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Bioengineering

Modelo de explante de extremidad posterior murina para el estudio de la mecanobiología del pinzamiento del tendón de Aquiles

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65801
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

Summary

Presentamos una plataforma experimental personalizada y un protocolo de cultivo de tejidos que recrea el cambio fibrocartilaginoso impulsado por el pinzamiento de la inserción del tendón de Aquiles en explantes de extremidades posteriores murinas con viabilidad celular sostenida, proporcionando un modelo adecuado para explorar la mecanobiología del pinzamiento tendinoso.

Abstract

El pinzamiento tendinoso sobre el hueso genera un ambiente de deformación mecánica multiaxial con una deformación compresiva transversal marcadamente elevada, que provoca un fenotipo de fibrocartílago localizado caracterizado por la acumulación de matriz rica en glicosaminoglicanos (GAG) y la remodelación de la red de colágeno. Si bien el fibrocartílago es una característica normal en las regiones afectadas de tendones sanos, el exceso de depósito de GAG y la desorganización de la red de colágeno son características distintivas de la tendinopatía. En consecuencia, el pinzamiento se reconoce clínicamente como un factor extrínseco importante en el inicio y la progresión de la tendinopatía. Sin embargo, la mecanobiología que subyace al pinzamiento del tendón sigue siendo poco estudiada. Los esfuerzos anteriores para dilucidar la respuesta celular al pinzamiento del tendón han aplicado compresión uniaxial a las células y extirpado explantes de tendones in vitro. Sin embargo, las células aisladas carecen de un entorno extracelular tridimensional crucial para la mecanorespuesta, y tanto los estudios in vitro como los de explantes extirpados no logran recapitular el entorno de deformación multiaxial generado por el pinzamiento del tendón in vivo, que depende de las características anatómicas de la región afectada. Además, los modelos in vivo de pinzamiento tendinoso carecen de control sobre el entorno de deformación mecánica. Para superar estas limitaciones, presentamos un novedoso modelo de explante murino de extremidad posterior adecuado para estudiar la mecanobiología del pinzamiento del tendón de Aquiles. Este modelo mantiene el tendón de Aquiles in situ para preservar la anatomía local y reproduce el entorno de tensión multiaxial generado por el pinzamiento de la inserción del tendón de Aquiles sobre el calcáneo durante la dorsiflexión del tobillo aplicada pasivamente, al tiempo que retiene las células dentro de su entorno nativo. Describimos un protocolo de cultivo de tejidos integral para este modelo y presentamos datos que establecen la viabilidad sostenida del explante durante 7 días. Los resultados representativos demuestran un aumento de la tinción histológica de GAG y una disminución de la alineación de las fibras de colágeno secundaria al pinzamiento, lo que sugiere una formación elevada de fibrocartílago. Este modelo se puede adaptar fácilmente para investigar diferentes regímenes de carga mecánica y permite la manipulación de vías moleculares de interés para identificar mecanismos que median el cambio fenotípico en el tendón de Aquiles en respuesta al pinzamiento.

Introduction

Una multitud de tendones, incluidos el tendón de Aquiles y los tendones del manguito rotador, experimentan pinzamiento óseo debido a la posición anatómica normal1,2,3,4. El pinzamiento del tendón genera una tensión compresiva dirigida transversalmente al eje longitudinal de la fibra5,6,7. Las regiones de pinzamiento del tendón demuestran un fenotipo único de fibrocartílago en el que las células redondas y encogidas (fibrocondrocitos) están incrustadas dentro de una red de colágeno desorganizada con un contenido marcadamente mayor de glicosaminoglicanos (GAG)2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Estudios anteriores sugieren que el entorno mecánico dispar producido por el pinzamiento del tendón sostiene esta matriz rica en GAG al impulsar la deposición de grandes proteoglicanos agregantes, sobre todo agrecano, aunque los mecanismos subyacentes no están claros1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Si bien el fibrocartílago es una característica normal en las regiones afectadas de tendones sanos, el metabolismo aberrante de los proteoglicanos asociado con la formación excesiva de fibrocartílago es una característica distintiva de la tendinopatía, una enfermedad común y debilitante que surge de manera desproporcionada en los tendones con afectación crónica1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. En consecuencia, el pinzamiento del tendón se reconoce clínicamente como un factor extrínseco importante que impulsa varias de las tendinopatías más comunes, incluida la enfermedad del manguito rotador y la tendinopatía insercional del tendón de Aquiles (IAT)50,51,52. En la actualidad, el tratamiento de la tendinopatía es ineficiente. Por ejemplo, aproximadamente el 47% de los pacientes con TAI requieren intervención quirúrgica después de un tratamiento conservador fallido, con resultados postoperatorios variables53,54,55,56. A pesar de la aparente relación entre el pinzamiento y la tendinopatía, los mecanismos mecanobiológicos por los cuales las células del tendón pinzado sienten y responden a su entorno mecánico están mal descritos, lo que oscurece la comprensión de la patogénesis de la tendinopatía y da lugar a un tratamiento inadecuado.

Los modelos de explantes son herramientas útiles en el estudio de la mecanobiología tendinosa57,58. Como primer paso hacia la comprensión de la mecanobiología del pinzamiento tendinoso, varios estudios previos han explorado la respuesta celular tras la aplicación de la compresión uniaxial simple a las células o explantes tendinosos extirpados 27,29,30,31,32,33,34,39. Sin embargo, las células in vitro carecen de matrices extracelulares y pericelulares que faciliten la transferencia de cepas, secuestren importantes factores de crecimiento y citocinas liberadas por deformación mecánica, y proporcionen sustrato para complejos de adhesión focal que desempeñan un papel en la mecanotransducción57,59. Además, tanto los estudios in vitro como los de explantes extirpados no logran recapitular el ambiente de deformación mecánica multiaxial generado por el pinzamiento tendinoso in vivo, que depende de las características anatómicas de la región afectada 5,6. En el contexto de la inserción del tendón de Aquiles afectado, esto incluye los tejidos circundantes como la bolsa retrocalcánea y la almohadilla de grasa de Kager 60,61,62,63. Por el contrario, los modelos in vivo de pinzamiento tendinoso 25,28,36,37,38,64,65,66 permiten un control mínimo sobre la magnitud y frecuencia de la carga aplicada directamente al tendón, lo cual es una limitación bien reconocida de los modelos in vivo para el estudio de la mecanobiología del tendón 57,58,67,68,69,70. Dados los desafíos en la medición de la deformación tendinosa in vivo, el entorno de deformación interna generado dentro de estos modelos a menudo está mal caracterizado.

En este manuscrito, presentamos una plataforma experimental personalizada que recrea el pinzamiento de la inserción del tendón de Aquiles sobre el calcáneo dentro de explantes de extremidades posteriores murinas enteras que, cuando se combina con este protocolo de cultivo de tejidos, mantiene la viabilidad durante 7 días en cultivo de explantes y permite el estudio de las secuelas biológicas del pinzamiento del tendón. La plataforma está construida sobre una base de ácido poliláctico (PLA) impresa en 3D que proporciona la base para la fijación de las empuñaduras y el inserto de reducción de volumen de PLA impreso en 3D. Las empuñaduras se utilizan para sujetar la parte superior de la pierna y la rodilla proximales a la unión miotendinosa del tendón de Aquiles con la cara caudal de la extremidad posterior hacia arriba, lo que permite obtener imágenes del tendón de Aquiles desde arriba utilizando una sonda de ultrasonido o un microscopio invertido (Figura 1A). El inserto de reducción de volumen se desliza a lo largo de una pista en la base y reduce el volumen requerido de medios de cultivo de tejidos. Una línea trenzada envuelta alrededor de la pata trasera se enruta fuera de la plataforma utilizando el diseño de la base y un clip de PLA impreso en 3D. Al tirar de la cuerda, la pata trasera se flexiona dorsal y la inserción del tendón de Aquiles se incita contra el calcáneo, lo que resulta en una tensión compresiva transversal elevada 5,6 (Figura 1A). La plataforma está contenida dentro de un baño acrílico que mantiene los explantes de la extremidad posterior sumergidos en medios de cultivo de tejidos. Asegurar la cuerda tensa al exterior de la bañera con cinta adhesiva mantiene la dorsiflexión del tobillo para producir un pinzamiento estático de la inserción del tendón de Aquiles. Los archivos CAD para componentes impresos en 3D se proporcionan en múltiples formatos (Archivo complementario 1), lo que permite la importación a una gama de software CAD comercial y gratuito de código abierto para su modificación y adaptación a las necesidades experimentales. Si el acceso a las impresoras 3D no está disponible para la fabricación, se pueden proporcionar archivos CAD a los servicios de impresión 3D en línea que imprimirán y enviarán las piezas a bajo costo.

