ROI по срезам тканей каждой конечности. Выполняйте парные статистические сравнения между группами контралатеральных конечностей.

9. Визуализация ГВГ для исследования изменений в организации коллагеновой сети

  1. Выполните ГВГ-визуализацию участков, окрашенных толуидиновым синим, с помощью мощной микроскопической системы с 20-кратным объективом. Получите z-стеки по толщине сечения и выполните сканирование плитки по мере необходимости, чтобы полностью зафиксировать прикрепление ахиллова сухожилия.
  2. Импортируйте изображения ГВГ в предпочтительное программное обеспечение для анализа изображений и определите ROI, охватывающие и разделяющие CTF при вставке ахиллова сухожилия, как описано для анализа изображений толуидинового синего цвета в разделе 8 (рис. 4A, B).
  3. Если изображения SHG импортируются в MATLAB, используйте подход для определения окупаемости инвестиций CTF в MATLAB, описанный в разделе 8. После определения ROI перенесите координаты ROI в FIJI, экспортировав вершины ROI из MATLAB в виде файлов .txt и импортировав в FIJI с помощью File > Import > XY Coordinates. Наложите выборку и отправьте ROI-менеджеру для анализа.
  4. Чтобы количественно оценить организацию коллагена, используйте плагин Directionality в FIJI, который выполняет анализ спектра Фурье для вычисления распределений ориентаций волокон в небольших окнах, охватывающих ROI. Разброс этого распределения, называемый дисперсией, обратно пропорционален выравниванию волокон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коллагеновые волокна могут принимать различную ориентацию в разных окнах по всей CTF из-за грубой кривизны сухожилия, а не из-за отсутствия выравнивания/организации. Чтобы лучше отличить изменения в организации коллагена от грубой кривизны сухожилия в месте вставки, необходимо определить меньшие ROI.
  5. Импортируйте изображения SHG в FIJI и установите масштаб в пикселях/длине. Проецируйте данные о максимальной интенсивности пикселей в 2D-композитное изображение и добавляйте ROI в ROI Manager. Последовательно наложите каждый вложенный ROI CTF на изображение и нарисуйте 10 небольших вложенных ROI одинакового размера в ROI, добавив их в диспетчер ROI.
  6. В каждом sub-ROI запустите плагин направленности в FIJI, чтобы рассчитать дисперсию волокна. Данные о средней дисперсии по суб-ROI в рамках каждого CTF ROI и средние данные о дисперсии в каждом CTF ROI по секциям от каждого экспланта. Выполняйте парные статистические сравнения между группами контралатеральных конечностей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Репрезентативные изображения срезов тканей, окрашенных методом TUNEL, демонстрируют минимальное количество апоптотических ядер в теле ахиллова сухожилия после 7 дней культивирования эксплантов в экспериментальных группах (рис. 2A). Количественная оценка этих изображений свидетельствует о том, что протокол культивирования тканей сохраняет жизнеспособность в среднем до 78% в ахилловом сухожилии после 7 дней культивирования эксплантата в условиях нагрузки (рис. 2B).

Качественно улучшенное окрашивание толуидиновым синим оценивается после 7 дней статического удара по сравнению с контрольной группой без нагрузки (рис. 3A, B), особенно в глубоких квадрантах, прилегающих к пяточной кости, где мы ранее измеряли максимальную поперечную сжимающую деформацию 5,6. Количественная оценка этих срезов ткани, окрашенных толуидиновым синим, указывает на значительное изменение оттенка (рис. 3D), насыщения (рис. 3E) и показателя фиброзно-хрящевой ткани (рис. 3F) после 7 дней статического импинджмента по сравнению с контралатеральными ненагруженными эксплантами. Это измененное окрашивание ГАГ, вероятно, представляет собой образование фиброзно-хрящевой ткани, вторичное по отношению к статическому импинджменту в этой модели. Статистически значимые различия в сатурации и оценке фиброзно-хрящевой ткани были обнаружены только в квадранте 1 после 7 дней исходного натяжения (рис. 3E, F). Кроме того, сатурация и показатель фиброзно-хрящевой ткани снизились по сравнению с контралатеральными ненагруженными сухожилиями, что является противоположной тенденцией по сравнению со статическим импинджментом. Эти данные могут подтвердить гипотезу о том, что растягивающее нагружение может ослабить или обратить вспять образование фиброзно-хрящевой ткани, вызванное столкновением, и требует дополнительных исследований в будущем.

Количественная оценка визуализации ГВГ позволяет предположить небольшое, но значительное изменение ориентации коллагеновых волокон после 7 дней статического импинджмента, опять же в глубокой и дистальной области, прилегающей к пяточной кости, на что указывают значительные различия в дисперсии (рис. 4C).