Es importante destacar que el complejo musculotendinoso tríceps sura-tendón de Aquiles abarca las articulaciones de la rodilla y el tobillo 71,72,73. En consecuencia, la tensión de tracción en el tendón de Aquiles se ve influenciada por la flexión de la rodilla. La extensión de la rodilla pone el tendón de Aquiles bajo tensión, mientras que la flexión de la rodilla reduce la tensión. Al extender primero la rodilla y luego dorsiflexionar pasivamente el tobillo, las tensiones de compresión en la inserción impactada se pueden superponer a las tensiones de tracción. Por el contrario, al flexionar pasivamente el tobillo con la rodilla flexionada, se reduce la tensión de tracción y queda la tensión de compresión. El protocolo actual explora tres de esas condiciones. 1) Para el pinzamiento estático, el pie se flexiona dorsal a < 110° con respecto a la tibia para incidir la inserción, con la rodilla flexionada para reducir la tensión. 2) Para el grupo de tensión basal, el tobillo se extiende por encima de los 145° de dorsiflexión con la rodilla extendida, generando predominantemente tensión de tracción en la inserción. 3) Para el grupo descargado, los explantes se cultivan en una placa de Petri con la rodilla y el tobillo en posiciones neutras en ausencia de carga aplicada externamente. Los ángulos mencionados anteriormente se miden fotográficamente en relación con un sistema de coordenadas en el que el pie y la tibia son paralelos en un ángulo de 180° y perpendiculares en un ángulo de 90°.

Los pasos clave del protocolo incluyen: 1) la disección de los explantes de las extremidades posteriores y la extracción cuidadosa de la piel y el tendón plantar; 2) cultivo de explantes después de un pretratamiento de 48 h con dexametasona; 3) corte de tejido y tinción histológica; y 4) análisis de imágenes en color para evaluar la formación de fibrocartílago. Después de la disección, cada explante de extremidad posterior se pretrata durante 48 h en medios de cultivo suplementados con dexametasona74. Las extremidades contralaterales de cada ratón se asignan a grupos experimentales separados para su comparación por pares, lo que ayuda a controlar la variabilidad biológica. Después del pretratamiento, los explantes se colocan en plataformas como se describió anteriormente y se cultivan durante 7 días más (Figura 1B). Se realizan comparaciones adicionales con un grupo pretratado (día 0) en el que los explantes se retiran inmediatamente después del pretratamiento de 48 h.

Después del cultivo del explante, las extremidades posteriores se recortan, se fijan en formol, se descalcifican y se incrustan en parafina. El corte en serie en orientación sagital proporciona una visualización del tendón de Aquiles desde la unión miotendinosa hasta la inserción del calcáneo, al tiempo que permite realizar un seguimiento de la profundidad de la sección a través de todo el tendón. El marcaje X-nick de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (TUNEL) se utiliza para visualizar el daño en el ADN secundario a la apoptosis y evaluar la viabilidad. La histología del azul de toluidina y el análisis de imágenes en color personalizadas se realizan para cuantificar los cambios en la tinción de GAG. A continuación, se utilizan secciones de tejido teñidas con azul de toluidina para la obtención de imágenes de SHG con el fin de caracterizar las alteraciones en la organización de las fibras del collage (Figura 1B).

Los resultados representativos proporcionados sugieren una tinción histológica alterada de la matriz rica en GAG y una desorganización de la red de colágeno extracelular generada por 7 días de pinzamiento estático dentro del modelo. Este modelo se puede utilizar para explorar los mecanismos moleculares que subyacen al cambio fibrocartilaginoso impulsado por el pinzamiento.

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Protocol

Todo el trabajo con animales fue aprobado por el Comité de Recursos Animales de la Universidad de Rochester.

1. Preparación de medios de cultivo de tejidos

  1. Cultivar todos los explantes en el Medio Eagle Modificado de Dulbecco (1x DMEM) con 1% v/v de penicilina-estreptomicina y 200 μM de ácido L-ascórbico en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2. Para el pretratamiento inicial de 48 h, se cultivó cada explante en 70 mL de medio de cultivo suplementado con dexametasona 100 nM74. Después del pretratamiento, cultivar las extremidades durante 7 días más sin dexametasona, cambiando de medio cada 48-72 h.
    NOTA: No se recomienda la adición de suero, como suero fetal bovino, a los medios de cultivo de acuerdo con las recomendaciones proporcionadas por Wunderli, Blache y Snedeker57. En resumen, las condiciones sin suero representan mejor el microambiente tendinoso avascular y pobre en nutrientes que existe in vivo. Además, la suplementación con suero puede promover la degradación de los tejidos en determinadas condiciones de cultivo75 y estimular la proliferación celular y la migración fuera de los tejidos, ambas características de la patología tendinosa57.
  2. Para el grupo descargado, cultivar cada explante en 70 mL de medio. Para los grupos de tensión basal y de pinzamiento estático, cada plataforma requiere aproximadamente 125 ml de medio de cultivo para mantener la extremidad sumergida. Este volumen puede variar en función de la posición de la parte superior de la pierna en las empuñaduras y de los parámetros de impresión 3D, principalmente de la densidad del relleno.

2. Disección del explante y pretratamiento con dexametasona

  1. Sacrificar ratones mediante inhalación de CO2 y luxación cervical secundaria, o de acuerdo con las pautas institucionales. Este protocolo utiliza ratones C57BL/6 de menos de 1 año de edad. El tamaño de las extremidades traseras aumentará con la edad y puede resultar difícil de encajar en las empuñaduras.
  2. Antes de la disección, transfiera 70 ml de medio de cultivo precalentado (37 °C) a una placa de Petri de 100 mm (diámetro) x 25 mm (altura) en una cabina de seguridad biológica (BSC) estéril. Agregue dexametasona para lograr una concentración de trabajo de 100 nM.
  3. Las disecciones se pueden llevar a cabo en la mesa de trabajo utilizando almohadillas absorbentes, trabajando rápidamente a través de la disección antes de transferir los explantes de las extremidades posteriores al BSC. Reúna las herramientas quirúrgicas necesarias para esta disección, que incluyen pinzas lisas, rectas y de punta fina; pinzas rectas de punta fina con dientes dentados; y tijeras rectas, afiladas y finas.
  4. Para la disección de los explantes de las extremidades traseras, coloque al ratón en posición supina e identifique la articulación de la cadera. Con unas tijeras finas, haga una pequeña incisión (5-10 mm) a través de la piel que se superponga a la cara proximal y anterior (craneal) de la parte superior de la pierna.
  5. Separe la incisión para expandirla, pellizque la parte superior de la pierna expuesta con los dedos y tire con cuidado de la piel distalmente para depurar la extremidad posterior hasta el nivel del tobillo. Inserte suavemente una hoja de tijera debajo de la piel a lo largo de la cara dorsal del pie y haga una incisión que se extienda hasta los dedos de los pies. Continúe tirando de la piel distalmente para eliminarla por completo.
  6. Coloque el ratón para visualizar la inserción del tendón de Aquiles en la cara posterior (caudal) del calcáneo, cerca del tobillo. Proximal a la inserción del tendón de Aquiles, el tendón plantar se encuentra directamente adyacente al borde medial del tendón de Aquiles y se extiende distalmente hacia la cara plantar del pie, pasando por encima de la cara posterior del calcáneo.
  7. Para extraer el tendón plantar, inserte con cuidado una punta de las pinzas de punta fina y lisa entre los dos tendones y extienda la punta medialmente pasando por debajo del tendón plantar. Dibuja la punta proximalmente y desgarra el músculo plantar. Con pinzas dentadas de punta fina, agarre el extremo proximal separado del tendón plantar y tire distalmente para retirarlo.
  8. En la articulación de la cadera, use unas tijeras finas para cortar la pelvis y aislar la extremidad posterior. Usa las tijeras para sacar la pelvis restante y exponer la cabeza femoral.
  9. Transfiera el explante de la extremidad posterior al BSC y a la placa que contiene los medios de cultivo celular con dexametasona. Coloque el plato en la incubadora y pretrátelo durante 48 h.

3. Cultivo de explantes y plataformas de carga

  1. Al concluir el pretratamiento de 48 h, precalentar volúmenes suficientes de medios de cultivo (sección 1). A partir de este momento, no se añadirá dexametasona a los medios de cultivo. En este momento, las extremidades del grupo pretratado (día 0) se pueden fijar, descalcificar e incrustar en parafina para futuras secciones, tinciones y análisis.
  2. Para el grupo descargado, aspire los medios de pretratamiento y transfiera los explantes a placas de Petri frescas, agregue 70 ml de medios de cultivo cada uno y regrese a la incubadora.
  3. Para los grupos de tensión de referencia y de impacto estático, prepare las plataformas de explante. Corta pedazos de papel de lija de tamaño similar a los platos de agarre. Para el grupo de impacto estático, corte trozos de línea trenzada de aproximadamente 18 pulgadas de largo y haga previamente un nudo simple suelto a la mitad a lo largo de la línea. Rasga trozos de papel de aluminio para cubrir cada baño acrílico y rocía con etanol al 70% (EtOH). Transfiera los preparativos al BSC.
  4. Cada plataforma incluye un baño acrílico, una base, un inserto de reducción de volumen, un clip y agarres. Cada empuñadura incluye dos platinas y tres tipos diferentes de tornillos, incluido un tornillo M5 x 0,8 mm de rosca x 10 mm de largo que une las mordazas a la base; dos tornillos M6 x 1 mm de rosca x 20 mm de largo que prolongan las platinas para sujetar las empuñaduras; y cuatro tornillos M3 x 0,5 mm de rosca x 14 mm de longitud que, en combinación con cuatro muelles de compresión, retraen las platinas para abrir las empuñaduras.
  5. Coloque todos los componentes en contenedores secundarios capaces de capturar todos los medios de cultivo en caso de fuga. Sumergir en ≥ solución de lejía al 10% y dejar en remojo durante al menos 1 h. Enjuague la solución de lejía con agua del grifo (autoclave según sea necesario) y muévase al BSC.
    NOTA: Para solucionar problemas de contaminación, considere esterilizar en autoclave toda el agua del grifo o usar agua purificada. Consulte la Discusión para obtener consejos adicionales sobre cómo abordar la contaminación.
  6. Utilice los tornillos M3 y los resortes de compresión para fijar las platinas a las mordazas, asegure las mordazas a la base con el tornillo M5 e inserte los tornillos M6 hasta que encajen en las placas. Use cinta adhesiva de doble cara para sujetar el papel de lija a los platos, luego cierre las empuñaduras para promover la adhesión del papel de lija a los platos. Repita el procedimiento para todas las plataformas.
  7. Cuando esté listo para cargar una plataforma, abra completamente las empuñaduras y, con unas pinzas, coloque la parte superior de la pierna y la rodilla entre las platinas con la superficie superficial del tendón de Aquiles hacia arriba (Figura 1A). Cierre las empuñaduras sin apretar para mantenerlas suavemente en su lugar.
  8. Use fórceps para agarrar la cabeza o el pie femoral expuesto y manipule el ángulo de flexión de la rodilla a medida que cierra gradualmente las empuñaduras para asegurarlas en su lugar. Para el grupo de tensión basal, extienda la articulación de la rodilla como se describió anteriormente. A medida que los agarres se aprietan con la rodilla extendida, el tobillo debe extenderse naturalmente. Para el grupo de impacto estático, flexione la articulación de la rodilla entre las empuñaduras como se describió anteriormente.
  9. Para el grupo de impacto estático, coloque el nudo simple de la cuerda alrededor de la pata distal y apriete. Pase la cuerda a través de una ranura en la base ubicada debajo del explante y a través del orificio del clip. Coloque la base en el baño acrílico y asegure el clip al borde superior del baño (Figura 1A).
  10. Tire de la cuerda para dorsiflexionar el pie al menos 110° con respecto a la tibia y use un marcador permanente para marcar la cuerda a medida que sale del clip. Tome una fotografía del explante en esta posición para luego cuantificar el ángulo de dorsiflexión (Figura 1A).
  11. Retire la base y coloque el inserto de reducción de volumen deslizándolo a lo largo de un riel en la base. Vuelva a colocar la base (ahora unida al inserto de reducción de volumen) en el baño acrílico y vuelva a colocar el clip en el borde superior. Tire de la cuerda para volver al ángulo de dorsiflexión original usando la cuerda marcada como guía y asegure la cuerda al exterior de la bañera con cinta adhesiva para mantener la dorsiflexión estática.
  12. Para el grupo de tensión de referencia, simplemente coloque la base con el inserto de reducción de volumen en el baño acrílico una vez que el explante esté colocado entre las mordazas y tome una fotografía para cuantificar el ángulo de dorsiflexión.
  13. Agregue 125 mL de medio de cultivo precalentado (37 °C) a cada plataforma para sumergir los explantes. Cubra la parte superior del baño con papel de aluminio, colóquelo en un recipiente secundario y muévalo a la incubadora. Cultivo durante 7 días adicionales, cambiando de medio cada 48-72 h.
    NOTA: La cinta adhesiva colocada en la parte superior del baño puede evitar que las piezas de PLA floten.

4. Fijación, descalcificación e inclusión en parafina

  1. Después del cultivo del explante, use unas tijeras para cortar las uñas de los pies o los dedos distales y corte la parte superior de la pierna proximal a la unión miotendinosa del tendón de Aquiles. Coloque cada articulación del tobillo recortada en un casete de procesamiento forrado con almohadillas de biopsia de espuma. Empuje el tobillo en la esquina del cassette para colocar el tobillo en una dorsiflexión de aproximadamente 90° y cierre el cassette para mantenerlo en su lugar.
  2. Fijar durante 3 días en formalina tamponada neutra (NBF) al 10% y descalcificar durante 2 semanas en ácido etilendiamenetetraacético (EDTA) al 14% disuelto en agua destilada (diH2O) con pH ajustado a 7,4-7,6 con ácido acético glacial.
  3. Para eliminar las sales, enjuague bien las muestras tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x seguida de diH2O, 5 minutos cada una. Realice el procesamiento rutinario de muestras para la histología de la parafina: deshidrate a través de una serie graduada de EtOH, se aclare en xileno e infílese con cera de parafina. Oriente e incruste las muestras en parafina para obtener secciones de tejido sagital a través del tendón de Aquiles en progresión medial a lateral, como se describe en la sección 5 a continuación (Figura 1B).