Figure 1
Рисунок 1: Эксплантированная платформа и экспериментальный дизайн. (А) Фотографическое и схематическое изображение эксплантированной платформы. (Наверх) Фотография целого экспланта задней конечности мыши, загруженного в платформу, с мечением критических компонентов. (Внизу) Схематическое изображение инсерционного импинджмента ахиллова сухожилия, вызванного пассивным тыльным сгибанием голеностопного сустава в этой модели экспланта. (Б) Схема дизайна исследования и культуры экспланта. Экспланты задних конечностей предварительно обрабатывают 100 нМ дексаметазоном в течение 48 ч74. От каждой мыши один эксплант задней конечности затем культивируется в чашке без нагрузки в течение 7 дней, в то время как контралатеральная конечность загружается на экспериментальную платформу, чтобы поместить ахиллово сухожилие либо под исходное натяжение, либо под статический импинджмент в течение 7 дней. Последовательные срезы тканей контралатеральных пар конечностей либо окрашивают толуидиновым синим для визуализации ткани, богатой ГАГ, либо используют для окрашивания TUNEL. Затем срезы, окрашенные толуидиновым синим, используются для визуализации ГВГ для оценки организации коллагена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Жизнеспособность экспланта. (A) Репрезентативные изображения окрашенных TUNEL срезов предварительно обработанных (день 0) эксплантов (вверху слева), ненагруженных сухожилий (вверху справа), сухожилий с сохранением исходного натяжения (внизу слева) и статически ущемленных сухожилий (внизу справа). Ахиллово сухожилие очерчено пунктирной белой линией и помечено AT, в то время как пяточная кость очерчена сплошной желтой линией и помечена C. Апоптотические ядра отображаются красным цветом (TUNEL), все ядра — синим (DAPI). (B) Количественная оценка фракции мертвых клеток составила в среднем менее 22% для ненагруженных, исходных групп натяжения и статического удара. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. В этих наборах данных присутствуют выбросы с гибелью клеток более 50%, что может быть связано с повреждением сухожилий, вызванным плохой техникой вскрытия. Средняя доля мертвых клеток с удаленными статистическими выбросами составляет менее 15% для всех групп. Статистически значимой разницы в гибели клеток между группами без нагрузки, исходного напряжения и статического импинджмента не выявлено (p < 0,05). Контроль 0-го дня: n=8. Без нагрузки: n=18. Исходное натяжение: n=8. Статическое соударение: n=12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Гистология толуидинового синего. (А) Репрезентативное окрашивание толуидинового синего после 7 дней разгруженного посева, изображающее компрессионный сухожильный фиброзный хрящ (CTF), фиброзный хрящ зоны прикрепления (AZF) и периостальной фиброзный хрящ (PF) в месте прикрепления ахиллова сухожилия16. Пяточная кость с надписью C. ROI, охватывающая CTF, обведена красным цветом и дополнительно разделена на 4 квадранта для предоставления дополнительной пространственной информации. (B) Репрезентативное окрашивание толуидиновым синим после 7 дней статического соударения с усиленным окрашиванием CTF, особенно в квадранте 1, где мы ранее измеряли максимальные поперечные деформации сжатия 5,6. (C) Схема цветового пространства насыщенности тона, используемого для анализа цветных изображений. Цвет описывается сочетанием оттенка (0°-360°) и насыщенности (0-255)76. Средний цвет в каждом ROI нормализуется к среднему цвету PF путем вычисления евклидова расстояния, отделяющего цвета в каждом ROI от цвета в PF, что обеспечивает нормализованный показатель фиброзно-хрящевой ткани. (Д-Ж) Изменения в окрашивании толуидинового синего после 7 дней статического импинджмента (вверху) и исходного натяжения (внизу) по сравнению с контралатеральными ненагруженными сухожилиями. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. (D) Количественная оценка оттенка указывает на значительные различия в среднем тоне во всех регионах после 7 дней статического импинджмента по сравнению с контралатеральными ненагруженными сухожилиями. Аналогичная тенденция не была обнаружена после 7 дней исходного натяжения по сравнению с контралатеральными ненагруженными сухожилиями. (E) Количественная оценка сатурации со значительными изменениями средней сатурации по всей КТФ и в пределах 1-3 квадрантов после 7 дней статического импинджмента по сравнению с контралатеральными ненагруженными сухожилиями. И наоборот, значимые различия были обнаружены только в квадранте 1 после 7 дней исходного натяжения, где насыщение уменьшилось по сравнению с контралатеральными ненагруженными сухожилиями. (F) Количественная оценка фиброзно-хрящевой ткани со значительными изменениями в оценке фиброзно-хрящевой ткани во всех регионах после 7 дней статического импинджмента по сравнению с контралатеральными ненагруженными сухожилиями. И наоборот, значимые различия были обнаружены только в квадранте 1 после 7 дней исходного натяжения, где показатель фиброзно-хрящевой ткани снизился по сравнению с контралатеральными ненагруженными сухожилиями. Полученные данные свидетельствуют об усиленном окрашивании ГАГ, вызванном статическим импинджментом, что указывает на повышенное образование фиброзно-хрящевой ткани. Данные, описывающие общий CTF, сравнивались с помощью знаковых ранговых тестов Уилкоксона. Данные квадрантов сравнивались с помощью двустороннего ANOVA с многократным критерием сравнения Шидака. *p < 0,05. **p < 0,01. p < 0,005. p < 0,001. Базовое напряжение по сравнению с ненагруженным: n = 6 пар. Статическое столкновение с ненагруженным: n = 8 пар. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Визуализация ГВГ. (A) Репрезентативное изображение ГВГ после 7 дней ненагруженной культуры по сравнению с (B) 7 дней статического столкновения. CTF обведена красным цветом и разделена на 4 квадранта, как показано на этикетке, в соответствии с показателями рентабельности инвестиций в анализе толуидинового синего цвета выше. (C) В каждом квадранте спектральный анализ Фурье выполнялся в движущемся подокне с помощью плагина Directionality в FIJI. Разброс распределения ориентаций волокон в пределах каждого подокна называется дисперсией (°) и обратно пропорционален выравниванию волокон. Дисперсия = 0° представляет собой идеальное параллельное выравнивание волокон. Увеличение дисперсии означает уменьшение выравнивания коллагеновых волокон. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. Статистически значимые различия в дисперсии были обнаружены в квадранте 1 после 7 дней статического импинджмента по сравнению с контралатеральными ненагруженными сухожилиями, что свидетельствует о повышенной дезорганизации коллагена. Данные квадрантов сравнивались с помощью двустороннего ANOVA с многократным критерием сравнения Шидака. * стр < 0,05. Статическое столкновение с ненагруженным: n = 5 пар. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Файлы САПР. Эти файлы САПР, скомпилированные в нескольких форматах, можно использовать для 3D-печати основания платформы, вставки для уменьшения объема и клипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Файлы MATLAB. Скомпилированные файлы MATLAB позволяют количественно определить гистологию толуидина синего, как описано в разделе 8 протокола, для оценки образования фиброзно-хрящевой ткани путем пространственного изменения при окрашивании ГАГ в месте прикрепления ахиллова сухожилия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3: Руководство по реализации кода MATLAB. В этом документе описывается конвейер для количественной оценки изменений в окрашивании ГАГ при вставке ахиллова сухожилия с помощью анализа изображений гистологии толуидинового синего с использованием предоставленного кода MATLAB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 4: Образец изображения гистологии толуидинового синего. Это цветное RGB-изображение гистологии толуидина синего может быть использовано для выполнения предоставленного кода MATLAB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Экспериментальная платформа эксплантата задних конечностей мыши в сочетании с протоколом культивирования тканей, описанным в этом исследовании, обеспечивает подходящую модель для изучения механобиологии формирования фиброзно-хрящевого хряща, вызванного импинджментом в месте прикрепления ахиллова сухожилия. Полезность этой модели эксплантов демонстрируется репрезентативными результатами, которые свидетельствуют о поддержании жизнеспособности клеток в сочетании со значительными и пространственно гетерогенными изменениями в окрашивании толуидиновым синим после 7 дней статического импинджмента. Эти результаты свидетельствуют об измененном метаболизме богатых GAG матричных молекул на фоне механического столкновения, что согласуется с другими моделями и клиническими исследованиями 3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,44,49. Кроме того, тонкие, но значимые изменения в организации коллагена были обнаружены с помощью визуализации ГВГ после 7 дней статического импинджмента, что согласуется с клиническими особенностями импинджмент-ассоциированной тендинопатии и in vivo моделями импинджмента сухожилий 28,37,38,43,44,49,64.

В предыдущих попытках изучить биологические последствия импинджмента сухожилий применялась простая компрессия к изолированным клеткам сухожилия27,29. После того, как механобиологический механизм был идентифицирован, эти модели обеспечивают превосходные терапевтические скрининговые платформы по сравнению с нашей моделью экспланта. Тем не менее, результаты этих исследований следует интерпретировать с осторожностью, поскольку изолированные клетки, культивируемые in vitro, не имеют трехмерной внеклеточной среды, которая влияет на механоответ57,59. Кроме того, клетки, выделенные из других коллагеновых тканей (например, хрящей), демонстрируют измененную активность механочувствительных ионных каналов при механическом воздействии in vitro в отсутствие внеклеточной среды78,79. Представленная модель устраняет эти ограничения, предоставляя платформу для воздействия на клетки сухожилий in situ в жизнеспособных эксплантах физиологически релевантным условиям нагрузки.

Модели эксплантов являются популярными экспериментальными системами для зондирования биологии и физиологии сухожилий57,58. В специфическом контексте импинджмента сухожилий в нескольких предыдущих исследованиях использовались частичные и целые экспланты сухожилий для изучения реакции клеток сухожилия на искусственную одноосную компрессию 30,31,32,33,34,39. Несмотря на то, что эти исследования продемонстрировали прямую связь между одноосной компрессией и формированием фиброзно-хрящевого хряща, механическая деформационная среда in vivo, создаваемая импинджментом сухожилия, является многоосной и зависит от анатомических особенностей ущемленной области 5,6. Например, на напряженную среду, создаваемую ударом пяточной кости об ахиллово сухожилие во время тыльного сгибания голеностопного сустава, влияют угол прикрепления, область прикрепления и наличие окружающих мягких тканей 60,61,62,63,80,81. Наша платформа эксплантатов сохраняет эти внешние структуры и воспроизводит многоосную деформационную среду, создаваемую импинджментом, сохраняя клетки в их родной среде6.

Животные модели сыграли фундаментальную роль в обосновании непосредственной связи между механическим импинджментом и квинтэссенцией особенностей фиброзно-хрящевого сухожилия и патологии, которые имеют аналогичные фенотипы 1,25,28,37,64,65,66. В последние десятилетия в большинстве исследований импинджмента in vivo использовались модели грызунов для изучения болезни вращательной манжеты плеча путем хирургического уменьшения субакромиального пространства для искусственного ущемления сухожилий вращательной манжеты плеча. Эти животные модели были использованы для описания клеточного и молекулярного патогенеза импинджмент-тендинопатии in vivo и могут быть расширены для оценки новых терапевтических стратегий, способствующих клиническому переводу импинджмент-исследований 36,37,38,66,82,83,84,85.

Установленные in vivo модели соприкосновения сухожилий, однако, имеют ряд важных ограничений при изучении механобиологии57,58. Эти модели хирургическим путем вводят или удаляют внешний источник ущемления сухожилий и возобновляют физическую активность (активность в свободной клетке, принудительный бег на беговой дорожке и т. д.). При таком подходе отсутствует контроль над величиной, ориентацией и частотой силы, приложенной непосредственно к сухожилию на протяжении всего эксперимента. Учитывая сложность измерения деформации тканей in vivo, эти модели предлагают ограниченный контроль или характеристику механической среды, генерируемой в сухожилии в ответ на соударение. Это ограничение хорошо известно в области исследований механобиологии сухожилий 57,58,67,68,69,70. Кроме того, были разработаны сложные экспериментальные платформы для применения контролируемой механической перегрузки (усталости) непосредственно к сухожилиям in vivo под наркозом 67,68,69. Эти модели контролируют применение механических стимулов в течение коротких промежутков времени под наркозом и не дают никакого контроля над историей нагрузки в течение оставшейся части эксперимента, когда животные возобновляют нормальную активность в клетке в течение нескольких дней или недель после механической перегрузки. Модель эксплантации, описанная в этом протоколе, предлагает контролируемое назначение импинджмента ахиллова сухожилия для создания измеримых и хорошо описанных паттернов деформации тканей6, что позволяет тщательно изучить механобиологию импинджмента. Следует, однако, отметить, что эта эксплантированная модель не устраняет необходимости в исследовании in vivo импинджмента сухожилий, а скорее служит дополнительным инструментом для обогащения данных, полученных из этих незаменимых моделей животных. Клеточные и молекулярные пути, определенные в связи с механикой импинджмента с использованием этой модели экспланта, могут быть охарактеризованы in vivo и оценены в качестве терапевтических мишеней с использованием животных моделей в рамках дополнительного подхода для улучшения клинического перевода механобиологических исследований. Возможности этой интегрированной стратегии используются в других областях механобиологических исследований сухожилий 58,86,87,88, и эта модель эксплантата дает свое применение для импинджмента сухожилий.

Модель экспланта не лишена ограничений. Как и в случае со всеми моделями эксплантов, механобиология может быть изучена только в относительно коротких временных масштабах, пока ткань остается жизнеспособной57,89. Несмотря на то, что модель является мощным инструментом для изучения непосредственной клеточной реакции на механическое столкновение, она не подходит для изучения хронического заболевания сухожилий, связанного с импинджментом. Кроме того, модель не может учесть системный ответ и перекрестные помехи в тканях, поскольку кровоснабжение и нейронная связь не поддерживаются. Тем не менее, модель предоставляет платформу для определения внутренней реакции эндогенных сухожильных клеток на механическое столкновение. Еще одним ограничением модели является то, что, согласно предыдущим исследованиям 32,90,91,92, мы ожидаем, что многие крупные протеогликаны, богатые ГАГ, будут диффундировать из сухожилия во время предварительной обработки и в ранние моменты культивирования эксплантов, особенно фрагменты агрегирующих протеогликанов, не закрепленных в основном матриксе. Таким образом, изменения в окрашивании ГАГ, вторичные по отношению к импинджменту в модели, вероятно, отражают изменения во вновь синтезированных макромолекулах, богатых ГАГ, которые еще не были катаболизированы и остаются закрепленными во внеклеточном матриксе. Учитывая, что эти богатые ГАГ протеогликаны локализуются в перицеллюлярном пространстве 22,30,93,94,95, модель эксплантата может облегчить изучение ремоделирования ПКМ на фоне импинджмента сухожилия.