5. Seccionamiento de tejidos

  1. Con un micrótomo, recorte con cuidado la muestra hasta que las secciones queden paralelas a la cara del bloque. Recorte macroscópicamente en el tobillo desde la cara medial de la articulación, deteniéndose antes de llegar al borde medial de la inserción del tendón de Aquiles.
  2. Transfiera la muestra a un bloque de hielo para ajustar la temperatura y la hidratación, y cambie las cuchillas (o cambie a una sección nueva de la cuchilla actual). Continúe seccionando la muestra con un espesor de 10 μm e identifique cuidadosamente la entrada en la inserción del tendón de Aquiles con un microscopio de campo claro. Una vez identificado, realice un corte en serie con el número de sección de seguimiento (es decir, la profundidad del tejido) a través de toda la inserción del tendón de Aquiles.

6. Desparafinación/rehidratación y selección de portaobjetos

  1. Para cada ensayo que se indica a continuación, seleccione secciones de tejido de cada par de extremidades contralaterales que coincidan con el nivel. Antes de la tinción, colóquelo en una rejilla de portaobjetos y muévase a través de 3 cambios de xileno, 2 cambios de 100% de EtOH, 2 cambios de 95% de EtOH y 1 cambio de 70% de EtOH, 5 min cada uno. Terminar de rehidratar en diH2O.

7. TUNEL para evaluar la viabilidad del tendón de Aquiles

  1. Para el etiquetado TUNEL, tiñe según el protocolo del fabricante. Incubar en 20 μg/ml de proteinasa K durante 20 min a temperatura ambiente y enjuagar en diH2O. Incubar en 50 μl de solución de tinción TUNEL (5 μl de solución enzimática, 45 μl de solución de etiqueta) durante 1 h a 37 °C. Enjuague en diH2O. Monte con reactivo antidecoloración que contenga DAPI y cubreobjetos.
  2. Imagine la inserción del tendón de Aquiles utilizando un microscopio de fluorescencia con una lente de objetivo de 4x. Incluya un canal DAPI (longitudes de onda de excitación/emisión = 360/460 nm) para visualizar todos los núcleos, un canal TUNEL (TMR Red) (longitudes de onda de excitación/emisión = 540/580 nm) para visualizar núcleos apoptóticos y, si es posible, un canal de campo claro.
  3. Para el análisis de imágenes, importe imágenes a un software de análisis de imágenes adecuado para el procesamiento basado en el ROI, como FIJI/ImageJ o MATLAB. Defina una región de interés (ROI) que describa todo el tendón de Aquiles a la vista (Figura 2A), excluyendo las células del epitenón que son altamente susceptibles a la muerte inducida por disección y cambio repentino en las condiciones ambientales cuando se colocan en cultivo.
  4. Para ello, realice la selección del ROI en MATLAB importando la imagen de campo claro y utilizando la función drawpolygon() para trazar y delimitar los límites del tendón. MATLAB crea un objeto Polygon para el ROI, que luego se puede aplicar a las imágenes de canal DAPI y TUNEL para enmascarar los datos de intensidad de píxeles fuera del ROI mediante createMask() para analizar solo los núcleos dentro del tendón de Aquiles.
  5. Importe las imágenes de los canales DAPI y TUNEL e identifique un umbral de intensidad de fluorescencia para definir núcleos apoptóticos (TUNEL+) normalizando a la intensidad de fluorescencia máxima de los núcleos apoptóticos en tejidos no viables como hueso, músculo o grasa que se capturan incidentalmente en la sección de tejido. Una vez enmascaradas las imágenes, calcule la fracción de núcleos apoptóticos (núcleos TUNEL+/núcleos DAPI) dentro del tendón de Aquiles.

8. Histología del azul de toluidina para caracterizar la formación de fibrocartílago

  1. Una vez rehidratado (Sección 6), transfiera la rejilla de portaobjetos con secciones de tejido niveladas de pares contralaterales de explantes a 0,4% p/v de azul de toluidina O en tampón de acetato de sodio 0,1 M con pH ajustado a 4,0 utilizando ácido acético glacial. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego enjuagar 3 veces en diH2O durante 30 s cada uno.
  2. Deshidratar a través de tres cambios de 95% de EtOH y dos cambios de 100% de EtOH, 30 s cada uno. Aclarar a través de tres cambios de xileno, 1 min cada uno. Cubreobjetos con medio de montaje a base de xileno.
  3. Obtenga imágenes en color rojo-azul-verde (RGB) de 24 bits de la inserción del tendón de Aquiles. Por ejemplo, para este protocolo, utilice un adaptador para conectar una cámara digital a color con el ocular de un microscopio de campo claro simple con un objetivo 4x.
  4. Para cuantificar las diferencias en la tinción con azul de toluidina dentro del fibrocartílago tendinoso compresivo (CTF)16 en la inserción del tendón de Aquiles (Figura 3A, B), importe imágenes RGB a un software de análisis de imágenes capaz de definir y gestionar múltiples ROI. Las opciones incluyen las selecciones y las herramientas de gestión de ROI en FIJI/ImageJ o la caja de herramientas de procesamiento de imágenes en MATLAB. Comience configurando la escala de píxeles/longitud.
    NOTA: La elección del software se deja a discreción del investigador y, desde luego, no se limita a MATLAB o FIJI/ImageJ. Los autores han proporcionado código de MATLAB (Archivo complementario 2), documentación que describe la implementación (archivo complementario 3) y una imagen de muestra (Archivo complementario 4). Alentamos a los investigadores a traducir este código a lenguajes de programación alternativos para su uso en otro software según sea necesario o preferido.
  5. Con la imagen mostrada en el software de su elección, identifique la intersección del borde profundo del tendón con el calcáneo. A partir de aquí, trace proximalmente 800 μm a lo largo del borde profundo del tendón para establecer el límite profundo del CTF. Por ejemplo, utilice la función drawpolyline() en MATLAB para dibujar de forma interactiva una polilínea sobre la imagen RGB. MATLAB crea un objeto Polyline que contiene los vértices de la línea, que se puede procesar y recortar hasta una longitud de 800 μm.
  6. Desde esta posición, cree el límite proximal del CTF dibujando un segmento de línea que se conecte con el borde del tendón superficial que sea perpendicular a la orientación de la fibra local.
  7. Retroceda a la intersección del borde tendinoso profundo y el calcáneo y defina el límite distal del CTF dibujando un segmento de línea que se conecte con el borde tendinoso superficial a lo largo de la marca de marea distintiva que separa el CTF del fibrocartílago de la zona de unión (AZF)16 (Figura 3A, B). Por último, genere el límite superficial del CTF trazando el borde tendinoso superficial que se va a encerrar.
  8. Para describir las variaciones espaciales en la tinción de GAG a lo largo de la inserción, divida el CTF total en 4 cuadrantes (Figura 3A, B). Conecte el punto medio de los límites CTF profundos y superficiales con un segmento de línea para crear un límite distal/proximal. Pasando por el punto medio de este límite, conecte los puntos medios de los límites CTF distal y proximal a lo largo de la orientación de la fibra para crear un límite superficial/profundo.
  9. Estos 6 límites proporcionan información que se puede utilizar para definir el ROI que representa todo el CTF, pero también 4 cuadrantes que subdividen el CTF. En MATLAB, por ejemplo, compile vértices que definan los límites de cada ROI individual (CTF, cuadrantes 1-4) en vectores y utilice images.roi.Polygon() para generar objetos Polygon cerrados para cada ROI.
  10. Con los ROI definidos, transforme los datos de píxeles RGB en el espacio de color Hue-Saturation-Value (HSV) utilizando el complemento de transformador de color en FIJI, la función rgb2hsv() en MATLAB u otro software que aplique las ecuaciones de transformación adecuadas76. Los datos HSV se pueden proyectar en el espacio de tono-saturación 2D, donde cada combinación de tono y saturación codifica un color único (Figura 3C).
  11. Dentro de cada ROI, calcule el tono y la saturación promedio que describen el color promedio de la mancha en el ROI. Esto se puede lograr en MATLAB, por ejemplo, utilizando los objetos Polygon que definen cada ROI para enmascarar la imagen mediante createMask() con el fin de analizar los datos de píxeles de saturación de tono específicamente dentro de cada ROI.
  12. Defina otro pequeño ROI dentro del fibrocartílago perióstico (PF)16 (Figura 3A, B) y calcule el tono y la saturación promedio. A continuación, calcule la distancia euclidiana que separa el color medio de cada ROI del CTF al del PF (Figura 3C).
    Equation 1
    NOTA: El cálculo de la distancia euclidiana describe el grado de similitud entre el color promedio del ROI y el del PF, un tejido fibrocartilaginoso por excelencia 16,17,77. Una distancia euclidiana más pequeña indica un color ROI que es más fibrocartilaginoso en apariencia.
  13. Utilice esta distancia para calcular la puntuación del fibrocartílago, que supone un valor máximo de 1 si el color del ROI es idéntico al color PF y un valor mínimo de -1 si el color ROI y el color PF alcanzan la separación máxima dentro del espacio de color de saturación de tono.
    Equation 2
  14. Los datos promedio para el tono, la saturación y la puntuación del fibrocartílago dentro de cada ROI en las secciones de tejido de cada extremidad. Realizar comparaciones estadísticas pareadas entre grupos de extremidades contralaterales.