Препарирование эксплантов задних конечностей мышей, описанное в этом протоколе, требует практики, но овладение техникой может быть достигнуто быстро. Полное снятие перчаток (т.е. удаление кожи) может оказаться сложной задачей, особенно вокруг пальцев задней лапы. Хотя кожу вокруг пальцев ног не нужно полностью удалять, она усиливает стерильность на протяжении всей культуры, поскольку бактерии присутствуют на коже и шерсти.

Наиболее сложным аспектом диссекции является удаление подошвенного сухожилия медиально от ахиллова сухожилия проксимально и поверхностное к ахиллову сухожилию дистально. Подошвенная мышечно-сухожильная единица охватывает коленный и голеностопный суставы в тесной связи с трицепсом и ахилловым сухожилием 81,96,97,98,99. Механические нагрузки, передаваемые через заднюю часть голеностопного сустава во время пассивного тыльного сгибания голеностопного сустава, распределяются между подошвенным и ахилловым сухожилиями, а подошвенное сухожилие, как известно, выдерживает высокую нагрузку in vivo100,101. Кроме того, анатомическая изменчивость в подошвенном жиле человека хорошо описана 96,102,103, и хотя эта изменчивость менее распространена у грызунов97, она имеет тенденцию влиять на механическую среду внутри ахиллова сухожилия in situ. В соответствии с предыдущими методами, используемыми для измерения напряжения в ахилловом сухожилии in situ 6,104, подошвенное сухожилие должно быть удалено, чтобы контролировать внутреннюю напряженную среду, создаваемую наружным импинджментом сухожилия.

Осторожное удаление подошвенного сухожилия необходимо для того, чтобы избежать гибели клеток ахиллова сухожилия, вызванной диссекцией, а вариабельность клеточного апоптоза, присутствующая в данных (рис. 2B), может отражать повреждения, вызванные диссекцией, из-за плохой техники диссекции. При удалении подошвенного сухожилия используются щипцы с тонким кончиком, которые аккуратно отделяют подошвенное сухожилие от ахиллова сухожилия и освобождают комплекс подошвенной мышцы и сухожилия проксимально. Зубчатые щипцы помогают захватить проксимальный свободный конец сухожилия подошвенной кости, чтобы потянуть дистально, вокруг пяточной кости и к пальцам лапы для полного удаления. Ли и Эллиотт дают полезное анатомическое описание подошвенного и ахиллова сухожилий крыс и связанных с ними мускулатур97.

Несмотря на то, что мы обнаружили, что техника вскрытия, описанная в этом исследовании, достаточна для обеспечения стерильности, протокол может быть скорректирован или изменен по мере необходимости в условиях, когда поддержание стерильности оказывается сложной задачей. Хирургические инструменты могут быть автоклавированы, раствор бетадина может быть нанесен местно на кожу, а вскрытие может проводиться в шкафу биологической безопасности. Мы обнаружили, что быстрое и эффективное настольное вскрытие имеет решающее значение и позволяет быстро переносить рассеченные конечности в стерильную среду в шкафу биологической безопасности после того, как стерильная граница, обеспечиваемая кожей, нарушена.

Еще одной основной целью для устранения загрязнений является метод, используемый для стерилизации компонентов платформы. В наших руках мы добились неизменного успеха с простым замачиванием в ≥ 10% растворе отбеливателя с надлежащим ополаскиванием в водопроводной воде без автоклавирования. Дополнительная стерилизация с использованием 70% этанола может быть применена по мере необходимости, но имейте в виду, что любой компонент, напечатанный на 3D-принтере с помощью PLA, несовместим с EtOH и деформируется. Кроме того, все части платформы, кроме акриловой ванны и напечатанных на 3D-принтере компонентов PLA, могут быть автоклавированы, а компоненты, замоченные ≥ 10% растворе отбеливателя, могут быть промыты автоклавной или очищенной водой. Чтобы избежать ржавчины, рекомендуется мыть и сушить вручную все металлические компоненты сразу после каждого эксперимента.

Методология количественного определения окрашивания толуидиновым синим для характеристики образования фиброзно-хрящевой ткани, описанная в этом протоколе, использует инновационный анализ цветных изображений, который предлагает широкое применение в исследованиях сухожилий. Существенные преимущества дает преобразование пиксельных данных из RGB в цветовое пространство HSV76. Здесь оттенок кодирует доминирующую длину волны в виде характерного цвета от 0° до 360°, в то время как насыщенность определяет чистоту каждого оттенка от 0 до 255. Значение, наоборот, описывает яркость цвета, и поэтому цветовая схема HSV отделяет яркость (значение) от цвета (оттенок, насыщенность). В контексте гистологического анализа пиксельные данные ВПГ более устойчивы к изменениям светопропускания во время микроскопии и изменениям толщины срезов тканей76. Кроме того, работа в цветовом пространстве ВПГ позволяет очертить конкретные интересующие длины волн (через оттенок) в зависимости от гистологического окрашивания76, например, оттенки около 240° для окрашивания толуидиновым синим.

Инновационным аспектом анализа изображений синего толуидина, представленного в этом исследовании, является оценка фиброзно-хрящевой ткани, метрика, которая связана с евклидовым расстоянием, отделяющим цвет каждого ROI от цвета периостального фиброзного хряща. Периостальной фиброзный хрящ появляется как вторичный хрящ сразу после рождения, в то время как компрессионный сухожильный фиброзный хрящ отсутствует постнатально и, как и другие сесамовидные фиброзные хрящи, по-видимому, регулируется механическим потреблением в областях повышенной компрессии сухожилий 16,17,28,77. Сравнивая показатели фиброзно-хрящевой ткани в экспериментальных группах, мы можем определить не только то, изменяется ли цвет синего цвета толуидина вторично по отношению к импинджменту, но и приводит ли это изменение к внешнему виду, близкому к фиброзно-хрящевой ткани. Этот анализ может быть расширен на другие популярные красители ГАГ, такие как альциановый синий и сафранин О, а также на другие участки фиброзно-хрящевого и фиброзно-хрящевого энтезисов сухожилий, при условии, что присутствует контрольная ткань, похожая на периостальный фиброзный хрящ. Например, изменения в окрашивании ГАГ в сухожилиях и связках коленного сустава могут быть нормализованы с помощью оценки фиброзно-хрящевой ткани к окрашиванию фиброзно-хрящевых менисков.

Важнейшим аспектом этого протокола является последовательное сечение тканей и отслеживание уровня срезов через ахиллово сухожилие, что требует повторяемого введения парафина и тщательной идентификации входа в ахиллово сухожилие для отслеживания глубины среза. Этот протокол секционирования и окрашивания, несомненно, требует практики и совершенствования, но может быть расширен до криосекции.

Гистологический подход, описанный в данной рукописи, может быть легко расширен до иммуногистохимии или иммунофлюоресценции. В связи с этим важным аспектом приведенного выше дизайна эксперимента является попарное сравнение контралатеральных конечностей каждой мыши. Здесь проводятся все статистические сравнения между срезами тканей на сопоставимом уровне срезов через ахиллово сухожилие от контралатеральных конечностей одной и той же мыши, отнесенных к разным экспериментальным группам. Эта стратегия помогает контролировать биологическую изменчивость. Кроме того, пары контралатеральных срезов тканей окрашиваются на одном и том же предметном стекле одновременно (гистология) или на предметном стекле одновременно, используя идентичные рабочие растворы для всех реагентов, буферов и растворов антител (иммуноокрашивание), чтобы помочь контролировать вариабельность от пятна к пятну, присущую гистологии и иммуномечению, а также анатомическую гетерогенность в зависимости от уровня, местоположения и ориентации среза.

Некоторые другие модификации протокола, описанные в данной рукописи, могут быть реализованы для дальнейшего изучения дополнительных исследовательских вопросов. Например, в то время как репрезентативные данные, представленные здесь, сосредоточены на 7-дневном статическом импинджменте, этот подход может быть адаптирован для исследования биологических последствий перемежающегося или циклического импинджмента путем соединения веревки, обернутой вокруг задней лапы через зажим, с механическим приводом, таким как шприцевой насос. Кроме того, платформа предоставляет возможность исследовать интересующие молекулярные механизмы, дополняя питательные среды низкомолекулярными агонистами/антагонистами или используя экспланты задних конечностей трансгенных линий мышей.