9. Imágenes SHG para investigar el cambio en la organización de la red de colágeno

  1. Realice imágenes SHG de las secciones teñidas con azul de toluidina utilizando un sistema de microscopio capaz con una lente de objeto de 20x. Adquiera pilas z a través del grosor de la sección y realice el escaneo de baldosas según sea necesario para capturar completamente la inserción del tendón de Aquiles.
  2. Importe imágenes SHG a un software de análisis de imágenes preferido y defina ROI que abarquen y subdividan el CTF en la inserción del tendón de Aquiles, como se describe para el análisis de imágenes de azul de toluidina en la sección 8 (Figura 4A, B).
  3. Si se importan imágenes SHG a MATLAB, utilice el enfoque para definir el ROI de CTF en MATLAB, tal y como se describe en la sección 8. Después de definir las ROI, transfiera las coordenadas de ROI a FIJI exportando los vértices de ROI de MATLAB como archivos .txt e importándolos a FIJI mediante File > Import > XY Coordinates. Superponga la selección y envíela al administrador de ROI para su análisis.
  4. Para cuantificar la organización del colágeno, utilice el complemento Directionality en FIJI, que realiza un análisis del espectro de Fourier para calcular las distribuciones de las orientaciones de las fibras en ventanas pequeñas que abarcan un ROI. La dispersión de esta distribución, denominada dispersión, está inversamente relacionada con la alineación de las fibras.
    NOTA: Las fibras de colágeno pueden asumir orientaciones variables en diferentes ventanas a lo largo del CTF debido a la curvatura macroscópica del tendón en lugar de la ausencia de alineación/organización. Para distinguir mejor los cambios en la organización del colágeno de la curvatura macroscópica del tendón en la inserción, es necesario definir ROI más pequeños.
  5. Importe imágenes SHG en FIJI y establezca la escala de píxeles/longitud. Proyecte datos de intensidad de píxeles máximos en una imagen compuesta 2D y agregue ROI al Administrador de ROI. Superponga secuencialmente cada ROI de CTF en la imagen y dibuje 10 pequeños sub-ROI de tamaño consistente dentro del ROI, agregando los sub-ROI al administrador de ROI.
  6. Dentro de cada sub-ROI, ejecute el complemento de direccionalidad en FIJI para calcular la dispersión de la fibra. Datos de dispersión promedio a través de sub-ROI dentro de cada ROI de CTF, y datos de dispersión promedio dentro de cada ROI de CTF en las secciones de cada explante. Realizar comparaciones estadísticas pareadas entre grupos de extremidades contralaterales.

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Representative Results

Las imágenes representativas de las secciones de tejido teñidas con TUNEL demuestran núcleos apoptóticos mínimos dentro del cuerpo del tendón de Aquiles después de 7 días de cultivo de explantes en grupos experimentales (Figura 2A). La cuantificación de estas imágenes proporciona evidencia de que el protocolo de cultivo de tejidos mantiene hasta un 78% de viabilidad en promedio dentro del tendón de Aquiles después de 7 días de cultivo de explantes en condiciones de carga (Figura 2B).

Cualitativamente, se aprecia una tinción mejorada con azul de toluidina después de 7 días de pinzamiento estático en comparación con los controles sin carga (Figura 3A,B), particularmente en cuadrantes profundos adyacentes al calcáneo donde previamente hemos medido la deformación compresiva transversal máxima 5,6. La cuantificación de estas secciones de tejido teñidas con azul de toluidina indica un cambio significativo en el tono (Figura 3D), la saturación (Figura 3E) y la puntuación del fibrocartílago (Figura 3F) después de 7 días de pinzamiento estático en comparación con los explantes contralaterales descargados. Esta tinción alterada de GAG probablemente representa la formación de fibrocartílago secundaria al pinzamiento estático dentro de este modelo. Las diferencias estadísticamente significativas en la saturación y la puntuación de fibrocartílago solo se detectaron en el cuadrante 1 después de 7 días de tensión basal (Figura 3E,F). Además, la saturación y la puntuación del fibrocartílago disminuyeron en relación con los tendones descargados contralaterales, una tendencia opuesta en comparación con el pinzamiento estático. Estos datos pueden respaldar la hipótesis de que la carga de tracción puede atenuar o revertir la formación de fibrocartílago impulsada por el pinzamiento y justifica una investigación adicional en el futuro.

La cuantificación de las imágenes de SHG sugiere un cambio sutil pero significativo en la orientación de las fibras de colágeno después de 7 días de pinzamiento estático, nuevamente en la región profunda y distal adyacente al calcáneo, como lo indican las diferencias significativas en la dispersión (Figura 4C).