В заключение мы представили новую модель эксплантата задней конечности мыши для изучения механобиологии, лежащей в основе импинджмента ахиллова сухожилия. Это обеспечивается протоколом культивирования тканей, который поддерживает жизнеспособность клеток в условиях нагрузки в течение 7 дней. Эта модель повторяет образование фиброзно-хрящевой ткани, вызванное импинджментом, и изменение коллагена, как описано в других модельных системах, а также при дегенеративных заболеваниях сухожилий. Экспериментальная платформа позволяет контролируемо применять и количественно оценивать характеры механических деформаций и, таким образом, обеспечивает отличную модель для тщательного изучения механобиологии столкновения. Эта модель может быть применена для изучения молекулярных механизмов, представляющих интерес, для выявления потенциальных терапевтических мишеней в лечении инсерционных тендинопатий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарны за поддержку и помощь, оказанную Джеффом Фоксом и Видьей Венкатрамани из Центра исследований опорно-двигательного аппарата Центра исследований опорно-двигательного аппарата (HBMI), частично финансируемого P30AR06965. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Центр световой микроскопии и наноскопии (CALMN) при Медицинском центре Университета Рочестера за помощь в проведении многофотонной микроскопии. Это исследование финансировалось R01 AR070765 и R01 AR070765-04S1, а также 1R35GM147054 и 1R01AR082349.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox - Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cook, J. L., Purdam, C. Is compressive load a factor in the development of tendinopathy. Br J Sports Med. 46 (3), 163-168 (2012).
  2. Benjamin, M., Qin, S., Ralphs, J. R. Fibrocartilage associated with human tendons and their pulleys. J Anat. 187 (Pt 3), 625-633 (1995).
  3. Benjamin, M., Ralphs, J. R. Fibrocartilage in tendons and ligaments - an adaptation to compressive load. J Anat. 193 (4), 481-494 (1998).
  4. Benjamin, M., Theobald, P., Suzuki, D., Toumi, H. The anatomy of the Achilles tendon. The Achilles Tendon. 3, 5-16 (2007).
  5. Chimenti, R. L., et al. Insertional achilles tendinopathy associated with altered transverse compressive and axial tensile strain during ankle dorsiflexion. J Orthop Res. 35 (4), 910-915 (2017).
  6. Mora, K. E., et al. Ultrasound strain mapping of the mouse Achilles tendon during passive dorsiflexion. J Biomech. 132, 110920 (2022).
  7. Pringels, L., et al. Intratendinous pressure changes in the Achilles tendon during stretching and eccentric loading: Implications for Achilles tendinopathy. Scand J Med Sci Sports. 33 (5), 619-630 (2023).
  8. Koob, T. J., Vogel, K. G. Site-related variations in glycosaminoglycan content and swelling properties of bovine flexor tendon. J Orthop Res. 5 (3), 414-424 (1987).
  9. Vogel, K. G., Koob, T. J. Structural specialization in tendons under compression. Int Rev Cytol. 115, 267-293 (1989).
  10. Vogel, K. G., Ordög, A., Pogány, G., Oláh, J. Proteoglycans in the compressed region of human tibialis posterior tendon and in ligaments. J Orthop Res. 11 (1), 68-77 (1993).
  11. Vogel, K. G., Sandy, J. D., Pogány, G., Robbins, J. R. Aggrecan in bovine tendon. Matrix Biol. 14 (2), 171-179 (1994).
  12. Robbins, J. R., Vogel, K. G. Regional expression of mRNA for proteoglycans and collagen in tendon. Eur J Cell Biol. 64 (2), 264-270 (1994).
  13. Vogel, K. Repetitive motion disorders of the upper extremity. Gordon, S. I., Blair, S. J., Fine, L. J. , American Academy of Orthopedic Surgeons, Michigan. (1995).
  14. Benjamin, M., Tyers, R. N., Ralphs, J. R. Age-related changes in tendon fibrocartilage. J Anat. 179, 127-136 (1991).
  15. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: a structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anat Rec. 231 (2), 167-177 (1991).
  16. Rufai, A., Benjamin, M., Ralphs, J. R. Development and ageing of phenotypically distinct fibrocartilages associated with the rat Achilles tendon. Anat Embryol (Berl). 186 (6), 611-618 (1992).
  17. Rufai, A., Ralphs, J. R., Benjamin, M. Ultrastructure of fibrocartilages at the insertion of the rat Achilles tendon. J Anat. 189 (Pt 1), 185-191 (1996).
  18. Waggett, A. D., Ralphs, J. R., Kwan, A. P. L., Woodnutt, D., Benjamin, M. Characterization of collagens and proteoglycans at the insertion of the human achilles tendon. Matrix Biol. 16 (8), 457-470 (1998).
  19. Ralphs, J., et al. Regional differences in cell shape and gap junction expression in rat Achilles tendon: relation to fibrocartilage differentiation. J Anat. 193 (pt 2), 215-222 (1998).
  20. Milz, S., et al. Three-dimensional reconstructions of the Achilles tendon insertion in man. J Anat. 200 (Pt 2), 145-152 (2002).
  21. Tischer, T., Milz, S., Maier, M., Schieker, M., Benjamin, M. An immunohistochemical study of the rabbit suprapatella, a sesamoid fibrocartilage in the quadriceps tendon containing aggrecan. J Histochem Cytochem. 50 (7), 955-960 (2002).
  22. Esquisatto, M. A., Joazeiro, P. P., Pimentel, E. R., Gomes, L. The effect of age on the structure and composition of rat tendon fibrocartilage. Cell Biol Int. 31 (6), 570-577 (2007).
  23. Matuszewski, P. E., et al. Regional variation in human supraspinatus tendon proteoglycans: Decorin, biglycan, and aggrecan. Connect Tissue Res. 53 (5), 343-348 (2012).
  24. Buckley, M. R., Huffman, G. R., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. The location-specific role of proteoglycans in the flexor carpi ulnaris tendon. Connect Tissue Res. 54 (6), 367-373 (2013).
  25. Gillard, G. C., Reilly, H. C., Bell-Booth, P. G., Flint, M. H. The influence of mechanical forces on the glycosaminoglycan content of the rabbit flexor digitorum profundus tendon. Connect Tissue Res. 7 (1), 37-46 (1979).
  26. Giori, N. J., Beaupre, G. S., Carter, D. R. Cellular shape and pressure may mediate mechanical control of tissue composition in tendons. J Orthop Res. 11 (4), 581-591 (1993).
  27. Wren, T. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanobiology of tendon adaptation to compressive loading through fibrocartilaginous metaplasia. J Rehabil Res Dev. 37 (2), 135-143 (2000).
  28. Malaviya, P., et al. An in vivo model for load-modulated remodeling in the rabbit flexor tendon. J Orthop Res. 18 (1), 116-125 (2000).
  29. Shim, J. W., Elder, S. H. Influence of Cyclic Hydrostatic Pressure on Fibrocartilaginous Metaplasia of Achilles Tendon Fibroblasts. Biomech Model Mechanobiol. 5 (4), 247-252 (2006).
  30. Koob, T. J., Clark, P. E., Hernandez, D. J., Thurmond, F. A., Vogel, K. G. Compression loading in vitro regulates proteoglycan synthesis by tendon fibrocartilage. Arch Biochem Biophys. 298 (1), 303-312 (1992).
  31. Evanko, S. P., Vogel, K. G. Proteoglycan Synthesis in Fetal Tendon Is Differentially Regulated by Cyclic Compression in Vitro. Arch Biochem Biophys. 307 (1), 153-164 (1993).