Figure 1
Figura 1: Plataforma de explante y diseño experimental. (A) Representación fotográfica y esquemática de la plataforma de explante. (Arriba) Fotografía de un explante de extremidad trasera murina entera cargado en la plataforma, con los componentes críticos etiquetados. (Abajo) Esquema que representa el pinzamiento del tendón de Aquiles de inserción provocado por la dorsiflexión del tobillo aplicada pasivamente en este modelo de explante. (B) Esquema del diseño del estudio y cultivo del explante. Los explantes de las extremidades posteriores se pretratan con dexametasona 100 nM durante 48 h74. De cada ratón, un explante de la extremidad posterior se cultiva en una placa descargada durante 7 días, mientras que la extremidad contralateral se carga en la plataforma experimental para colocar el tendón de Aquiles bajo tensión basal o pinzamiento estático durante 7 días. Las secciones seriadas de tejido de pares contralaterales de extremidades se tiñen con azul de toluidina para visualizar el tejido rico en GAG o se utilizan para la tinción de TUNEL. A continuación, se utilizan secciones teñidas con azul de toluidina para obtener imágenes de SHG para evaluar la organización del colágeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Viabilidad del explante. (A) Imágenes representativas de secciones teñidas con TUNEL de explantes pretratados (día 0) (arriba a la izquierda), tendones descargados (arriba a la derecha), tendones mantenidos a tensión basal (abajo a la izquierda) y tendones con impacto estático (abajo a la derecha). El tendón de Aquiles está delineado en una línea blanca discontinua y etiquetado como AT, mientras que el calcáneo está delineado en una línea amarilla sólida y etiquetado como C. Los núcleos apoptóticos aparecen rojos (TUNEL), todos los núcleos aparecen azules (DAPI). (B) La cuantificación de la fracción de células muertas fue, en promedio, inferior al 22% para los grupos sin carga, tensión basal y pinzamiento estático. Los datos representan la media ± la desviación estándar. Los valores atípicos están presentes en estos conjuntos de datos con más del 50% de muerte celular, lo que puede atribuirse al daño tendinoso inducido por una técnica de disección deficiente. La fracción media de células muertas con valores atípicos estadísticos eliminados es inferior al 15% para todos los grupos. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la muerte celular entre los grupos sin carga, tensión basal y pinzamiento estático (p < 0,05). Control día 0: n=8. Descargado: n=18. Tensión basal: n=8. Impacto estático: n=12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Histología del azul de toluidina. (A) Tinción representativa de azul de toluidina después de 7 días de cultivo descargado que muestra el fibrocartílago tendinoso compresivo (CTF), el fibrocartílago de la zona de unión (AZF) y el fibrocartílago perióstico (PF) en la inserción del tendón de Aquiles16. El calcáneo marcado como C. El ROI que captura el CTF se delinea en rojo y se subdivide en 4 cuadrantes para proporcionar información espacial adicional. (B) Tinción representativa de azul de toluidina después de 7 días de pinzamiento estático, con tinción aumentada de la CTF, especialmente en el cuadrante 1 donde previamente hemos medido deformaciones de compresión transversal máxima 5,6. (C) Esquema del espacio de color de tono-saturación utilizado para el análisis de imágenes en color. El color se describe mediante una combinación de tono (0°-360°) y saturación (0-255)76. El color promedio en cada ROI se normaliza al color promedio del PF calculando la distancia euclidiana que separa los colores en cada ROI del color en el PF, lo que proporciona una puntuación normalizada de fibrocartílago. (D-F) Cambios en la tinción azul de toluidina después de 7 días de pinzamiento estático (arriba) y tensión basal (abajo) en comparación con los tendones contralaterales descargados. Los datos representan la media ± la desviación estándar. (D) La cuantificación del tono indica diferencias significativas en el tono promedio en todas las regiones después de 7 días de pinzamiento estático en comparación con los tendones contralaterales descargados. No se detectó una tendencia similar después de 7 días de tensión basal en comparación con los tendones descargados contralaterales. (E) Cuantificación de la saturación, con cambios significativos en la saturación promedio en todo el CTF y dentro de los cuadrantes 1-3 después de 7 días de pinzamiento estático en comparación con los tendones descargados contralaterales. Por el contrario, solo se detectaron diferencias significativas en el cuadrante 1 después de 7 días de tensión basal, donde la saturación disminuyó en comparación con los tendones contralaterales descargados. (F) Cuantificación de la puntuación del fibrocartílago, con cambios significativos en la puntuación del fibrocartílago en todas las regiones después de 7 días de pinzamiento estático en comparación con los tendones contralaterales descargados. Por el contrario, solo se detectaron diferencias significativas en el cuadrante 1 después de 7 días de tensión basal, donde la puntuación del fibrocartílago disminuyó en comparación con los tendones contralaterales descargados. Los datos sugieren un aumento de la tinción de GAG provocada por el pinzamiento estático, lo que indica un aumento de la formación de fibrocartílago. Los datos que describen el CTF total se compararon mediante pruebas de rangos con signo de pares emparejados de Wilcoxon. Los datos de los cuadrantes se compararon utilizando ANOVA de dos vías de medidas repetidas con la prueba de comparaciones múltiples de Šídák. *p < 0,05. **p < 0,01. p < 0,005. p < 0,001. Tensión basal vs. descarga: n = 6 pares. Impacto estático vs. descargado: n = 8 pares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes de SHG. (A) Imagen representativa de SHG después de 7 días de cultivo descargado en comparación con (B) 7 días de pinzamiento estático. El CTF se delinea en rojo y se divide en 4 cuadrantes como se indica, de acuerdo con los ROI en el análisis de azul de toluidina anterior. (C) Dentro de cada cuadrante, el análisis del espectro de Fourier se realizó en una subventana móvil utilizando el complemento de direccionalidad en FIJI. La distribución de las orientaciones de las fibras dentro de cada subventana se denomina dispersión (°) y está inversamente relacionada con la alineación de las fibras. La dispersión = 0° representa una alineación paralela perfecta de las fibras. El aumento de la dispersión representa la disminución de la alineación de las fibras de colágeno. Los datos representan la media ± la desviación estándar. Se detectaron diferencias estadísticamente significativas en la dispersión en el cuadrante 1 después de 7 días de pinzamiento estático en comparación con los tendones descargados contralaterales, lo que sugiere una mayor desorganización del colágeno. Los datos de los cuadrantes se compararon utilizando ANOVA de dos vías de medidas repetidas con la prueba de comparaciones múltiples de Šídák. * p < 0,05. Impacto estático vs descargado: n = 5 pares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Archivos CAD. Estos archivos CAD, compilados en múltiples formatos de archivo, se pueden utilizar para imprimir en 3D la base de la plataforma, el inserto de reducción de volumen y el clip. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero complementario 2: Ficheros de MATLAB. Los archivos compilados de MATLAB permiten cuantificar la histología del azul de toluidina, tal y como se describe en la sección 8 del protocolo, para evaluar la formación de fibrocartílago a través del cambio espacial en la tinción de GAG en la inserción del tendón de Aquiles. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Directrices para la implementación de código de MATLAB. En este documento se describe una canalización para cuantificar los cambios en la tinción de GAG en la inserción del tendón de Aquiles mediante el análisis de imágenes de la histología del azul de toluidina utilizando el código de MATLAB proporcionado. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Imagen de muestra de la histología del azul de toluidina. Esta imagen en color RGB de la histología del azul de toluidina se puede utilizar para ejecutar el código de MATLAB proporcionado. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La plataforma experimental de explante de extremidades posteriores murinas, junto con el protocolo de cultivo de tejidos descrito en este estudio, proporciona un modelo adecuado para estudiar la mecanobiología de la formación de fibrocartílago impulsada por el pinzamiento en la inserción del tendón de Aquiles. La utilidad de este modelo de explante queda demostrada por los resultados representativos, que indican el mantenimiento de la viabilidad celular concomitante con un cambio significativo y espacialmente heterogéneo en la tinción con azul de toluidina después de 7 días de pinzamiento estático. Estos hallazgos sugieren una alteración del metabolismo de las moléculas de la matriz rica en GAG secundaria al pinzamiento mecánico, consistente con otros modelos y estudios clínicos 3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,44,49. Además, se detectaron cambios sutiles pero significativos en la organización del colágeno a través de imágenes SHG después de 7 días de pinzamiento estático, consistentes con las características clínicas de la tendinopatía asociada al pinzamiento y los modelos in vivo de pinzamiento tendinoso 28,37,38,43,44,49,64.

Los esfuerzos previos para explorar las secuelas biológicas del pinzamiento tendinoso han aplicado compresión simple a células tendinosas aisladas27,29. Una vez que se ha identificado un mecanismo mecanobiológico de interés, estos modelos proporcionan plataformas de cribado terapéutico superiores en comparación con nuestro modelo de explante. Sin embargo, los hallazgos de estos estudios deben ser interpretados con cautela, ya que las células aisladas cultivadas in vitro carecen de un ambiente extracelular tridimensional que influya en la mecanorespuesta57,59. Además, las células aisladas de otros tejidos colágenos (p. ej., cartílago) muestran una actividad alterada de los canales iónicos mecanosensibles cuando se desafian mecánicamente in vitro en ausencia de un entorno extracelular78,79. El modelo presentado aborda estas limitaciones al proporcionar una plataforma para someter células tendinosas in situ dentro de explantes viables a condiciones de carga fisiológicamente relevantes.

Los modelos de explantes son sistemas experimentales populares para sondear la biología y fisiología de los tendones57,58. En el contexto específico del pinzamiento tendinoso, varios estudios previos han empleado explantes parciales y enteros del tendón para explorar la respuesta de las células tendinosas a la compresión uniaxial artificial 30,31,32,33,34,39. Si bien estos estudios demostraron una relación directa entre la compresión uniaxial y la formación de fibrocartílago, el entorno de tensión mecánica in vivo generado por el pinzamiento del tendón es multiaxial y depende de las características anatómicas de la región afectada 5,6. Por ejemplo, el entorno de tensión creado por el pinzamiento del calcáneo sobre el tendón de Aquiles durante la dorsiflexión del tobillo está influenciado por el ángulo de inserción, el área de inserción y la presencia de tejidos blandos circundantes 60,61,62,63,80,81. Nuestra plataforma de explantes preserva estas estructuras externas y reproduce el entorno de deformación multiaxial generado por el pinzamiento, manteniendo las células dentro de su entorno nativo6.

Los modelos animales han sido fundamentales para fundamentar una relación inmediata entre el pinzamiento mecánico y las características por excelencia del fibrocartílago tendinoso y la patología, que comparten fenotipos análogos 1,25,28,37,64,65,66. En las últimas décadas, la mayoría de las investigaciones in vivo sobre el pinzamiento han utilizado modelos de roedores para estudiar la enfermedad del manguito rotador a través de la reducción quirúrgica del espacio subacromial para incidir artificialmente los tendones del manguito rotador. Estos modelos animales se han utilizado para describir la patogénesis celular y molecular de la tendinopatía por pinzamiento in vivo y pueden extenderse para evaluar nuevas estrategias terapéuticas para promover la traslación clínica de la investigación sobre pinzamiento 36,37,38,66,82,83,84,85.

Sin embargo, los modelos establecidos in vivo de pinzamiento tendinoso tienen varias limitaciones importantes en el estudio de la mecanobiología57,58. Estos modelos introducen o extirpan quirúrgicamente una fuente externa de pinzamiento del tendón y reanudan la actividad física (actividad en jaula libre, carrera forzada en cinta rodante, etc.) Este enfoque carece de control sobre la magnitud, la orientación y la frecuencia de la fuerza aplicada directamente al tendón a lo largo de la duración del experimento. Dada la dificultad de medir la deformación tisular in vivo, estos modelos ofrecen un control limitado o una caracterización del entorno mecánico generado dentro del tendón en respuesta al pinzamiento. Esta limitación es bien reconocida en el campo de la investigación en mecanobiología de tendones 57,58,67,68,69,70. En otros lugares, se han diseñado sofisticadas plataformas experimentales para aplicar sobrecarga mecánica controlada (fatiga) directamente a los tendones in vivo bajo anestesia 67,68,69. Estos modelos controlan la aplicación de estímulos mecánicos durante períodos cortos bajo anestesia y no ofrecen control sobre el historial de carga durante el resto del experimento, ya que los animales reanudan la actividad normal de la jaula durante días o semanas después de la sobrecarga mecánica. El modelo de explante descrito en este protocolo ofrece una prescripción controlada del pinzamiento del tendón de Aquiles para generar patrones medibles y bien descritos de la deformación tisular6, lo que permite un estudio riguroso de la mecanobiología del pinzamiento. Cabe señalar, sin embargo, que este modelo de explante no obvia la necesidad de una investigación in vivo del pinzamiento tendinoso, sino que sirve como una herramienta complementaria para enriquecer los datos derivados de estos modelos animales indispensables. Las vías celulares y moleculares definidas en relación con la mecánica de impacto utilizando este modelo de explante pueden caracterizarse in vivo y evaluarse como dianas terapéuticas utilizando modelos animales en un enfoque complementario para mejorar la traslación clínica de la investigación mecanobiológica. El poder de esta estrategia integrada está siendo explotado en otros ámbitos de la investigación de la mecanobiología del tendón 58,86,87,88, y este modelo de explante otorga su aplicación al pinzamiento del tendón.

El modelo de explante no está exento de limitaciones. Al igual que con todos los modelos de explantes, la mecanobiología solo puede estudiarse en escalas de tiempo relativamente cortas mientras el tejido siga siendo viable57,89. Si bien el modelo es una herramienta poderosa para estudiar la respuesta celular inmediata al pinzamiento mecánico, no es adecuado para estudiar la enfermedad crónica del tendón asociada con el pinzamiento. Además, el modelo no puede tener en cuenta la respuesta sistémica y la diafonía tisular, ya que el suministro de sangre y la comunicación neuronal no se mantienen. Sin embargo, el modelo proporciona una plataforma para delinear la respuesta intrínseca de las células tendinosas endógenas al pinzamiento mecánico. Una limitación adicional del modelo es que, de acuerdo con investigaciones previas 32,90,91,92, esperamos que muchos proteoglicanos grandes ricos en GAG se difundan fuera del tendón durante el pretratamiento y los primeros puntos de tiempo del cultivo de explantes, particularmente fragmentos de proteoglicanos agregados no anclados a la matriz fundamental. Por lo tanto, es probable que los cambios en la tinción de GAG secundarios al pinzamiento en el modelo reflejen cambios en macromoléculas ricas en GAG recién sintetizadas que aún no se han catabolizado y permanecen ancladas dentro de la matriz extracelular. Dado que estos proteoglicanos ricos en GAG se localizan en el espacio pericelular 22,30,93,94,95, el modelo de explante puede facilitar la investigación de la remodelación de la MCP secundaria al pinzamiento tendinoso.

La disección de explantes de extremidades posteriores murinas descrita en este protocolo requiere práctica, pero se puede lograr rápidamente una técnica competente. El desguante completo (es decir, la eliminación de la piel) puede resultar un desafío, particularmente alrededor de los dedos de la pata trasera. Si bien no es necesario eliminar por completo la piel alrededor de los dedos de los pies, refuerza la esterilidad durante el cultivo, ya que las bacterias están presentes en la piel y el pelaje.

El aspecto más difícil de la disección es la extirpación del tendón plantar medial al tendón de Aquiles proximalmente y el paso superficial al tendón de Aquiles distalmente. La unidad músculo-tendón plantar abarca las articulaciones de la rodilla y el tobillo en estrecha asociación con el tríceps sural y el tendón de Aquiles 81,96,97,98,99. Las cargas mecánicas transferidas a través de la cara posterior del tobillo durante la dorsiflexión pasiva del tobillo se distribuyen entre los tendones plantar y de Aquiles, y se sabe que el tendón plantar soporta un alto estrés in vivo100,101. Además, la variabilidad anatómica en el plantar humano está bien descrita 96,102,103 y aunque esta variabilidad es menos prevalente en roedores97, tiene la propensión a afectar el ambiente mecánico dentro del tendón de Aquiles in situ. De acuerdo con las técnicas anteriores utilizadas para medir la tensión dentro del tendón de Aquiles in situ 6,104, el tendón plantar debe extirparse para controlar el entorno de tensión interna generado por el pinzamiento del tendón aplicado externamente.

Es necesaria una extirpación cuidadosa del plantar para evitar la muerte celular inducida por la disección en el tendón de Aquiles, y la variabilidad en la apoptosis celular presente en los datos (Figura 2B) puede reflejar el daño inducido por la disección debido a una técnica de disección deficiente. La extirpación del tendón plantar se beneficia de unas pinzas de punta fina para separar cuidadosamente el plantar del tendón de Aquiles y liberar el complejo músculo-tendón plantar proximalmente. Las pinzas dentadas ayudan a agarrar el extremo libre proximal del tendón plantar para tirar distalmente, alrededor del calcáneo y hacia los dedos de la pata para una extracción completa. Lee y Elliott proporcionan una descripción anatómica útil de los tendones plantares y de Aquiles de la rata y de la musculatura asociada97.

Si bien encontramos que la técnica de disección descrita en este estudio es suficiente para garantizar la esterilidad, el protocolo se puede ajustar o modificar según sea necesario en entornos donde el mantenimiento de la esterilidad resulta un desafío. Las herramientas quirúrgicas se pueden esterilizar en autoclave, la solución de betadine se puede aplicar tópicamente sobre la piel y la disección se puede llevar a cabo en una cabina de seguridad biológica. Hemos descubierto que la disección rápida y eficiente en el banco de trabajo es fundamental y permite que las extremidades diseccionadas se transfieran rápidamente a medios estériles en una cabina de seguridad biológica después de que se rompe el límite estéril proporcionado por la piel.

Otro objetivo principal para la resolución de problemas de contaminación es la técnica utilizada para esterilizar los componentes de la plataforma. En nuestras manos, hemos tenido un éxito constante con simples remojos en ≥ solución de lejía al 10% con un enjuague adecuado en agua del grifo sin esterilización en autoclave. Se puede aplicar esterilización adicional con etanol al 70% según sea necesario, pero tenga en cuenta que cualquier componente impreso en 3D con PLA es incompatible con EtOH y se deformará. Además, todas las partes de la plataforma, aparte del baño acrílico y los componentes de PLA impresos en 3D, se pueden esterilizar en autoclave, y los componentes empapados en ≥ solución de lejía al 10% se pueden enjuagar con agua esterilizada en autoclave o purificada. Para evitar la oxidación, se recomienda lavar y secar a mano todos los componentes metálicos inmediatamente después de cada experimento.

La metodología para cuantificar la tinción con azul de toluidina para caracterizar la formación de fibrocartílago descrita en este protocolo emplea un innovador análisis de imágenes en color personalizado que ofrece una amplia aplicación a la investigación de tendones. La conversión de datos de píxeles del espacio de color RGB al HSV76 proporciona ventajas significativas. Aquí, el tono codifica una longitud de onda dominante como un color característico de 0 ° a 360 °, mientras que la saturación define la pureza de cada tono de 0 a 255. El valor, por el contrario, describe el brillo del color y, como tal, el esquema de color HSV separa el brillo (valor) del color (tono, saturación). En el contexto de los análisis histológicos, los datos de píxeles del VHS son más robustos a los cambios en la transmisión de la luz durante la microscopía y a las variaciones en el grosor de la sección tisular76. Además, el trabajo en el espacio de color HSV permite la delineación de longitudes de onda específicas de interés (a través del tono) en función de la tinción histológica76, por ejemplo, tonos de alrededor de 240° para la tinción con azul de toluidina.

Un aspecto innovador del análisis de la imagen de azul de toluidina presentado en este estudio es la puntuación del fibrocartílago, una métrica que se relaciona con la distancia euclidiana que separa el color de cada ROI del color del fibrocartílago perióstico. El fibrocartílago perióstico emerge como cartílago secundario inmediatamente después del nacimiento, mientras que el fibrocartílago tendinoso compresivo está ausente postnatalmente y, al igual que otros fibrocartílagos sesamoideos, parece estar regulado por la demanda mecánica en regiones de compresión tendinosa elevada 16,17,28,77. Al comparar las puntuaciones de fibrocartílago entre los grupos experimentales, podemos determinar no solo si el color de la tinción azul de toluidina está cambiando como consecuencia del pinzamiento, sino si este cambio da lugar a una apariencia más cercana al fibrocartílago. Este análisis puede extenderse a otras tinciones populares de GAG, como el azul alcián y la safranina O, así como a otras regiones del fibrocartílago tendinoso y las entesis del tendón fibrocartilaginoso, siempre que exista un tejido de control similar al fibrocartílago perióstico. Por ejemplo, los cambios en la tinción de GAG en los tendones y ligamentos de la rodilla podrían normalizarse a través de la puntuación de fibrocartílago a la tinción en los meniscos fibrocartilaginosos.

Un aspecto crucial de este protocolo es el corte de tejido en serie y el seguimiento del nivel de la sección a través del tendón de Aquiles, lo que requiere la inclusión repetible en parafina y la identificación minuciosa de la entrada en la inserción del tendón de Aquiles para el seguimiento de la profundidad de la sección. Este protocolo de seccionamiento y tinción requiere sin duda práctica y refinamiento, pero puede extenderse a la criosección.

El enfoque histológico descrito en este manuscrito puede extenderse fácilmente a la inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. En este sentido, un aspecto importante del diseño experimental anterior es la comparación por pares de las extremidades contralaterales de cada ratón. Aquí, todas las comparaciones estadísticas se realizan entre secciones de tejido a nivel de sección comparable a través del tendón de Aquiles de extremidades contralaterales del mismo ratón asignadas a diferentes grupos experimentales. Esta estrategia ayuda a controlar la variabilidad biológica. Además, los pares de secciones de tejido contralateral emparejados se tiñen en el mismo portaobjetos simultáneamente (histología) o en portaobjetos simultáneamente utilizando soluciones de trabajo idénticas para todos los reactivos, tampones y soluciones de anticuerpos (inmunotinción) para ayudar a controlar la variabilidad de tinción a tinción inherente a la histología y el inmunomarcaje, así como la heterogeneidad anatómica que depende del nivel, la ubicación y la orientación de la sección.

Es posible que se implementen varias otras modificaciones al protocolo descrito en este manuscrito para un estudio más profundo de preguntas de investigación adicionales. Por ejemplo, mientras que los datos representativos proporcionados aquí se centran en 7 días de pinzamiento estático, este enfoque se puede adaptar para investigar las secuelas biológicas del pinzamiento intermitente o cíclico acoplando la cuerda enrollada alrededor de la pata trasera a través del clip a un actuador mecánico como una bomba de jeringa. Además, la plataforma ofrece la oportunidad de interrogar los mecanismos moleculares de interés mediante la suplementación de los medios de cultivo con agonistas/antagonistas de moléculas pequeñas, o mediante el uso de explantes de extremidades traseras de cepas de ratones transgénicos.

En conclusión, hemos presentado un nuevo modelo de explante murino de extremidades posteriores para el estudio de la mecanobiología subyacente al pinzamiento del tendón de Aquiles. Esto está dotado por un protocolo de cultivo de tejidos que mantiene la viabilidad celular en condiciones de carga durante 7 días. Este modelo recapitula la formación de fibrocartílago impulsada por el pinzamiento y el cambio de colágeno como se describe en otros sistemas modelo, así como en la enfermedad degenerativa del tendón. La plataforma experimental permite la aplicación controlada y la cuantificación de patrones de deformación mecánica y, por lo tanto, proporciona un excelente modelo para el estudio riguroso de la mecanobiología del impacto. Este modelo se puede aplicar para interrogar mecanismos moleculares de interés para identificar posibles dianas terapéuticas en el tratamiento de las tendinopatías insercionales.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen el apoyo y la asistencia brindados por Jeff Fox y Vidya Venkatramani del Centro de Investigación Musculoesquelética de la Universidad de Rochester, financiado en parte por P30AR06965. Además, los autores desean agradecer al Centro de Microscopía Óptica y Nanoscopía (CALMN) del Centro Médico de la Universidad de Rochester por su ayuda con la microscopía multifotónica. Este estudio fue financiado por R01 AR070765 y R01 AR070765-04S1, así como por 1R35GM147054 y 1R01AR082349.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox - Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining

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Modelo de explante de extremidad posterior murina para el estudio de la mecanobiología del pinzamiento del tendón de Aquiles
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