  32. Vogel, K. G. The effect of compressive loading on proteoglycan turnover in cultured fetal tendon. Connect Tissue Res. 34 (3), 227-237 (1996).
  33. Thornton, G. M., et al. Changes in mechanical loading lead to tendon specific alterations in MMP and TIMP expression: influence of stress deprivation and intermittent cyclic hydrostatic compression on rat supraspinatus and Achilles tendons. Br J Sports Med. 44 (10), 698-703 (2010).
  34. Robbins, J. R., Evanko, S. P., Vogel, K. G. Mechanical Loading and TGF-β Regulate Proteoglycan Synthesis in Tendon. Arch Biochem Biophys. 342 (2), 203-211 (1997).
  35. Docking, S., Samiric, T., Scase, E., Purdam, C., Cook, J. Relationship between compressive loading and ECM changes in tendons. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (1), 7-11 (2013).
  36. Wang, X., et al. Aberrant TGF-β activation in bone tendon insertion induces enthesopathy-like disease. J Clin Invest. 128 (2), 846-860 (2018).
  37. Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. J Orthop Res. 36 (10), 2780-2788 (2018).
  38. Liu, Y., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: development and analysis of a novel rat model. J Shoulder Elbow Surg. 31 (9), 1898-1908 (2022).
  39. Majima, T., et al. Compressive compared with tensile loading of medial collateral ligament scar in vitro uniquely influences mRNA levels for aggrecan, collagen type II, and collagenase. J Orthop Res. 18 (4), 524-531 (2000).
  40. Hopkins, C., et al. Critical review on the socio-economic impact of tendinopathy. Asia Pac J Sports Med, Arthrosc, Rehabil Technol. 4, 9-20 (2016).
  41. Scott, A., Ashe, M. C. Common tendinopathies in the upper and lower extremities. Curr Sports Med Rep. 5 (5), 233-241 (2006).
  42. Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin Sports Med. 22 (4), 675-692 (2003).
  43. Bah, I., et al. Tensile mechanical changes in the Achilles tendon due to Insertional Achilles tendinopathy. J Mech Behav Biomed Mater. 112, 104031 (2020).
  44. Chondral Metaplasia in Calcific Insertional Tendinopathy of the Achilles Tendon. Clin J Sport Med. Maffulli, N., Reaper, J., Ewen, S. W. B., Waterston, S. W., Barrass, V. 16 (4), 329-334 (2006).
  45. Corps, A. N., et al. Increased expression of aggrecan and biglycan mRNA in Achilles tendinopathy. Rheumatology (Oxford). 45 (3), 291-294 (2006).
  46. Scott, A., et al. Increased versican content is associated with tendinosis pathology in the patellar tendon of athletes with jumper's knee. Scand J Med Sci Sports. 18 (4), 427-435 (2008).
  47. Attia, M., et al. Greater glycosaminoglycan content in human patellar tendon biopsies is associated with more pain and a lower VISA score. Br J Sports Med. 48 (6), 469-475 (2014).
  48. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative Incidence of Achilles Tendon Rupture and Tendinopathy in Male Former Elite Athletes. Clin J Sport Med. 15 (3), 133-135 (2005).
  49. Corps, A. N., et al. Changes in matrix protein biochemistry and the expression of mRNA encoding matrix proteins and metalloproteinases in posterior tibialis tendinopathy. Ann Rheum Dis. 71 (5), 746-752 (2012).
  50. Neer, C. S. 2nd Anterior acromioplasty for the chronic impingement syndrome in the shoulder: a preliminary report. J Bone Joint Surg Am. 54 (1), 41-50 (1972).
  51. Bigliani, L. U., Ticker, J. B., Flatow, E. L., Soslowsky, L. J., Mow, V. C. The relationship of acromial architecture to rotator cuff disease. Clin Sports Med. 10 (4), 823-838 (1991).
  52. Chimenti, R. L., Cychosz, C. C., Hall, M. M., Phisitkul, P. Current Concepts Review Update Insertional Achilles Tendinopathy. Foot Ankle Int. 38 (10), 1160-1169 (2017).
  53. Nicholson, C. W., Berlet, G. C., Lee, T. H. Prediction of the Success of Nonoperative Treatment of Insertional Achilles Tendinosis Based on MRI. Foot Ankle Int. 28 (4), 472-477 (2007).
  54. Lohrer, H., David, S., Nauck, T. Surgical treatment for achilles tendinopathy - a systematic review. BMC musculoskelet disord. 17 (1), 207 (2016).
  55. McGarvey, W. C., Palumbo, R. C., Baxter, D. E., Leibman, B. D. Insertional Achilles Tendinosis: Surgical Treatment Through a Central Tendon Splitting Approach. Foot Ankle Int. 23 (1), 19-25 (2002).
  56. Maffulli, N., et al. Surgery for chronic Achilles tendinopathy produces worse results in women. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1714-1720 (1714).
  57. Wunderli, S. L., Blache, U., Snedeker, J. G. Tendon explant models for physiologically relevant in vitro study of tissue biology - a perspective. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 262-277 (2020).
  58. Dyment, N. A., et al. A brief history of tendon and ligament bioreactors: Impact and future prospects. J Orthop Res. 38 (11), 2318-2330 (2020).
  59. Screen, H. R. C., Berk, D. E., Kadler, K. E., Ramirez, F., Young, M. F. Tendon Functional Extracellular Matrix. J Orthop Res. 33 (6), 793-799 (2015).
  60. Theobald, P., et al. The functional anatomy of Kager's fat pad in relation to retrocalcaneal problems and other hindfoot disorders. J Anat. 208 (1), 91-97 (2006).
  61. Ghazzawi, A., Theobald, P., Pugh, N., Byrne, C., Nokes, L. Quantifying the motion of Kager's fat pad. J Orthop Res. 27 (11), 1457-1460 (2009).
  62. Malagelada, F., et al. Pressure changes in the Kager fat pad at the extremes of ankle motion suggest a potential role in Achilles tendinopathy. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 28 (1), 148-154 (2020).
  63. Shaw, H. M., Benjamin, M. Structure-function relationships of entheses in relation to mechanical load and exercise. Scand J Med Sci Sports. 17 (4), 303-315 (2007).
  64. Soslowsky, L. J., et al. Rotator cuff tendinosis in an animal model: role of extrinsic and overuse factors. Ann Biomed Eng. 30 (8), 1057-1063 (2002).
  65. Schneeberger, A. G., Nyffeler, R. W., Gerber, C. Structural changes of the rotator cuff caused by experimental subacromial impingement in the rat. J Shoulder Elbow Surg. 7 (4), 375-380 (1998).
  66. Croen, B. J., et al. Chronic subacromial impingement leads to supraspinatus muscle functional and morphological changes: Evaluation in a murine model. J Orthop Res. 39 (10), 2243-2251 (2021).
  67. Andarawis-Puri, N., Flatow, E. L. Tendon fatigue in response to mechanical loading. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 106-114 (2011).
  68. Gains, C. C., Giannapoulos, A., Zamboulis, D. E., Lopez-Tremoleda, J., Screen, H. R. C. Development and application of a novel in vivo overload model of the Achilles tendon in rat. J Biomech. 151, 111546 (2023).
  69. Williamson, P. M., et al. A passive ankle dorsiflexion testing system to assess mechanobiological and structural response to cyclic loading in rat Achilles tendon. J Biomech. 156, 111664 (2023).
  70. Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A Novel, Open-Source, Low-Cost Bioreactor for Load-Controlled Cyclic Loading of Tendon Explants. J Biomech Eng. 144 (8), 084505 (2022).
  71. Orishimo, K. F., et al. Effect of Knee Flexion Angle on Achilles Tendon Force and Ankle Joint Plantarflexion Moment During Passive Dorsiflexion. J Foot Ankle Surg. 47 (1), 34-39 (2008).
  72. Liu, C. L., et al. Influence of different knee and ankle ranges of motion on the elasticity of triceps surae muscles, Achilles tendon, and plantar fascia. Sci Rep. 10 (1), 6643 (2020).
  73. Cruz-Montecinos, C., et al. Soleus muscle and Achilles tendon compressive stiffness is related to knee and ankle positioning. J Electromyogr Kinesiol. 66, 102698 (2022).
  74. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Lose-dose administration of dexamethasone is beneficial in preventing secondary tendon damage in a stress-deprived joint injury explant model. J Orthop Res. 38 (1), 139-149 (2020).
  75. Wunderli, S. L., et al. Tendon response to matrix unloading is determined by the patho-physiological niche. Matrix Biol. 89, 11-26 (2020).
  76. Yabusaki, K., et al. A Novel Quantitative Approach for Eliminating Sample-To-Sample Variation Using a Hue Saturation Value Analysis Program. PloS one. 9 (3), e89627 (2014).
  77. Gao, J., Messner, K., Ralphs, J. R., Benjamin, M. An immunohistochemical study of enthesis development in the medial collateral ligament of the rat knee joint. Anat Embryol. 194 (4), 399-406 (1996).
  78. Han, S. K., Wouters, W. A. J., Clark, A., Herzog, W. Mechanically induced calcium signaling in chondrocytes in situ. J Orthop Res. 30 (3), 475-481 (2012).
  79. Han, W., et al. Impact of cellular microenvironment and mechanical perturbation on calcium signalling in meniscus fibrochondrocytes. Eur Cell Mater. 27, 321-331 (2014).
  80. Rossetti, L., et al. The microstructure and micromechanics of the tendon-bone insertion. Nat Mater. 16 (6), 664-670 (2017).
  81. Sartori, J., Köhring, S., Witte, H., Fischer, M. S., Löffler, M. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
  82. Eliasberg, C. D., et al. Identification of Inflammatory Mediators in Tendinopathy Using a Murine Subacromial Impingement Model. J Orthop Res. 37 (12), 2575-2582 (2019).
  83. Zhang, Y., et al. Expression of alarmins in a murine rotator cuff tendinopathy model. J Orthop Res. 38 (11), 2513-2520 (2020).
  84. Zhang, X., et al. Assessment of Mitochondrial Dysfunction in a Murine Model of Supraspinatus Tendinopathy. J Bone Joint Surg. Am. 103 (2), 174-183 (2021).
  85. Liu, Y., et al. The role of Indian Hedgehog Signaling in tendon response to subacromial impingement: evaluation using a mouse model. Am J Sports Med. 50 (2), 362-370 (2022).
  86. Wang, T., et al. Load-induced regulation of tendon homeostasis by SPARC, a genetic predisposition factor for tendon and ligament injuries. Sci Transl Med. 13 (582), eabe5738 (2021).
  87. Passini, F. S., et al. Shear-stress sensing by PIEZO1 regulates tendon stiffness in rodents and influences jumping performance in humans. Nat Biomed Eng. 5 (12), 1457-1471 (2021).
  88. Jones, D. L., et al. Mechanoepigenetic regulation of extracellular matrix homeostasis via Yap and Taz. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (22), e2211947120 (2023).
  89. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Release of pro-inflammatory cytokines from muscle and bone causes tenocyte death in a novel rotator cuff in vitro explant culture model. Connect Tissue Res. 59 (5), 423-436 (2018).
  90. Rees, S. G., et al. Catabolism of aggrecan, decorin and biglycan in tendon. Biochem J. 350 (Pt 1), 181-188 (2000).
  91. Samiric, T., Ilic, M. Z., Handley, C. J. Large aggregating and small leucine-rich proteoglycans are degraded by different pathways and at different rates in tendon. Eur J Biochem. 271 (17), 3612-3620 (2004).
  92. Rees, S. G., Curtis, C. L., Dent, C. M., Caterson, B. Catabolism of aggrecan proteoglycan aggregate components in short-term explant cultures of tendon. Matrix Biol. 24 (3), 219-231 (2005).
  93. Taye, N., Karoulias, S. Z., Hubmacher, D. The "other" 15-40%: The Role of Non-Collagenous Extracellular Matrix Proteins and Minor Collagens in Tendon. J Orthop Res. 38 (1), 23-35 (2020).
  94. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L. The development of the pressure-bearing tendon of the bullfrog, Rana catesbeiana. Anat Embryol. 200 (1), 55-64 (1999).
  95. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L., Covizi, D. Z., Della Colleta, H. H., Gomes, L. Structure and proteoglycan composition of specialized regions of the elastic tendon of the chicken wing. Cell Tissue Res. 300 (3), 435-446 (2000).
  96. van Sterkenburg, M. N., Kerkhoffs, G. M., Kleipool, R. P., Niek van Dijk, C. The plantaris tendon and a potential role in mid-portion Achilles tendinopathy: an observational anatomical study. J Anat. 218 (3), 336-341 (2011).
  97. Lee, A. H., Elliott, D. M. Comparative multi-scale hierarchical structure of the tail, plantaris, and Achilles tendons in the rat. J Anat. 234 (2), 252-262 (2019).
  98. Lee, A. H., Elliott, D. M. Multi-Scale Loading and Damage Mechanisms of Plantaris and Rat Tail Tendons. J Orthop Res. 37 (8), 1827-1837 (2019).
  99. Fan, H. M., Shrestha, L., Guo, Y., Tao, H. R., Sun, Y. L. The twisted structure of the rat Achilles tendon. J Anat. 239 (5), 1134-1140 (2021).
  100. Cutlip, R. G., Stauber, W. T., Willison, R. H., McIntosh, T. A., Means, K. H. Dynamometer for rat plantar flexor muscles in vivo. Med Biol Eng Comput. 35 (5), 540-543 (1997).
  101. Rijkelijkhuizen, J. M., Baan, G. C., de Haan, A., de Ruiter, C. J., Huijing, P. A. Extramuscular myofascial force transmission for in situ rat medial gastrocnemius and plantaris muscles in progressive stages of dissection. J Exp Biol. 208 (Pt 1), 129-140 (2005).
  102. Saxena, A., Bareither, D. Magnetic Resonance and Cadaveric Findings of the Incidence of Plantaris Tendon. Foot Ankle Int. 21 (7), 570-572 (2000).
  103. dos Santos, M. A., Bertelli, J. A., Kechele, P. R., Duarte, H. Anatomical study of the plantaris tendon: reliability as a tendo-osseous graft. Surg Radiol Anat. 31 (1), 59-61 (2009).
  104. Sartori, J., Köhring, S., Bruns, S., Moosmann, J., Hammel, J. U. Gaining Insight into the Deformation of Achilles Tendon Entheses in Mice. Adv Eng Mater. 23 (11), 2100085 (2021).

Tags

Биоинженерия выпуск 202
Модель эксплантата задней конечности мыши для изучения механобиологии импинджмента ахиллова сухожилия
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W.,… More

Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W., Buckley, M. R. Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement. J. Vis. Exp. (202), e65801, doi:10.3791/65801 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter